CN111032858A - 不使用酶地从活体组织分离基质细胞的方法及装置 - Google Patents

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Abstract

本发明的一个实施例提供一种方法及装置，所述方法为不使用酶地从活体组织分离基质细胞的方法，其特征在于利用诱导活体组织的基质细胞的自发迁移(spontaneous migration)将基质细胞移动到活体组织的外部的方式，基质细胞的自发迁移的诱导在活体组织附着于能够附着活体组织的材料的附着部件上的状态下进行，基质细胞的自发迁移的诱导在基质细胞能够生存的培养液内进行。能够以此解决关于酶的毒性及费用、处理时间、异种病毒的担忧等问题和使用具有从异种动物的胃液提取的成份的酶引起的不稳定性的问题，而且不使用酶地从活体组织分离出无损伤、相对完整的自然状态的基质细胞，从而能够提高分离效率。

Description

不使用酶地从活体组织分离基质细胞的方法及装置
技术领域
本发明涉及从活体组织分离基质细胞的方法及装置，具体来讲涉及一种不使用酶地从活体组织分离基质细胞的方法及装置。
背景技术
从活体组织分离动物的活体组织中存在的基质细胞的方法有使用酶的方法和不使用酶的方法。
使用酶从动物的活体组织分离基质细胞的方法有在初始分离步骤使用酶的方法或在收获或传代培养(subculture)步骤使用酶的方法。
在从活体组织分离基质细胞的初始步骤中，对在活体组织中强力包围贴附于基质细胞的胶原(collagen)组织使用胶原酶(collagenase)之类的酶以从活体组织溶解出基质细胞，从这样溶解出来的基质细胞洗去酶后得到基质细胞。但这种情况下产生关于酶的毒性与费用、处理时间、异种病毒的担忧等问题。
在培养基增殖在从活体组织分离基质细胞的上述初始步骤中分离的基质细胞的情况下，由于细胞密度(confluency)增大而需传代培养时，使用胰蛋白酶(trypsin)之类的酶进行传代培养。然而，此时使用的酶是从异种动物的胃液提取的成份，因此具有稳定性低下的问题。
根据不使用酶地从动物的活体组织分离基质细胞的方法，在初始分离步骤中，利用超声波、激光或强负压等将活体组织切断成细微以破坏胶原，通过离心分离来分离基质细胞。但这种情况下基质细胞从胶原脱落而完整地分离的概率极低，基质细胞的损伤大，因此相比于使用酶的方法收率不足5％，具有工序复杂的问题。
根据不使用酶地从动物的活体组织分离基质细胞的方法，在收获或传代培养步骤中，为了培养增殖分离的基质细胞而在比重不同的微珠表面增殖细胞，收集重复将如上增殖细胞的微珠和液体进行混合的过程使得微珠相互碰撞而脱落的细胞，或在平面培养增殖基质细胞后用刮器(scraper)刮下基质细胞。然而由于该情况下微珠是球形，因此无法最大化相互碰撞过程中微珠表面上增殖的细胞脱落的效果，用刮器刮下脱落的细胞的数量不多，而且有刮下的过程中细胞受损的担忧。
另外，培养脂肪组织之类的活体组织是利用浮在培养液的特性而在装满培养液的容器放入脂肪组织使得浮在培养液以诱导培养的脂肪组织附着在培养容器的上部内侧面。然而该情况下培养的脂肪组织附着的面为平面，因此无法极大化培养的脂肪组织附着的面，从而具有无法极大化培养效率的问题。
发明内容
技术问题
本发明的目的是提供一种不使用酶地是将切断成细微的活体组织放入培养液并诱导活体组织中被胶原包围的基质细胞通过自发迁移(spontaneous migration)移动到活体组织的外部，以此解决关于酶的毒性及费用、处理时间、异种病毒的担忧等问题和使用具有从异种动物的胃液提取的成份的酶引起的不稳定性的问题，而且不使用酶地从活体组织分离出无损伤、相对完整的自然状态的基质细胞，从而能够提高分离效率的方法及装置。
本发明的另一目的是提供一种从活体组织有效地刮削(scraping)在培养液内通过自发迁移移动到活体组织的外部的基质细胞，以解决关于酶的毒性及费用、处理时间、异种病毒的担忧等的问题和由于使用具有从异种动物的胃液提取的成份的酶而引起的不稳定性的问题，并且能够提高从活体组织分离基质细胞的分离效率的方法及装置。
技术方案
根据用于达成上述目的的本发明的一个实施例，提供一种不使用酶地从活体组织分离基质细胞的方法，其特征在于：利用诱导活体组织的基质细胞的自发迁移(spontaneous migration)将基质细胞移动到活体组织的外部的方式，基质细胞的自发迁移的诱导在活体组织附着于能够附着活体组织的材料的附着部件上的状态下进行，基质细胞的自发迁移的诱导在基质细胞能够生存的培养液内进行。
在本实施例中，还可以包括微细地切断活体组织使得基质细胞的至少一部分从活体组织中包围基质细胞的胶原之间向外部露出。
在本实施例中，还可以包括从活体组织分离移动到附着部件的外部的基质细胞，基质细胞的分离可通过向附着于附着部件的基质细胞施加物理性的力实现。
在本实施例中，施加于移动到活体组织的外部的基质细胞的物理性的力可以是使在培养液内移动到活体组织的外部的基质细胞与培养液一起进行紊流运动发生的力。
在本实施例中，还可以包括收集从活体组织分离的基质细胞。
根据用于达成上述目的的本发明的另一实施例，提供一种不使用酶地从活体组织分离基质细胞的方法，其特征在于，包括：(1)将活体组织切断成细微；(2)将被切断成细微的活体组织在培养液内附着于该活体组织能够附着的材料的附着部件上；(3)诱导在附着部件上基质细胞自发迁移使得基质细胞移动到活体组织的外部；以及(4)从附着部件分离移动到活体组织的外部的基质细胞。
在本实施例中，(1)的活体组织可被细微地切断成基质细胞的至少一部分从该活体组织中包围基质细胞的胶原之间向外部露出。
在本实施例中，可以使排列有移动到活体组织的外部的基质细胞的多个附着部件通过培养液的紊流运动相互碰撞向基质细胞施加物理性的力实现(4)的基质细胞的分离。
在本实施例中，还可以包括(5)收集从活体组织分离的基质细胞。
在本实施例中，可以按顺序重复执行(2)至(4)。
在本实施例中，更换选自由活体组织、培养液及附着部件构成的群组的至少一种后按顺序重复执行(2)至(4)。
在本实施例中，活体组织可包括选自由皮肤、脂肪、软骨、粘膜、血管、韧带、心脏、脑、胎盘、脐带、羊膜、肌肉及末梢神经构成的群组的至少任意一种。
在本实施例中，培养液可包括选自DMEM(Dulbecco′s Modified Eagle′s Medium，杜氏改良Eagle培养基)及牛胎儿血清(fetal bovine serum)构成的群组的至少任意一种。
根据用于达成上述目的的本发明的又一实施例，提供一种不使用酶地从活体组织分离基质细胞的装置，其特征在于，包括：附着部件，其在培养液内附着活体组织诱导活体组织的基质细胞的自发迁移以将基质细胞移动到活体组织的外部，其中，附着部件具有比培养液更小的平均比重或具有比培养液更大的平均比重。
在本实施例中，附着部件的平均比重比培养液更小的情况下，该附着部件可以是包括选自由聚丙烯(polypropylene)、聚乙烯(polyethylene)、聚氨酯(polyurethane)、细胞外基质(Extracellular Matrix，ECM)、胶原(collagen)、聚二恶烷酮(polydioxanone)、聚己内酯(polycaprolactone)、聚L-丙交酯(poly(L-lactide)，PLLA)、聚乳酸-羟基乙酸(poly(lactic-co-glycolic acid)，PLGA)、聚乳酸(poly(lactic acid)，PLA)、蝶酰谷氨酸(pterolyglutamic acid，PGA)、透明质酸(hyaluronic acid)及硅胶构成的群组的至少任意一种的部件。
在本实施例中，附着部件的平均比重比培养液更大的情况下，该附着部件可以是包括选自由聚四氟乙烯(teflon)、聚碳酸酯(polycarbonate)、聚乙烯(polyethylene)、邻苯二甲酸酯(phthalate)、聚苯乙烯(polystyrene)、聚氨酯(polyurethane)、细胞外基质(Extracellular Matrix，ECM)、胶原(collagen)、聚二恶烷酮(polydioxanone)、聚己内酯(polycaprolactone)、聚L-乳酸(poly(L-lactide)，PLLA)、聚乳酸羟基乙酸(poly(lactic-co-glycolic acid)，PLGA)、聚乳酸(poly(lacticacid)，PLA)、蝶酰谷氨酸(pterolyglutamic acid，PGA)、透明质酸(hyaluronic acid)及硅胶构成的群组的至少任意一种的部件。
在本实施例中，附着部件可附着被细微地切断成基质细胞的至少一部分从活体组织中包围基质细胞的胶原之间露出的活体组织。
在本实施例中，附着部件可在培养液内附着活体组织诱导活体组织的基质细胞的自发迁移以将基质细胞移动到活体组织的外部，而且从活体组织分离如上移动的基质细胞。
在本实施例中，附着部件可包括：构成通过自发迁移移动到活体组织的外部的基质细胞排列的区域的本体；以及具有从本体向外侧延伸且厚度比本体的厚度更薄，能够刮削(scraping)排列于其他附着部件的基质细胞的形状的刮削部。
在本实施例中，刮削部的横截面的角部可形成的角度构成锐角。
在本实施例中，还可以包括内部收容培养液与活体组织及附着部件的容器。
在本实施例中，容器可具有形成收容培养液与活体组织及附着部件的空间且形成为能够通过旋转进行离心分离的倾斜部。
在本实施例中，容器能够通过正旋转与逆向旋转诱导培养液的紊流。
在本实施例中，容器还可以包括使得活体组织无法透过而培养液能够透过，在容器静止的状态下排列在浸在培养液的位置防止浮到培养液的活体组织浮于培养液的阻隔膜。
在本实施例中，容器可包括形成于离心力最大的位置，通过离心力收敛从活体组织分离的基质细胞的收敛部。
在本实施例中，容器还可以包括在收容空间位于到收敛部的路径上允许基质细胞通过离心力移动，阻隔活体组织及附着部件的移动的过滤器。
在本实施例中，容器还可以包括形成于收敛部向外部排出收敛于收敛部的基质细胞的基质细胞排出部。
在本实施例中，容器还可以包括从外部延伸到收容空间注入或排出培养液的培养液贯通管。
在本实施例中，容器还可以包括注入用于内部消毒的气体的气体注入部。
技术效果
本发明的主要效果是能够提供一种不使用酶地是将切断成细微的活体组织放入培养液并诱导活体组织中被胶原包围的基质细胞通过自发迁移移动到活体组织的外侧面，以此解决关于酶的毒性及费用、处理时间、异种病毒的担忧等问题和使用具有从异种动物的胃液提取的成份的酶引起的不稳定性的问题，而且不使用酶地从活体组织分离出无损伤、相对完整的自然状态的基质细胞，从而能够提高分离效率的方法及装置。
本发明的另一主要效果是能够提供一种从活体组织有效地刮削(scraping)在培养液内通过自发迁移移动到活体组织的外部的基质细胞，以解决关于酶的毒性及费用、处理时间、异种病毒的担忧等的问题和由于使用具有从异种动物的胃液提取的成份的酶而引起的不稳定性的问题，并且能够提高从活体组织分离基质细胞的分离效率的方法及装置。
附图说明
图1是示出基质细胞从活体组织蔓延的图像的照片；
图2是示出附于铬缝合线的脂肪细胞的图像的照片；
图3是简要示出在附着部件上活体组织的基质细胞通过自发迁移移动到活体组织外部的示意图；
图4是简要示出另一形态的在附着部件上活体组织的基质细胞通过自发迁移移动到活体组织的外部的示意图；
图5是简要示出在附着部件上通过自发迁移移动到活体组织的外部的基质细胞被其他附着部件刮削的示意图；
图6是示出在收容培养液与活体组织及附着部件的容器内按各层排列的状态的示意图；
图7是示出容器内的培养液与活体组织及附着部件离心分离的状态的示意图；
图8是示出从容器内的活体组织分离的基质细胞和培养液一起收敛于收敛部的状态的示意图。
具体实施方式
以下说明用于实施发明的具体内容。这些说明是为了使得发明所属技术领域的普通技术人员能够理解用于实施发明的具体内容而例示性地提供的，可变形成多种其他形态，因此本发明的范围不限于以下说明。
1.不使用酶地从活体组织分离基质细胞的方法
本方法为不使用酶地从活体组织分离基质细胞的方法，其特征在于利用诱导活体组织的基质细胞的自发迁移(spontaneous migration)将基质细胞移动到活体组织的外部的方式。
活体组织可包括选自由皮肤、脂肪、软骨、粘膜、血管、韧带、心脏、脑、胎盘、脐带、羊膜、肌肉及末梢神经构成的群组的至少任意一种。
活体组织的基质细胞的自发迁移表示基质细胞穿透在活体组织内包围基质细胞的胶原(collagen)自发地向外部移动。通过这种基质细胞的自发迁移，基质细胞继续在活体组织蔓延的图像例示性地如图1所示。
这种基质细胞通过基质细胞的自发性迁移移动到活体组织的外部可作为不使用酶地从活体组织分离基质细胞的非常重要的特性。本发明通过利用诱导活体组织的基质细胞的自发迁移将基质细胞移动到活体组织的外部的方式，提供不使用酶也能够从活体组织分离基质细胞的方法。
基质细胞的自发迁移在活体组织附着于能够附着活体组织的材料的部件的状态下能够进行得更为有效。例如，如例示性的图2所示，脂肪组织附着于铬缝合线(chromiccatgut)时脂肪细胞能够通过脂肪细胞的自发迁移移动附着于脂肪组织外部。如上，在将活体组织附着在能够附着活体组织的材料的部件的状态下诱导基质细胞的自发迁移，因此能够更有效地诱导基质细胞的自发迁移，从而能够更有效地从活体组织分离基质细胞。其中，能够附着活体组织的材料的部件可以是多种部件。例如，可以是与铬缝合线相同的材料的部件。
优选的是在基质细胞能够生存的培养液内诱导基质细胞的自发迁移。从而可通过和培养液一起分离移动到活体组织外部的基质细胞，在不损坏的前提下收集培养基质细胞。
培养液可包括选自DMEM(Dulbecco′s Modified Eagle′s Medium)及牛胎儿血清(fetal bovine serum)构成的群组的至少任意一种。
使用平均比重与活体组织相同的培养液使得活体组织全面分布于培养液，从而能够和培养液一起有效地分离通过自发迁移移动到活体组织的外部的基质细胞。
如果在培养液内能够附着活体组织的材料的部件被附着活体组织的状态下发生基质细胞的自发迁移，优选的是使用平均比重与附着部件及活体组织相同的培养液或使用平均比重比附着部件及活体组织大的培养液。这是因为该情况下在培养液内附着部件及活体组织全面分布或附着部件及活体组织分布在培养液的水面附近，因此活体组织接触附着部件的可能性增大，因此活体组织更有效地附着于附着部件，能够更有效地诱导基质细胞的自发迁移。
更为优选地，活体组织以被细微切断成基质细胞的至少一部分从包围基质细胞的胶原之间向外部露出的状态附着于附着部件。这是因为能够从而更好地诱导基质细胞在活体组织的自发迁移以从活体组织更有效地分离基质细胞。在此这种活体组织的切断可利用激光等实现。
基质细胞通过基质细胞的自发迁移移动到活体组织的外部后，可对基质细胞施加物理性的力以从活体组织分离基质细胞。例如，在培养液内基质细胞通过自发迁移移动到活体组织的外部后，可以使基质细胞和培养液一起进行紊流运动从而对基质细胞施加物理性的力以从活体组织分离基质细胞。如果在培养液内基质细胞在附着部件上通过自发迁移移动到活体组织的外部的情况下，可以使附着部件和培养液一起紊流运动从而对附着部件上的基质细胞施加物理性的力或使多个附着部件和培养液一起紊流运动相互碰撞从而对附着部件上的基质细胞施加更强的力以从活体组织有效地分离基质细胞。
从活体组织分离基质细胞后收集到外部。可通过在培养液内培养或传代培养增殖如上收集的基质细胞。如果在培养液内从活体组织分离基质细胞，则能够和培养液一起收集基质细胞，因此能够更有效地分离及培养或传代培养。
2.不使用酶地从活体组织分离基质细胞的装置
本装置是不使用酶地从活体组织分离基质细胞的装置，其特征在于具有在培养液内附着活体组织诱导活体组织的基质细胞的自发迁移，以将基质细胞移动到活体组织的外部的附着部件。
附着部件的材料可以是在培养液内附着活体组织诱导活体组织的基质细胞的自发迁移使得基质细胞移动到活体组织的外部的多种材料。例如，为了稳定或有效地附着活体组织，附着部件可以由与活体组织相同或相似的材料构成。如果在将活体组织附着在附着部件的表面的至少一部分的状态下将附着部件排列在培养液内，分布在培养液内的活体组织能够更轻易地附着在附着有相同组织的附着部件的表面。
附着部件的形状可以是能够在培养液内附着活体组织诱导活体组织的基质细胞的自发迁移使得基质细胞移动到活体组织的外部的多种形状。如例示性地示于图3，附着部件110可以由具有构成用于附着被切断成微细的多个活体组织120且附着的多个活体组织120的基质细胞130通过自发迁移移动到活体组织120的外部排列的区域的表面的本体111构成。为此，附着部件110可构成为整体为扁立方体形状。例示性地示于图3的附着部件110为四角立方体形状，但不限于此，附着部件可以构成为圆立方体、三角立方体、五角各立方体等多种形状。
优选地，附着部件110的厚度t形成为厚至具有能够被附着切断成细微的多个活体组织120且承受培养液的紊流运动的强度且薄至能够通过培养液的紊流运动顺畅地移动。
如果附着部件的表面的至少一部分形成有凹凸形状，活体组织与附着部件的表面接触的面积增大，因此能够更容易附着。
附着部件的比重可以是在培养液内附着活体组织诱导活体组织的基质细胞的自发迁移以将基质细胞移动到活体组织的外部的多种比重。
如果活体组织的平均比重比培养液小而大部分分布于培养液的水面附近，则优选的是使附着部件的平均比重比培养液小。这是因为该情况下附着部件也像活体组织大部分分布在培养液的水面附近，因此附着部件与活体组织接触的可能性增大，因此活体组织附着到附着部件的可能性增大。因此该情况下活体组织的基质细胞在附着部件上通过自发迁移移动到活体组织的外部的可能性增大。
附着部件的平均比重比培养液更小的情况下，附着部件可以是包括选自由聚丙烯(polypropylene)、聚乙烯(polyethylene)、聚氨酯(polyurethane)、细胞外基质(Extracellular Matrix，ECM)、胶原(collagen)、聚二恶烷酮(polydioxanone)、聚己内酯(polycaprolactone)、聚L-丙交酯(poly(L-lactide)，PLLA)、聚乳酸-羟基乙酸(poly(lactic-co-glycolic acid)，PLGA)、聚乳酸(poly(lactic acid)，PLA)、蝶酰谷氨酸(pterolyglutamic acid，PGA)、透明质酸(hyaluronic acid)及硅胶构成的群组的至少任意一种的部件。
如果活体组织的平均比重比培养液更大而附着在培养液的底面附近的情况下，优选的是使附着部件的平均比重比培养液更大。这是因为，该情况下附着部件也像活体组织一样大部分分布在培养液的底面附近，因此附着部件与活体组织接触的可能性更大，因此活体组织附着在附着部件上的可能性更大。因此该情况下活体组织的基质细胞在附着部件上通过自发迁移移动到活体组织的外部的可能性更大。
附着部件的平均比重比培养液更大的情况下，附着部件可以是包括选自由聚四氟乙烯(teflon)、聚碳酸酯(polycarbonate)、聚乙烯(polyethylene)、邻苯二甲酸酯(phthalate)、聚苯乙烯(polystyrene)、聚氨酯(polyurethane)、细胞外基质(Extracellular Matrix，ECM)、胶原(collagen)、聚二恶烷酮(polydioxanone)、聚己内酯(polycaprolactone)、聚L-乳酸(poly(L-lactide)，PLLA)、聚乳酸羟基乙酸(poly(lactic-co-glycolic acid)，PLGA)、聚乳酸(poly(lacticacid)，PLA)、蝶酰谷氨酸(pterolyglutamic acid，PGA)、透明质酸(hyaluronic acid)及硅胶构成的群组的至少任意一种的部件。
如果活体组织的平均比重与培养液相同而分散在整个培养液分布的情况下，优选的是使附着部件的平均比重与培养液相同。这是因为该情况下附着部件也像活体组织一样分散于整个培养液分布，因此附着部件和活体组织接触的可能性更大，因此活体组织附着在附着部件的可能性更大。因此该情况下活体组织的基质细胞在附着部件上通过自发迁移移动到活体组织的外部的可能性增大。
优选地，附着到附着部件的活体组织为被细微切断成基质细胞的至少一部分从在活体组织中包围基质细胞的胶原之间向外部露出的活体组织。这样能够更好地诱导基质细胞的自发迁移，因此基质细胞能够更好地从活体组织分离。
附着部件不仅可以是在培养液内附着活体组织诱导活体组织的基质细胞的自发迁移以将基质细胞移动到活体组织的外部的部件，还可以是从活体组织分离通过自发迁移移动到活体组织的外部的基质细胞的部件。因此附着部件不仅能够促进基质细胞通过自发迁移移动到活体组织的外部，还能够促进移动到活体组织的外部的基质细胞从活体组织分离。
附着部件可通过多种方式从活体组织分离通过自发迁移移动到活体组织的外部的基质细胞。
例如，附着部件可起到刮削(scraping)在附着部件上移动到活体组织的外部的基质细胞的作用。因此基质细胞受到物理性的力而从活体组织分离移动到培养液内。为此，如例示性地示于图4，附着部件210除了具有构成用于活体组织220附着且通过自发迁移移动到活体组织220的外部的基质细胞230排列的区域的本体211以外，还可以具有从本体211向外侧延伸且厚度比本体211的厚度t更薄从而能够刮削(scraping)排列在其他附着部件的基质细胞的形状的刮削部212。这种刮削部212可形成为其横截面的角部形成的角度小于90度的锐角。能够通过这种刮削部212从活体组织220或附着部件210轻易地分离通过自发迁移从活体组织220分离排列在活体组织220的外侧面或附着部件210上的基质细胞230使得移动到培养液内部。如例示性地示于图5，第一附着部件210上的从活体组织220分离排列在活体组织220的外侧面或附着部件210上的基质细胞230在与随着培养液的紊流运动一起进行紊流运动的邻接的第二附着部件210′碰撞的过程中，被厚度比第二本体211′的厚度t′更薄且向外侧延伸的第二刮削部212′轻易地刮削而能够从活体组织220或附着部件210轻易地分离移动到培养液内部。第一刮削部212也起到刮削排列在其他附着部件上的基质细胞的作用。第一刮削部212与第二刮削部212′的横截面的角部的角度A、A′构成小于90度的锐角使得分别具有比第一本体211的厚度t与第二本体211′的厚度t′更小的厚度。但是，刮削部的形状不限于例示性地示于图4及图5的形状，也可以具有能够分离排列在附着部件上的基质细胞的其他多种形状。
本装置还可以具有在内部收容培养液与活体组织及附着部件的容器。
容器具有收容培养液与活体组织及附着部件的空间。如例示性地示于图6，容器350可具有能够收容培养液340与活体组织320及附着部件310、311的收容空间351。但是收容空间351不限于此，可具有能够收容培养液340与活体组织320及附着部件310、311的多种形状。
收容空间351具有形成为能够通过旋转离心分离的倾斜部352，具有随着趋向上侧半径增大的圆形横截面。收容空间351的上部被盖353盖住。盖353起到防止收容于收容空间351的培养液340与活体组织320及附着部件310、311向外部泄漏的功能。进一步地，盖353起到防止培养液340由于容器350的正旋转与逆旋转引起的培养液340的紊流运动而向外部泄漏的功能。盖353具备具有与收容空间351的倾斜部352相反的倾斜的倾斜部且随着趋向上侧半径减小的圆形横截面将有利于通过旋转离心分离。
容器可通过重复向任意一个方向的正旋转及向反方向的逆旋转诱导收容空间内部的培养液的紊流。活体组织及附着部件也通过这种培养液的紊流进行紊流运动。因此附着在附着部件上的活体组织中通过自发迁移移动到活体组织的外部，从而排列在附着部件上的基质细胞从活体组织或附着部件分离而分离到培养液内部。并且，容器可向任意一个方向旋转以对分布在培养液内部的基质细胞施加离心力，从而从活体组织及附着部件分离基质细胞，以和培养液一起收集起来。
容器还可以具有在其静止的状态下排列于浸在收容空间内部的培养液的位置的阻隔膜。阻隔膜阻止由于平均比重比培养液更小而浮在培养液的活体组织浮到培养液的水面上使得活体组织与附着部件接触附着在附着部件。为此阻隔膜具有活体组织无法透过而培养液则透过的贯通孔。附着部件无法透过这种阻隔膜。
如例示性地示于图6，阻隔膜360在容器350静止的状态下排列于比收容空间351内部的培养液340的水面靠下的水面附近之类的浸于培养液340的位置。阻隔膜360形成有多个贯通孔，这种贯通孔具有被调节成培养液340透过而活体组织320及附着部件310、311无法透过的大小。注入到阻隔膜360下部的培养液340内部的活体组织320的平均比重比培养液340小的情况下被阻隔膜360阻隔而聚集在阻隔膜360下侧附近，并非浮在培养液340的水面上。注入到阻隔膜360下部的培养液340内部的附着部件310、311中平均比重比培养液340小的附着部件311被阻隔膜360阻隔而不浮在培养液340的水面上，而是聚集在阻隔膜360的下侧附近。当活体组织320的平均比重比附着部件311小的情况下，附着部件311聚集在活体组织320所聚集层的下侧。因此活体组织320与附着部件311邻接或重叠形成层，因此与附着部件311接触的可能性大幅增大，附着于附着部件311的可能性大幅增大。其结果，基质细胞从附着于附着部件311的活体组织320通过自发迁移移动到活体组织320的外部的可能性大幅增大。
并且，阻隔膜在附着部件通过培养液的紊流进行紊流运动时阻隔附着部件向培养液上部脱离，以阻隔在附着部件上移动到活体组织的外部的基质细胞脱离到培养液外部。
容器可具有形成于离心力最大的位置通过离心力收敛从活体组织分离的基质细胞的收敛部。能够以此收敛从活体组织分离的基质细胞轻易地排出到外部。
如例示性地示于图6，收敛部354a、354b具有排列于收容空间351的上部边缘位置中离心力最大的位置的第一收敛部354a、排列于收容空间351的上部边缘位置中与第一收敛部354a对称且离心力最大的位置的第二收敛部354b。第一收敛部354a及第二收敛部354b分别具有能够收容与培养液340一起收敛的基质细胞的空间。由于这种第一收敛部354a及第二收敛部354b排列在离心力最大的位置，因此通过容器350旋转进行离心分离时诱导从活体组织320分离而分布在培养液340的基质细胞与培养液340一起收敛。收敛部不限于例示性地示于图6的情况，可以由一个或三个以上的收敛部构成。
容器还可以具有在收容空间位于到收敛部的路径上允许基质细胞通过离心力移动且阻止活体组织及附着部件移动的过滤器。可以以此调节使得分布有基质细胞的培养液收敛到收敛部，而活体组织与附着部件不收敛。
如例示性地示于图6，过滤器370a、370b具有在收容空间351位于到第一收敛部354a的路径上的第一过滤器370a、在收容空间351位于到第二收敛部354b的路径上的第一过滤器370b。第一过滤器370a位于第一收敛部354a的入口，第二过滤器370b位于第二收敛部354b的入口。第一过滤器370a及第二过滤器370b形成有多个贯通孔，这种贯通孔具有被调节成分布有基质细胞的培养液340贯通而活体组织320与附着部件310、311无法贯通的大小。从而第一过滤器370a及第二过滤器370b允许分布有基质细胞的培养液340的移动且阻隔活体组织320与附着部件310、320移动使得除活体组织320与附着部件310、311以外的分布有基质细胞的培养液340收敛到第一收敛部354a及第二收敛部354b。过滤器不限于例示性地示于图6的情况，在收容空间可排列在到收敛部的路径上的多种位置。
容器还可以具有形成于收敛部以向外部排出收敛于收敛部的基质细胞的基质细胞排出部。从而能够轻易地向外部排出收敛于收敛部的基质细胞。
如例示性地示于图6，基质细胞排出部355a、355b具有形成于第一收敛部354a向外部排出收敛于第一收敛部354a的基质细胞的第一基质细胞排出部355a、形成于第二收敛部354b向外部排出收敛于第二收敛部354b的基质细胞的第二基质细胞排出部355b。第一基质细胞排出部355a将收敛于第一收敛部354a的分布有基质细胞的培养液340排出到外部，第二基质细胞排出部355b将收敛于第二收敛部354b的分布有基质细胞的培养液340排出到外部。第一基质细胞排出部355a及第二基质细胞排出部355b可以由连接在形成于第一收敛部354a及第二收敛部354b的排出口的管构成。基质细胞排出部不限于例示性地示于图6的情况，可以构成为形成于收敛部能够将收敛于收敛部的基质细胞排出到外部的多种构成。
容器还可以具有从外部延伸到收容空间注入或排出培养液的培养液贯通管。从而能够轻易地向收容空间注入或排出培养液。
如例示性地示于图6，培养液贯通管380具有从外部贯通盖353伸入收容空间351内部的管。培养液贯通管380可依次贯通盖353及阻隔膜360的中央部分延伸至收容空间351的中央底面附近。培养液贯通管380贯通的盖353的中央部分排列有橡胶材质的密封部件390，从而能够牢固地密闭培养液贯通管380贯通的收容空间351的中央部分。采用培养液贯通管380的情况下无需打开盖353也能够从外部向收容空间351轻易地注入或排出培养液，从而能够每当需要时轻易地注入或更换培养液。培养液贯通管不限于例示性地示于图6的情况，可以构成为能够从外部向收容空间延伸注入或排出培养液的多种构成。
容器还可以具有注入用于内部消毒的气体的气体注入部。从而能够轻易地进行容器内部消毒。
3.实施例
根据本发明的一个实施例的不使用酶地从活体组织分离基质细胞的方法，包括(1)将活体组织切断成细微的步骤；(2)在培养液内将切断成细微的活体组织附着在该活体组织能够附着的材料的附着部件上的步骤；(3)诱导在附着部件上基质细胞的自发迁移以将基质细胞移动到活体组织的外部的步骤；(4)从活体组织分离移动到活体组织的外部的基质细胞的步骤；以及(5)收集从活体组织分离的基质细胞的步骤。
(1)将活体组织切断成细微的步骤是指细微地切断成基质细胞的至少一部分从活体组织中包围基质细胞的胶原之间向外部露出。可利用激光等实现这种活体组织的切断。通过如上将活体组织细微地切断成基质细胞的至少一部分从包围基质细胞的胶原之间向外部露出，能够有效地基质细胞诱导在活体组织自发迁移。
(2)在培养液内将细微地切断的活体组织附着在该活体组织能够附着的材料的附着部件上的步骤如例示性地示于图6，在放入了活体组织、培养液及附着部件的容器内进行。
首先，准备具有收容活体组织320与培养液340及附着部件310、311的收容空间351的容器350。从容器350分离容器350的盖353及阻隔膜360后将提前准备的细微地切断的活体组织320及活体组织320能够附着的材料的附着部件310、311放置在收容空间351。之后将盖353及阻隔膜360结合到容器350之后，通过依次贯通盖353及阻隔膜360的中央部延伸至收容空间351的培养液贯通管380注入基质细胞能够生存的培养液340。在此注入培养液340至培养液340的水面位于比阻隔膜360更高的位置。
如上将活体组织320与附着部件310、311放置在容器350的收容空间351的状态下注入培养液340的情况下，平均比重比培养液340小的活体组织320与附着部件311向培养液340的水面侧上升，在阻隔膜360下侧面及其附近构成层排列。在此，平均比重比附着部件311小的活体组织320位于附着部件311的上层，附着部件311位于活体组织320的下层。该情况下活体组织320排列的层与附着部件311排列的层部分重叠或邻接，活体组织320与附着部件311接触的区域大幅扩大。平均比重比培养液340大的附着部件310排列在位于培养液340的下侧的收容空间351的底面及其附近。平均比重比培养液340大的附着部件310的一部分可排列在阻隔膜360的上侧面。培养液340与活体组织320及附着部件311如上排列的状态下随着时间的经过，活体组织320附着于附着部件311。
(3)诱导在附着部件上基质细胞的自发迁移以将基质细胞移动到活体组织的外部的步骤如例示性地示于图6，是指使得在附着有活体组织320的附着部件311上活体组织320内的基质细胞通过自发迁移移动到活体组织320的外部。
活体组织320内的基质细胞通过自发迁移移动到活体组织320的外侧面或附着部件311的表面或培养液340内部。这种基质细胞由于通过附着于附着部件311上的活体组织320的胶原之间向外部露出的基质细胞而活跃地移动。
(4)从活体组织分离移动到活体组织的外部的基质细胞的步骤如例示性地示于图6，表示从活体组织320分离在附着有活体组织320的附着部件311上通过活体组织320内的基质细胞的自发迁移移动到活体组织320的外部的基质细胞以移动到培养液340内。
从活体组织320分离移动到活体组织320的外部的基质细胞使得移动到培养液340内如例示性地示于图6，通过交替反复容器350的正旋转与逆旋转对移动到活体组织320的外部的基质细胞施加从活体组织320分离的物理力实现。交替容器350的正向旋转与逆旋转的情况下培养液340发生紊流，因此浸在培养液340的附着部件311进行紊流运动，因此在附着部件311上移动到活体组织320的外部的基质细胞受到使得从活体组织320分离的物理性的力。
并且，通过多个附着部件311的紊流运动使得附着部件311彼此碰撞的情况下，形成于附着部件311的刮削部(参见图5)从其他附着部件311上刮削(scraping)移动到活体组织320的外部的基质细胞，从而能够更促进基质细胞从活体组织320分离到培养液340内部。
进一步地，通过多个附着部件311的紊流运动使得附着部件311与容器350的倾斜部352的内侧面、平均比重比培养液340更大而进行紊流运动的附着部件310、培养液贯通管380的外侧面或阻隔膜360的下侧面接触及碰撞，促进在附着部件311上移动到活体组织320的外部的基质细胞从活体组织320分离到培养液340内部。
(5)收集从活体组织分离的基质细胞的步骤是将从活体组织分离到培养液内部的基质细胞和活体组织及附着部件分离开进行收集，如例示性地示于图7及图8，由(a)通过离心分离将从活体组织320分离到培养液340内部的基质细胞330收敛于收敛部354a、354b的步骤、(b)向外部排出收敛于收敛部354a、354b的基质细胞330的步骤构成。
(a)通过离心分离将从活体组织320分离到培养液340内部的基质细胞330收敛于收敛部354a、354b的步骤如例示性地示于图7，是向正旋转或逆旋转中的一方向旋转包括从活体组织320分离到培养液340的基质细胞330的容器350以对基质细胞330施加离心力，将基质细胞330收敛于排列在彼此对称的位置的离心力作用最大的第一收敛部354a及第二收敛部354b。
随着容器350向一个方向旋转，培养液340及活体组织320甚至附着部件310、311都通过离心力向第一收敛部354a及第二收敛部354b移动。在此，培养液340和基质细胞320一起分别透过排列于第一收敛部354a的入口的第一过滤器370a及排列于第二收敛部354b的入口的第二过滤器370b分别收敛于第一收敛部354a及第二收敛部354b。但是活体组织320与附着部件310、311均无法透过排列于第一收敛部354a的入口的第一过滤器370a及排列于第二收敛部354b的入口的第二过滤器370b，因此无法收敛于第一收敛部354a及第二收敛部354b中任何位置。这是因为第一过滤器370a及第二过滤器370b的贯通孔的大小均被调节成培养液340与基质细胞320透过而活体组织320与附着部件310、311无法透过。
如上，第一收敛部354a及第二收敛部354b分别只被收敛培养液340及基质细胞320。
(b)向外部排出收敛于收敛部354a、354b的基质细胞330的步骤如例示性地示于图8，是指向外部排出分别收敛于第一收敛部354a及第二收敛部354b的培养液340与基质细胞320。
通过容器350的单方向旋转以在第一收敛部354a及第二收敛部354b只收敛了培养液340与基质细胞320的情况下，使容器350停止旋转。之后通过形成于第一收敛部354a的第一基质细胞排出部355a向外部排出收敛于第一收敛部354a的培养液340与基质细胞330，通过形成于第二收敛部354b的第二基质细胞排出部355b向外部排出收敛于第二收敛部354b的培养液340与基质细胞330。
通过以上过程最终收集从活体组织320分离的基质细胞330。
能够通过连续执行以上(1)至(5)的步骤从活体组织连续分离基质细胞，因此能够提高分离效率。
以上(2)至(5)的步骤可按顺序重复执行。从而能够反复收集容器350的收容空间351内存在的同一附着部件310、311或残留于活体组织320或培养液340的基质细胞330，因此能够提高基质细胞的收率。
可在以上(2)至(4)的步骤中更换活体组织320、培养液340及附着部件310、311中至少任意一个后可按顺序重复执行以上(2)至(5)的步骤。因此能够更换存在于容器350的收容空间351内的活体组织320、培养液340及附着部件310、311中至少任意一个反复收集基质细胞330，从而能够大幅提高收率。
工业应用性
本发明可用于不使用酶地从活体组织分离基质细胞的方法及装置。

Claims (29)

1.一种不使用酶地从活体组织分离基质细胞的方法，其特征在于：
利用诱导活体组织的基质细胞的自发迁移(spontaneous migration)将基质细胞移动到活体组织的外部的方式，基质细胞的自发迁移的诱导在活体组织附着于能够附着活体组织的材料的附着部件上的状态下进行，基质细胞的自发迁移的诱导在基质细胞能够生存的培养液内进行。
2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，还包括：
微细地切断活体组织使得基质细胞的至少一部分从活体组织中包围基质细胞的胶原之间向外部露出。
3.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，还包括：
从活体组织分离移动到附着部件的外部的基质细胞，
基质细胞的分离通过向附着于附着部件的基质细胞施加物理性的力实现。
4.根据权利要求3所述的方法，其特征在于：
施加于移动到活体组织的外部的基质细胞的物理性的力是使在培养液内移动到活体组织的外部的基质细胞与培养液一起进行紊流运动发生的力。
5.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，还包括：
收集从活体组织分离的基质细胞。
6.一种不使用酶地从活体组织分离基质细胞的方法，其特征在于，包括：
(1)将活体组织切断成细微；
(2)将被切断成细微的活体组织在培养液内附着于该活体组织能够附着的材料的附着部件上；
(3)诱导在附着部件上基质细胞自发迁移使得基质细胞移动到活体组织的外部；以及
(4)从附着部件分离移动到活体组织的外部的基质细胞。
7.根据权利要求6所述的方法，其特征在于：
(1)的活体组织被细微地切断成基质细胞的至少一部分从该活体组织中包围基质细胞的胶原之间向外部露出。
8.根据权利要求6所述的方法，其特征在于：
使排列有移动到活体组织的外部的基质细胞的多个附着部件通过培养液的紊流运动相互碰撞以向基质细胞施加物理性的力实现(4)的基质细胞的分离。
9.根据权利要求6所述的方法，其特征在于，还包括：
(5)收集从活体组织分离的基质细胞。
10.根据权利要求6所述的方法，其特征在于：
按顺序重复执行(2)至(4)。
11.根据权利要求6所述的方法，其特征在于：
更换选自由活体组织、培养液及附着部件构成的群组的至少一种后按顺序重复执行(2)至(4)。
12.根据权利要求1至11中任一项所述的方法，其特征在于：
活体组织包括选自由皮肤、脂肪、软骨、粘膜、血管、韧带、心脏、脑、胎盘、脐带、羊膜、肌肉及末梢神经构成的群组的至少任意一种。
13.根据权利要求6至11中任一项所述的方法，其特征在于：
培养液包括选自DMEM(Dulbecco′s Modified Eagle′s Medium)及牛胎儿血清(fetalbovine serum)构成的群组的至少任意一种。
14.一种不使用酶地从活体组织分离基质细胞的装置，其特征在于，包括：
附着部件，其在培养液内附着活体组织诱导活体组织的基质细胞的自发迁移以将基质细胞移动到活体组织的外部，
其中，附着部件具有比培养液更小的平均比重或具有比培养液更大的平均比重。
15.根据权利要求14所述的装置，其特征在于：
附着部件的平均比重比培养液更小的情况下，该附着部件包括选自由聚丙烯(polypropylene)、聚乙烯(polyethylene)、聚氨酯(polyurethane)、细胞外基质(Extracellular Matrix，ECM)、胶原(collagen)、聚二恶烷酮(polydioxanone)、聚己内酯(polycaprolactone)、聚L-丙交酯(poly(L-lactide)，PLLA)、聚乳酸-羟基乙酸(poly(lactic-co-glycolic acid)，PLGA)、聚乳酸(poly(lactic acid)，PLA)、蝶酰谷氨酸(pterolyglutamic acid，PGA)、透明质酸(hyaluronic acid)及硅胶构成的群组的至少任意一种。
16.根据权利要求14所述的装置，其特征在于：
附着部件的平均比重比培养液更大的情况下，该附着部件包括选自由聚四氟乙烯(teflon)、聚碳酸酯(polycarbonate)、聚乙烯(polyethylene)、邻苯二甲酸酯(phthalate)、聚苯乙烯(polystyrene)、聚氨酯(polyurethane)、细胞外基质(Extracellular Matrix，ECM)、胶原(collagen)、聚二恶烷酮(polydioxanone)、聚己内酯(polycaprolactone)、聚L-乳酸(poly(L-lactide)，PLLA)、聚乳酸羟基乙酸(poly(lactic-co-glycolic acid)，PLGA)、聚乳酸(poly(lacticacid)，PLA)、蝶酰谷氨酸(pterolyglutamic acid，PGA)、透明质酸(hyaluronic acid)及硅胶构成的群组的至少任意一种。
17.根据权利要求14所述的装置，其特征在于：
附着部件附着被细微地切断成基质细胞的至少一部分从活体组织中包围基质细胞的胶原之间露出的活体组织。
18.根据权利要求14所述的装置，其特征在于：
附着部件在培养液内附着活体组织诱导活体组织的基质细胞的自发迁移以将基质细胞移动到活体组织的外部，而且从活体组织分离如上移动的基质细胞。
19.根据权利要求18所述的装置，其特征在于，附着部件包括：
本体，其构成通过自发迁移移动到活体组织的外部的基质细胞排列的区域；以及
刮削部，其具有从本体向外侧延伸且厚度比本体的厚度更薄，能够刮削(scraping)排列于其他附着部件的基质细胞的形状。
20.根据权利要求19所述的装置，其特征在于：
刮削部的横截面的角部形成的角度构成锐角。
21.根据权利要求14所述的装置，其特征在于，还包括：
容器，其内部收容培养液与活体组织及附着部件。
22.根据权利要求21所述的装置，其特征在于：
容器具有形成收容培养液与活体组织及附着部件的空间且形成为能够通过旋转进行离心分离的倾斜部。
23.根据权利要求21所述的装置，其特征在于：
容器能够通过正旋转与逆向旋转诱导培养液的紊流。
24.根据权利要求21所述的装置，其特征在于，容器还包括：
阻隔膜，其使得活体组织无法透过而培养液能够透过，在容器静止的状态下排列在浸在培养液的位置防止浮到培养液的活体组织浮于培养液。
25.根据权利要求21所述的装置，其特征在于，容器包括：
收敛部，其形成于离心力最大的位置，通过离心力收敛从活体组织分离的基质细胞。
26.根据权利要求25所述的装置，其特征在于，容器还包括：
过滤器，其在收容空间位于到收敛部的路径上允许基质细胞通过离心力移动，阻隔活体组织及附着部件的移动。
27.根据权利要求25所述的装置，其特征在于，容器还包括：
基质细胞排出部，其形成于收敛部以向外部排出收敛于收敛部的基质细胞。
28.根据权利要求21所述的装置，其特征在于，容器还包括：
培养液贯通管，其从外部延伸到收容空间以注入或排出培养液。
29.根据权利要求21所述的装置，其特征在于，容器还包括：
气体注入部，其注入用于内部消毒的气体。
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Families Citing this family (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
KR102454663B1 (ko) 2020-08-25 2022-10-14 메디칸 주식회사 세포 배양 및 분리 효율을 향상시킨 세포 배양 및 분리 장치와 이를 이용한 세포 배양 및 분리 방법

Citations (8)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
WO2006131722A1 (en) * 2005-06-09 2006-12-14 Smith & Nephew, Plc Stem cells and isolation method
CN102497896A (zh) * 2009-07-16 2012-06-13 巴奥米特生物公司 用于分离生物材料的方法和装置
KR20130073717A (ko) * 2011-12-23 2013-07-03 메디칸(주) 생물학적 시료로부터 생체세포를 배양, 분리 및 저장하는 방법
CN103476924A (zh) * 2011-04-15 2013-12-25 普拉里斯坦有限公司 收获细胞的方法和***
US20140193375A1 (en) * 2011-05-18 2014-07-10 Aastrom Biosciences, Inc. Mesenchymal Stromal Cell Populations and Methods of Making Same
CN104039951A (zh) * 2011-09-19 2014-09-10 居里研究所 用于引导细胞迁移的装置和实施这种装置的引导方法
CN104480062A (zh) * 2014-12-30 2015-04-01 广东海洋大学 一种人乳腺组织不同细胞组分的分离与培养方法
TW201512395A (zh) * 2013-09-24 2015-04-01 Buddhist Tzu Chi Medical Foundation 體外快速切碎脂肪組織以分離活細胞之方法

Family Cites Families (12)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US4994388A (en) * 1988-04-15 1991-02-19 Solohill Engineering, Inc. Collagen-coated polystyrene microcarrier beads
US7514075B2 (en) * 2001-12-07 2009-04-07 Cytori Therapeutics, Inc. Systems and methods for separating and concentrating adipose derived stem cells from tissue
CA2532754A1 (en) * 2003-07-17 2005-02-03 Global Cell Solutions, Llc Automated cell culture system and process
KR100842378B1 (ko) 2007-04-27 2008-07-01 양현진 비중을 증가시킨 세포 배양용 지지체 및 그 제조방법
JP2014082956A (ja) * 2012-10-19 2014-05-12 Somar Corp 細胞培養基材、およびそれを用いた細胞培養方法並びに多能性幹細胞の分化誘導方法
AU2014211236B2 (en) 2013-02-01 2019-05-02 Meiji Seika Pharma Co., Ltd. Method for separating cell from biological tissue
EP2956186B1 (en) * 2013-02-18 2018-09-26 Terumo BCT, Inc. Separating composite liquids
EP2983728B1 (en) * 2013-04-10 2018-06-06 Agency For Science, Technology And Research Polycaprolactone microcarriers for stem cell culture and fabrication thereof
US20170166853A1 (en) 2014-02-12 2017-06-15 Kristian EKEROTH Dividable surfaces for cell culturing
EP3193889A4 (en) * 2014-09-19 2018-05-09 Philip J. Simpson Stromal vascular fraction processing devices and methods
KR101750790B1 (ko) 2015-04-06 2017-06-27 메디칸(주) 배양세포의 세포간 분리방법
KR101799653B1 (ko) 2015-12-18 2017-11-21 단국대학교 천안캠퍼스 산학협력단 세포배양을 위한 부착기질 및 이의 제조방법

Patent Citations (8)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
WO2006131722A1 (en) * 2005-06-09 2006-12-14 Smith & Nephew, Plc Stem cells and isolation method
CN102497896A (zh) * 2009-07-16 2012-06-13 巴奥米特生物公司 用于分离生物材料的方法和装置
CN103476924A (zh) * 2011-04-15 2013-12-25 普拉里斯坦有限公司 收获细胞的方法和***
US20140193375A1 (en) * 2011-05-18 2014-07-10 Aastrom Biosciences, Inc. Mesenchymal Stromal Cell Populations and Methods of Making Same
CN104039951A (zh) * 2011-09-19 2014-09-10 居里研究所 用于引导细胞迁移的装置和实施这种装置的引导方法
KR20130073717A (ko) * 2011-12-23 2013-07-03 메디칸(주) 생물학적 시료로부터 생체세포를 배양, 분리 및 저장하는 방법
TW201512395A (zh) * 2013-09-24 2015-04-01 Buddhist Tzu Chi Medical Foundation 體外快速切碎脂肪組織以分離活細胞之方法
CN104480062A (zh) * 2014-12-30 2015-04-01 广东海洋大学 一种人乳腺组织不同细胞组分的分离与培养方法

Non-Patent Citations (4)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
CHA, KYOUNG JE ET AL: "Cell density-dependent differential proliferation of neural stem cells on omnidirectional nanopore-arrayed surface", 《SCIENTIFIC REPORTS》, vol. 7, 12 October 2017 (2017-10-12), pages 1 - 14 *
夏洁云 等: "小鼠原代胸腺上皮细胞分离方法的比较与优化", 《徐州医科大学学报》, vol. 37, no. 5, 31 May 2017 (2017-05-31), pages 298 - 303 *
李晓娜: "机械拉伸对大鼠骨髓间充质干细胞迁移行为的调节及其相关分子机理研究", 《中国优秀硕士学位论文全文数据库（医药卫生科技辑）》, no. 03, 15 March 2013 (2013-03-15), pages 059 - 34 *
满馨遥: "生物材料特性及微环境对间充质干细胞向心肌细胞分化的作用研究", 《中国优秀硕士论文全文数据库（医药卫生科技辑）》, no. 03, 15 March 2017 (2017-03-15), pages 080 - 68 *

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