CN111033260A - 用于脓毒症的诊断试剂盒和使用其的诊断方法 - Google Patents

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Abstract

本发明涉及一种用于脓毒症的诊断试剂盒以及使用所述诊断试剂盒诊断脓毒症的方法，所述诊断试剂盒包括：第一核金纳米颗粒，其具有与其缀合的靶捕获寡核苷酸，所述靶捕获寡核苷酸与脓毒症病原体特异性基因组的一部分互补结合；和第二核金纳米颗粒，具有与其一端缀合的拉曼活性分子的靶捕获寡核苷酸经由其另一端与所述第二核金纳米颗粒缀合，所述靶捕获寡核苷酸包括与所述脓毒症病原体特异性基因组的一部分互补的序列，所述序列与其不重叠，但与所述第一金纳米颗粒的所述部分接续。

Description

用于脓毒症的诊断试剂盒和使用其的诊断方法
技术领域
本发明涉及一种用于脓毒症的诊断试剂盒以及使用所述诊断试剂盒诊断脓毒症的方法，所述诊断试剂盒包括：第一核金纳米颗粒，其具有与其缀合的寡核苷酸，所述寡核苷酸与脓毒症病原体特异性基因组的一部分互补结合；和第二核金纳米颗粒，其具有与其另一端缀合的寡核苷酸，所述寡核苷酸具有与其一端缀合的拉曼活性分子，包括与所述脓毒症病原体特异性基因组的一部分互补的序列，所述序列不重叠，但与所述第一金纳米颗粒的所述部分接续。
背景技术
脓毒症是一种急性严重疾病，其中患者被引起脓毒症的病原体(诸如细菌、病毒、真菌等)感染，并且因此该患者可能罹患高烧且最终死亡。在此情况下，存在两种主要的死亡原因，并且首先，免疫***由于所谓的‘细胞因子风暴’过度发挥功能，并且这种过度的自身免疫功能破坏人体中的器官(过度炎症)，并且其次，病原体的蔓延未受到抑制，造成病原体扩散到血液和器官，从而使器官的所有功能瘫痪(低炎症；免疫麻痹)。
脓毒症引起的休克被称为主要的致病机理，其主要通过各种微生物的全身炎症反应，并且这导致动脉血管舒张和血压降低，这种血压降低不对血压升高剂应答。尽管在诊断、监测和治疗方面取得了进步，但感染性休克患者的死亡率仍然很高，并且随着我们步入老龄化社会，老年患者中感染性休克的患病率持续增加，这在医院中占很大比例的死亡。
韩国的脓毒症发生率为每100000人中347人，并且它是致命性疾病，是心肌梗塞的3倍和中风的1.5倍，死亡率为31％(心肌梗塞和中风的死亡率为9％)。特别地，它是全球5岁以下婴儿死亡60％的病因，并且是韩国‘重症监护病房’(ICU)中的首要死亡原因，并且在北美、澳大利亚和欧洲，脓毒症死亡率为20％，脓毒症死亡率为31％，这在某种程度上较高。
在这方面，增加脓毒症患者存活率的最重要治疗方法是快速施用适当的抗生素。2012年公布的脓毒症治疗指南建议在三小时内适当施用广谱抗生素，并且在施用抗生素之前进行血液培养测试以鉴定病原体(Journal of the Korean Medical Association,2012)。
然而，在临床试验中，血液培养测试的结果一般可以在至少5天之后和血液采集之后至少24小时进行诊断，并且因此大多数脓毒症患者在没有鉴定确切病原体的情况下接受经验性抗生素。因此，如果对经验性抗生素具有抗性的细菌诸如耐多药细菌是败血症的病原体，则当血液培养测试的结果证实被耐多药细菌感染时，有可能患者的治疗已经失败，导致死亡率增加。
因此，为了更快的诊断，可以考虑通过PCR扩增和检测基因的方法，但是由于PCR的性质：即使少量基因也扩增，可能检测到除脓毒症病原体以外的细菌，或者可能检测到多种细菌，从而导致错用和/或滥用抗生素。
发明内容
[技术问题]
作为致力于发现可以快速准确地诊断脓毒症以及在不通过PCR扩增基因的情况下鉴定病原体类型的试剂盒和方法的研究工作的结果，本发明人通过证实以下情况而完成了本发明：通过形成两种核金纳米颗粒二聚体，其中互补序列的寡核苷酸与脓毒症病原体特异性基因组结合，以受控的厚度形成银或金壳，从而将颗粒之间的距离控制在几纳米之内，并且通过最大化表面增强的拉曼散射效应，可以检查拉曼散射信号以快速灵敏地鉴定脓毒症感染以及病原体类型。
[技术方案]
本发明的第一方面在于提供一种用于脓毒症的诊断试剂盒，所述诊断试剂盒包括：第一核金纳米颗粒，其具有经由一端与其缀合的第一靶捕获寡核苷酸，所述第一靶捕获寡核苷酸与第一脓毒症病原体特异性基因组的一部分互补结合；第二核金纳米颗粒，其具有经由一端与其缀合的第二靶捕获寡核苷酸，所述第二靶捕获寡核苷酸与所述第一脓毒症病原体特异性基因组的其它部分互补结合；和包含稳定剂、还原剂、和银或金离子的溶液，其中所述第一靶捕获寡核苷酸或所述第二靶捕获寡核苷酸中的任一种具有与其另一端缀合的第一拉曼活性分子，所述第一拉曼活性分子不与金纳米颗粒结合。
本发明的第二方面在于提供一种用于为诊断脓毒症提供信息的方法，所述方法包括：制备包含基因组的样本的第一步骤，所述基因组分离自从疑似患有脓毒症的受试者收集的样品；使所述第一步骤的样本与以下反应的第二步骤：第一核金纳米颗粒，其具有经由一端与其缀合的第一靶捕获寡核苷酸，所述第一靶捕获寡核苷酸与脓毒症病原体特异性基因组的一部分互补结合；和第二核金纳米颗粒，其具有经由一端与其缀合的第二靶捕获寡核苷酸，所述第二靶捕获寡核苷酸与所述脓毒症病原体特异性基因组的其它部分互补结合(其中，所述第一靶捕获寡核苷酸或所述第二靶捕获寡核苷酸中的任一种具有与其另一端缀合的拉曼活性分子，所述拉曼活性分子不与金纳米颗粒结合)；使所述第二步骤的产物与包含稳定剂、还原剂、和银或金离子的溶液反应以同时分别形成由所述第一核金纳米颗粒和所述第二核金纳米颗粒上的银或金制成的第一壳和第二壳的第三步骤；以及测量从所述第三步骤获得的产物中拉曼活性分子的拉曼信号的第四步骤。
[有益效果]
因为本发明的试剂盒在与脓毒症病原体特异性基因组反应时可以形成显示显著增加的拉曼散射信号的结构，因此即使少量样品也可以在数小时内被快速准确地诊断，从而导致适当的抗生素施用，并且因此它可以通过脓毒症的早期诊断而广泛用于降低死亡率。
附图说明
图1是示意性地示出了使用根据本发明的脓毒症诊断试剂盒的核-壳纳米颗粒二聚体形成的脓毒症病原体分析方法的图。
具体实施方式
本发明的第一方面在于提供一种用于脓毒症的诊断试剂盒，所述诊断试剂盒包括：第一核金纳米颗粒，其具有经由一端与其缀合的第一靶捕获寡核苷酸，所述第一靶捕获寡核苷酸与第一脓毒症病原体特异性基因组的一部分互补结合；第二核金纳米颗粒，其具有经由一端与其缀合的第二靶捕获寡核苷酸，所述第二靶捕获寡核苷酸与所述第一脓毒症病原体特异性基因组的其它部分互补结合；和包含稳定剂、还原剂、和银或金离子的溶液，其中所述第一靶捕获寡核苷酸或所述第二靶捕获寡核苷酸中的任一种具有与其另一端缀合的第一拉曼活性分子，所述第一拉曼活性分子不与金纳米颗粒结合。
本发明的第二方面在于提供一种用于为诊断脓毒症提供信息的方法，所述方法包括：制备包含基因组的样本的第一步骤，所述基因组分离自从疑似患有脓毒症的受试者收集的样品；使所述第一步骤的样本与以下反应的第二步骤：第一核金纳米颗粒，其具有经由一端与其缀合的第一靶捕获寡核苷酸，所述第一靶捕获寡核苷酸与脓毒症病原体特异性基因组的一部分互补结合；和第二核金纳米颗粒，其具有经由一端与其缀合的第二靶捕获寡核苷酸，所述第二靶捕获寡核苷酸与所述脓毒症病原体特异性基因组的其它部分互补结合(其中，所述第一靶捕获寡核苷酸或所述第二靶捕获寡核苷酸中的任一种具有与其另一端缀合的拉曼活性分子，所述拉曼活性分子不与金纳米颗粒结合)；使所述第二步骤的产物与包含稳定剂、还原剂、和银或金离子的溶液反应以同时分别形成由所述第一核金纳米颗粒和所述第二核金纳米颗粒上的银或金制成的第一壳和第二壳的第三步骤；以及测量从所述第三步骤获得的产物中拉曼活性分子的拉曼信号的第四步骤。
在下文中，将详细地描述本发明。
本发明设计成提供一种用于诊断脓毒症的快速、准确和灵敏的方法，并且是基于使用表面增强拉曼散射(SERS)的超灵敏拉曼光谱法。拉曼光谱法即使对于分子的诱导极化发生变化的非极性分子也可以获得信号，并且几乎所有有机分子都有自己的拉曼位移(cm-1)。此外，由于它不受水分子干扰的影响，所以它也更适合于检测生物分子，诸如蛋白质、基因等。然而，它由于信号强度低而尚未被商业化，但是表面增强的拉曼散射可以通过各种纳米结构，从而能够实现在单分子水平上的信号检测。当拉曼活性分子被吸附或位于金属表面附近时发生SERS，因为它是一种由激光在金属表面上产生、经投射用于拉曼测量的等离子体增加了从拉曼活性分子发出的信号的现象，所以热点可以增强SERS信号，所述热点是在密集的纳米颗粒之间形成的强电磁场。在此情况下，SERS信号对纳米颗粒的大小和形状，和/或纳米颗粒与拉曼活性材料之间的距离敏感地反应。但是，因为由纳米颗粒之间的任意聚集形成的热点无法控制这些因素，因此它可能会损害信号检测的可重复性。
因此，本发明人旨在提供一种试剂盒，该试剂盒可以形成可控的纳米结构，该纳米结构可以使SERS效应最大化，从而提供可再现的结果，以便提供敏感可靠的测量结果。具体而言，两个核纳米颗粒通过DNA杂交以规律的间隔隔开，并且在其间形成包括拉曼活性分子的二聚体之后，在每个核纳米颗粒上以受控的厚度形成金或银壳，从而能够通过将两个核-壳颗粒的间距控制到亚纳米水平诱导SERS增强。将DNA引入核纳米颗粒的表面以通过杂交形成二聚体是维持纳米颗粒之间恒定距离的优选方式。通过互补结合形成的双链DNA具有恒定的结构并且具有每个碱基对0.34nm的恒定长度，并且因此颗粒之间的间距可以通过控制组成其的核苷酸的数目来控制。此外，当除了设计成在核纳米颗粒上形成二聚体的序列之外另外引入具有任何序列的DNA以防止非特异性结合时，存在阻断多聚体形成以及制备高纯度二聚体的优点。
对于本发明的试剂盒，术语“第一脓毒症病原体特异性基因组”可以指包含能够通过基因组的存在而指定第一病原体的预定序列的寡核苷酸。基因组可以是分离自脓毒症的病原体菌株的整个基因组，并且可以是用限制性内切酶切割的DNA片段以简化反应，但不限于此。在此情况下，对于限制性内切酶，可以使用HpaII(MspI)、HaeIII、HgaI或Taq(alpha)I，但是限制性内切酶不限于此。例如，可以选择并使用能够使用4bp或更小的识别序列来固定尽可能多的片段的限制性内切酶。具体而言，考虑到以上条件和经济效率，可使用Hpall或Taql。当设计本发明的靶寡核苷酸和对应的靶捕获寡核苷酸时，应用以上限制性内切酶，特别是Hpall和Taql的限制性酶切位点。
例如，与脓毒症病原体特异性基因组的一部分互补结合的寡核苷酸可以指包括脓毒症病原体特异性基因组的一部分和用于与脓毒症病原体特异性基因组杂交的互补序列的寡核苷酸。
如本文所用，术语“靶捕获寡核苷酸”是指能够通过杂交捕获靶寡核苷酸的寡核苷酸，因为它具有与待检测的基因(即靶寡核苷酸)的一部分互补的序列。在本发明中，第一靶捕获寡核苷酸和第二靶捕获核苷酸可以各自具有不与脓毒症病原体特异性基因组重叠并且与连续地定位或在几个寡核苷酸缺口内的其它部分互补的序列。相反地，在本发明中，靶核苷酸可以包括与第一靶捕获寡核苷酸和第二靶捕获核苷酸互补的序列，并且如果存在，整个序列包括在其间出现的几个寡核苷酸的缺口。
本发明设计成防止由于适当的抗生素治疗延迟而导致的高死亡率，因为用于诊断脓毒症和鉴定病原体的常规血液培养测试需要至少24小时和几天。本发明可以提供一种结构，该结构可以通过确认脓毒症病原体的特定基因组并且使用与其互补的序列来提供显著增强的拉曼信号，并且是基于发现以下结果：除了花费数小时预处理样品之外，它可以在1小时内通过拉曼光谱法以高精度和灵敏度快速测量和诊断，并且可以通过简单测量同时鉴定出几种病原体。
同时，因为拉曼光谱信号因其基于振动光谱的特征而具有高光谱分辨率，因此与荧光信号不同，拉曼信号的波峰非常尖锐且光谱几乎没有重叠，并且因此可以通过使用多种在不同波长下显示拉曼信号的拉曼活性分子同时诊断多种病原体。
具体而言，本发明的试剂盒可以进一步包括一对或多对第三核金纳米颗粒，所述第三核金纳米颗粒具有经由一端与其缀合的第三靶捕获寡核苷酸，所述第三靶捕获寡核苷酸与不同于所述第一脓毒症病原体的第二脓毒症病原体特异性基因组的一部分互补结合；和第四核金纳米颗粒，所述第四核金纳米颗粒具有经由一端与其缀合的第四靶捕获寡核苷酸，所述第四靶捕获寡核苷酸与所述第二脓毒症病原体特异性基因组的其它部分互补结合，使得多个脓毒症病原体可以被同时检测，其中所述第三靶捕获寡核苷酸或所述第四靶捕获寡核苷酸中的任一种具有与其另一端缀合的第二拉曼活性分子，所述第二拉曼活性分子不与金纳米颗粒结合。因为第一靶捕获寡核苷酸、第二靶捕获寡核苷酸、第三靶捕获寡核苷酸、和第四靶捕获寡核苷酸彼此之间不呈竞争关系，因此它们不会干扰与每个靶的相互作用和每一者的信号。由以下构成的一对：第一核金纳米颗粒，其具有经由一端与其缀合的第一靶捕获寡核苷酸，所述第一靶捕获寡核苷酸与第一脓毒症病原体特异性基因组的一部分互补结合；和第二核金纳米颗粒，其具有经由一端与其缀合的第二靶捕获寡核苷酸，所述第二靶捕获寡核苷酸与所述第一脓毒症病原体特异性基因组的其它部分互补结合；并且由以下构成的一对：第三核金纳米颗粒，所述第三核金纳米颗粒具有经由一端与其缀合的第三靶捕获寡核苷酸，所述第三靶捕获寡核苷酸与第二脓毒症病原体特异性基因组的一部分互补结合；和第四核金纳米颗粒，所述第四核金纳米颗粒具有经由一端与其缀合的第四靶捕获寡核苷酸，所述第四靶捕获寡核苷酸与所述第二脓毒症病原体特异性基因组的其它部分互补结合可以以混合物形式或各自独立地提供。
在此情况下，所述第三核金纳米颗粒和所述第四核金纳米颗粒分别可以具有与所述第一核金纳米颗粒和所述第二核金纳米颗粒之间任一种和另一种相同的大小，或所有都是各自独立的。例如，虽然可以全部包括寡核苷酸，其中可以包括两对或更多对核金纳米颗粒，但在具有一种序列的核酸与一个核金纳米颗粒结合，或者两种或多种类型的败血症病原体特异性基因组可以与一种核金纳米颗粒结合的情况下，可以使用被设计为包括在不同波长下显示拉曼信号的拉曼活性分子的核金纳米颗粒。这些颗粒可以用于同时检测两种或多种脓毒症病原体。
包括在本发明的试剂盒中的第一核金纳米颗粒和第三核金纳米颗粒各自独立地具有10nm至50nm的平均直径，并且第二核金纳米颗粒和第四核金纳米颗粒可以以组合选择为具有是第一核金纳米颗粒和第三核金纳米颗粒的平均直径1至2倍的平均直径。在使用本发明的试剂盒诊断脓毒症时，最终测量的拉曼信号的增强程度可取决于在核金纳米颗粒上形成的金或银壳之间的距离。然而，测量的拉曼信号不仅与最终形成的核-壳纳米颗粒二聚体之间的距离有关，而且与每个构成核的大小和距离(即靶寡核苷酸的距离)有关，并且它们具有相互有机的关系。
如上所述，虽然一个核金纳米颗粒具有选自10nm至50nm的范围的大小，但是将与其形成二聚体的另一个核金纳米颗粒可以选择大小为所选大小的1至2倍、优选1.3至1.7倍的颗粒。更优选地，可以选择具有1.4至1.6倍大小的颗粒，但不限于此。
此外，所述第一靶捕获寡核苷酸和所述第二靶捕获寡核苷酸，以及所述第三靶捕获寡核苷酸和所述第四靶捕获寡核苷酸具有相同数目、或差值在±5个碱基内的包括在其中的碱基，并且所述第一靶捕获寡核苷酸和所述第二靶捕获寡核苷酸的碱基数目的总和，以及所述第三靶捕获寡核苷酸和所述第四靶捕获寡核苷酸的碱基数目的总和可以各自独立的为15至100、优选25至70、并且更优选35至60，但不限于此。
例如，为了提供最有效地增强的拉曼信号，考虑到上文所述的核金纳米颗粒的大小，优选选择与每个核金纳米颗粒缀合的靶捕获寡核苷酸、即第一靶捕获寡核苷酸、第二靶捕获寡核苷酸，第三靶捕获寡核苷酸和第四靶捕获寡核苷酸的距离，以便与待检测的靶寡核苷酸互补结合。基于当所述第一核金纳米颗粒和所述第三核金纳米颗粒为20nm，并且所述第一靶捕获寡核苷酸和所述第二靶捕获寡核苷酸的所述碱基数目的总和，以及所述第三靶捕获寡核苷酸和所述第四靶捕获寡核苷酸的所述碱基数目的总和为30时，所述第一核金纳米颗粒的大小与所述第一靶捕获寡核苷酸和所述第二靶捕获寡核苷酸的碱基数目的总和，以及所述第三核金纳米颗粒的大小与所述第三靶捕获寡核苷酸和所述第四靶捕获寡核苷酸的碱基数目的总和可以被设计成成比例的。例如，虽然第一靶捕获寡核苷酸和第二靶捕获寡核苷酸的碱基数目的总和，以及第三靶捕获寡核苷酸和第四靶捕获寡核苷酸的碱基数目的总和在上文所述的范围内选择，但当所使用的第一核金纳米颗粒或第三核金纳米颗粒的大小为20nm时，可能优选的是基于根据30个碱基数目大小的增加和减少，在20％偏差内成比例地减少或增加。
另外，当通过在其中第一靶捕获寡核苷酸和第二靶捕获寡核苷酸之间的任一种寡核苷酸的核金纳米颗粒未结合的另一端引入拉曼活性分子而缀合靶寡核苷酸时形成复合物，该复合物中的拉曼活性分子位于第一核金纳米颗粒与第二核金纳米颗粒之间，并且每个核金纳米颗粒中的金或银壳以相同的速率形成。在最终形成的核-壳纳米颗粒二聚体中，优选的是拉曼活性分子位于这些颗粒之间的距离的中心附近，以便位于在这些壳之间形成的纳米间隙中以显示最大的SERS效应。因此，优选的是将与每个核结合的第一靶捕获寡核苷酸和第二靶捕获寡核苷酸设计成具有彼此类似的长度。例如，当第一靶捕获寡核苷酸和第二靶捕获寡核苷酸的长度之间的差值较大时，当形成壳从而具有几纳米的纳米间隙时拉曼活性分子嵌入任一壳中并且可能不显示拉曼信号。
另外，当所使用的颗粒的大小小于上文所述的范围时，拉曼信号本身的大小可能较小，使得即使当通过SERS效应扩增时也可能难以获得所希望的灵敏度水平。同时，当大于上文范围时，单位二聚体可能不必要地较大，或者与靶寡核苷酸的结合可能由于其大小而受到空间效应的阻碍。另外，如上文所述，为了获得有效的拉曼信号，核金纳米颗粒大小增加，靶核苷酸碱基数目根据此而增加，核颗粒之间的距离由于此而增加，并且因此需要将壳颗粒形成为不必要的较厚，并且可能伴随反应时间和/或试剂的浪费。
在本发明的具体示例性实施方式中，第一核金纳米颗粒和第二核心金纳米颗粒的大小分别选择为40nm和60nm，并且因此第一靶捕获寡核苷酸和第二靶捕获寡核苷酸配置成包括具有其20个连续序列的互补序列，以便与靶核苷酸的40个碱基互补结合。
可以通过使用本发明的试剂盒诊断的第一脓毒症病原体和第二病原体可以各自独立地选自由以下组成的组：大肠杆菌、克雷伯氏肺炎菌、金黄色葡萄球菌、酿脓链球菌、粪肠球菌和绿脓杆菌。上文列出的菌株是本领域众所周知的脓毒症病原体，并且本发明不限于这些菌株，并且可以不受限制地应用于能够引起脓毒症的菌株。
尽管本发明的试剂盒被设计为显示增强的信号以检测痕量的脓毒症病原体，但是由于脓毒症的性质而引起的错误诊断可能导致药物的错用和滥用，其特征在于每种元件经过优化，使得可以进行更准确的诊断。
在本发明的试剂盒中，第一核金纳米颗粒、第二核金纳米颗粒、第三核金纳米颗粒和第四核金纳米颗粒可以各自独立地是直径为20nm至100nm的球形颗粒，但不限于此。具体而言，第一核金纳米颗粒至第四核金纳米颗粒可以是球形的，圆形度为0.9至1.0，标准偏差不超过±0.05。因为市售的金纳米颗粒具有多面体形状而非球形，所以在引入银或金壳时保持核金纳米颗粒的基本结构，而当以均匀厚度引入银或金壳时，根据寡核苷酸连接部分的微结构形成的二聚体中两个核-壳纳米颗粒之间的间距可能存在差异。因此，为了形成大小更均匀的纳米间隙，优选使用尽可能多的球形核金颗粒，从而获得更均匀且可预测地控制的拉曼信号。具体而言，因为由完整球体的组合形成的二聚体显示出点对点的相互作用，所以对来自位于它们之间的拉曼活性分子的信号的扩增效果可能相当低，但是优点在于可以获得在更准确和更希望和/或更可预测的方向下控制的信号，而没有任何其它干扰等。另一方面，以异质形式形成的二聚体，即接近圆的多面体颗粒的组合是点对点、点对线、点对面、线对线、线对面或面对面选择，并且可能会发生任何不可控制的相互作用。这可能会由于接触面积增加而导致更高的信号增强效果，但是由于信号的异质混合，即信号的频谱展宽，信号的不确定性不可避免。因此，为了更准确的诊断，优选使用完全球形的核金纳米颗粒。
另外，可能模糊所测量信号的另一个因素是考虑形成聚集体而非二聚体的情况，也就是说，将多个第二核金纳米颗粒与一个第一核金纳米颗粒组合。聚集体的形成可能导致所测量的拉曼信号的频谱展宽和/或峰位置偏移。因此，为了使第一核金纳米颗粒和第二核金纳米颗粒分别以1:1组合，除了第一靶捕获寡核苷酸和第二靶捕获寡核苷酸之外，还可以在每个核金纳米颗粒的表面上进一步引入保护寡核苷酸。保护寡核苷酸可以由不与可能存在于待检测菌株中的靶寡核苷酸或基因组非特异性结合的任何序列组成。在此情况下，可以根据待施加的核金纳米颗粒的大小来确定所使用的保护寡核苷酸的量。例如，基于尺寸为15nm的颗粒，靶捕获寡核苷酸(第一靶捕获寡核苷酸至第四靶捕获寡核苷酸)和保护寡核苷酸可以以1:90至1:110的比例使用，并且可以根据颗粒大小的增加或减少而成比例增加或减少地使用。在本发明的一个具体示例性实施方式中，将1:99的比例用于直径为15nm的颗粒，并且将1:199的比例用于直径为30nm的颗粒。
本发明的试剂盒中包括的寡核苷酸的特征在于与脓毒症病原体特异性基因组的一部分互补结合。寡核苷酸可以通过以下程序选择。例如，从已知数据库获得脓毒症病原体的基因组信息，并且其中，分析和选择参与细胞内新陈代谢回路并且在菌株之间不太可能发生交叉反应的序列，并且可以根据上文设计适当长度和序列的寡核苷酸对。寡核苷酸可以是DNA或RNA，但是就RNA而言，因为无法保证稳定性，所以可以优选使用DNA。在通过以上方法选择10至15个候选基团之后，可以基于上文形成使用本发明的试剂盒的拉曼复合物，并且可以通过测量信号并选择具有高分子诊断效果的寡核苷酸序列将其包括在试剂盒中。
在本发明的试剂盒中，所述第一靶捕获寡核苷酸和所述第二靶捕获寡核苷酸中的任一种可以分别经由5'末端并且另一者经由3'末端分别与所述第一核金纳米颗粒和所述第二核金纳米颗粒结合，并且所述第三靶捕获寡核苷酸和所述第四靶捕获寡核苷酸中的任一种可以分别经由5'末端并且另一者经由3'末端分别与所述第三核金纳米颗粒和所述第四核金纳米颗粒结合。
具体而言，第一靶捕获寡核苷酸和第二靶捕获寡核苷酸均可以分别地包括5至20个与第一脓毒症病原体特异性基因组的一部分互补的核苷酸序列，并且第三靶捕获寡核苷酸和第四靶捕获寡核苷酸均可以分别地包括5至20个与第二脓毒症病原体特异性基因组的一部分互补的核苷酸序列。在此情况下，优选的是这些序列彼此不重叠，并且优选的是它们与在几个序列内彼此间隔开的相邻序列互补。例如，第一靶捕获寡核苷酸和第二靶捕获寡核苷酸，以及第三靶捕获寡核苷酸和第四靶捕获寡核苷酸可以彼此连接，或者可以在3个核苷酸间隔内彼此相邻定位。
例如，当第一脓毒症病原体特异性基因组由30个氨基酸序列构成时，为了与第一脓毒症病原体特异性基因组从3'末端至5'末端的15个序列杂交，第一个靶捕获寡核苷酸可以构成为包括与其互补的序列。此外，为了杂交从3'末端至5'末端方向第16个序列的15个序列，即从5'末端至3'末端的15个序列，可以将第二靶捕获寡核苷酸组成为包括与其互补的序列。在此情况下，可以将硫醇基团连接至第一靶捕获寡核苷酸的5'末端，以便由此直接或经由接头与第一核金纳米颗粒结合。同时，第二靶捕获寡核苷酸可以在3'末端具有硫醇基团，以便由此直接或经由接头与第一核金纳米颗粒结合。因此，拉曼活性分子可以与第一靶捕获寡核苷酸的3'末端或第二靶捕获寡核苷酸的5'末端缀合，并且可以直接或通过由1至3个序列构成的接头与其缀合，但不限于此。
如上文所配置，当第一靶捕获寡核苷酸和第二靶捕获寡核苷酸包含A10-PEG18作为接头时，金纳米颗粒可以获得其中金纳米颗粒被分隔约15nm的结合二聚体。当调节反应时间和/或条件以形成厚度为5nm的银或金壳时，可以获得纳米间隙为5nm的金核-银或金壳二聚体，其中拉曼活性分子位于纳米间隙中。引入接头以使靶捕获寡核苷酸以直立形式定位而不平铺在核金纳米颗粒的表面上，并且这些接头连接至表面并且对核金纳米颗粒之间的距离影响很小。
例如，所述第一靶捕获寡核苷酸和所述第二靶捕获寡核苷酸均可以包含5至20个与所述第一脓毒症特异性基因组的一部分互补的核苷酸序列，并且所述第三靶捕获寡核苷酸和所述第四靶捕获寡核苷酸均可以包含5至20个与所述第二脓毒症病原体特异性基因组的一部分互补的核苷酸序列，并且这些序列不重叠，其中所述第一靶捕获寡核苷酸和所述第二靶捕获寡核苷酸，以及所述第三靶捕获寡核苷酸和所述第四靶捕获寡核苷酸可以分别以1至3个核苷酸的间隔相邻定位，但不限于此。
第一拉曼活性分子或第二拉曼活性分子可以是有机荧光分子。例如，它可以选自由以下组成的组：FAM(6-羧基荧光素；6-FAM)、Dabcyl(4-((4-(二甲氨基)苯基)偶氮)苯甲酸或4-((4-(二甲氨基)苯基)偶氮)苯甲酸)、四甲基罗丹明异硫醇(TRIT)、NBD(7-硝基苯-2-1,3-二唑)、德克萨斯红染料、邻苯二甲酸、对苯二甲酸、间苯二甲酸、甲苯基坚牢紫、甲苯基蓝紫、亮甲酚蓝、对氨基苯甲酸、赤藓红、生物素、洋地黄毒苷、5-羧基-4',5-二氯-2',7'-二甲氧基、荧光素、5-羧基-2',4',5',7'-四氯荧光素、5-羧基荧光素、5-羧基若丹明、6-羧基若丹明、6-羧基四甲基氨基酞菁、偶氮甲碱、花青、黄嘌呤、琥珀酰荧光素、氨基吖啶、量子点、碳纳米管、碳同素异形体、氰化物、硫醇、氯、溴、甲基、磷、硫和花青染料(Cy3、Cy3.5和Cy5)和罗丹明。在此情况下，为了促进多种病原体的同时检测，可以通过组合不同的第一拉曼活性分子或第二拉曼活性分子，例如不具有拉曼光谱重叠的那些来选择第一拉曼活性分子或第二拉曼活性分子。同时，有机荧光分子可以显示拉曼信号以及荧光信号，并且为了最小化荧光信号的覆盖，可以选择具有低荧光产率的材料，但是本发明不限于此。
在本发明的用于为诊断脓毒症提供信息的方法中，当从第四步骤测量的拉曼活性分子的拉曼信号与从在具有相同大小的金-核-银或金-壳纳米颗粒上标记的相同拉曼活性分子测量的拉曼信号相比显著增加时，判断受试者被脓毒症病原体感染，所述脓毒症病原体在基因组中包括与所述第一靶捕获寡核苷酸和所述第二靶捕获寡核苷酸互补的序列。
当分离自从受试者收集的样品中的样本中包括的脓毒症病原体特异性基因组可杂交时，包括与结合于第一核金纳米颗粒和第二核金纳米颗粒的寡核苷酸互补的序列，第一核金纳米颗粒和第二核金纳米颗粒经由与其结合的寡核苷酸和与其杂交的脓毒症病原体特异性基因组连接以形成哑铃型二聚体。在此情况下，第一靶捕获寡核苷酸或第二靶捕获寡核苷酸中的任一种在不与金纳米颗粒结合的另一端，并且拉曼活性分子将位于核金纳米颗粒与第二金纳米颗粒的中间。因此，在形成的二聚体中形成银或金壳的情况下，两侧上的纳米颗粒之间的间隙变窄，并且通过控制壳厚度，可以控制纳米颗粒之间的间隙以具有0.5nm至10nm、具体地0.5nm至5nm、更具体地0.5nm至3nm的窄纳米间隙。因此形成的最终结构具有几纳米的纳米间隙，并且形成了通过寡核苷酸的互补结合连接的金核-银或金壳结构的颗粒，其中拉曼活性分子位于纳米间隙中。因此，位于金核-银或金壳结构的颗粒之间的纳米间隙中的拉曼活性分子在用适当波长的光照射时产生拉曼信号，并且因为此时产生的拉曼信号表示大约1010倍或更多倍的增强信号，所以可以通过拉曼光谱法检测少量的基因组。此外，因为可以在比血液培养测试明显更快的时间内区分出病原体的类型，所以可能早期诊断脓毒症并及早开出合适的抗生素。
详细描述
在下文中，提供优选的实施例来帮助理解本发明。然而，提供以下实施例仅仅是为了更容易理解本发明，并且本发明的内容不受实例限制。
实施例1.制备拉曼活性分子(Cy3)位于两个纳米颗粒接合处的金核-银壳纳米颗粒
基于银壳形成的DNA引导的桥接方法合成拉曼活性的金核-银壳二聚体，该方法通过与靶核苷酸缀合的金颗粒的量以及另外通过银前体的量控制。
首先，通过精确控制和有效纯化摩尔比的保护和靶捕获寡核苷酸序列的步骤，获得具有靶寡核苷酸的高度纯化的金纳米颗粒二聚体结构。具体而言，选择包括由SEQ IDNO.1表示的40个碱基的靶核苷酸，它是大肠杆菌基因组的一部分的(5'-GCCGCCTTGCCAGGCATTGACTTCGACATCATCGTAATAT-3'；Tm＝67.6℃)，并且为了检测该靶核苷酸，设计了一种靶捕获寡核苷酸以包括各自由SEQ ID NO.2和SEQ ID NO.3表示的碱基序列(SEQ ID NO.2；探针A；5'-TCAATGCCTGGCAAGGCGGC/iSp9/A30/SH-3'；Tm＝64.2℃和SEQ ID NO.3；探针B；5'-HS/A30/iSp9/ATATTACGATGATGTCGAAGAAA/拉曼活性分子/-3'；Tm＝54.2℃)。保护寡核苷酸由阻断与靶核苷酸结合的任何序列构成(SEQ ID NO.4；保护A；5'-GACCTGAATAACCCT/iSp9/A10/SH-3'；Tm＝50.4℃和SEQ ID NO.5；保护B；5'-HS/A10/iSp9/GATCGTCGTCTACCG-3'；Tm＝61.0℃)。
因为金纳米颗粒(AuNP)与拉曼活性分子之间的最大间隙距离(d；间隙距离)仍达到7nm，所以有必要减小间距以获得扩增的电磁增益。同时，在SERS检测中，因为银的效果比金好几倍，所以引入银纳米壳以控制壳表面与拉曼活性分子之间的距离。在此情况下，对于拉曼活性分子，替换并测试了具有不同荧光波长和/或强度的各种有机荧光分子，诸如Cy3、Dabcyl、FAM等。结果，当引入具有比具有高荧光强度的Cy3稍弱的荧光的Dabcyl时，证实了其通过减少荧光对拉曼信号的隐藏对于拉曼信号检测更有利。
具体而言，为了减小纳米颗粒之间的间隙距离以产生扩增的SERS信号，通过已知的修饰方法将银纳米壳的厚度调节至纳米水平(Chem.Comm.2008,J.Phys.Chem.B 2004,108,5882-5888)，并且涂覆金纳米颗粒二聚体的表面。在100μL作为稳定剂的聚(乙烯基)吡咯烷酮和50μL作为还原剂的L-抗坏血酸钠(10-1M)存在下，使250μM金纳米颗粒二聚体溶液与各种量的AgNO3(10-3M)在0.3M PBS溶液中在室温下反应3小时。分别使用30μL、40μL和70μL的AgNO3溶液(10-3M)合成银壳厚度为约3nm、5nm、和10nm的金核-银壳异二聚体纳米颗粒。通过此方法，成功地将银壳厚度控制在纳米单位，诸如约3nm、5nm、10nm等，从而获得与靶寡核苷酸缀合的金-银核-壳异二聚体结构。
通过常规的合成方法，为了控制一个靶捕获寡核苷酸序列在金纳米颗粒的表面上修饰，将探针A的金纳米颗粒(20nm)用探针A和保护A两种类型的3'末端硫醇修饰的寡核苷酸序列官能化。探针B的金纳米颗粒(40nm)也通过探针B和保护B两种类型的5'末端硫醇修饰的寡核苷酸序列功能化。对于两种类型序列的摩尔比，基于在金纳米颗粒表面上寡核苷酸的纳米颗粒大小依赖性负载能力，对于探针A将保护寡核苷酸：靶捕获寡核苷酸的比例控制为132:1，并且对于探针B控制为266:1。具体而言，通过控制所用保护寡核苷酸的量进行实验，使得探针A的金纳米颗粒和探针B的纳米颗粒可以形成1:1结合的二聚体而非聚集体。对于直径为15nm的颗粒，通过将保护寡核苷酸：靶捕获寡核苷酸的比例设置为99:1，并且根据颗粒大小成比例调节，证实了可以阻断多聚体的形成并且可以准备二聚体。重要的是，对于探针B的靶捕获寡核苷酸序列，将充当拉曼标签的拉曼活性分子Cy3与末端缀合。还通过磁分离技术纯化寡核苷酸修饰的探针A和B以除去未结合靶捕获寡核苷酸的单体颗粒。磁珠(直径为1μm，Invitrogen)的甲苯磺酰基基团被分别与探针A或B的靶捕获序列互补的胺修饰的寡核苷酸序列替换和组合。仅与靶捕获序列结合的金纳米颗粒才能被磁珠分离。接着，将纯化的探针A和B溶液与0.3M PBS中足够量的靶寡核苷酸序列杂交。
实施例2：根据核颗粒的形状提高准确度
为了提高测量的准确度，选择大小受控制的两种完全球形的金纳米颗粒作为核。使用成均馆大学的Gira Yi教授提出的方法进行合成(ACS Nano,2013,7(12):11064-11070)。具体而言，合成具有比待制备的球形颗粒大的大小的八面体作为初始颗粒，并且蚀刻以制备具有圆形度为0.94或更大的完全球形的金纳米颗粒。由于颗粒被用于合成DNA或经由硫醇基团将DNA引入颗粒表面上的十六烷基三甲基溴化铵(CTAB)团聚是不利的，所以通过用表面活性剂(诸如Tween 20等)处理对表面改性以具有负Zeta电位。
实施例3：选择用于诊断脓毒症的靶捕获寡核苷酸
用于诊断脓毒症的靶寡核苷酸选自是已知引起脓毒症的代表性菌株的大肠杆菌、克雷伯氏肺炎菌、金黄色葡萄球菌、粪肠球菌和绿脓杆菌的基因组。选择两至十二个靶捕获寡核苷酸对以与靶寡核苷酸特异性结合，该靶寡核苷酸包括至少两种类型的各自选自五种菌株的基因组的40至115个碱基。具体而言，除了大肠杆菌的用于实施例1中的由SEQ IDNO:2和3表示的寡核苷酸，另外测试由SEQ ID NO:6和7(SEQ ID NO.6：5'-TTTTGGCAACAGGGCTAGGT-3'和SEQ ID NO.7：5'-TAATATCCTGTCGAAAATCCT-3')表示的序列对。
此外，将由SEQ ID NO:8至19(共6对)、20至27(共4对)、28至51(共12对)以及52至59(共4对)表示的一系列靶捕获寡核苷酸对用于测试并且每一者在下文中描述，所述靶捕获寡核苷酸被设计成用于检测克雷伯氏肺炎菌(KP)、金黄色葡萄球菌(SA)、粪肠球菌(EF)和绿脓杆菌(PA)的基因组。
SEQ ID NO:8；5'-GGGATATCTGACCAGTCGGG-3'
SEQ ID NO:9；5'-GAATTAAAAAACAGGAAATC-3'
SEQ ID NO:10；5'-AGGTCAACAATGCTGCGGAT-3'
SEQ ID NO:11；5'-CTGCAGAAACACTGTACGTC-3'
SEQ ID NO:12；5'-GTACTTCGCAAATCTCAACG-3'
SEQ ID NO:13；5'-CAAATGAACATCAAAGCGAA-3'
SEQ ID NO:14；5'-TTAACTGCCCTACACTGGTG-3'
SEQ ID NO:15；5'-GACAATGTCGGTAAAGTTAA-3'
SEQ ID NO:16；5'-GTTAACTGCCCTACACTGGTG-3'
SEQ ID NO:17；5'-CAAGGTCTTTTGGGGTTATCG-3'
SEQ ID NO:18；5'-GGTACCAGAGGTCTCGTAAA-3'
SEQ ID NO:19；5'-CAGAGGTCTCGTAAAACTGA-3'
SEQ ID NO:20；5'-TCACAAACAGATAATGGCGT-3'
SEQ ID NO:21；5'-AAATAGAAGTGGTTCTGAAG-3'
SEQ ID NO:22；5'-CTATGATTGTGGTAGCCATC-3'
SEQ ID NO:23；5'-ATTATTGTAGGTGTATTAGC-3'
SEQ ID NO:24；5'-CGAACTAAAGCTTCGTTTACC-3'
SEQ ID NO:25；5'-CCACGTCCATATTTATCAGT-3'
SEQ ID NO:26；5'-CAATGTTCTACCATAGCGAT-3'
SEQ ID NO:27；5'-CATACGATCTTTACTTATCC-3'
SEQ ID NO:28；5'-GCTTCTTTCCTCCCGAGTGC-3'
SEQ ID NO:29；5'-TTGCACTCAATTGGAAAGAG-3'
SEQ ID NO:30；5'-GAAGAACAAGGACGTTAGTA-3'
SEQ ID NO:31；5'-ACTGAACGTCCCCTGACGGT-3'
SEQ ID NO:32；5'-TGGTTAAACTTTTTGCCTTA-3'
SEQ ID NO:33；5'-CGAGCGAAGATCATTGGCAC-3'
SEQ ID NO:34；5'-TTTTGAACATCATCGGTGAC-3'
SEQ ID NO:35；5'-CATATAGTCTAAGAAGGCTT-3'
SEQ ID NO:36；5'-AATGTAATAATTGGTTCATA-3'
SEQ ID NO:37；5'-CCCTGGGTAAATAGGTGCTG-3'
SEQ ID NO:38；5'-GGAATTTCGTTCCCGTTACT-3'
SEQ ID NO:39；5'-ATACCAGTTCGCAAAAAGCA-3'
SEQ ID NO:40；5'-ACGATCCGAAAACCTTCTTC-3'
SEQ ID NO:41；5'-GTCCATTGCCGAAGATTCCC-3'
SEQ ID NO:42；5'-CTTTCGAGCCTCAGCGTCAG-3'
SEQ ID NO:43；5'-CAGGGTATCTAATCCTGTTT-3'
SEQ ID NO:44；5'-GTGTATTAGGtGAAGGTGTT-3'
SEQ ID NO:45；5'-TGATGGCCGTGTATTAGGTG-3'
SEQ ID NO:46；5'-GAAATCGTCGTAATAAACCG-3'
SEQ ID NO:47；5'-CAAGAAATCGTCGTAATAAA-3'
SEQ ID NO:48；5'-GGAATTGAAGGTATTTTAAA-3'
SEQ ID NO:49；5'-ATTAACGCTAGGAGAGCCGG-3'
SEQ ID NO:50；5'-CGACTATTTACAAGTTCGCCC-3'
SEQ ID NO:51；5'-ATTTACAAGTTCGCCCAGAG-3'
SEQ ID NO:52；5'-CAGCGGTACGTCCTTGACCA-3'
SEQ ID NO:53；5'-GCCAGACATGTACGTCGGCC-3'
SEQ ID NO:54；5'-GTTTCCAGTGCGTGGTACTG-3'
SEQ ID NO:55；5'-GACGAAGACGTACAGCGGCC-3'
SEQ ID NO:56；5'-GCGCTCAGTCAGGAAAGCAT-3'
SEQ ID NO:57；5'-CGACAAGAAGGCGCTCAGTC-3'
SEQ ID NO:58；5'-GACCTGGCAGTGCATTCTTC-3'
SEQ ID NO:59；5'-GTCATTCGCAGTGGTCCCTG-3'
在培养每种菌株之后，证实了使用上文设计的靶捕获寡核苷酸对通过检测每种菌株来诊断脓毒症的适用性，包括通过PCR分离和扩增基因组DNA(gDNA)的一系列程序。
此外，代表性地，再次证实了靶寡核苷酸用于确认在大肠杆菌引起的脓毒症患者中gDNA的适用性。首先，通过样本证实靶寡核苷酸的敏感性，其中通过血液培养测试检测大肠杆菌。另外，通过使用其中通过血液培养测试未确认大肠杆菌，但通过组织学检查确认到大肠杆菌感染的脓毒症患者的样本，证实了靶寡核苷酸的敏感性。
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<210> 1
<211> 40
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> EC_靶_SEQ1
<400> 1
gccgccttgc caggcattga cttcgacatc atcgtaatat 40
<210> 2
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> EC_靶_捕获_探针A1
<400> 2
tcaatgcctg gcaaggcggc 20
<210> 3
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> EC_靶_捕获_探针B1
<400> 3
atattacgat gatgtcgaag 20
<210> 4
<211> 15
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 保护_探针A
<400> 4
gacctgaata accct 15
<210> 5
<211> 15
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 保护_探针B
<400> 5
gatcgtcgtc taccg 15
<210> 6
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> EC_靶_捕获_探针A2
<400> 6
ttttggcaac agggctaggt 20
<210> 7
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> EC_靶_捕获_探针B2
<400> 7
taatatcctg tcgaaaatcc t 21
<210> 8
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> KP_靶_捕获_探针A1
<400> 8
gggatatctg accagtcggg 20
<210> 9
<211> 20
<212> DNA
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<220>
<223> KP_靶_捕获_探针B1
<400> 9
gaattaaaaa acaggaaatc 20
<210> 10
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> KP_靶_捕获_探针A2
<400> 10
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<210> 11
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> KP_靶_捕获_探针B2
<400> 11
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<210> 12
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<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> KP_靶_捕获_探针A3
<400> 12
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<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
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<220>
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<220>
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<220>
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<220>
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<220>
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<220>
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<220>
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<220>
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<400> 57
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<220>
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<212> DNA
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<220>
<223> PA_靶_捕获_探针B4
<400> 59
gtcattcgca gtggtccctg 20
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<211> 40
<212> DNA
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<220>
<223> EC_靶_SEQ1
<400> 1
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<220>
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<220>
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<400> 4
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<400> 5
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<220>
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<220>
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<220>
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<220>
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<220>
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<220>
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<400> 15
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<220>
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<400> 17
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<213> 人工序列
<220>
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<400> 18
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<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> KP_靶_捕获_探针B6
<400> 19
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<211> 20
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<220>
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<213> 人工序列
<220>
<223> EF_靶_捕获_探针B8
<400> 43
cagggtatct aatcctgttt 20
<210> 44
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> EF_靶_捕获_探针A9
<400> 44
gtgtattagg tgaaggtgtt 20
<210> 45
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> EF_靶_捕获_探针B9
<400> 45
tgatggccgt gtattaggtg 20
<210> 46
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> EF_靶_捕获_探针A10
<400> 46
gaaatcgtcg taataaaccg 20
<210> 47
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> EF_靶_捕获_探针B10
<400> 47
caagaaatcg tcgtaataaa 20
<210> 48
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> EF_靶_捕获_探针A11
<400> 48
ggaattgaag gtattttaaa 20
<210> 49
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> EF_靶_捕获_探针B11
<400> 49
attaacgcta ggagagccgg 20
<210> 50
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> EF_靶_捕获_探针A12
<400> 50
cgactattta caagttcgcc c 21
<210> 51
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> EF_靶_捕获_探针B12
<400> 51
atttacaagt tcgcccagag 20
<210> 52
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> PA_靶_捕获_探针A1
<400> 52
cagcggtacg tccttgacca 20
<210> 53
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> PA_靶_捕获_探针B1
<400> 53
gccagacatg tacgtcggcc 20
<210> 54
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> PA_靶_捕获_探针A2
<400> 54
gtttccagtg cgtggtactg 20
<210> 55
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> PA_靶_捕获_探针B2
<400> 55
gacgaagacg tacagcggcc 20
<210> 56
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> PA_靶_捕获_探针A3
<400> 56
gcgctcagtc aggaaagcat 20
<210> 57
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> PA_靶_捕获_探针B3
<400> 57
cgacaagaag gcgctcagtc 20
<210> 58
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> PA_靶_捕获_探针A4
<400> 58
gacctggcag tgcattcttc 20
<210> 59
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> PA_靶_捕获_探针B4
<400> 59
gtcattcgca gtggtccctg 20

Claims (17)

1.一种用于脓毒症的诊断试剂盒，其包括：
第一核金纳米颗粒，其具有经由一端与其缀合的第一靶捕获寡核苷酸，所述第一靶捕获寡核苷酸与第一脓毒症病原体特异性基因组的一部分互补结合；
第二核金纳米颗粒，其具有经由一端与其缀合的第二靶捕获寡核苷酸，所述第二靶捕获寡核苷酸与所述第一脓毒症病原体特异性基因组的其它部分互补结合；和
包含稳定剂、还原剂、和银或金离子的溶液，
其中所述第一靶捕获寡核苷酸或所述第二靶捕获寡核苷酸中的任一种具有与其另一端缀合的第一拉曼活性分子，所述第一拉曼活性分子不与金纳米颗粒结合。
2.根据权利要求1所述的用于脓毒症的诊断试剂盒，其进一步包括：
一对或多对第三核金纳米颗粒，所述第三核金纳米颗粒具有经由一端与其缀合的第三靶捕获寡核苷酸，所述第三靶捕获寡核苷酸与不同于所述第一脓毒症病原体的第二脓毒症病原体特异性基因组的一部分互补结合；和第四核金纳米颗粒，所述第四核金纳米颗粒具有经由一端与其缀合的第四靶捕获寡核苷酸，所述第四靶捕获寡核苷酸与所述第二脓毒症病原体特异性基因组的其它部分互补结合，使得多个脓毒症病原体可以被同时检测，
其中所述第三靶捕获寡核苷酸或所述第四靶捕获寡核苷酸中的任一种具有与其另一端缀合的第二拉曼活性分子，所述第二拉曼活性分子不与金纳米颗粒结合。
3.根据权利要求2所述的用于脓毒症的诊断试剂盒，其中所述第三核金纳米颗粒和所述第四核金纳米颗粒分别具有与所述第一核金纳米颗粒和所述第二核金纳米颗粒中的任一种和另一种相同的大小，或是各自独立的。
4.根据权利要求1或2所述的用于脓毒症的诊断试剂盒，其中所述第一核金纳米颗粒和所述第三核金纳米颗粒各自独立地具有10nm至50nm的平均直径，并且所述第二核金纳米颗粒和所述第四核金纳米颗粒的平均直径分别是所述第一核金纳米颗粒和所述第三核金纳米颗粒的平均直径的1至2倍。
5.根据权利要求1或2所述的用于脓毒症的诊断试剂盒，其中所述第一靶捕获寡核苷酸和所述第二靶捕获寡核苷酸，以及所述第三靶捕获寡核苷酸和所述第四靶捕获寡核苷酸具有相同数目、或差值在±5内的包括在其中的碱基，并且所述第一靶捕获寡核苷酸和所述第二靶捕获寡核苷酸的碱基数目的总和，以及所述第三靶捕获寡核苷酸和所述第四靶捕获寡核苷酸的碱基数目的总和各自独立的为15至100。
6.根据权利要求1或2所述的用于脓毒症的诊断试剂盒，其中，基于当所述第一核金纳米颗粒和所述第三核金纳米颗粒具有20nm的大小，并且所述第一靶捕获寡核苷酸和所述第二靶捕获寡核苷酸的所述碱基数目的总和、以及所述第三靶捕获寡核苷酸和所述第四靶捕获寡核苷酸的所述碱基数目的总和为30时，所述第一核金纳米颗粒的大小与所述第一靶捕获寡核苷酸和所述第二靶捕获寡核苷酸的碱基数目的总和、以及所述第三核金纳米颗粒的大小与所述第三靶捕获寡核苷酸和所述第四靶捕获寡核苷酸的碱基数目的总和分别与其成比例。
7.根据权利要求1或2所述的用于脓毒症的诊断试剂盒，其中所述第一核金纳米颗粒至所述第四核金纳米颗粒呈球形形式，圆形度为0.9至1.0，标准偏差不超过±0.05。
8.根据权利要求1或2所述的用于脓毒症的诊断试剂盒，其中所述第一脓毒症病原体和所述第二脓毒症病原体各自独立地选自由以下组成的组：大肠杆菌、克雷伯氏肺炎菌、金黄色葡萄球菌、酿脓链球菌、粪肠球菌和绿脓杆菌。
9.根据权利要求1或2所述的用于脓毒症的诊断试剂盒，其中所述第一核金纳米颗粒、所述第二核纳米颗粒、所述第三核金纳米颗粒和所述第四核金纳米颗粒是完整的球形颗粒，各自独立地具有20nm至100nm的直径。
10.根据权利要求1或2所述的用于脓毒症的诊断试剂盒，其中所述第一靶捕获寡核苷酸和所述第二靶捕获寡核苷酸中的任一种分别经由5'末端并且另一者经由3'末端分别与所述第一核金纳米颗粒和所述第二核金纳米颗粒结合，并且所述第三靶捕获寡核苷酸和所述第四靶捕获寡核苷酸中的任一种分别经由5'末端并且另一者经由3'末端分别与所述第三核金纳米颗粒和所述第四核金纳米颗粒结合。
11.根据权利要求1或2所述的用于脓毒症的诊断试剂盒，其中所述第一靶捕获寡核苷酸和所述第二靶捕获寡核苷酸均包含5至20个与所述第一脓毒症病原体特异性基因组的一部分互补的核苷酸序列，并且所述第三靶捕获寡核苷酸和所述第四靶捕获寡核苷酸均包含5至20个与所述第二脓毒症病原体特异性基因组的一部分互补的核苷酸序列，并且这些序列不重叠，其中所述第一靶捕获寡核苷酸和所述第二靶捕获寡核苷酸，以及所述第三靶捕获寡核苷酸和所述第四靶捕获寡核苷酸分别以0至3个核苷酸的间隔相邻定位。
12.根据权利要求1或2所述的用于脓毒症的诊断试剂盒，其中所述第一拉曼活性分子或所述第二拉曼活性分子是有机荧光分子，其在不同波长下显示拉曼信号。
13.根据权利要求1或2所述的用于脓毒症的诊断试剂盒，其中所述第一拉曼活性分子和所述第二拉曼活性分子显示低荧光信号。
14.一种用于为诊断脓毒症提供信息的方法，其包括：
制备包含基因组的样本的第一步骤，所述基因组分离自从疑似患有脓毒症的受试者收集的样品；
使所述第一步骤的样本与以下反应的第二步骤：第一核金纳米颗粒，其具有经由一端与其缀合的第一靶捕获寡核苷酸，所述第一靶捕获寡核苷酸与脓毒症病原体特异性基因组的一部分互补结合；和第二核金纳米颗粒，其具有经由一端与其缀合的第二靶捕获寡核苷酸，所述第二靶捕获寡核苷酸与所述脓毒症病原体特异性基因组的其它部分互补结合(其中，所述第一靶捕获寡核苷酸或所述第二靶捕获寡核苷酸中的任一种具有与其另一端缀合的拉曼活性分子，所述拉曼活性分子不与金纳米颗粒结合)；
使所述第二步骤的产物与包含稳定剂、还原剂、和银或金离子的溶液反应以同时分别形成由所述第一核金纳米颗粒和所述第二核金纳米颗粒上的银或金制成的第一壳和第二壳的第三步骤；以及
测量从所述第三步骤获得的产物中拉曼活性分子的拉曼信号的第四步骤。
15.根据权利要求14所述的方法，其中所述脓毒症病原体选自由以下组成的组：大肠杆菌、克雷伯氏肺炎菌、金黄色葡萄球菌、酿脓链球菌、粪肠球菌和绿脓杆菌。
16.根据权利要求14所述的方法，其中，当从所述第四步骤测量的所述拉曼活性分子的拉曼信号与从在具有相同大小的金-核-银或金-壳纳米颗粒上标记的相同拉曼活性分子测量的拉曼信号相比显著增加时，判断所述受试者为被脓毒症病原体感染，所述脓毒症病原体在基因组中包含与所述第一靶捕获寡核苷酸和所述第二靶捕获寡核苷酸互补的序列。
17.根据权利要求14所述的方法，其中进行所述第三步骤直至所述第一壳与所述第二壳之间的最短距离为0.5nm至10nm。
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