CN111004793B

CN111004793B - 一种具有高稳定性的重组纤维素酶MaCel

Info

Publication number: CN111004793B
Application number: CN202010025119.XA
Authority: CN
Inventors: 吴边; 朱彤; 孙瑨原; 李瑞峰
Original assignee: Institute of Microbiology of CAS
Current assignee: Institute of Microbiology of CAS
Priority date: 2020-01-10
Filing date: 2020-01-10
Publication date: 2022-02-01
Anticipated expiration: 2040-01-10
Also published as: CN111004793A

Abstract

本发明属于基因制备纤维素技术领域。本发明公开了一种具有强的耐热、耐盐与耐有机溶剂能力的重组纤维素酶MaCel，其氨基酸序列如序列表中SEQ ID NO.1所示。

Description

一种具有高稳定性的重组纤维素酶MaCel

技术领域

本发明属于基因制备纤维素技术领域。

背景技术

第二代生物燃料的生产以玉米芯、玉米秸秆等农作物废料为原料，经过木质纤维素的降解与乙醇的发酵生产两大环节，获得最终产品生物乙醇。目前木质纤维素的降解一般采用化学处理与生物降解相结合的方式，而纤维素酶是生物降解过程中重要的生物催化剂。纤维素的生物降解过程常在高温下进行，例如堆肥过程的温度一般在60℃左右，这要求纤维素酶具有优秀的热稳定性以保证其持续催化能力。在生物降解之前，往往会先使用碱处理法对植物原料进行初步加工，之后加酸中和以提供适合生物降解的中性环境，而酸碱中和会产生大量的盐，这便要求纤维素酶具有优秀的耐盐能力，从而在高盐环境中依然保留较高活性。另外，纤维素降解与乙醇发酵的一锅反应工艺虽然尚未应用于实际生产中，但已成为当下学术界的研究热点，未来能够耐受较高乙醇浓度的纤维素酶在一锅反应工艺中将具有显著优势。因此，具有优秀的热稳定性、耐盐能力、耐乙醇等有机溶剂能力的纤维素酶在生物燃料的生产中能够发挥出明显优势，降低使用的酶量与补酶频率，从而降低生产成本。

发明内容

本发明公开了一种具有强的耐热、耐盐与耐有机溶剂能力的重组纤维素酶MaCel，其氨基酸序列如序列表中SEQ ID NO.1所示。

附图说明

图1是重组纤维素酶MaCel和已报道的高相似度蛋白质的序列比对图。

其中，A是与GH5结构域的序列比对，MaCel野生型的第40-328位氨基酸部分与CelE1(PDB:4M1R)最相似(序列相似度57％)；B是CBM64结构域的序列比对，MaCel野生型的第342-426位氨基酸部分与StCBM64A(PDB:5E9P)最相似(序列相似度76％)。

图2是重组纤维素酶MaCel的重组质粒图谱与蛋白表达结果图。

其中，A是重组纤维素酶MaCel的载体构建图，野生型第1-34位氨基酸被删除，第35-426位氨基酸的基因整合到pET21a载体上，C端融合His标签；B 是重组纤维素酶MaCel经表达、纯化后得到的蛋白质的电泳图，M为分子量标记， 1为重组纤维素酶MaCel。

图3是重组纤维素酶MaCel性能表征图。

其中，A是pH值对酶活的影响；B是反应温度对酶活的影响；C是二价金属离子对酶活的影响；D是底物浓度对酶活的影响(用于计算酶学常数)。

图4是高密度发酵生产重组MaCel图。

图5是重组纤维素酶MaCel的稳定性测试图。

其中，A是通过荧光定量PCR法测定的酶的Tm值为76℃；B是酶的热稳定性测试；C是酶的NaCl耐受能力测试；D是酶的有机溶剂耐受能力测试。

具体实施方式

实施例1

1.酶的来源与获取

重组纤维素酶MaCel的序列来源于油藏微生物(Mahella australiensis) 50-1BON菌株(NCBI编号:txid697281)的基因组。

根据NCBI数据库中的信息，该菌株来自澳大利亚的Riverslea油田，采集自石油样品，为厌氧菌，最适生长温度50℃，最适生长pH值为7.5，最高NaCl 耐受浓度为4％，其基因组序列在2011年被测定。该基因组中的一个基因(NCBI 编号AEE96310.1)被注释为纤维素酶(预测)，对其序列进行分析，发现该潜在酶由信号肽、糖苷水解酶家族5结构域(glycosylhydrolase family 5)和糖类结合模块家族64结构域(carbohydrate-binding modulefamily 64)组成。第40-328位氨基酸和已报道的耐热纤维素酶CelE1具有57％的序列相似度，第 342-426位氨基酸和已报道的纤维素结合域StCBM64A具有76％的序列相似度，两个结构域组成的整体(第40-426位氨基酸)与已有文献报道蛋白质的序列相似度低于57％，因此认为这个基因能编码一个新型纤维素酶，重组表达了这个蛋白并测定其酶学性质。

2.重组纤维素酶MaCel的制备与纯化

对油藏微生物(Mahella australiensis)50-1BON菌株的编码信号肽的核苷酸序列(第1至34位)删除，优化编码剩余氨基酸(第35至426位)序列的密码子后获得重组纤维素酶基因序列，通过DNA合成仪合成对应的重组纤维素酶基因序列。将合成的重组纤维素酶基因序列***pET21a载体(两端连接位点为NdeI 和XhoI)，获得重组质粒pET21a-MaCel。将重组质粒转入大肠杆菌BL21(DE3)菌株，获得生产重组纤维素酶MaCel的工程菌株。经过发酵表达，镍柱纯化后得到重组纤维素酶MaCel，分子量在44kDa左右。重组纤维素酶MaCel的氨基酸序列如序列表1(SEQ ID NO.1)所示。

(1)重组纤维素酶MaCel的制备方法

将含有pET21a-MaCel重组质粒的大肠杆菌BL21(DE3)菌株作为生产菌株。

在新鲜的LB平板上挑取单克隆至50mL LB培养基(250mL摇瓶)中，37℃旋摇(200rpm)培养至细胞密度OD₆₀₀约为2.0，将其作为种子液接入2L发酵罐。发酵罐的底料为1L无机盐培养基，成分为：13.4g/L磷酸二氢钾、4.0g/L 硫酸铵、1.8g/L一水合柠檬酸、0.6g/L七水合硫酸镁、10.0g/L一水合葡萄糖、50mg/L氨苄霉素以及1％(v/v)微量元素溶液(含有0.8g/L乙二胺四乙酸二钠、0.3g/L六水合氯化钴、1.5g/L四水合氯化锰、0.2g/L二水合氯化铜、 0.3g/L硼酸、0.3g/L二水合钼酸钠、1.0g/L氯化锌和11.4g/L柠檬酸铁铵)。

整个发酵过程中，pH值保持在6.96-7.04之间(用50％氨水调节)，通气量维持在1L/min，初始转速保持在500rpm，后期设置为自动控制转速，将溶氧值保持在25-35％之间。发酵过程具体分为三个阶段：第一阶段，从接种开始保持37℃培养；第二阶段，以溶氧值突然上升(2min内上升超过30％)为开始标志，向发酵罐中流加补料液(含50％(m/v)一水合葡萄糖、2.0g/L七水合硫酸镁和 1％(v/v)微量元素溶液)，流加速度为10mL/h；第三阶段，以细胞密度达到20 为开始标志，将培养温度下调至30℃，向发酵罐中加入IPTG(终浓度0.5mM) 诱导基因表达。在发酵总时长达到15h时停止发酵，收集发酵液。

(2)MaCel的纯化方法

取50mL发酵液，离心(8,000g，10min，4℃)收集菌体，菌体用30mL 溶液A(含50mM磷酸二氢钾、200mM氯化钠和20mM咪唑，pH＝7.5)重悬，用超声破碎仪破碎后，离心(14,000g，30min，4℃)分离上清与沉淀，上清即为粗酶。使用Bio-Rad NGC Quest 10中高压层析***进行纯化操作，将粗酶装载至5mL镍柱(HisTrap HP，GE Healthcare公司)，流速5mL/min；之后用 50mL溶液B(含50mM磷酸二氢钾、200mM氯化钠和40mM咪唑，pH＝7.5)洗去杂蛋白，流速5mL/min；接着使用溶液C(含50mM磷酸二氢钾、200mM氯化钠和200mM咪唑，pH＝7.5)将MaCel从镍柱上洗脱，再使用30kDa截流柱将洗脱液用溶液D(含50mM磷酸二氢钾，pH＝7.5)置换缓冲液。纯化后重组纤维素酶MaCel储存在-20℃冰箱。

3.重组纤维素酶MaCel的活性

活性测定方法如下：在1.5mL EP管中加入0.95mL 1.5％羧甲基纤维素钠溶液(含50mM Tris-HCl，pH＝7.5)，在65℃水浴下预热10min，再加入0.05 mL MaCel纯酶溶液(0.02mg/mL)，65℃反应15min，加入1.5倍体积的DNS试剂终止反应，沸水浴加热5min以显色，用分光光度计测定540nm下的吸收值来测定还原糖的浓度(标准曲线用葡萄糖溶液作为参照)，一个酶活单位(U)定义为1min内产生1μmol的还原糖所需的酶量。

经测试，该酶的最适反应温度为65℃，最适反应pH为7.5，反应体系中存在0.5mM氯化钴可以大幅提高MaCel的活性。添加氯化钴后，该酶比活为367 U/mg，酶学常数K_m＝(12.8±1.4)mg·mL^-1，K_cat＝(514±32)s^-1，K_cat/K_m＝(40.2±5.1) mL·mg^-1·s^-1。根据这些活性数据，大肠杆菌高密度发酵的产量如下：发酵15h产量达到1.7×10⁶U/L,生产速率为1.2×10⁵U/(L·h)。

表1是pH值对酶活的影响

表2是反应温度对酶活的影响

温度(℃)	相对活性(％)
		20	24±3
30	44±7
		40	68±7
50	69±2
		55	76±2
60	88±6
		65	100±2
70	96±5
		75	88±5
80	72±4
		90	46±2

表3是二价金属离子对酶活的影响

浓度

Mg

Ca

Mn

Fe

Co

Ni

Cu

Zn

0.5mM

101+5

112+2

100+2

102+1

202+8

75+2

115+3

46+2

5mM

99+6

134+5

101+7

88+4

213+3

41+2

88+7

13+2

(数据为相对于未添加金属离子时的活性，单位为％)

表4是底物浓度对酶活的影响

底物浓度

0.25％

0.5％

0.75％

1％

1.25％

1.5％

含0.5mM氯化钴

124±16

183±30

258±13

309±13

339±16

377±28

不含氯化钴

68±4

120±9

151±10

194±14

213±15

230±12

(数据为比酶活，单位为U/mg)

表5是高密度发酵生产重组MaCel

4.酶的高稳定性

该酶具有强的耐热、耐盐与耐有机溶剂能力。

热稳定性方面，该酶在50℃热处理24h后能保留82％活性，60℃热处理24 h后能保留67％活性；盐稳定性方面，并在高盐环境下仍具有较高活性，15％NaCl 酶活相对于无盐条件下酶活提高1倍，30％NaCl相对于无盐条件下酶活提高20％；有机溶剂稳定性方面，该酶在20％甲醇、乙醇、异丙醇或15％丙酮中保留超过70％的酶活。

表6是不同温度下酶的相对活性

温度

0h

2h

4h

6h

9h

24h

50℃

100±4

97±3

98±7

89±5

85±2

79±3

55℃

100±3

101±7

95±2

88±2

86±4

72±2

60℃

100±7

91±3

90±4

84±2

82±6

67±2

65℃

100±2

96±2

83±2

71±7

55±9

44±10

(数据为以0h作基准的相对活性，单位为％)

表7是酶的NaCl耐受能力测试

NaCl浓度(％)	0	5	10	15	20	25	30
								相对活性(％)	100±3	173±13	178±8	193±3	184±10	152±8	122±2

表8是酶的有机溶剂耐受能力测试

浓度(％)	甲醇	乙醇	异丙醇	丙酮
					5	100±2	97±6	98±9	95±3
10	92±2	88±8	94±2	81±4
					15	87±3	78±3	91±3	75±6
20	78±4	72±5	80±2	59±4

(数据为以不含有机溶剂作基准的相对活性，单位为％)。

序列表

<110> 中国科学院微生物研究所

<120> 一种具有高稳定性的重组纤维素酶MaCel

<160> 1

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 401

<212> PRT

<213> 油藏微生物(Mahella australiensis)

<400> 1

Met Ser Ser Ile Val Ala Ser His Gly Met Leu Lys Val Val Gly Asn

1 5 10 15

Lys Val Cys Asp Ala Ser Gly Lys Pro Ile Gln Leu Lys Gly Met Ser

20 25 30

Leu Phe Trp Ser Gln Trp Ser Thr Pro Phe Trp Asn Ala Asp Leu Val

35 40 45

Asn Asn Leu Ala Ser Thr Trp Asn Ala Thr Leu Ile Arg Ala Ala Met

50 55 60

Gly Val Asp Glu Gly Gly Tyr Ile Ser Asn Pro Gln Val Glu Lys Gln

65 70 75 80

Lys Val Ile Thr Val Val Asp Ala Ala Ile Asn Ala Gly Ile Tyr Val

85 90 95

Ile Ile Asp Trp His Ser His Asp Ile His Thr Ser Glu Ala Val Ala

100 105 110

Phe Phe Gly Glu Met Ala Gln Arg Tyr Lys Asn Thr Pro Asn Val Ile

115 120 125

Phe Glu Ile Phe Asn Glu Pro Asp Tyr Glu Ser Trp Ala Gln Val Lys

130 135 140

Thr Tyr Ser Thr Gln Val Ile Asn Thr Ile Arg Ser Thr Gly Ala Gln

145 150 155 160

Asn Leu Ile Leu Val Gly Ser Pro Thr Trp Ser Gln Asp Val Asp Val

165 170 175

Ala Ala Asn Asp Pro Ile Thr Gly Phe Ser Asn Ile Ala Tyr Thr Leu

180 185 190

His Phe Tyr Ala Gly Thr His Lys Gln Tyr Leu Arg Asp Lys Ala Ile

195 200 205

Thr Ala Met Ser Lys Gly Leu Ala Leu Phe Val Ser Glu Trp Gly Thr

210 215 220

Cys Asp Ala Ser Gly Asn Gly Asn Leu Asp Leu Thr Glu Ser Gln Arg

225 230 235 240

Trp Ile Asp Phe Met Asn Gln Tyr Gln Ile Ser Trp Ala Asn Trp Ser

245 250 255

Met Asn Asp Lys Ala Glu Thr Ala Ser Ala Leu Val Val Gly Ala Ser

260 265 270

Thr Thr Gly Pro Trp Pro Asp Ser Gln Leu Thr Glu Ser Gly Lys Phe

275 280 285

Val Lys Ala Lys Ile Met Glu Asn Thr Pro Val Pro Pro Ser Gly Gly

290 295 300

Thr Thr Pro Pro Gly Glu Tyr Thr Gly Ile Gly Leu Pro Phe Thr His

305 310 315 320

Asp Gly Ala Gly Glu Tyr Tyr Trp Lys Thr Asn Lys Leu Ser Thr Asp

325 330 335

Pro Asn Asp Trp Ser His Tyr Ile Asn Ser Trp Asn Leu Asp Leu Leu

340 345 350

Glu Ile Asn Gly Lys Asp Tyr Thr Asn Val Trp Val Ala Gln His Gln

355 360 365

Ile Ala Pro Ser Ser Asp Gly Tyr Trp Tyr Ile His Tyr Lys Gly Ser

370 375 380

Ala Ser Ser Ala His Met Glu Met Lys Leu Glu His His His His His

385 390 395 400

His

Claims

1.一种重组纤维素酶MaCel在降解纤维素中的应用，其特征在于，所述重组纤维素酶的氨基酸序列如序列表中SEQ ID NO.1所示。

2.根据权利要求1所述的应用，其特征在于，所述重组纤维素酶的适用温度为40℃-80℃。

3.根据权利要求1所述的应用，其特征在于，所述重组纤维素酶适用于NaCl的质量浓度为0-30％的环境。

4.根据权利要求1所述的应用，其特征在于，所述重组纤维素酶适用于含0-20％的甲醇或0-20％的乙醇或0-20％的异丙醇或0-15％丙酮的环境。