CN111004788B - 一种果胶酯酶及其制备方法和应用 - Google Patents

一种果胶酯酶及其制备方法和应用 Download PDF

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Abstract

本发明公开了一种果胶酯酶及其制备方法和应用，制备方法包括，将基因工程菌株pEASY‑E1‑243/BL21接种至改良LB发酵培养液中扩培发酵，随后添加IPTG诱导产果胶酯酶，获得成熟发酵液后添加蛋白酶抑制剂，超滤收集分子量在10‑50kD的酶液；利用该果胶酯酶对高酯果胶的脱酯方法为，将果胶酯酶添加到浓度为10‑12w/v％的高酯果胶溶液中，其添加量为控制活力100‑200U/mL，40‑45℃下酶解2‑3h。本发明所提供的果胶酯酶的制备方法简单，发酵周期短，成本低，且产物含外源酶少；利用其酶解高酯果胶可避免破坏原料中果胶的主链，能获得品质均一的大分子量低酯果胶。

Description

一种果胶酯酶及其制备方法和应用
技术领域
本发明涉及微生物发酵技术领域，具体涉及一种果胶酯酶及其制备方法和应用。
背景技术
果胶是存在于植物细胞壁中的一种高分子糖类聚合物，其相对分子量介于5×105-30×105之间。通常把酯化度高于50％(相当于甲氧基含量为7％-16.3％)的果胶称为高酯果胶，把酯化度低于50％(相当于甲氧基含量小于7％)的果胶称为低酯果胶。
在食品加工过程中，高酯果胶在糖浓度高于55°Brix和pH值低于3.5的条件下受热能形成凝胶，主要用于高糖食品的生产；低酯果胶只需较低的糖浓度甚至无糖条件下，就能在Ca2+或其它二价阳离子体系中形成凝胶。为了满足肥胖和糖尿病等人的需要，低酯果胶可制成低热量的食品，这使低酯果胶的需求量越来越大。
然而，天然低酯果胶来源有限，主要是由高酯果胶在一定条件下通过酶法脱酯、酸法脱酯和碱法脱酯等工艺制备。覃章龙等在2011年报道了传统的酸水解、碱水解均对果胶主链有不同程度的降解，导致果胶分子链缩短，而利用酶法制备低酯果胶具有专一性，明显优于其他方法得到的低酯果胶；杨蕙于2017年比较了不同脱酯方法制备的果胶样品，结果表明，酶法脱酯获得的果胶样品分子链最长，其稀溶液的粘度最大，对大豆蛋白溶液的稳定性效果最好。
酶法脱酯制备低酯果胶的关键是获得优良的果胶酯酶。通常天然微生物产果胶酯酶的同时也产果胶解聚酶，其发酵的粗酶液水解果胶酯键的同时也会在果胶主链的α-1，4-糖苷键发生水解作用或消去作用，缩短了果胶主链。若要用天然微生物发酵生产的果胶酯酶，还需经过纯化分离获得单一果胶酯酶，这一过程新增了生产设备，延长了生产周期，增加生产成本。因此，探索果胶酯酶新的微生物来源和简便的生产工艺势在必行。
随着分子生物学技术的发展，从天然微生物中克隆出果胶酯酶基因，构建基因工程菌株，用于发酵生产特定的果胶酯酶具有重要的实际生产意义。
发明内容
针对现有技术存在的不足，本发明提供了一种果胶酯酶及其制备方法和应用。
为达到上述目的，本发明采用以下技术方案：
一种果胶酯酶的制备方法，包括，将基因工程菌株pEASY-E1-243/BL21接种至含Amp120μg/mL的改良LB发酵培养液中扩培发酵，随后添加IPTG诱导产果胶酯酶，获得成熟发酵液后添加蛋白酶抑制剂，超滤收集分子量在10-50kD的酶液，即得；
其中，所述改良LB发酵培养液的质量比配方为：葡萄糖0.42％-0.58％+胰蛋白胨0.7％-1.2％+酵母提取物0.4％-0.58％+NaCl 0.8％-1.2％，余量为水。
在上述技术方案中，所述IPTG(异丙基-β-D-硫代吡喃半乳糖苷)的添加时间为扩培发酵至OD600为0.4-0.6，所述IPTG的添加量为控制其终浓度为1.15-1.25mmol/L。
进一步地，在上述技术方案中，所述蛋白酶抑制剂的添加时间为，添加IPTG后，在25-30℃诱导培养12-18h，获得成熟发酵液。
具体地，在上述技术方案中，所述成熟发酵液中的果胶酯酶活力大于500U/mL。
具体地，在上述技术方案中，所述蛋白酶抑制剂为PMSF和DTT。
优选地，在上述技术方案中，所述PMSF和DTT的添加量为控制其终浓度分别为1-1.5mmol/L。
又进一步地，在上述技术方案中，所述扩培发酵的方法为：按体积比为1:40-50的比例将所述pEASY-E1-243/BL21的种子液与所述改良LB发酵培养液置于密封的发酵罐中，控制灌装量为发酵罐容积的50％-60％，同时通过添加NH3·H2O控制pH值为7.0-7.5，35-37℃，搅拌速度为200-220r/min，对应于每升种子液的通气量为0.6-0.8m3/h。
再进一步地，在上述技术方案中，在用于扩培发酵前，所述改良LB发酵培养液用NH3·H2O调pH值为7.5，并在121℃下灭菌30min，冷却后添加无菌氨苄青霉素至终浓度为110-130μg/mL。
本发明另一方面提供了上述制备方法制备得到的果胶酯酶。
本发明又一方面提供了上述制备方法或上述果胶酯酶在高酯果胶降酯中的应用。
本发明还一方面提供了利用上述制备方法或上述果胶酯酶酶解高酯果胶的方法，将所述果胶酯酶添加到浓度为10-12w/v％的高酯果胶溶液中，所述果胶酯酶的添加量为控制其活力为100-200U/mL，在40-45℃下酶解2-3h。
在上述技术方案中，还包括，酶解后，采用1-1.5mol/L NaOH溶液中和，真空干燥或低温蒸发浓缩至浓度为2-3g/L，随后在98％的乙醇溶液中静置沉淀，固液分离，并用65％的乙醇溶液洗涤沉淀，烘干后粉碎过筛。
本发明的优点：
(1)本发明所提供的果胶酯酶的制备方法，采用原核微生物(大肠杆菌)为受体的基因工程菌株pEASY-E1-243/BL21发酵生产特定的果胶酯酶，与真核微生物相比，具有发酵周期短的优势；
(2)本发明所提供的果胶酯酶的制备方法，采用基因工程菌株pEASY-E1-243/BL21分泌的果胶酯酶较天然菌来源的果胶酯酶含有的外源酶少，经过粗分离即可获得满足后续要求的酶液，方法简单、成本低廉、易于推广应用，实际应用前景广阔，理论和实际意义重大；
(3)利用本发明所提供的果胶酯酶酶解高酯果胶制备低酯果胶，可避免天然菌产生的其他果胶酶(果胶解聚酶、果胶裂解酶等)破坏原料中果胶的主链，能获得品质均一的大分子量低酯果胶。
附图说明
图1为本发明实施例所提供的果胶酯酶的制备方法的工艺流程图。
具体实施方式
下面结合附图和具体实施例，对本发明的具体实施方式作进一步详细描述。
以下实施例用于说明本发明，但不用来限制本发明的保护范围，本发明的保护范围以权利要求书为准。
若未特别指明，本发明实施例中所用的实验试剂和材料等均可市售获得，若未具体指明，本发明实施例中所用的技术手段均为本领域技术人员所熟知的常规手段。
实施例1一种果胶酯酶的制备方法
如图1所示，从中国农业科学院麻类研究所农产品加工微生物遗传改良与应用团队-80℃保存的甘油管吸取1mL基因工程菌pEASY-E1-243/BL21菌液接种至200mL改良LB培养液(含Amp 120μg/mL)，充分混匀，200r/min，37℃培养10-12h，即为种子液。
上述改良LB培养液的质量比配方为：葡萄糖0.5％+胰蛋白胨1％+酵母提取物0.5％+NaCl 1％，并用NH3·H2O调pH值为7.5。
将600mL种子液直接接种至盛有30L改良LB培养液(含Amp120μg/mL)的50L发酵罐(瑞士比欧，德国)中，不断自动补加氨水(NH3·H2O)，使pH维持至7.0，通气量0.8m3/h，37℃，200r/min培养3-4h，使OD600达到0.5左右，添加IPTG至终浓度为1.2mmol/L，改为28℃诱导培养12-18h，即得成熟发酵液。
具体地，上述IPTG溶液母液配制浓度为20％(0.8mol/L)，经0.2μm滤膜过滤除菌，-80℃保存备用。使用时冰上解冻，尽量减少反复冻融的次数，以免失效。
发酵液中果胶酯酶活力检测方法为：用pH 6.0柠檬酸-Na2HPO4缓冲液配置5mg/mL的橘子果胶(DE为85％)溶液。取10mL 0.5％果胶溶液，40℃水浴平衡5min，加入2mL适当稀释的酶液，40℃保温30min后，煮沸终止反应，用0.02mol/L NaOH滴定产生的羧基基团。以煮沸灭活的酶液做相同的处理作阴性对照。酶活力单位定义为：底物每分钟释放出1μmol羧酸所需的酶量为一个酶活力单位(以U表示)。
在4-8℃条件下，将上述30L成熟发酵液添加蛋白酶抑制剂PMSF和DTT，同时控制PMSF和DTT的终浓度分别为1.2mmol/L，通过0.2μm超滤膜包(赛多利斯，德国)过滤除菌，再先后通过50kD和10kD膜包过滤，收集到10-50kD部分的超滤液3L，即为果胶酯酶液。
具体地，上述PMSF溶液母液的配制浓度为0.15mol/L，DTT溶液母液的配制浓度为1mol/L，分装后-20℃保存；避免反复冻溶，保质期一个月。
对比例1一种果胶酯酶的制备方法
与实施例1类似，从中国农业科学院麻类研究所农产品加工微生物遗传改良与应用团队-80℃保存的甘油管吸取1mL基因工程菌pEASY-E1-243/BL21菌液接种至200mL改良LB培养液(含Amp 120μg/mL)，充分混匀，200r/min，37℃培养10-12h，即为种子液。
上述改良LB培养液的质量比配方为：葡萄糖0.5％+胰蛋白胨1％+酵母提取物0.5％+NaCl 1％，并用NH3·H2O调pH值为7.5。
将600mL种子液直接接种至盛有30L改良LB培养液(含Amp 120μg/mL)的50L发酵罐(瑞士比欧，德国)中，不断自动补加氨水(NH3·H2O)，使pH维持至7.0，通气量0.8m3/h，37℃，200r/min培养3-4h，使OD600达到0.25-0.3，添加IPTG至终浓度为1.0mmol/L，改为28℃诱导培养12-18h，即得成熟发酵液。
在4-8℃条件下，将上述30L成熟发酵液添加蛋白酶抑制剂PMSF和DTT，同时控制PMSF和DTT的终浓度分别为1.0mmol/L，成熟发酵液通过0.2μm超滤膜包(赛多利斯，德国)过滤除菌，再先后通过50kD和10kD膜包过滤，收集到10-50kD部分的超滤液3L，即为果胶酯酶液。
对比例2一种果胶酯酶的制备方法
与实施例1类似，从中国农业科学院麻类研究所农产品加工微生物遗传改良与应用团队-80℃保存的甘油管吸取1mL基因工程菌pEASY-E1-243/BL21菌液接种至200mL改良LB培养液(含Amp 120μg/mL)，充分混匀，200r/min，37℃培养10-12h，即为种子液。
上述改良LB培养液的质量比配方为：葡萄糖0.5％+胰蛋白胨1％+酵母提取物0.5％+NaCl 1％，并用NH3·H2O调pH值为7.5。
将600mL种子液直接接种至盛有30L改良LB培养液(含Amp 120μg/mL)的50L发酵罐(瑞士比欧，德国)中，不断自动补加氨水(NH3·H2O)，使pH维持至7.0，通气量0.8m3/h，37℃，200r/min培养3-4h，使OD600达到0.5左右，添加IPTG至终浓度为1.2mmol/L，改为28℃诱导培养12-18h，即得成熟发酵液。
在4-8℃条件下，将上述30L成熟发酵液添加蛋白酶抑制剂PMSF和DTT，同时控制PMSF和DTT的终浓度分别为1.2mmol/L，成熟发酵液通过0.2μm超滤膜包(赛多利斯，德国)过滤除菌，再先后通过100kD和5kD膜包过滤，收集5-100kD部分的超滤液3L，即为果胶酯酶液。
采用考马斯亮蓝G-250法测定成熟发酵液和果胶酯酶中的蛋白质含量。
如下表1所示为本发明实施例和对比例在不同工艺条件下制备得到的果胶酯酶的结果对比表。
表1本发明在不同工艺条件下制备得到的果胶酯酶的结果对比表
Figure BDA0002322790630000071
分析表1的数据可以看出，本发明实施例1中对果胶酯酶的纯化倍数和回收率相对于对比例1和2均较高。
应用例果胶酯酶酶解高酯果胶制备低酯果胶的方法
将实施例1中得到的果胶酯酶液20-30mL添加到10L 10％-12％(w/v)高酯果胶液(DE 65％-85％)，使果胶酯酶浓度为100-200U/mL。控制酶解温度为40-45℃，水解时间为2-3h，得到低酯果胶溶液。
果胶酯化度的检测方法为：称取0.1g冷却后干燥的低酯果胶样品，移入250mL锥形瓶中，用2mL无水乙醇浸湿，加入100mL经煮沸冷却去除二氧化碳的水，用瓶塞塞紧并不断摇动，使样品全部溶解为止；加入5滴酚酞指示剂，用0.02mol/L氢氧化钠溶液滴定，记录消耗氢氧化钠溶液的毫升数(V1)，即为样品的原始滴定度，向样液中继续加入20mL 0.1mol/L的氢氧化钠溶液，用瓶塞塞紧，经强烈摇动后，静置15min，加入20mL 0.1mol/L盐酸溶液，不断摇动使溶液中粉红色消失，然后再加入3滴酚酞指示剂，继续用0.02mol/L氢氧化钠溶液滴定至样液显出微红色，记录所消耗氢氧化钠的毫升数(V2)，即为样品的皂化滴定度。果胶酯化度(％)＝V2×100/(V1+V2)
采用旋转蒸发仪对低酯果胶溶液进行低温浓缩，得到浓度3g/L的果胶浓缩液，再向果胶浓缩液中缓慢加入98％乙醇，静置3h，直至果胶充分沉淀，随后用3倍体积的浓度为65％的乙醇溶液洗涤沉淀2次，在低于50℃下烘干，得到含水量小于2％低酯果胶成品，粉碎过筛得到大分子量的低酯果胶粉末(DE<50％)。
最后，以上仅为本发明的较佳实施方案，并非用于限定本发明的保护范围。凡在本发明的精神和原则之内，所作的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。

Claims (3)

1.一种果胶酯酶的制备方法，其特征在于，包括，将采用原核微生物为受体的基因工程菌株pEASY-E1-243/BL21接种至含Amp120 μg/mL的改良LB发酵培养液中扩培发酵，随后添加IPTG诱导产果胶酯酶，获得成熟发酵液后添加蛋白酶抑制剂，超滤收集分子量在10-50kD的酶液，即得；
其中，所述改良LB发酵培养液的质量比配方为：葡萄糖0.42%- 0.58%+胰蛋白胨0.7%-1.2%+酵母提取物0.4%-0.58%+NaCl 0.8%- 1.2%，余量为水；在用于扩培发酵前，所述改良LB发酵培养液用NH3·H2O调pH值为7.5，并在121℃下灭菌30 min，冷却后添加无菌氨苄青霉素至终浓度为120 μg/mL；所述IPTG的添加时间为扩培发酵至OD 600为0.4-0.6，所述IPTG的添加量为控制其终浓度为1.0-1.2 mmol/L；所述蛋白酶抑制剂的添加时间为，添加IPTG后，在28℃诱导培养12-18 h，获得成熟发酵液；所述蛋白酶抑制剂为PMSF和DTT的混合物，所述PMSF和DTT的添加量为控制其终浓度分别为1.0-1.2 mmol/L。
2.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于，所述扩培发酵的方法为：按体积比为1: 40-50的比例将所述pEASY-E1-243/ BL21的种子液与所述改良LB发酵培养液置于密封的发酵罐中，控制灌装量为发酵罐容积的50%-60%，同时通过添加NH3·H2O控制pH值为7.0，35-37℃，搅拌速度为200 r/min，对应于每升种子液的通气量为0.8 m3/h。
3.权利要求1或2所述的制备方法在高酯果胶脱酯中的应用。
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