CN111004831B - 一种粪便保存液及其制备方法和应用 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种粪便保存液及其制备方法和应用，属于生物医疗技术领域，该粪便保存液包括三羟甲基氨基甲烷0.15‑0.30M、乙二胺四乙酸0.25‑0.55M、氯化钠5‑20mM、十二烷基硫酸钠1‑3％(w/v)、氯丁醇10‑35％(v/v)和聚乙二醇PEG200 10‑30％(v/v)。该粪便保存液用于保存粪便类样品，可以在常温下保持粪便中微生物的构成稳定在刚刚离体时的状态，避免粪便样本中的细胞及核酸受环境影响被破坏或降解，保持粪便内的细菌构成不发生显著性的变化。该粪便保存液制备方法简单，易于实验室配置使用也易于工业化批量生产，且使用方便、快捷。
Description
技术领域
本发明属于生物医疗技术领域，具体涉及一种粪便保存液及其制备方法和应用。
背景技术
粪便检测是临床常规化验检查项目之一，通过此项检查可较直观地了解胃肠道一些病理现象，特别是结直肠癌的检测，人粪便当中脱落细胞的检测由于无创无痛且特异性高等特征，常用于结直肠癌等疾病的初筛普查。肠道微生物存在于人的肠道内，研究人体排出的粪便中的微生物，以此代表大肠内的共生微生物，通过对这些共生微生物进行生物信息学分析，可以了解粪便中的细菌构成，进一步研究其和人体疾病之间的相关性。
人的粪便产自肠道，其中携带了大量的肠道微生物同时含有大量的消化残余及细菌产生的各种核酸降解酶和各种PCR抑制剂，使得粪便样本中的细胞及核酸极易受到破坏和降解，同时粪便离体后，其环境也发生了变化，主要是从无氧环境转变为有氧环境，其中的部分细菌还保持了部分活性，继续代谢和生长，而由于环境的变化，不同细菌其增长与死亡的速率已不同于排便前。因此，需要对粪便进行一些保存措施，尽量将其中微生物的构成稳定在刚刚离体时的状态，从而更好的代表大肠中的共生微生物。
目前常用的保存方法是通过采集粪便样本后立即冻存在-20℃或者更低的温度中，以避免脱落细胞的降解或其它生化反应，同时保持粪便内的细菌构成不发生显著性的变化。但是，粪便样本采集很多时候并不是在实验室中进行，即，采集的粪便样本或多或少都需要在常温下放置一段时间才能放入冰箱中-20℃保存；这个过程容易造成原本就很少量的脱落细胞进一步损失以及大量厌氧菌的死亡，从而影响后续检测。
发明内容
为了克服上述现有技术的缺陷，本发明所要解决的技术问题是：提供一种使采样者在任何时候都可以进行采样并且进行粪便样品的保存、运输、保持菌群丰富度和遗传物质稳定性的粪便类样本的保存液及其制备方法和应用。
为了解决上述技术问题，本发明采用的技术方案为：一种粪便保存液，包括以下组分：
三羟甲基氨基甲烷0.15-0.30M、乙二胺四乙酸0.25-0.55M、氯化钠5-20mM、十二烷基硫酸钠1-3％(w/v)、氯丁醇10-35％(v/v)和聚乙二醇PEG200 10-30％(v/v)。
上述的粪便保存液的制备方法，包括以下步骤：三羟甲基氨基甲烷、乙二胺四乙酸、氯化钠、十二烷基硫酸钠1-3％、氯丁醇10-35％和聚乙二醇PEG200混合后用无菌无核酸去离子水溶解，过0.22um的滤膜过滤或高压灭菌，得到粪便保存液。
上述的粪便保存液在粪便样本保存中的应用，10ml粪便保存液用于保存0.5-2g粪便。
本发明的有益效果在于：本发明提供的粪便保存液用于保存粪便类样品，可以在常温下保持粪便中微生物的构成稳定在刚刚离体时的状态，避免粪便样本中的细胞及核酸受环境影响被破坏或降解，保持粪便内的细菌构成不发生显著性的变化，保存液中添加的聚乙二醇PEG200，有助于溶解粪便样本中的脂类物质，使粪便在保存液中更趋于分散，有利于微生物和细胞的稳定。该粪便保存液制备方法简单，易于实验室配置使用也易于工业化批量生产，且使用方便、快捷。
附图说明
图1所示为本发明具体实施方式的第一名志愿者的经4种方法保存后的粪便的DNA中的β-actin检测结果图；
图2所示为本发明具体实施方式的第二名志愿者的经4种方法保存后的粪便的DNA中的β-actin检测结果图；
图3所示为本发明具体实施方式的第三名志愿者的经4种方法保存后的粪便的DNA中的β-actin检测结果图；
图4所示为本发明具体实施方式的第四名志愿者的经4种方法保存后的粪便的DNA中的β-actin检测结果图；
图5所示为本发明具体实施方式的第一名志愿者的经4种方法保存后的粪便中大肠杆菌DNA检测结果图；
图6所示为本发明具体实施方式的第二名志愿者的经4种方法保存后的粪便中大肠杆菌DNA检测结果图；
图7所示为本发明具体实施方式的第三名志愿者的经4种方法保存后的粪便中大肠杆菌DNA检测结果图；
图8所示为本发明具体实施方式的第四名志愿者的经4种方法保存后的粪便中大肠杆菌DNA检测结果图。
具体实施方式
为详细说明本发明的技术内容、所实现目的及效果，以下结合实施方式并配合附图予以说明。
请参照图1至图8所示，本发明的一种粪便保存液，包括以下组分：
三羟甲基氨基甲烷0.15-0.30M、乙二胺四乙酸0.25-0.55M、氯化钠5-20mM、十二烷基硫酸钠1-3％(w/v)、氯丁醇10-35％(v/v)和聚乙二醇PEG200 10-30％(v/v)。
从上述描述可知，本发明的有益效果在于：本发明提供的粪便保存液用于保存粪便类样品，可以在常温下保持粪便中微生物的构成稳定在刚刚离体时的状态，避免粪便样本中的细胞及核酸受环境影响被破坏或降解，保持粪便内的细菌构成不发生显著性的变化，保存液中添加的聚乙二醇PEG200，有助于溶解粪便样本中的脂类物质，使粪便在保存液中更趋于分散，有利于微生物和细胞的稳定。该粪便保存液制备方法简单，易于实验室配置使用也易于工业化批量生产，且使用方便、快捷。
进一步的，所述粪便保存液的pH值为7.0-8.0。
进一步的，上述的粪便保存液，具体包括以下组分：三羟甲基氨基甲烷0.20M、乙二胺四乙酸0.30M、氯化钠5mM、十二烷基硫酸钠2％(w/v)、氯丁醇25％(v/v)和聚乙二醇PEG200 15％(v/v)。
进一步的，上述的粪便保存液的制备方法，包括以下步骤：三羟甲基氨基甲烷、乙二胺四乙酸、氯化钠、十二烷基硫酸钠1-3％、氯丁醇10-35％和聚乙二醇PEG200混合后用无菌无核酸去离子水溶解，过0.22um的滤膜过滤或高压灭菌，得到粪便保存液。
进一步的，上述的粪便保存液在粪便样本保存中的应用，10ml粪便保存液用于保存0.5-2g粪便。
实施例1-3和对比例1的粪便保存液的组成见表1所示。
表1
| 原料名称 | 对比例1 | 实施例1 | 实施例2 | 实施例3 |
| 三羟甲基氨基甲烷 | 0.20M | 0.20M | 0.15M | 0.30M |
| 乙二胺四乙酸 | 0.30M | 0.30M | 0.25M | 0.55M |
| 氯化钠 | 7mM | 5mM | 10mM | 20mM |
| 十二烷基硫酸钠 | / | 2％(w/v) | 1(w/v) | 3(w/v) |
| 氯丁醇 | / | 25％(v/v) | 10(v/v) | 35(v/v) |
| 聚乙二醇PEG200 | / | 15％(v/v) | 10(v/v) | 30(v/v) |
| 异硫氰酸胍 | 0.5M | / | / | / |
| 无水乙醇 | 20％ | / | / | / |
上述的粪便保存液的制备方法，包括以下步骤：三羟甲基氨基甲烷、乙二胺四乙酸、氯化钠、十二烷基硫酸钠1-3％、氯丁醇10-35％和聚乙二醇PEG200混合后用无菌无核酸去离子水溶解，过0.22um的滤膜过滤或高压灭菌，得到粪便保存液。
上述的粪便保存液在粪便样本保存中的应用，10ml粪便保存液用于保存0.5-2g粪便。
实验例1：
采集4名志愿者(第一名、第二名、第三名和第四名)的粪便样本，每名志愿者的样本分装四份，分别采用四种不同的方法进行保存，每种设置3个平行。
1)冻存：称取0.2g粪便样本，-80℃下密封、避光保存一周，然后进行DNA提取；
2)对比例1保存液保存：称取0.2g粪便样本，使用对比例1的粪便保存液，室温下(25℃)密封、避光保存一周，然后进行DNA提取；
3)实施例1保存液保存：称取0.2g粪便样本，使用事实例1的粪便保存液，室温下(25℃)密封、避光保存一周，然后进行DNA提取；
4)室温保存：称取0.2g粪便样本，不使用保存液，室温下(25℃)密封、避光保存一周，然后进行DNA提取。
对上述保存后的粪便样本进行DNA提取，具体包括以下步骤：
提取试剂盒：
Fast DNA Stool Mini；
1)每个样本加入2ml InhibitEX Buffer，振荡混匀1min；
2)取1.2ml的步骤1)的混合物至新的2ml离心管，最高速离心1min；
3)取25μl蛋白酶K至新的2ml离心管中；
4)取600μl步骤2)中的上清液至步骤3)中的离心管中；
5)加入600μl Buffer AL，振荡混匀15秒；
6)70℃孵育10min；
7)加入600μl无水乙醇，振荡混匀；
8)取600μl步骤7)中的混合物至QIAamp spin柱，高速离心1min，弃离心后的废液；
9)重复步骤8)致所有步7)中的混合物过QIAamp spin柱，弃离心废液；
10)在QIAamp spin柱中加入500μl Buffer AW1，高速离心1min，弃废液；
11)在QIAamp spin柱中加入500μl Buffer AW2，高速离心3min，弃废液；
12)将QIAamp spin柱置于新的2ml离心管中，高速离心3min；
13)将QIAamp spin柱置于新的1.5ml离心管中，加入200μl Buffer ATE，室温静置1min；
(14)高速离心1min，得到洗脱的DNA，-20℃保存。
利用Qbuit 4.0测得DNA浓度见表2所示。其中，S1、S2、S3代表3位志愿者(第一名、第二名和第三名)，-1表示冻存、-2表示对比例1保存液保存、-3表示实施例1保存液保存、-4表示室温保存。
表2
| 样本 | 浓度(ng/μl) |
| S1-1 | 152.61 |
| S1-2 | 112.62 |
| S1-3 | 215.31 |
| S1-4 | 88.26 |
| S2-1 | 149.38 |
| S2-2 | 130.85 |
| S2-3 | 224.37 |
| S2-4 | 85.41 |
| S3-1 | 209.46 |
| S3-2 | 155.48 |
| S3-3 | 274.58 |
| S3-4 | 96.35 |
可以看出，S1、S2、S3的志愿者的样本，本发明实施例1的粪便保存液测得的DNA浓度最高，冻存一周的效果次之，可能是因为冻融而导致的DNA略有降解，对比例1的粪便保存液再次之，直接室温保存的最差。
S4代表第四名志愿者，对4名志愿者保存后的粪便中的大肠杆菌DNA以及DNA中的β-actin进行检测，结果如下；
对DNA中的β-actin进行检测，检测结果如图1-4所示。可以看出4位志愿者的β-actin的检测效果从好到差以次均为-3、-1、-2、-4。
对保存后的粪便中的大肠杆菌DNA进行检测，检测结果如图5-8所示。可以看出4位志愿者的大肠杆菌的检测效果从好到差以次均为-3、-1、-2、-4。
实验例2：
实施例1中的聚乙二醇PEG200分别用PEG400、PEG600、PEG1000代替配制粪便保存液。采集3名志愿者(第五名、第六名和第七名)的粪便样本，每名志愿者的样本分装四份，分别采用这四种含不同聚乙二醇的保存液进行保存，每种设置3个平行。对不同保存液粪便中DNA的提取方法同实验例1。
利用Qbuit 4.0测得DNA浓度见表3所示。其中，S5、S6、S7代表3位志愿者，-200表示使用含PEG200的保存液保存、-400表示使用含PEG400的保存液保存、-600表示使用含PEG600的保存液保存、-1000表示使用含PEG1000的保存液保存。
表3
| 样本 | 浓度(ng/μl) |
| S5-200 | 237.12 |
| S5-400 | 178.87 |
| S5-600 | 123.52 |
| S5-1000 | 97.09 |
| S6-200 | 187.94 |
| S6-400 | 115.32 |
| S6-600 | 91.53 |
| S6-1000 | 72.21 |
| S7-200 | 210.77 |
| S7-400 | 175.84 |
| S7-600 | 124.56 |
| S7-1000 | 99.66 |
从表3中可以看出，使用PEG200以外的聚乙二醇代替聚乙二醇PEG200后，无法有效起到保持微生物和细胞的稳定、提升提取DNA浓度的效果。
综上所述，本发明提供的粪便保存液用于保存粪便类样品，可以在常温下保持粪便中微生物的构成稳定在刚刚离体时的状态，避免粪便样本中的细胞及核酸受环境影响被破坏或降解，保持粪便内的细菌构成不发生显著性的变化，保存液中添加的聚乙二醇PEG200，有助于溶解粪便样本中的脂类物质，使粪便在保存液中更趋于分散，有利于微生物和细胞的稳定。该粪便保存液制备方法简单，易于实验室配置使用也易于工业化批量生产，且使用方便、快捷。
以上所述仅为本发明的实施例，并非因此限制本发明的专利范围，凡是利用本发明说明书及附图内容所作的等同变换，或直接或间接运用在相关的技术领域，均同理包括在本发明的专利保护范围内。
Claims (5)
1.一种粪便保存液，其特征在于，包括以下组分：
三羟甲基氨基甲烷0.15-0.30M、乙二胺四乙酸0.25-0.55M、氯化钠5-20mM、十二烷基硫酸钠1-3%（w/v）、氯丁醇10-35%（v/v）和聚乙二醇PEG200 10-30%（v/v）。
2.根据权利要求1所述的粪便保存液，其特征在于，所述粪便保存液的pH值为7.0-8.0。
3.根据权利要求1所述的粪便保存液，其特征在于，包括以下组分：
三羟甲基氨基甲烷0.20M、乙二胺四乙酸0.30M、氯化钠5mM、十二烷基硫酸钠2%（w/v）、氯丁醇25%（v/v）和聚乙二醇PEG200 15%（v/v）。
4.权利要求1-2任意一项所述的粪便保存液的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：三羟甲基氨基甲烷、乙二胺四乙酸、氯化钠、十二烷基硫酸钠、氯丁醇和聚乙二醇PEG200混合后用无菌无核酸去离子水溶解，0.22um的滤膜过滤或高压灭菌，得到粪便保存液；
粪便保存液中三羟甲基氨基甲烷0.15-0.30M、乙二胺四乙酸0.25-0.55M、氯化钠5-20mM、十二烷基硫酸钠1-3%（w/v）、氯丁醇10-35%（v/v）和聚乙二醇PEG200 10-30%（v/v）。
5.权利要求1-3任意一项所述的粪便保存液在粪便样本保存中的应用，其特征在于，10ml粪便保存液用于保存0.5-2g粪便。
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