CN111024949A - 一种重组抗vegfr2单克隆抗体的生物活性分析方法及其应用 - Google Patents
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Abstract
本发明涉及一种重组抗VEGFR2单克隆抗体的生物活性分析方法及其应用，所述生物活性分析方法包括：将重组抗VEGFR2单克隆抗体与人脐静脉内皮细胞和VEGF试剂进行共培养，然后加入CCK8显色液继续培养，读取吸光值，根据重组抗VEGFR2单克隆抗体浓度与吸光值的量效关系进行4‑参数拟合，根据曲线拟合的EC50值进行生物活性评价。该方法是一种专门针对于重组抗VEGFR2单克隆抗体的生物活性分析方法，灵敏度高、准确度高，且适用范围广，对不同效价水平的重组抗VEGFR2单克隆抗体均能进行检测，对重组抗VEGFR2单克隆抗体的中间体、原液或成品的生物活性均能进行检测。
Description
技术领域
本发明属于生物分析技术领域，具体涉及一种单克隆抗体的生物活性分析方法及其应用，尤其涉及一种重组抗VEGFR2单克隆抗体的生物活性分析方法及其应用。
背景技术
VEGFR2在肿瘤相关的内皮细胞上高表达。当VEGF与肿瘤细胞相关内皮细胞上的VEGFR2结合后启动信号级联反应，引起内皮细胞增殖和转移，血管壁通透性增加，将导致血管生成，为肿瘤发生、发展提供足够的氧分和营养。抗VEGFR2重组全人化单克隆抗体能够特异性阻断血管内皮生长因子受体2(VEGFR-2)与其配体VEGF的相互作用，抑制VEGFR2的激活以及下游信号传导途径，阻断肿瘤血管的生成，从而阻断对肿瘤细胞的血液供应，抑制肿瘤细胞的增殖，进而导致肿瘤细胞凋亡。Cyramza是由美国礼来开发的全球首个靶向VEGFR2(血管内皮生长因子受体2)的全人源化单克隆抗体药物，通过抑制肿瘤血管生成达到抑制肿瘤的目的，于2014年在美国、日本和欧盟批准上市，是目前唯一一个无需筛选患者的治疗胃癌二线靶向药物，被推荐为胃癌二线首选药物，此外还可用于结直肠癌、非小细胞肺癌的治疗。
重组抗VEGFR2单克隆抗体的应用价值巨大，对其的相关研究必然涉及到对其的生物学活性评价，目前还没有一种专门针对其的生物活性分析方法，因此，完成对重组抗VEGFR2单克隆抗体的生物学细胞活性方法开发是非常有意义的。
发明内容
针对现有技术的不足，本发明的目的在于提供一种单克隆抗体的生物活性分析方法及其应用，尤其提供一种重组抗VEGFR2单克隆抗体的生物活性分析方法及其应用。
为达到此发明目的，本发明采用以下技术方案：
一方面，本发明提供一种重组抗VEGFR2单克隆抗体的生物活性分析方法，所述生物活性分析方法包括：将重组抗VEGFR2单克隆抗体与人脐静脉内皮细胞和VEGF试剂进行共培养，然后加入CCK8显色液继续培养，读取吸光值，根据重组抗VEGFR2单克隆抗体浓度与吸光值的量效关系进行4-参数拟合，根据曲线拟合的EC50值进行生物活性评价。
本发明所涉及的生物活性分析方法是一种专门针对于重组抗VEGFR2单克隆抗体的生物活性分析方法，该方法灵敏度高、准确度高，且适用范围广，对不同效价水平的重组抗VEGFR2单克隆抗体均能进行检测，对重组抗VEGFR2单克隆抗体的中间体、原液或成品的生物活性均能进行检测。
优选地，所述进行共培养时，人脐静脉内皮细胞的活细胞密度为0.5×105-1×105细胞/mL，例如0.5×105细胞/mL、0.55×105细胞/mL、0.6×105细胞/mL、0.65×105细胞/mL、0.7×105细胞/mL、0.75×105细胞/mL、0.8×105细胞/mL、0.85×105细胞/mL或1×105细胞/mL等，范围内的其他具有点值均可选择，在此便不一一赘述。优选0.5×105细胞/mL。
所述进行共培养时，人脐静脉内皮细胞的活细胞密度特定选择在0.5×105-1×105细胞/mL范围内，因为不同的细胞铺板密度对4-参数拟合曲线的信号值及拟合情况会造成影响，细胞密度不够或者太多都有可能造成信号值偏低，药物敏感性下降；若超过此浓度，拟合曲线的上下平台的区间变小，可能由于细胞过多不利于充分与药物相互作用，导致对药物作用敏感性下降所致。
优选地，所述进行共培养时，VEGF试剂的浓度为0.2-2μg/mL，例如0.2μg/mL、0.5μg/mL、0.8μg/mL、1μg/mL、1.2μg/mL、1.5μg/mL或2μg/mL等，范围内的其他具体点值均可选择，在此便不一一赘述。优选0.5μg/mL。
所述进行共培养时，VEGF试剂的浓度特定选择为0.2-2μg/mL范围内，因为不同的VEGF浓度对4-参数拟合曲线的信号值及拟合情况会造成影响，VEGF浓度不够或者太多都有可能造成信号值偏低，药物敏感性下降；再升高浓度，信号值基本不变，上下平台的区间也基本稳定。
优选地，所述共培养的时间为60-70h，例如60h、61h、62h、65h、66h、67h、68h或70h等，范围内的其他具体点值均可选择，在此便不一一赘述。
所述共培养的时间特定选择在60-70h范围内，是因为增殖抑制信号的区间需要足够长的时间才能表现出来，超过此时间范围会浪费时间，增加检测工作的时间成本，小于此时间范围会使得增殖抑制信号的区间较小，不利于方法的精密度和准确度。
优选地，所述共培养的温度为35-39℃，例如35℃、36℃、37℃、38℃或39℃等，范围内的其他具体点值均可选择，在此便不一一赘述。
优选地，所述加入CCK8显色液继续培养的时间为3.5-4h，例如3.5h、3.6h、3.7h、3.8h、3.9h或4h等，范围内的其他具体点值均可选择，在此便不一一赘述。
所述加入CCK8显色液继续培养的时间特定选择为3.5-4h，是因为显色时间较短则不足以检测到足够的增殖抑制信号区间，若超过此时间范围会浪费时间，增加检测工作的时间成本，若小于此时间范围会使得增殖抑制信号的区间较小，不利于方法的精密度和准确度。
优选地，所述加入CCK8显色液继续培养的温度为35-39℃，例如35℃、36℃、37℃、38℃或39℃等，范围内的其他具体点值均可选择，在此便不一一赘述。
优选地，所述读取吸光值是使用酶标仪读取，检测波长450nm，参比波长620nm。
作为本发明的优选技术方案，所述重组抗VEGFR2单克隆抗体的生物活性分析方法具体包括如下步骤：
(1)将对数生长期的人脐静脉内皮细胞进行消化并制成单细胞悬液，用ECM完全培养基调整其活细胞密度，于35-39℃下培养5-7h，弃上清，换用0.1％FBS的ECM培养基继续培养12-18h；
(2)向步骤(1)孵育后的细胞中分别加入不同浓度的重组抗VEGFR2单克隆抗体溶液，于35-39℃下培养1.5-2.5h；
(3)向步骤(2)处理后的样品中加入VEGF试剂，于35-39℃下培养60-70h；
(4)向步骤(3)处理后的样品中加入CCK8显色液继续培养3.5-4h，用酶标仪读取吸光值，检测波长450nm，参比波长620nm，根据重组抗VEGFR2单克隆抗体浓度与吸光值的量效关系进行4-参数拟合，根据曲线拟合的EC50值进行生物活性评价。
上述步骤(1)示例性地可以具体为：取对数生长期的人脐静脉内皮细胞，按照细胞传代培养流程进行细胞消化，用ECM完全培养基将经过消化的细胞洗脱下来离心，接着用ECM完全培养基将细胞重悬制成人脐静脉内皮单细胞悬液，混匀，进行细胞计数，确定活细胞数及细胞活率。接着用ECM完全培养基调整活细胞密度至0.5×105细胞/mL，以100μL/孔加入96孔细胞培养板中。将96孔细胞培养板置于恒温培养箱中培养。弃掉上清，以100μL/孔加入0.1％FBS的ECM分析培养基，周边以PBS封边，于恒温培养箱中培养过夜。
上述步骤(2)中不同浓度的重组抗VEGFR2单克隆抗体溶液是指重组抗VEGFR2单克隆抗体的终浓度分别为300μg/mL，20μg/mL，2.5μg/mL，0.75μg/mL，0.2μg/mL，0.04μg/mL，0.001μg/mL这7个浓度，采用7个浓度点标准曲线，保证曲线线性段拟合完整，能够最大程度的利用1块96孔板用于样品检测。
另一方面，本发明提供一种如上所述的重组抗VEGFR2单克隆抗体的生物活性分析方法在检测重组抗VEGFR2单克隆抗体的中间体、原液或成品的生物活性中的应用。
相对于现有技术，本发明具有以下有益效果：
本发明所涉及的生物活性分析方法是一种专门针对于重组抗VEGFR2单克隆抗体的生物活性分析方法，该方法灵敏度高、准确度高，且适用范围广，对不同效价水平的重组抗VEGFR2单克隆抗体均能进行检测，对重组抗VEGFR2单克隆抗体的中间体、原液或成品的生物活性均能进行检测。
附图说明
图1是实施例2、实施例6-8的拟合曲线图；
图2是实施例1、实施例3-5的拟合曲线图。
具体实施方式
下面通过具体实施方式来进一步说明本发明的技术方案。本领域技术人员应该明了，所述实施例仅仅是帮助理解本发明，不应视为对本发明的具体限制。
以下实施例所涉及的关键试剂及耗材如表1所示：
表1
以下实施例所涉及的仪器设备如表2所示：
表2
| 仪器设备名称 | 型号 | 生产厂家 | 仪器编号 |
| 酶标仪 | SpectraMax | MD | MV-C-MPR-002 |
| 生物生物安全柜 | 1374/1379 | Thermo | MV-C-BSC-001 |
| 二氧化碳培养箱 | 311 | Thermo | MV-B-CDI-002 |
| 细胞计数仪 | Cedex HiRes | Roche | MV-C-CVA-009 |
| 生物洁净工作台 | BCM-1300A | Airtech | MV-C-BCB-009 |
| 离心机 | 5810R | Eppendorf | MV-B-CTF-011 |
以下实施例所涉及的实验试剂如下所示：
(1)完全培养基：ECM完全培养基
将ECM培养基套组中的25mLFBS，5mL P/S和5mL ECGS加入到500mL ECM-基础培养基，混匀，制成ECM完全培养基。贴标签，2-8℃保存，有效期1个月，并不得超过所用任何试剂有效期。
(2)ECM分析培养基
取500mL ECM-基础培养基，加入5mL P/S，配成ECM分析培养基。
(3)含0.1％FBS的ECM分析培养基
ECM分析培养基中加入0.1％的FBS制成含0.1％FBS的ECM分析培养基，现用现配。
(4)样品稀释液
ECM分析培养基中加入2％的FBS制成样品稀释液。现用现配。
以下实施例所使用的人脐静脉内皮细胞需首先经过细胞传代培养，具体操作为：将细胞培养瓶置于生物安全柜内，轻轻吸出培养基并加入10mL PBS洗去细胞表面残余培养基，弃除PBS之后加入1-2mL胰蛋白酶，保证胰蛋白酶可以覆盖瓶底细胞层，37℃静置消化1-2min，待细胞消化完全(显微镜下观察，此时细胞形态变圆，离壁)，加入10mL ECM完全培养基将经过消化的HUVEC细胞洗脱下来，1000rpm室温离心5min，弃上清，接着加入5-20mL ECM完全培养基将细胞重悬，制成HUVEC单细胞悬液。取0.3mL细胞悬液进行细胞计数，接种适当数目的细胞于T75细胞培养瓶中，将细胞培养瓶放置在二氧化碳培养箱，37℃、5％CO2培养。
实施例1
本实施例提供一种重组抗VEGFR2单克隆抗体的生物活性分析方法，包括如下步骤：
(1)取对数生长期的HUVEC细胞，按照细胞传代培养流程进行细胞消化，用ECM完全培养基将经过消化的细胞洗脱下来离心，接着用ECM完全培养基将细胞重悬制成HUVEC单细胞悬液，混匀，取0.3mL进行细胞计数，平行操作2次。根据2次细胞计数的均值来确定活细胞数及细胞活率。接着用ECM完全培养基调整活细胞密度至0.5×105细胞/mL，以100μL/孔加入96孔细胞培养板中。将96孔细胞培养板置于37℃，5％CO2恒温培养箱中培养6h。弃掉上清，以100μL/孔加入0.1％FBS的ECM分析培养基，周边以PBS封边，于37℃，5％CO2恒温培养箱中培养过夜，去上清；
(2)将已稀释完成的各个浓度的Cyramza待测品用多道移液器以50μL/孔加入至96孔细胞培养板所对应的细胞孔中(使其终浓度分别为300μg/mL，20μg/mL，2.5μg/mL，0.75μg/mL，0.2μg/mL，0.04μg/mL，0.001μg/mL)。完成加样操作后，将96孔细胞培养板置于37℃，5％CO2恒温培养箱中培养2h。将VEGF165用样品稀释液稀释至1μg/mL，用多道移液器以50μl/孔加入到板所对应的孔中，37℃，5％CO2恒温培养箱中培养65h；
(3)将CCK8试剂以20μL/孔加入96孔细胞培养板中，37℃、5％CO2恒温培养箱中培养3.8h；
(4)数据拟合：利用酶标仪读取吸光值，检测波长450nm，参比波长620nm。根据待测样品浓度和吸光值的量效关系进行4-参数拟合，根据样品曲线拟合的EC50值进行样品的生物学细胞活性评价。
实施例2
本实施例提供一种重组抗VEGFR2单克隆抗体的生物活性分析方法，包括如下步骤：
(1)取对数生长期的HUVEC细胞，按照细胞传代培养流程进行细胞消化，用ECM完全培养基将经过消化的细胞洗脱下来离心，接着用ECM完全培养基将细胞重悬制成HUVEC单细胞悬液，混匀，取0.3mL进行细胞计数，平行操作2次。根据2次细胞计数的均值来确定活细胞数及细胞活率。接着用ECM完全培养基调整活细胞密度至1×105细胞/mL，以100μL/孔加入96孔细胞培养板中。将96孔细胞培养板置于37℃，5％CO2恒温培养箱中培养6h。弃掉上清，以100μL/孔加入0.1％FBS的ECM分析培养基，周边以PBS封边，于37℃，5％CO2恒温培养箱中培养过夜；
(2)将已稀释完成的各个浓度的Cyramza待测品用多道移液器以50μL/孔加入至96孔细胞培养板所对应的细胞孔中(使其终浓度分别为300μg/mL，20μg/mL，2.5μg/mL，0.75μg/mL，0.2μg/mL，0.04μg/mL，0.001μg/mL)。完成加样操作后，将96孔细胞培养板置于37℃，5％CO2恒温培养箱中培养1.5h。将VEGF165用样品稀释液稀释至1μg/mL，用多道移液器以50μl/孔加入到板所对应的孔中，37℃，5％CO2恒温培养箱中培养60h；
(3)将CCK8试剂以20μL/孔加入96孔细胞培养板中，37℃、5％CO2恒温培养箱中培养4h；
(4)数据拟合：利用酶标仪读取吸光值，检测波长450nm，参比波长620nm。根据待测样品浓度和吸光值的量效关系进行4-参数拟合，根据样品曲线拟合的EC50值进行样品的生物学细胞活性评价。
实施例3
本实施例提供一种重组抗VEGFR2单克隆抗体的生物活性分析方法，所述分析方法与实施例1的区别仅在于步骤(2)中将VEGF165用样品稀释液稀释至0.4μg/mL，其它均保持不变。
实施例4
本实施例提供一种重组抗VEGFR2单克隆抗体的生物活性分析方法，所述分析方法与实施例1的区别仅在于步骤(2)中将VEGF165用样品稀释液稀释至2μg/mL，其它均保持不变。
实施例5
本实施例提供一种重组抗VEGFR2单克隆抗体的生物活性分析方法，所述分析方法与实施例1的区别仅在于步骤(2)中将VEGF165用样品稀释液稀释至4μg/mL，其它均保持不变。
实施例6
本实施例提供一种重组抗VEGFR2单克隆抗体的生物活性分析方法，所述分析方法与实施例2的区别仅在于步骤(2)中将VEGF165用样品稀释液稀释至0.4μg/mL，其它均保持不变。
实施例7
本实施例提供一种重组抗VEGFR2单克隆抗体的生物活性分析方法，所述分析方法与实施例2的区别仅在于步骤(2)中将VEGF165用样品稀释液稀释至2μg/mL，其它均保持不变。
实施例8
本实施例提供一种重组抗VEGFR2单克隆抗体的生物活性分析方法，所述分析方法与实施例2的区别仅在于步骤(2)中将VEGF165用样品稀释液稀释至4μg/mL，其它均保持不变。
评价实验1：
实施例1-8的拟合结果如表3所示(表中A/D表示增殖抑制曲线的区间，B表示检测标准4-参数拟合曲线的斜率，EC50表示药物作用的半数有效浓度，R2表示曲线拟合的拟合度)：
表3
实施例1-8的拟合曲线如图1和图2所示。
由表3和图1-2可知：本发明所涉及的重组抗VEGFR2单克隆抗体的生物活性分析方法所得到的曲线拟合效果好，R2值均高于0.950，且信号值高，药物敏感度高。对比实施例1和实施例2，当细胞密度较高时，上下平台的区间变小，可能由于细胞过多不利于充分与药物相互作用，导致对药物作用敏感性下降所致；对比实施例3-5或实施例6-8，VEGF浓度的升高到0.5μg/mL后，再升高浓度，信号值基本不变，上下平台的区间也基本稳定。
评价实验2：
为了探究本发明所涉及的分析方法是否适用于不同效价水平的活性样品，将Cyramza待测品用样品稀释液(2％FBS分析培养基)稀释制备得到不同效价水平的活性样品(分别为50％、75％、100％、125％和150％活性效价水平的样品)，采用如实施例1所述的分析方法进行实验，考察检测结果回收率。结果如表4所示。
表4
由表4数据可知：本发明所涉及的重组抗VEGFR2单克隆抗体的生物活性分析方法回收率高，准确度高，且适用范围广，对不同效价水平的重组抗VEGFR2单克隆抗体均能进行检测。
申请人声明，本发明通过上述实施例来说明本发明的一种重组抗VEGFR2单克隆抗体的生物活性分析方法及其应用，但本发明并不局限于上述实施例，即不意味着本发明必须依赖上述实施例才能实施。所属技术领域的技术人员应该明了，对本发明的任何改进，对本发明产品各原料的等效替换及辅助成分的添加、具体方式的选择等，均落在本发明的保护范围和公开范围之内。
以上详细描述了本发明的优选实施方式，但是，本发明并不限于上述实施方式中的具体细节，在本发明的技术构思范围内，可以对本发明的技术方案进行多种简单变型，这些简单变型均属于本发明的保护范围。
另外需要说明的是，在上述具体实施方式中所描述的各个具体技术特征，在不矛盾的情况下，可以通过任何合适的方式进行组合，为了避免不必要的重复，本发明对各种可能的组合方式不再另行说明。
Claims (10)
1.一种重组抗VEGFR2单克隆抗体的生物活性分析方法，其特征在于，所述生物活性分析方法包括：将重组抗VEGFR2单克隆抗体与人脐静脉内皮细胞和VEGF试剂进行共培养，然后加入CCK8显色液继续培养，读取吸光值，根据重组抗VEGFR2单克隆抗体浓度与吸光值的量效关系进行4-参数拟合，根据曲线拟合的EC50值进行生物活性评价。
2.如权利要求1所述的重组抗VEGFR2单克隆抗体的生物活性分析方法，其特征在于，所述进行共培养时，人脐静脉内皮细胞的活细胞密度为0.5×105-1×105细胞/mL；优选0.5×105细胞/mL。
3.如权利要求1或2所述的重组抗VEGFR2单克隆抗体的生物活性分析方法，其特征在于，所述进行共培养时，VEGF试剂的浓度为0.2-2μg/mL；优选0.5μg/mL。
4.如权利要求1-3中任一项所述的重组抗VEGFR2单克隆抗体的生物活性分析方法，其特征在于，所述共培养的时间为60-70h。
5.如权利要求1-4中任一项所述的重组抗VEGFR2单克隆抗体的生物活性分析方法，其特征在于，所述共培养的温度为35-39℃。
6.如权利要求1-5中任一项所述的重组抗VEGFR2单克隆抗体的生物活性分析方法，其特征在于，所述加入CCK8显色液继续培养的时间为3.5-4h。
7.如权利要求1-6中任一项所述的重组抗VEGFR2单克隆抗体的生物活性分析方法，其特征在于，所述加入CCK8显色液继续培养的温度为35-39℃。
8.如权利要求1-7中任一项所述的重组抗VEGFR2单克隆抗体的生物活性分析方法，其特征在于，所述读取吸光值是使用酶标仪读取，检测波长450nm，参比波长620nm。
9.如权利要求1-8中任一项所述的重组抗VEGFR2单克隆抗体的生物活性分析方法，其特征在于，所述生物活性分析方法具体包括如下步骤：
(1)将对数生长期的人脐静脉内皮细胞进行消化并制成单细胞悬液，用ECM完全培养基调整其活细胞密度，于35-39℃下培养5-7h，弃上清，换用0.1％FBS的ECM培养基继续培养12-18h；
(2)向步骤(1)孵育后的细胞中加入重组抗VEGFR2单克隆抗体溶液，于35-39℃下培养1.5-2.5h；
(3)向步骤(2)处理后的样品中加入VEGF试剂，于35-39℃下培养60-70h；
(4)向步骤(3)处理后的样品中加入CCK8显色液继续培养3.5-4h，用酶标仪读取吸光值，检测波长450nm，参比波长620nm，根据重组抗VEGFR2单克隆抗体浓度与吸光值的量效关系进行4-参数拟合，根据曲线拟合的EC50值进行生物活性评价。
10.如权利要求1-9中任一项所述的重组抗VEGFR2单克隆抗体的生物活性分析方法在检测重组抗VEGFR2单克隆抗体的中间体、原液或成品的生物活性中的应用。
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