CN111019971A - 在rosa26位点条件性过表达hpv e6基因小鼠模型的构建方法 - Google Patents

在rosa26位点条件性过表达hpv e6基因小鼠模型的构建方法 Download PDF

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Abstract

本发明提供一种在ROSA26位点条件性过表达HPV E6基因小鼠模型的构建方法，包括步骤：根据HPV E6基因的序列，设计并获得sgRNA，制备Cas9/sgRNA混合物；构建打靶载体，显微共注射与F0代小鼠获得；F1代小鼠获得。本发明具有编辑效率与靶向性高、打靶容易，实验操作更加精准、高效的特点。

Description

在ROSA26位点条件性过表达HPV E6基因小鼠模型的构建方法
技术领域
本发明涉及一种在ROSA26位点条件性过表达HPV E6基因小鼠模型的构建方法，属于生物技术领域。
背景技术
***位居女性生殖道恶性肿瘤首位，是比较常见的癌症之一，极大威胁着妇女的健康。近年来我国***新发病例呈上升态势，且日趋年轻化。近年来，大量研究认为癌变是一个连续地过程，人***瘤病毒(HPV)感染与***的关系已得到证实，几乎所有的***(>99％)都与高危型HPV(hrHPV)相关，但HPV感染导致***发生的分子机制仍不太明了。虽然HPV感染人群比例很大，但一过性阳性携带者中80％以上在1年内会自然清除，仅有很少一部分会进展到宫颈病变或者癌症。提示HPV并非***发生发展的唯一因素，HPV致癌机理还有待进一步研究。HPV为双链环状DNA，按基因功能可分为3个部分：长控制区(上游调控区)、早期基因区(E1、E2、E4-E7)编码6个早期蛋白和晚期基因区(L1、L2)编码2个晚期蛋白。其中，E6是明确的致癌基因，是hrHPV感染促进***发生的重要分子机制。对E6基因在***发生发展过程中的机制、***诊疗与疫苗研发等方面开展深入研究具有重要的医学应用价值。
目前，如何全面评价hrHPV E6的促癌机制，尤其是在诱导正常细胞恶性转化及肿瘤微环境免疫调控等过程中的机理研究尚存在着瓶颈。由于目前HPV感染的案例不断增加，且没有彻底根治的药物，建立相应的动物模型，开发预防性、治疗性的药物势在必行。目前多利用裸鼠、传统随机转基因小鼠开展相关研究。
(1)裸鼠：如国内研究者通过构建带有角蛋白(K14)启动子的E6/E7腺病毒载体，尾静脉注射重组病毒Ad-K14-E6/E7至裸鼠体内联合腹腔注射***等方式，诱导E6/E7在受试小鼠子宫体中的表达，然而当前却没有单独过表达E6的裸鼠模型。
(2)转基因小鼠：如，研究者通过构建含有皮肤特异启动子pINV的HPV16 E6真核表达质粒，线性化后显微注射的方式获得了pINV-HPV16 E6转基因首建鼠，HPV16-E6基因在小鼠皮肤中特异表达。
在上述模型中，由于裸鼠缺乏健全的免疫***，该模型不适用于研究HPV E6在介导肿瘤微环境免疫调控、免疫逃逸等过程中的作用。而对于传统的随机转基因小鼠，具有转基因效率及整合位点不确定的特点。由于敲入方式随机性较强，很容易引起其它基因功能的丧失，同时***的拷贝数和位置不固定，通常会得到多个品系。不同品系由于质粒在染色体上的整合位点不同、拷贝数不同，不同品系之间不容易得到一致的结果。而且由于转基因小鼠传代后，转基因的拷贝数稀释以及基因沉默等原因，同一品系的表型在传代过程中也很容易丢失，造成实验结果不能重复。通过这种方式建立小鼠品系需要花费较高的时间与金钱成本。
发明内容
本发明的目的在于提供一种在ROSA26位点条件性过表达HPV E6基因小鼠模型的构建方法，以解决上述问题。
本发明采用了如下技术方案：
一种在ROSA26位点条件性过表达HPV E6基因小鼠模型的构建方法，其特征在于，包括如下步骤：
(1)根据HPV E6基因的序列，设计并获得sgRNA，评估候选序列脱靶效应；
(2)将得到的sgRNA与Cas9蛋白共同孵育，制备Cas9/sgRNA混合物；
(3)构建打靶载体，利用In-Fusion克隆技术构建携带条件性过表达E6序列的同源重组载体，构建过程中所用重组***为Cre-LoxP诱导表达***，载体包括“启动子-loxP-Stop-loxP-Kozak-HPV E6-筛选标记-polyA”基因片段；
(4)显微共注射与F0代小鼠获得，将所述打靶载体、Cas9/sgRNA混合物共注射到小鼠受精卵中；再将显微注射后的受精卵送回至***鼠输卵管中，待小鼠出生后，经基因鉴定筛选出中靶小鼠，即F0代小鼠；
(5)F1代小鼠获得，将性成熟的阳性F0鼠与野生型鼠配繁产生F1代，经PCR与Southern验证后最终得到阳性杂合子F1代鼠，完成可传代繁育的小鼠模型构建。
进一步，本发明的在ROSA26位点条件性过表达HPV E6基因小鼠模型的构建方法，还具有这样的特征：sgRNA的序列为：CUCCAGUCUUUCUAGAAGAUGGG。
进一步，本发明的在ROSA26位点条件性过表达HPV E6基因小鼠模型的构建方法，还具有这样的特征，还包括：小鼠基因型鉴定的步骤：采用PCR检测或测序验证，提取小鼠鼠尾基因组DNA，进行repair donor中靶后的PCR鉴定，引物ROSA26-seqF1/ROSA26-seqR1分别位于5’同源臂外及repair donor片段内，如该对引物扩增产生PCR产物，则目标donor在小鼠基因组5’进行了有效***；ROSA26-seqF2/ROSA26-seqR2分别位于repair donor的片段内及3’同源臂外，如该对引物扩增产生PCR产物，则目标donor在小鼠基因组3’进行了有效***。
进一步，本发明的在ROSA26位点条件性过表达HPV E6基因小鼠模型的构建方法，还具有这样的特征，其特征在于，PCR检测或测序验证所采用的引物序列如下：
引物名称 引物序列
F1 5’-AAAGATCGCTCTCCACGCCCTAG-3’
R1 5’-AGATGTACTGCCAAGTAGGAAAGTC-3’
F2 5’-CTGCTGTCCATTCCTTATTCCATAG-3’
R2 5’-CTGGAAATCAGGCTGCAAATCTC-3’
F3 5’-CACTTGCTCTCCCAAAGTCGCTC-3’
R3 5’-ATACTCCGAGGCGGATCACAA-3’
。
进一步，本发明的在ROSA26位点条件性过表达HPV E6基因小鼠模型的构建方法，还具有这样的特征，若DNA样品纯度较低或希望缩短PCR反应时间，则采用备选PCR引物，可获得较短片段PCR产物，备选PCR引物的序列如下：
引物名称 引物序列
F4 5’-AGATCTGCAAGCTAATTCCTGC-3’
R4 5’-TGCATAACTGTGGTAACTTTCTG-3’
。
进一步，本发明的在ROSA26位点条件性过表达HPV E6基因小鼠模型的构建方法，还具有这样的特征，备选PCR反应体系：
反应组件 体积
Mouse tail genomic DNA 1μL
Forward primer(10μM) 1μL
Reverse primer(10μM) 1μL
Premix Taq Polymerase 12.5μL
ddH<sub>2</sub>O 9.5μL
Total 25μL
。
进一步，本发明的在ROSA26位点条件性过表达HPV E6基因小鼠模型的构建方法，还具有这样的特征，备选PCR反应条件：
Figure BDA0002327051090000051
进一步，本发明的在ROSA26位点条件性过表达HPV E6基因小鼠模型的构建方法，还具有这样的特征，还包括：小鼠基因型鉴定的步骤：采用Southernblot进行鉴定：
取上述经PCR及测序验证双臂同源重组阳性小鼠，提取鼠尾DNA，经限制性内切酶BamHI或BstEII酶切，同时选择用于Southern blot分析的DNA探针，
5’探针引物序列：
引物名称 引物序列
Forward 5’-AAACGTGGAGTAGGCAATACCCAGG-3’
Reverse 5’-AAAGAAGGGTCACCTCAGTCTCCCT-3’
3’探针引物序列：
引物名称 引物序列
Forward 5’-TTCTGGGCAGGCTTAAAGGCTAAC-3’
Reverse 5’-AGGAGCGGGAGAAATGGATATGAAG-3’
。
进一步，本发明的在ROSA26位点条件性过表达HPV E6基因小鼠模型的构建方法，还具有这样的特征，还包括：步骤(6)，F1代小鼠与带有组织特异性启动子的Cre鼠杂交或利用Cre病毒感染的步骤。
发明的有益效果
本发明的在ROSA26位点条件性过表达HPV E6基因小鼠模型的构建方法，具有如下有益效果：
(1)本发明采用CRISPR-Cas9***，该***主要利用Cas9核酸酶在sgRNA的引导下介导目的基因的原间区毗邻序列(PAM序列，NGG)上游3个碱基的双链断裂，Cas9上的HNH结构域切割与sgRNA形成互补的单链DNA，RuvC结构域切割非互补的单链，在模板链存在的条件下，通过同源重组修复(Homology-Directed Repair,HDR)实现基因片段的定点敲入。该***具有编辑效率与靶向性高、打靶容易，实验操作更加精准、高效的特点。
(2)本发明解决了现有技术中“裸鼠缺乏健全的免疫***，不适用于研究HPV E6在介导肿瘤微环境免疫调控、免疫逃逸等过程中的作用”的问题，本发明所提供动物模型具有健全的免疫***，适用于所有关于HPV E6与免疫***相互作用的研究。
(3)本发明解决了现有技术中传统的随机转基因小鼠“基因的效率及整合位点不确定性”的问题，本发明所提供动物模型构建方法具有基因编辑效率高、整合位点明确的特点。
(4)本发明解决了现有技术中传统的随机转基因小鼠“基因整合拷贝数不固定”的问题，本发明所提供动物模型构建方法具有基因整合拷贝数固定的特点；
(5)本发明解决了现有技术中传统的随机转基因小鼠“时间与金钱成本高”的问题，本发明所提供动物模型构建方法可降低基因敲入小鼠模型的定制成本，缩短构建周期，同时缩短了研发周期。
(6)本发明还解决了在特定组织或特定时间表达HPV E6基因的问题。(7)本发明使用含有小鼠同源序列作为同源重组修复模板的repair donor，与Cas9/sgRNA共同注射到小鼠受精卵中，增加了同源重组修复的几率以及获得阳性小鼠的概率，使用该方法制备的小鼠不含有目的序列之外的其他外源序列。
(8)本发明选择小鼠第6号染色体ROSA26位点作为目的基因的特定***位点，由于该位点属于安全区域，外源性的基因的定点***不会影响其他基因的表达。
(9)本发明将“启动子-loxP-Stop-loxP-Kozak-HPV E6-筛选标记-polyA”序列定点嵌入到ROSA26位点，由于启动子与目的基因E6之间用loxP-STOP-loxP结构隔开，使得正常情况下启动子无法启动E6表达基因的表达。只有与组织特异性Cre工具鼠交配后，才会在特异细胞或者特定时间中表达目的基因，较常规的转基因小鼠模型具有更好的特异性与可控性。
(10)本发明实现了单拷贝目的基因***，更容易预测表达量；且在打靶载体中增加了筛选标记，后续可通过此标记对模型进行灵活的检测。
(11)本发明的小鼠模型，可以和任何带有组织特异性启动子的Cre鼠杂交或利用Cre病毒感染，实现个体特定的组织或特定时间选择性地调控E6基因的功能，最终所得到的条件性过表达E6小鼠可用于研究HPV感染过程中E6对诱导细胞恶性转化、肿瘤微环境调控及免疫逃逸等过程的影响。并且对研究***发生发展机制具有重要意义。
附图说明
图1是本发明一个实施例中基因编辑整体策略示意图。
图2为本发明一个实施例中sgRNA脱靶效应评估。
图3是本发明一个实施例中打靶载体示意图。
图4是本发明一个实施例中打靶载体酶切验证结果图。
图5是本发明一个实施例中中靶小鼠PCR鉴定引物设计原理图。
图6是本发明一个实施例中F1代小鼠5’同源臂PCR电泳结果图。
图7是本发明一个实施例中F1代小鼠3’同源臂PCR电泳结果图。
图8是本发明一个实施例中F1代小鼠5’同源臂PCR产物测序比对结果图。
图9是本发明一个实施例中F1代小鼠3’同源臂PCR产物测序比对结果。
图10是本发明一个实施例中中靶小鼠备选PCR鉴定引物设计原理图。
图11是本发明一个实施例中中靶小鼠Southern blot鉴定酶切及引物设计原理图。
图12A和图12B是本发明一个实施例中中靶小鼠Southern blot验证结果图。
具体实施方式
以下结合附图来对本发明的技术方案做进一步的说明。
为让本发明的上述和其它目的、特征和优点能更明显易懂，以下结合具体实施例与附图对本发明的技术方案进行详细说明。以下实施例仅用于更加清楚地说明本发明的技术方案，因此只是作为示例，而不能以此来限制本发明的保护范围。
以下实施例中如无特殊说明，所采用的试剂和生物材料均来源于市售。实施例中未注明具体条件者，按照常规条件或制造商建议的条件进行。实施例中未作具体说明的分子生物学实验方法，均参照《分子克隆实验指南》(第三版)J.萨姆布鲁克一书中所列的具体方法进行，或者按照试剂盒和产品说明书进行。
具体实施例：在ROSA26位点进行条件性过表达HPV16 E6动物模型的构建
利用CRISPR-Cas9基因编辑技术在小鼠模型ROSA26位点定点敲入HPV16 E6基因序列，可实现条件性过表达HPV16 E6，以建立条件性过表达HPV16 E6小鼠模型。包括如下步骤：
(1)sgRNA设计与脱靶效应评估
在C57BL/6小鼠ROSA26位点进行条件性过表达HPV16 E6的sgRNA设计，并对候选sgRNA进行脱靶效应评估，如图2所示。筛选得到sgRNA(matching forward strand ofgene):
CUCCAGUCUUUCUAGAAGAUGGG。
(2)将得到的gRNA与Cas9蛋白共同孵育，制备Cas9/sgRNA混合物；
(3)基因编辑策略与打靶载体构建
基因编辑整体策略如图1所示，为实现此基因编辑目的，如图3所示，利用In-Fusion克隆技术构建携带条件性过表达E6序列的同源重组载体，构建过程中所用重组***为Cre-LoxP诱导表达***，载体包括“CAG-loxP-Stop-loxP-Kozak-HPV16E6-3*FLAG-polyA”基因片段。载体酶切验证结果如图4所示。
(4)显微共注射与F0代小鼠获得
将上述打靶载体、Cas9/sgRNA混合物共注射到小鼠受精卵中；再将显微注射后的受精卵送回至***鼠输卵管中，待小鼠出生后，经基因鉴定筛选出中靶小鼠，即F0代小鼠。
(5)F1代小鼠获得
将性成熟的阳性F0鼠与野生型鼠配繁产生F1代，经PCR与Southern验证后最终得到阳性杂合子F1代鼠，完成可传代繁育的小鼠模型构建。(6)上述小鼠基因型鉴定方案有AB两种：
A方案：PCR检测及测序验证
提取小鼠鼠尾基因组DNA，进行repair donor中靶后的PCR鉴定。如图5所示，引物ROSA26-seqF1/ROSA26-seqR1分别位于5’同源臂外及repair donor片段内，如该对引物扩增产生PCR产物，说明目标donor在小鼠基因组5’进行了有效***；ROSA26-seqF2/ROSA26-seqR2分别位于repairdonor的片段内及3’同源臂外，如该对引物扩增产生PCR产物，说明目标donor在小鼠基因组3’进行了有效***。并分别利用引物ROSA26-seqF3/ROSA26-seqR3对上述PCR产物进行测序及序列比对。
PCR引物序列：
引物名称 引物序列
F1 5’-AAAGATCGCTCTCCACGCCCTAG-3’
R1 5’-AGATGTACTGCCAAGTAGGAAAGTC-3’
F2 5’-CTGCTGTCCATTCCTTATTCCATAG-3’
R2 5’-CTGGAAATCAGGCTGCAAATCTC-3’
F3 5’-CACTTGCTCTCCCAAAGTCGCTC-3’
R3 5’-ATACTCCGAGGCGGATCACAA-3’
PCR反应体系：
Figure BDA0002327051090000111
Figure BDA0002327051090000123
PCR反应条件：
Figure BDA0002327051090000121
本实例中经PCR及测序验证共获得阳性F1代小鼠3只，编号2、3、4号：5’和3’同源臂PCR鉴定电泳结果分别如图6、图7所示，图中数字：F1代小鼠编号；WT：野生型对照；分别取上述5’和3’同源臂PCR产物进行测序及序列比对，结果以2号小鼠为例，见图8和图9。
备注：
1)使用的TaqDNA聚合酶是LongAmp Taq DNA聚合酶(NEB M0323V)。
2)PCR基因分型中使用的两个对照是：
水控制：不添加DNA模板。
野生型对照：400ng小鼠基因组DNA。
如果DNA样品不是很纯净或没有足够的PCR延伸时间，则可能无法扩增长片段PCR产物。可使用如图10所示的备选引物。
备选PCR引物序列：
Figure BDA0002327051090000122
Figure BDA0002327051090000131
备选PCR反应体系：
反应组件 体积
Mouse tail genomic DNA 1μL
Forward primer(10μM) 1μL
Reverse primer(10μM) 1μL
Premix Taq Polymerase 12.5μL
ddH<sub>2</sub>O 9.5μL
Total 25μL
备选PCR反应条件：
Figure BDA0002327051090000132
B方案：Southernblot鉴定：
取上述经PCR及测序验证双臂同源重组阳性小鼠(2-4号)，提取鼠尾DNA。如图11所示，经限制性内切酶BamHI或BstEII酶切，同时选择用于Southernblot分析的DNA探针。如图12A和12B所示，检测结果显示，上述三只小鼠DNA酶切后对应基因组片段均可与所设计探针发生杂交，产物大小符合预期。
5’探针引物序列：
引物名称 引物序列
Forward 5’-AAACGTGGAGTAGGCAATACCCAGG-3’
Reverse 5’-AAAGAAGGGTCACCTCAGTCTCCCT-3’
3’探针引物序列：
引物名称 引物序列
Forward 5’-TTCTGGGCAGGCTTAAAGGCTAAC-3’
Reverse 5’-AGGAGCGGGAGAAATGGATATGAAG-3’
在其它的实施方式中，在获得F1代小鼠之后，若需要对实现个体特定的组织或特定时间选择性地调控E6基因的表达，则可以采用与带有组织特异性启动子的Cre鼠杂交或利用Cre病毒感染的步骤，得到条件性过表达E6的小鼠。实现个体特定的组织或特定时间选择性地调控E6基因的功能，最终所得到的条件性过表达E6小鼠可用于研究HPV感染过程中E6对诱导细胞恶性转化、肿瘤微环境调控及免疫逃逸等过程的影响。
Figure BDA0002327051090000151
Figure BDA0002327051090000161
Figure BDA0002327051090000171
Figure BDA0002327051090000181
SEQUENCE LISTING
<110> 上海同科生物科技有限公司
<120> 在ROSA26位点条件性过表达HPV E6基因小鼠模型的构建方法
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agatctgcaa gctaattcct gc 22
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<212> DNA
<213> Artificial
<220>
<223> R4
<400> 9
tgcataactg tggtaacttt ctg 23
<210> 10
<211> 25
<212> DNA
<213> Artificial
<220>
<223> Probe
<400> 10
aaacgtggag taggcaatac ccagg 25
<210> 11
<211> 25
<212> DNA
<213> Artificial
<220>
<223> Probe
<400> 11
aaagaagggt cacctcagtc tccct 25
<210> 12
<211> 24
<212> DNA
<213> Artificial
<220>
<223> Probe
<400> 12
ttctgggcag gcttaaaggc taac 24
<210> 13
<211> 25
<212> DNA
<213> Artificial
<220>
<223> Probe
<400> 13
aggagcggga gaaatggata tgaag 25

Claims (9)

1.一种在ROSA26位点条件性过表达HPV E6基因小鼠模型的构建方法，其特征在于，包括如下步骤：
(1)根据HPV E6基因的序列，设计并获得sgRNA，评估候选序列脱靶效应；
(2)将得到的sgRNA与Cas9蛋白共同孵育，制备Cas9/sgRNA混合物；
(3)构建打靶载体，利用In-Fusion克隆技术构建携带条件性过表达E6序列的同源重组载体，构建过程中所用重组***为Cre-LoxP诱导表达***，载体包括“启动子-loxP-Stop-loxP-Kozak-HPV E6-筛选标记-polyA”基因片段；
(4)显微共注射与F0代小鼠获得，将所述打靶载体、Cas9/sgRNA混合物共注射到小鼠受精卵中；再将显微注射后的受精卵送回至***鼠输卵管中，待小鼠出生后，经基因鉴定筛选出中靶小鼠，即F0代小鼠；
(5)F1代小鼠获得，将性成熟的阳性F0鼠与野生型鼠配繁产生F1代，经PCR与Southern验证后最终得到阳性杂合子F1代鼠，完成可传代繁育的小鼠模型构建。
2.如权利要求1所述的在ROSA26位点条件性过表达HPV E6基因小鼠模型的构建方法，其特征在于：
sgRNA的序列为：CUCCAGUCUUUCUAGAAGAUGGG。
3.如权利要求1所述的在ROSA26位点条件性过表达HPV E6基因小鼠模型的构建方法，其特征在于，还包括：
小鼠基因型鉴定的步骤：采用PCR检测或测序验证，
提取小鼠鼠尾基因组DNA，进行repair donor中靶后的PCR鉴定，引物ROSA26-seqF1/ROSA26-seqR1分别位于5’同源臂外及repair donor片段内，如该对引物扩增产生PCR产物，则目标donor在小鼠基因组5’进行了有效***；ROSA26-seqF2/ROSA26-seqR2分别位于repair donor的片段内及3’同源臂外，如该对引物扩增产生PCR产物，则目标donor在小鼠基因组3’进行了有效***。
4.如权利要求3所述的在ROSA26位点条件性过表达HPV E6基因小鼠模型的构建方法，其特征在于，
PCR检测或测序验证所采用的引物序列如下：
引物名称 引物序列 F1 5’-AAAGATCGCTCTCCACGCCCTAG-3’ R1 5’-AGATGTACTGCCAAGTAGGAAAGTC-3’ F2 5’-CTGCTGTCCATTCCTTATTCCATAG-3’ R2 5’-CTGGAAATCAGGCTGCAAATCTC-3’ F3 5’-CACTTGCTCTCCCAAAGTCGCTC-3’ R3 5’-ATACTCCGAGGCGGATCACAA-3’
。
5.如权利要求4所述的在ROSA26位点条件性过表达HPV E6基因小鼠模型的构建方法，其特征在于：
若DNA样品纯度较低或希望缩短PCR反应时间，则采用备选PCR引物，可获得较短片段PCR产物，备选PCR引物的序列如下：
引物名称 引物序列 F4 5’-AGATCTGCAAGCTAATTCCTGC-3’ R4 5’-TGCATAACTGTGGTAACTTTCTG-3’
。
6.如权利要求5所述的在ROSA26位点条件性过表达HPV E6基因小鼠模型的构建方法，其特征在于：
备选PCR反应体系：
反应组件 体积 Mouse tail genomic DNA 1μL Forward primer(10μM) 1μL Reverse primer(10μM) 1μL Premix Taq Polymerase 12.5μL ddH<sub>2</sub>O 9.5μL Total 25μL
。
7.如权利要求6所述的在ROSA26位点条件性过表达HPV E6基因小鼠模型的构建方法，其特征在于：
备选PCR反应条件：
Figure FDA0002327051080000031
Figure FDA0002327051080000041
8.如权利要求1所述的在ROSA26位点条件性过表达HPV E6基因小鼠模型的构建方法，其特征在于，还包括：
小鼠基因型鉴定的步骤：采用Southern blot进行鉴定：
取上述经PCR及测序验证双臂同源重组阳性小鼠，提取鼠尾DNA，经限制性内切酶BamHI或BstEII酶切，同时选择用于Southern blot分析的DNA探针，
5’探针引物序列：
引物名称 引物序列 Forward 5’-AAACGTGGAGTAGGCAATACCCAGG-3’ Reverse 5’-AAAGAAGGGTCACCTCAGTCTCCCT-3’
3’探针引物序列：
引物名称 引物序列 Forward 5’-TTCTGGGCAGGCTTAAAGGCTAAC-3’ Reverse 5’-AGGAGCGGGAGAAATGGATATGAAG-3’
。
9.如权利要求1所述的在ROSA26位点条件性过表达HPV E6基因小鼠模型的构建方法，其特征在于，还包括：
步骤(6)，F1代小鼠与带有组织特异性启动子的Cre鼠杂交或利用Cre病毒感染的步骤。
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