CN111007252A - 一种基于纳米磁颗粒数量和状态变化的磁弛豫时间传感器检测农药残留的方法 - Google Patents

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Abstract

本发明公开了一种基于生物正交反应改变纳米磁颗粒数量及状态，进而检测农药残留的生物传感方法，该方法基于二苯基环辛炔与叠氮的级联生物正交反应同时改变纳米磁颗粒的数量和聚集状态，实现了磁纳米颗粒数量和状态的可控调节，二者有机结合进行磁信号级联放大，从而提高农药残留检测的准确性和灵敏度。

Description

一种基于纳米磁颗粒数量和状态变化的磁弛豫时间传感器检 测农药残留的方法
技术领域
本发明属于食品安全检测技术领域，具体涉及一种基于纳米磁颗粒数量和状态变化的磁弛豫时间传感器检测农药残留的方法。
背景技术
食品安全关系广大人民群众身体健康，是一项重要的民生工程，而食品中农药残留是危害人类健康的一个重要的食品安全问题。由于违规使用高毒农药、病虫抗药性增强、农药使用不当等原因常常造成农药残留超标，而农药残留对人体健康危害巨大，会造成急性中毒或慢性中毒，降低人体免疫力、可致癌、致畸和致突变，甚至造成个体死亡。鉴于农药残留给健康带来的巨大危害，减少、合理使用农药是解决问题的根本措施，而食品中农药残留的快速、准确检测则是保证合理使用的前提和保障人民群众舌尖上安全的最后一道防线。
目前，对食品中农药残留定性定量分析的主要手段是仪器分析法、酶抑制法和免疫分析法。仪器分析方法具有灵敏度高、准确性好等优势，但样品前处理复杂，检测成本高，需要较高水平的专业技术人员，不适合现场快速检测。酶抑制法主要针对有机磷农药，具有操作简单、成本低等优势，但其容易受样品基质的干扰，假阳性比较多，准确性不够。传统免疫分析主要包括酶联免疫吸附测定法(ELISA)和胶体金免疫层析试纸条方法。ELISA具有操作相对简单、高通量等优势，但是，某些农药残留的浓度可能非常低，传统的ELISA方法无法满足检测需求。胶体金免疫层析试纸条方法具有操作简单、检测速度快等优势，但其灵敏度低，容易受到基质干扰等。因此传统的免疫测定法无法满足检测灵敏度的实际需求。筛选具有较高亲和力结合的抗体可以提高的灵敏度，但往往较为昂贵。因此，非常有必要在不损害方法特异性的前提下，提高免疫分析方法的灵敏度。
各种纳米材料由于其独特的物理化学特性，已被用于改善传统免疫分析方法的分析性能。纳米粒子具有较大比表面积，多样的表面化学，被广泛地应用于免疫分析中的富集和分离，以简化预处理。纳米颗粒的光学、电化学和磁特征也极大的增强了传统免疫分析中的信号读出与放大。在各种纳米颗粒中，磁性纳米颗粒(MNPs)引起了人们极大的兴趣，因为MNPs不仅可以在磁场下很容易地分离，用在样品预处理的载体，而且还可以用作磁信号传感探针，因为MNPs可以导致一个不均匀的磁场，而不均匀的磁场会显著缩短周围水分子质子的横向弛豫时间(T2)。此外，由于样品基质中的磁信号可忽略不计，因此基于MNPs的磁弛豫时间免疫传感器具有很高的信噪比，在食品安全和临床诊断等领域得到了广泛地应用。传统的磁免疫传感器的传感机理主要分为两个方面：(1)MNPs的状态变化：MNPs偶联上抗体之后，由于抗体-抗原之间的免疫识别作用，可以使原来分散的MNPs变成聚集状态，进而会引起一个不均匀的磁场，导致T2信号发生改变，而传统磁免疫传感器的信号大都取决于MNPs的状态变化，其灵敏度不足以检测痕量的靶标，并且很容易受到非特异性聚集的干扰。(2)MNPs数量的变化：有研究表明磁信号T2对纳米磁颗粒MNPs数量的变化更为敏感，因此，有研究者通过结合免疫磁分离，可以实现目标物和磁颗粒数量变化的一一对应，进而构建了基于纳米磁颗粒数量变化的磁弛豫时间免疫传感器，用于生物大分子，例如食源性致病菌、病毒等检测。然而像农药这类小分子化学物仅具有一个抗体结合位点，不能有效导致磁颗粒数量的改变，因此，需要借助其他放大手段才能将磁弛豫时间免疫传感器用于痕量的农药残留小分子的高灵敏检测。
生物正交反应(Bioorthogonal reactions，BRs)具有反应速度快，特异性好等优势，通过层层组装的生物正交反应，可以极大增强MNPs结合在目标物上面的量，进而放大T2信号并增强传统磁横向弛豫时间免疫传感器(T2-MRS)的灵敏度。因此，层层组装的生物正交反应为克服T2-MRS检测痕量小分子目标的灵敏度提供了一种有吸引力的工具。更为重要的是，一方面，我们通过生物正交反应，可以增加纳米磁颗粒的偶联量，进而引起纳米磁颗粒数量的改变；同时，我们发现，通过生物正交反应，也可以使原来处于分散状态的纳米磁颗粒变成聚集状态，即引起纳米磁颗粒状态的改变，从而进一步放大T2信号。因此，基于级联生物正交反应，在MNPs数量的变化的基础上，有机结合了MNPs的状态变化，实现磁信号的级联放大，进而构建了超灵敏的磁弛豫时间免疫传感器，用于农药小分子的快速检测。
发明内容
本发明的目的是提供一种基于生物正交反应检测农药残留的生物传感器方法，该方法可同时改变纳米磁颗粒的聚集状态和数量，二者有机结合进行磁信号级联放大，从而提高农药残留检测的准确性和灵敏度。
一种基于纳米磁颗粒数量和状态变化的磁弛豫时间传感器检测农药残留的方法，包括以下步骤：
1)将待测农药与载体蛋白偶联，然后再与羧基磁珠反应，得到偶联有待测农药完全抗原的磁珠；
2)将识别待测农药的单克隆抗体与二苯基环辛炔-四聚乙二醇-活性酯(DBCO-PEG4-NHS ester)反应，得到二苯基环辛炔(DBCO)修饰的单克隆抗体；
3)将偶联有待测农药完全抗原的磁珠和DBCO修饰的单克隆抗体加入到待测样品溶液中，发生免疫竞争反应，磁分离后得到“磁珠-完全抗原-抗体-DBCO”免疫复合物；
4)将15-叠氮基-4,7,10,13-四氧十五烷酸-N-琥珀酰亚胺基酯(Azide-PEG4-NHSester)与氨基纳米磁颗粒反应，得到叠氮(Azide)标记的纳米磁颗粒(azide-MNPs)，将产物磁分离后用PBS缓冲液重悬，然后加入到步骤3)得到的免疫复合物中，使Azide与DBCO发生生物正交反应，从而将纳米磁颗粒偶联到磁珠上，磁分离后收集上清液，上清液中含有未反应的azide-MNPs并且没有反应的azide-MNPs数量和待测物的含量成正相关；
5)向步骤4)磁分离后的上清液中加入叠氮化物交联剂，触发生物正交反应，形成纳米磁颗粒-叠氮-叠氮化物交联剂-叠氮-纳米磁颗粒复合物，从而将原来分散状态的纳米磁颗粒改变为聚集状态，使磁免疫传感器的横向弛豫时间信号被级联放大，测量其横向弛豫时间进而对农药残留定量分析。
优选地，所述羧基磁珠的粒径为500-3000nm。
优选地，所述氨基纳米磁颗粒的粒径为10-100nm。
优选地，所述叠氮化物交联剂为二苯基环辛炔-四聚乙二醇-二苯基环辛炔(DBCO-PEG4-DBCO)。
优选地，所述15-叠氮基-4,7,10,13-四氧十五烷酸-N-琥珀酰亚胺基酯与氨基纳米磁颗粒的重量比为1：5。
优选地，所述单克隆抗体与二苯基环辛炔-四聚乙二醇-活性酯反应的摩尔比为1：10。
优选地，标记叠氮(Azide)的纳米磁颗粒与DBCO-PEG4-DBCO生物正交反应的反应时间为20min。
优选地，所述农药为小分子化合物农药，例如毒死蜱。
优选地，所述农药的载体蛋白为牛血清白蛋白。
在本发明中，我们基于级联生物正交反应(BRs)实现了磁纳米颗粒(MNPs)数量和状态的可控调节，并在此基础上构建了一种超灵敏的磁弛豫时间免疫传感器，用于农药残留的检测。利用快速且高度选择性的生物正交反应，并结合竞争性免疫反应，可以通过MNPs数量的变化实现磁弛豫信号的放大；在此基础上将不同数量的MNPs进一步进行生物正交反应，改变其状态(由分散到聚集)，从而实现磁弛豫信号的多级放大，最终实现对样品中农药残留的高灵敏检测。MNPs数量变化引起的信号放大与MNPs状态变化引起的信号放大的有机结合，实现级联信号放大，是本传感器能够实现超灵敏检测的核心技术。具体如图1所示，通过两步生物正交反应，单个小分子目标物不仅可以增加MNP30的结合效率，而且可以组装MNP30，使其状态由分散变成聚集。当农药分子(以毒死蜱为例)含量较多时，由于竞争作用，相对较少的二苯基环辛炔(DBCO)修饰的抗体(Ab-DBCO)能够与MNP1000-BSA-毒死蜱结合，形成的“MNP1000-BSA-毒死蜱-Ab-DBCO”复合物的量较少。当加入MNP30-Azide后，Azide能够与DBCO发生的生物正交反应(Ab上含有多个DBCO位点，可结合多个MNP30-Azide，实现信号的放大)，因“MNP1000-BSA-毒死蜱-Ab-DBCO”复合物较少，因此偶联在“MNP1000-BSA-毒死蜱-Ab-DBCO”复合物上的MNP30则越少。因MNP1000与MNP30磁分离效率具有显著差异，1000nm的MNP1000因为粒径大，磁饱和强度大，容易磁分离，而30nm的MNP30因为粒径小，磁饱和强度小，不容易磁分离。因此，MNP1000-MNP30复合物可以很容易地与MNP30经磁分离架进行分离。磁分离后，上清液中所剩余的MNP30-Azide则越多(磁颗粒数量变化引起磁信号的变化)。反之，如果样品中农药分子(以毒死蜱为例)含量较少时，上清液中所剩余的MNP30-Azide则较少。为进一步扩大传感器的磁信号，我们在上述上清液中加入DBCO-PEG4-DBCO，进一步触发DBCO和Azide之间的生物正交反应，将分散状态的MNP30-Azide改变为聚集状态(磁颗粒从分散变成聚聚状态，其磁信号会增强)，从而使信号进一步放大。
本发明制备的基于状态和数量改变的横向弛豫时间免疫传感器的优势在于：
1.首次通过生物正交反应将MNPs数量变化引起的信号放大与MNPs状态变化引起的信号放大有机结合起来，实现磁信号的级联放大，有效地提高了磁生物传感器的灵敏度和检测范围，属于方法学角度进行创新。
2.叠氮化物(Azide)与DBCO的生物正交反应具有快速、高选择性的特点，是实现信号放大而不引入交叉反应的重要手段，这一优势在复杂样品中尤为明显。
3.本发明中磁免疫传感器的检测方法，前处理简单，操作简便，检测成本低，且检测速度较快，避免使用GC-MS等大型仪器，有效地提高了检测效率。
附图说明
图1是本发明检测农药残留的磁弛豫时间免疫传感器的工作原理。
图2是Azide-PEG4-NHS ester与MNP30质量比对传感器信号的影响。
图3是单克隆抗体在偶联DBCO前后的分子量(MWs)的变化，图中，A为偶联前；B为偶联后。
图4是Ab/DBCO比例对传感器信号强度的影响。
图5是磁颗粒状态改变阶段中Azide-MNP30与DBCO-PEG4-DBCO的反应时间对信号强度的影响。
图6是Azide-MNP30磁颗粒状态改变阶段前后的磁弛豫性能及微观状态变化对比。图中，A为不同浓度纳米磁颗粒状态改变前后T2值的变化对比；B为不同浓度纳米磁颗粒状态改变前后弛豫率的变化对比；C为纳米磁颗粒状态改变前的透射电镜图；D为纳米磁颗粒状态改变后的透射电镜图。
图7是本发明MRS传感器与传统MRS传感器及基于磁颗粒数量变化的MRS传感器检测毒死蜱的线性范围。图中，A为传统MRS的检测原理；D为基于磁颗粒数量变化的MRS检测原理；G为本发明MRS传感器的检测原理；B、E、H分别为三种检测方式的样品浓度(ng/mL)-T2值线性关系；C、F、I分别为三种检测方式样品浓度的对数-T2值线性关系。
图8是本发明MRS传感器检测毒死蜱的特异性结果。
图9是本发明MRS传感器检测苹果和卷心菜中毒死蜱的结果对比。
图10是本发明MRS传感器检测苹果和卷心菜中吡虫啉的结果对比。
具体实施方式
下面通过具体实施方式来进一步说明本发明的技术方案。本领域技术人员应该明了，所述实施例仅是帮助理解本发明，不应视为对本发明的限制。
所用的试剂仪器设备来源：
1.粒径为1000nm的羧基磁珠(简称MNP1000)：Invitrogen(美国)
2.粒径为30nm的氨基纳米磁颗粒(简称MNP30)：Ocean NanoTech公司(美国)
3.15-叠氮基-4,7,10,13-四氧十五烷酸-N-琥珀酰亚胺基酯(Azide-PEG4-NHSester)，二苯基环辛炔-四聚乙二醇-活性酯(DBCO-PEG4-NHS ester)，二苯基环辛炔-四聚乙二醇-二苯基环辛炔(DBCO-PEG4-DBCO)：Click Chemistry Tools公司(美国)
4.毒死蜱-BSA、毒死蜱单克隆抗体、毒死蜱ELISA试剂盒，吡虫啉-BSA、吡虫啉单克隆抗体、吡虫啉ELISA试剂盒：山东绿都生物技术有限公司
5.牛血清白蛋白、毒死蜱、吡虫啉、乐果、***磷、草甘磷、高灭磷：上海Sigma-Aldrich公司
6.磁分离架：上海万润纳米科技公司
7.0.47T核磁共振仪(PQ 001)：上海纽迈科技公司
8.随机苹果和卷心菜样品：采购自当地超市
实施例1.本磁弛豫免疫传感器的构建
(1)Azide-MNP30偶联物的制备
将100μL 15-叠氮基-4,7,10,13-四氧十五烷酸-N-琥珀酰亚胺基酯(Azide-PEG4-NHS ester)溶液(1mg/mL)加入到200μL NH2-MNP30溶液(2.5mg/mL)中，在室温下缓慢搅拌1小时。反应完成后，在4℃下进行磁分离12小时，除去上清液得到Azide-MNP30偶联物，然后使用500μL PBST(pH＝7.4，0.01M，含0.05％吐温20)重悬偶联物，此过程重复三次。最后，Azide-MNP30偶联物用100μL PBS溶液(pH＝7.4，0.01M)重悬，并保存在4℃备用。
本实施例中优化了偶联过程中Azide的用量，具体方法如下：取不同质量的Azide-PEG4-NHS与1mg MNP30进行偶联，将得到的Azide-MNP30与DBCO-Ab-毒死蜱-BSA-MNP1000进行生物正交反应，测其上清液的T2值，T2值越大，证明上清液中剩余的Azide-MNP30越少，偶联到DBCO-Ab-毒死蜱-BSA-MNP1000表面的Azide-MNP30越多。参见图2所示，当Azide-PEG4-NHS为0.2mg时，即Azide-PEG4-NHS与MNP30质量比为1：5时，T2值最大，证明偶联率最高。因此将其选作最终用量。
(2)DBCO-Ab偶联物的制备
将10μL二苯基环辛炔-四聚乙二醇-活性酯(DBCO-PEG4-NHS ester)(2mg/mL)溶解在DMF中，并与100μL Ab(3mg/mL)在10mM的PBS(pH＝7.4)中混匀，在室温下反应1小时。然后在混合溶液中加入50mM Tris-HCl(pH＝8.0)缓冲液，以终止反应10分钟。反应完成后，用干净的离心超滤装置(10kDa过滤器)在4℃下以9000rpm离心20分钟，除去过量的DBCO-PEG4-NHS分子。离心洗涤3次后，用PBS(pH 7.4，10mM)将DBCO-Ab重悬并保存在-20℃。
本实施例中通过应用基质辅助激光解析电离飞行时间质谱对比了单克隆抗体(Ab)在偶联DBCO前后分子量(MWs)的变化，如图3所示，Ab与DBCO-Ab的分子量由146985变为149135，证明DBCO-Ab偶联成功。并经以下公式计算了DBCO-Ab偶联物的偶联率。经计算，每个抗体分子可以偶联4个DBCO-PEG4-NHS分子。
偶联率＝(MWs(DBCO-Ab)-MWs(Ab))/MWs(DBCO-PEG4-NHS)
本实施例中优化了偶联过程中DBCO与Ab的比例，具体方法如下：取不同比例的Ab/DBCO进行偶联，将偶联成功的DBCO-Ab与MNP1000-BSA-毒死蜱进行偶联，并进一次地通过生物正交反应与Azide-MNP30进行偶联，经磁分离后，不同比例的Ab/DBCO可引起上清液中Azide-MNP30的数量变化，通过测定T2值进行量化对比，参见图4所示，当Ab/DBCO的摩尔比为1：10时，T2值最大，信号放大效果最好，因此将其选作最终比例。
(3)MNP1000-BSA-毒死蜱偶联物的制备
首先通过EDC/NHS方法活化200μL羧基化MNP1000(5mg/mL)，然后向其中加入0.2mgBSA-毒死蜱结合物，与活化的MNP1000混合，并在室温下震荡反应2h。反应完成后，将100μL3％BSA溶液添加到该溶液混合物中，并在室温振摇0.5h。磁分离并用PBST洗涤3次后，将MNP1000-BSA-毒死蜱偶联物重新悬浮于200μL PBS溶液中，4℃保存备用。
(4)本磁弛豫免疫传感器的构建
将100μL不同浓度的毒死蜱溶液与100μL MNP1000-BSA-Ag溶液、100μL DBCO-Ab偶联物混合，并在室温下缓慢涡流反应30-60min。反应完成后，磁分离并用PBST洗涤3次后，得到MNP1000-BSA-Ag-Ab-DBCO偶联物。在所得的MNP1000-BSA-Ag-Ab-DBCO偶联物中加入100μLAzide-MNP30溶液，室温下反应，经磁分离后可获得上清液中未反应的Azide-MNP30。在所得的上清液中加入100μL DBCO-PEG4-DBCO溶液，并在室温下静置反应15min。最后，收集混合物并测量其T2值。
本实施例中优化了磁颗粒状态改变阶段中Azide-MNP30与DBCO-PEG4-DBCO的反应时间，具体方法如下：混匀Azide-MNP30与DBCO-PEG4-DBCO，并反应不同的时间，测定反应溶液的T2值，参见图5所示，当时间为20min时，T2值最小，证明状态改变最明显。因此将其选作最终反应时间。
本实施例中研究了Azide-MNP30磁颗粒状态改变阶段前后的磁信号及弛豫效率的变化，并用TEM进行了表征。如图6所示，经生物正交反应后，体系T2值显著减小，弛豫效率显著提高，证明磁颗粒状态改变。
实施例2.本磁弛豫免疫传感器与传统磁弛豫时间传感器灵敏度的对比
根据实施例1，分别用传统MRS(图7A)、基于磁颗粒数量变化的MRS(图7D)、以及基于磁颗粒数量与状态变化的MRS(图7G)对梯度浓度的毒死蜱进行检测。具体方法为：(1)传统MRS：在磁颗粒上偶联抗体(MNP30-Ab)，并在另一磁颗粒上偶联完全抗原(MNP30-BSA-毒死蜱)，将100μL不同浓度的毒死蜱溶液与100μL MNP30-BSA-毒死蜱溶液、100μL MNP30-Ab偶联物混合，发生竞争免疫反应，引起磁颗粒的聚集(MNP30-Ab-毒死蜱-BSA-MNP30，状态改变)，从而引起T2值的变化。(2)基于磁颗粒数量变化的MRS：偶联物的制备与实施例1相同，将100μL不同浓度的毒死蜱溶液与100μL MNP1000-BSA-毒死蜱溶液、100μL DBCO-Ab偶联物混合，并在室温下缓慢涡流反应30-60min。反应完成后，在所得的MNP1000-BSA-Ag-Ab-DBCO偶联物中加入100μLAzide-MNP30溶液，室温下反应，经磁分离后可获得上清液中未反应的Azide-MNP30。磁分离并对上清液进行T2测定(MNP30数量改变)。(3)基于磁颗粒数量与状态变化的MRS：构建方法与实施例1相同。
以样品浓度(ng/mL)为横坐标，以T2值为纵坐标作图，如图7B、E、H所示。以样品浓度(ng/mL)的对数为横坐标，以T2值为纵坐标作图，如图7C、F、I所示。根据3S/M标定曲线计算LOD，其中S是空白样品的标准，M是标准曲线在低浓度范围内的斜率。结果表明，(1)传统MRS：LOD＝4.1ng/mL(S＝8.8,M＝6.4)，线性范围(5-500ng/mL)；(2)基于磁颗粒数量变化的MRS：LOD＝0.36ng/mL(S＝14.1,M＝117.9)，线性范围(1-500ng/mL)；(3)基于磁颗粒数量与状态变化MRS的LOD＝0.05ng/mL(S＝18.2,M＝1096)，线性范围(0.1-1000ng/mL)。因此基于磁颗粒数量与状态变化的MRS具有更高的灵敏度与更好的线性范围，具有灵敏度高、检测范围广的特点。
实施例3.本磁弛豫免疫传感器特异性与回收率的研究
(1)在特异性试验中，分别添加乐果、***磷、草甘磷、高灭磷这四种毒死蜱类似物来测定本传感器检测毒死蜱的特异性，以验证本传感器的特异性。其中，毒死蜱的浓度为10ng/mL，这些类似物的浓度为100ng/mL。如图8所示，只有毒死蜱能够导致T2值的显著变化，其他类似物对磁信号的影响可以忽略不计。
(2)回收率采用标准加入法进行了研究，即在空白苹果样品中加入不同浓度的毒死蜱(0.5、1、5、10、50和100ng/mL)，然后用本传感器进行测定。如表1所示，毒死蜱检测回收率(76％-119％)也表明了该方法的准确性。
表1本传感器检测苹果样品中毒死蜱的回收率
毒死蜱加标浓度(ng mL<sup>-1</sup>) 检测浓度(ng mL<sup>-1</sup>) 回收率(％)
0.5 0.38 76
1 1.19 119
5 4.55 91
10 9.06 90.6
50 50.14 100.28
100 96.5 96.5
实施例4.本磁弛豫免疫传感器用于果蔬中毒死蜱残留的定量检测
将50.00g苹果和卷心菜样品切成薄片并匀浆。分别称取一定量的浆液用甲醇/水溶液(3/17，V/V)超声处理。通过本实施例1中的MRS传感器进行分析，并用气相色谱法(GC)和ELISA进行方法学比对。如图9所示，本传感器的检测结果与GC方法具有很好的吻合性，证明本传感器具有良好的准确性。
实施例5.本磁弛豫免疫传感器用于果蔬中的吡虫啉残留的定量检测
我们还对食品中常见的农药——吡虫啉进行了实际样品的检测，并与气相色谱法(GC)和ELISA进行方法学比对，进一步验证本传感器的准确性和可应用性。果蔬处理方法与实施例4相同，用本传感器检测的步骤与实施例1相似，不同之处在于将目标物定义为吡虫啉。如图10所示，本传感器的检测结果与GC方法吻合性很好，证明本传感器具有良好的准确性和可应用性。

Claims (9)

1.一种基于纳米磁颗粒数量和状态变化的磁弛豫时间传感器对农药残留进行检测的方法，其特征在于包括以下步骤：
1)将待测农药与载体蛋白偶联，然后再与羧基磁珠反应，得到偶联有待测农药完全抗原的磁珠；
2)将识别待测农药的单克隆抗体与二苯基环辛炔-四聚乙二醇-活泼酯反应，得到二苯基环辛炔修饰的单克隆抗体；
3)将偶联待测农药完全抗原的磁珠和二苯基环辛炔修饰的单克隆抗体加入到待测样品溶液中，发生免疫竞争反应，磁分离后得到的“磁珠-完全抗原-抗体-二苯基环辛炔”的免疫复合物；
4)将15-叠氮基-4,7,10,13-四氧十五烷酸-N-琥珀酰亚胺基酯与氨基纳米磁颗粒反应，得到叠氮标记的纳米磁颗粒，将产物磁分离后用PBS缓冲液重悬，然后加入到步骤3)得到的“磁珠-完全抗原-抗体-二苯基环辛炔”免疫复合物中，叠氮与二苯基环辛炔发生生物正交反应，从而叠氮标记的纳米磁颗粒偶联到磁珠上，磁分离后收集上清液，上清液中叠氮标记的纳米磁颗粒数量发生改变；
5)向步骤4)磁分离后的上清液中加入叠氮化物交联剂，触发生物正交反应，将原来分散状态的叠氮-纳米磁颗粒变为聚集状态，使磁免疫传感器的横向弛豫时间信号被级联放大，测量其横向弛豫时间进而对农药残留定量分析。
2.如权利要求1所述的农药残留检测方法，其特征在于：所述羧基磁珠的粒径为500-3000nm。
3.如权利要求1所述的农药残留检测方法，其特征在于：所述氨基纳米磁颗粒的粒径为10-100nm。
4.如权利要求1所述的农药残留检测方法，其特征在于：所述叠氮化物交联剂为二苯基环辛炔-四聚乙二醇-二苯基环辛炔。
5.如权利要求1所述的农药残留检测方法，其特征在于：所述15-叠氮基-4,7,10,13-四氧十五烷酸-N-琥珀酰亚胺基酯与氨基纳米磁颗粒的重量比为1：5。
6.如权利要求1所述的农药残留检测方法，其特征在于：所述单克隆抗体与二苯基环辛炔-四聚乙二醇-活性酯反应的摩尔比为1：10。
7.如权利要求1所述的农药残留检测方法，其特征在于：步骤5)所述生物正交反应的反应时间为20min。
8.如权利要求1所述的农药残留检测方法，其特征在于：所述农药为小分子化合物农药，例如毒死蜱。
9.如权利要求1所述的农药残留检测方法，其特征在于：所述农药的载体蛋白为牛血清白蛋白。
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