CN110982770B

CN110982770B - 一种动态调控脂肪酸代谢途径强化柚皮素合成的方法

Info

Publication number: CN110982770B
Application number: CN201911354531.XA
Authority: CN
Inventors: 周景文; 陈坚; 周胜虎; 邓禹; 堵国成
Original assignee: Jiangnan University
Current assignee: Jiangnan University
Priority date: 2019-12-25
Filing date: 2019-12-25
Publication date: 2021-10-22
Anticipated expiration: 2039-12-25
Also published as: CN110982770A

Abstract

本发明公开了一种动态调控脂肪酸代谢途径强化柚皮素合成的方法动态调控策略调节脂肪酸代谢途径积累丙二酰‑CoA，并进一步强化柚皮素合成的方法，属于代谢工程技术领域。本发明以柚皮素响应蛋白FdeR为基础，利用基因过表达技术和反义RNA抑制技术等调控手段，结合组成型表达柚皮素合成途径，从而建立了一种可感应胞内柚皮素含量的动态循环放大***，强化柚皮素合成，使柚皮素产量提升到原来的3.2倍，达95.1mg/L。本发明实现了细胞生长和产物合成之间的平衡，所述方法为其他高附加值化合物生产菌株的代谢工程改造提供方法借鉴。

Description

一种动态调控脂肪酸代谢途径强化柚皮素合成的方法

技术领域

本发明涉及一种动态调控脂肪酸代谢途径强化柚皮素合成的方法，属于代谢工程技术领域。

背景技术

黄酮类化合物是一类广泛存在与植物组织中的天然产物，具有多种生理功能，如抗癌、抗炎症、抗衰老、调节人体激素水平、抗氧化和保肝护肝等功能，已经被广泛应用于食品和药品中。所有黄酮类化合物都含有三个碳原子连接两个苯环所构成的核心骨架。柚皮素是一种具有最多衍生物的黄酮骨架类物质，经过对柚皮素的后续化学或酶法催化修饰，适当的羟基化、甲基化、糖基化等催化反应，即可生成具有更高附加值和功能多样的黄酮类化合物。

大肠杆菌合成柚皮素等黄酮类化合物过程中，胞内丙二酰-CoA的供给不足是导致最终产量较低的重要原因。胞内丙二酰-CoA绝大部分流向脂肪酸合成途经。此外丙二酰-CoA的前体物质乙酰-CoA大部分进入TCA循环，为菌体生长提供必需的能量。这些都导致了较低的丙二酰-CoA胞内含量。利用代谢工程手段过多的积累胞内丙二酰-CoA不仅会影响菌体生长，还会造成胞内过多的脂酰-CoA衍生物积累，从而进一步影响细胞整体蛋白组的酰基化水平。目前已有报道中，研究者主要通过抑制胞内脂肪酸合成途径积累丙二酰-CoA。Leonard等通过添加浅蓝菌素抑制脂肪酸合成相关基因(fabB/fabF)，分别得到700mg/L和113mg/L的黄酮和花青素。通过强化丙二酰-CoA合成途径来积累丙二酰-CoA同样获得了较大进展。Leonard等和Zhu等通过过表达来自谷氨酸棒状杆菌的乙酰-CoA羧化酶(ACC)极大地提升了黄酮类化合物的产量。

然而，上述静态调控***调控丙二酰-CoA合成需要在合适的时间添加诱导剂，诱导时间、诱导剂浓度和菌体的生长状态等都对最终产量具有较大影响。同时，由于丙二酰-CoA与细胞生长息息相关，过量积累丙二酰-CoA不仅会严重影响细胞生长，还会影响细胞的蛋白质组酰基化水平而进一步改变胞内代谢环境。因此，构建稳定、高效、可动态调节细胞生长和产物合成的柚皮素生产平台菌株至关重要。

发明内容

为了解决上述问题，本发明提供了一种动态响应柚皮素含量调控脂肪酸合成途径的方法，强化胞内丙二酰-CoA积累，从而进一步强化柚皮素合成。

本发明的第一个目的是提供一种动态响应柚皮素含量调控脂肪酸合成途径的方法，是利用动态响应柚皮素含量的生物传感器调控脂肪酸合成途径，所述生物传感器包括柚皮素响应的调控蛋白FdeR和受FdeR调控的启动子P_fdeA，所述调控蛋白FdeR的氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示。

在本发明的一种实施方式中，编码所述调控蛋白FdeR的基因的核苷酸序列如SEQID NO.2所示。

在本发明的一种实施方式中，所述启动子P_fdeA包括P_fdeA(180-1)、P_fdeA(223-1)、P_fdeA(250-1)、P_fdeA(288-1)、P_fdeA(223-50+RBS)、P_fdeA(223-83+RBS)、P_fdeA(223-135+RBS)或P_fdeA(223-180+RBS)。所述P_fdeA(288-1)的核苷酸序列如SEQ ID NO.3所示。

以P_fdeA(288-1)3’端第一个核苷酸为1位、5’端第一个核苷酸为288位计算，P_fdeA(180-1)、P_fdeA(223-1)、P_fdeA(250-1)、P_fdeA(223-50+RBS)、P_fdeA(223-83+RBS)、P_fdeA(223-135+RBS)、P_fdeA(223-180+RBS)启动子所在区域分别为180-1、223-1、250-1、223-50、223-80、223-135和223-180区域(5’-3’)，其中，P_fdeA(223-50+RBS)、P_fdeA(223-83+RBS)、P_fdeA(223-135+RBS)或P_fdeA(223-180+RBS)，在3’端还添加了RBS序列，所述RBS的核苷酸序列为AAGGAG。

在本发明的一种实施方式中，所述调控脂肪酸合成途径包括利用启动子P_fdeA调控目标基因或其反义RNA，从而动态抑制胞内活性ACP含量的策略。

在本发明的一种实施方式中，所述调控脂肪酸合成途径包括利用启动子P_fdeA抑制acpS和acpT基因表达，并过表达acpH基因。

在本发明的一种实施方式中，所述acpH的核苷酸序列如SEQ ID NO.4所示，所述acpS的反义RNA的核苷酸序列如SEQ ID NO.5所示，所述acpT的反义RNA的核苷酸序列如SEQID NO.6所示。

所述反义RNA，含有一个PT发夹回文结构携带目标基因的互补序列，以及一个rrnB终止子结构。

本发明的第二个目的是提供一种动态响应柚皮素含量的生物传感器，包括脂肪酸响应的调控蛋白FdeR和受FdeR调控的启动子P_fdeA，所述调控蛋白FdeR的氨基酸序列如SEQID NO.1所示。

本发明的第三个目的是提供一种动态响应柚皮素含量的载体，含有上述生物传感器。

本发明的第四个目的是提供一种动态响应对柚皮素含量的工程菌株，以上述载体为表达载体。

在本发明的一种实施方式中，所述工程菌株以大肠杆菌为宿主。

在本发明的一种实施方式中，所述工程菌株抑制acpS和acpT基因表达，并过表达acpH基因。

本发明的第五种目的是提供上述生物传感器在食品或制药领域中的应用。

本发明的有益之处：

本发明建立了一种动态响应胞内柚皮素含量调控脂肪酸合成的方法，此方法通过抑制脂肪酸合成代谢途径强化胞内丙二酰-CoA积累，并进一步促进柚皮素合成，因此形成了一个无需添加诱导剂的动态循环放大***。此方法是首次建立的针对微生物发酵生产柚皮素等黄酮类化合物的动态调控方法，为黄酮类化合物的微生物法生产提供了一个高效的代谢调控体系。其他具有相似代谢途径的目标化合物合成同样可采用此方法。与传统的静态方法相比较，本方法最大的优势是无需添加诱导剂，可实现细胞生长、丙二酰-CoA积累以及柚皮素合成之间的动态平衡。更加有助于实现微生物全局代谢网络的平衡，强化目标化合物合成。利用此方法，柚皮素产量可提升到原来的3.2倍，达95.1mg/L。此外，此方法也为其他高附加值化合物的动态合成提供了一定的借鉴意义。

附图说明

图1：启动子P_fdeA结构优化质粒图谱。

图2：不同长度和不同区域的启动子P_fdeA表达强度。

图3：柚皮素响应放大***工作原理。A：柚皮素响应的放大***原理图，组成型启动子表达柚皮素合成途径基因；B：模块B代谢途径和工作原理图；C：发酵过程中acpH，asacpS和asacpT基因表达随柚皮素含量变化关系。

图4：不同组合表达acpS、acpT、acpP和fabD基因的反义RNA和acpH基因菌株胞内乙酰-CoA，丙二酰-CoA和CoA含量变化。+代表过表达，-表示表达的反义RNA抑制该基因，0代表不做任何改变。

图5：动态调控菌株对香豆酸、柚皮素和菌体生长趋势图。A：仅含有柚皮素合成途径(模块A)的对照菌株；B：以低拷贝质粒pACM4为载体构建的放大模块pACM-FdeR-acpH-asacpT-asacpS和模块A组合发酵结果；C：以中拷贝质粒pCOM4为载体构建的放大模块pCOM-FdeR-acpH-asacpT-asacpS和模块A组合发酵结果；D：以高拷贝质粒pRSM3为载体构建的放大模块pRSM-FdeR-acpH-asacpT-asacpS和模块A组合发酵结果。

具体实施方式

材料与方法：

柚皮素合成途径基因由南京金斯瑞合成并进行密码子优化，限制性内切酶和DNA聚合酶分别购自赛默飞和Takara公司，MOPS均购自生工生物工程(上海)股份有限公司。黑色荧光96潜孔板。多功能酶标仪Cytation 3 plate reader(BioTek)用于检测样品荧光强度。大肠杆菌BL21(DE3)用于蛋白质表达和柚皮素合成，大肠杆菌JM109用于分子克隆。

CoA定量方法：为定量CoA、乙酰-CoA和丙二酰-CoA胞内含量，利用Shim-pack VP-ODS(250L×2.0)UPLC色谱柱，在40℃条件下用日本岛津LCMS-IT-TOF进行检测。流动相为以水溶解的15mM甲酸铵(A)和以甲醇溶解的10mM乙酸铵(B)。0.2mL·min^-1流速梯度洗脱条件为，0-5min：10-25％B，5-10min：25-100％B，10-11min：100-10％B，11-13min：保持10％B。以提取离子流(EIC)峰面积积分进行CoA、乙酰-CoA和丙二酰-CoA的定量。CoA、乙酰-CoA和丙二酰-CoA的EIC分别为[M-H]-＝766.5299m/z，[M+H]+＝810.5813m/z和[M-H]-＝852.5764m/z。

RT-PCR方法：利用RNA提取试剂盒RNAprep pure Cell/Bacteria Kit DP430，根据试剂盒说明书分别提取每个菌株的总RNA。然后利用Takara公司试剂盒PrimeScript RTreagent Kit with gDNA Eraser RR047A将总RNA反转录为cDNA，并去除基因组DNA。反转录后的cDNA直接进行RT-qPCR上机实验(Roche，LightCycler 480II)。内参基因为16S rRNA。

附图说明以及以下实施例中所涉及的所有菌体培养都利用LB培养基，培养条件为37℃、220rpm。柚皮素发酵利用MOPS培养基，发酵条件为30℃、220rpm。

本申请涉及的序列如表1所示。

表1本申请涉及的序列

反义RNA序列说明：加粗序列为PT发夹结构，斜体序列为rrnB终止子序列，大写字母为反义RNA与mRNA互补区域序列。

实施例1 P_fdeA启动子结构精简

由于柚皮素的响应蛋白FdeR的识别启动子P_fdeA的最小结构尚不清楚，为了构建高效的调控体系必须利用最小长度的P_fdeA启动子。因此，利用启动子截短策略，从P_fdeA两端不同程度截短启动子(图1)。以pCDM4为出发质粒，经过SpeI/SalI双酶切后与EGFP连接从而构建得到pCDM-EGFP质粒。

以P_fdeA(288-1)启动子为模板，以PfdeA(M)-F/PfdeA(N)-RBS-R或PfdeA(M)-F/PfdeA(1)-R(PfdeA启动子下游第一个碱基编号为1，M为上游引物扩增PfdeA启动子的上游位置，N为下游引物扩增PfdeA启动子的下游位置)为引物对，扩增PfdeA启动子的不同区域。扩增得到的PfdeA启动子区域为：180-1、223-1、250-1、288-1、223-50+RBS、223-83+RBS、223-135+RBS和223-180+RBS。

分别将不同区域的P_fdeA启动子连接至经过KpnI/SpeI双酶切的pCDM-EGFP质粒的EGFP上游。最终得到8种质粒，分别是pCDM-PfdeA(180-1)-EGFP、pCDM-PfdeA(223-1)-EGFP、pCDM-PfdeA(250-1)-EGFP、pCDM-PfdeA(288-1)-EGFP、pCDM-PfdeA(223-50+RBS)-EGFP、pCDM-PfdeA(223-83+RBS)-EGFP、pCDM-PfdeA(223-135+RBS)-EGFP和pCDM-PfdeA(223-180+RBS)-EGFP(图1)。

以pRSF-Duet-1质粒为基础，在XbaI/KpnI位点连接FdeR调控蛋白基因，从而构建得到pRSFR载体。在大肠杆菌中同时转化pRSFR和pCDM-P_fdeA-EGFP质粒，添加不同浓度柚皮素诱导，并检测绿色荧光蛋白强度。结果显示：P_fdeA启动子长度在223-135bp范围内表达荧光蛋白具有较高强度(图2)，达62789荧光强度/OD₆₀₀，是未截短启动子的4.3倍，且启动子长度最短，可用于后续代谢调控。该启动子命名为P_{fdeA(223-135)}。

实施例2脂肪酸合成途径优化

在实施例1的基础上，利用结构精简的P_fdeA启动子构建如图3A、3B所示调控***。以pACM4载体为骨架，以大肠杆菌为宿主，基于ePathbrick原理将P_{fdeA(223-135)}启动子分别克隆至acpS、acpT、acpP和fabD基因的反义RNA上游调控其表达，同时用P_{fdeA(223-135)}启动子过表达acpH基因，并组合表达上述基因，得到不同组合的重组质粒(图4)，分别为：pACM-FdeR-acpH、pACM-FdeR-acpH-asacpT、pACM-FdeR-acpH-asacpT-asacpS、pACM-FdeR-acpH-asacpT-asacpS-asacpP、pACM-FdeR-acpH-asacpT-asacpS-asfabD和pACM-FdeR-acpH-asacpT-asacpS-asacpP-asfabD。

将上述重组质粒转入大肠杆菌BL21(DE3)。分别挑取单克隆在LB培养基中37℃、220rpm培养过夜后，次日以1％接种量接种至MOPS培养基中，30℃、220rpm培养2h。检测胞内CoA、乙酰-CoA和丙二酰-CoA含量。结果显示：组合过表达acpS和acpT的反义RNA以及acpH基因，胞内CoA、乙酰-CoA和丙二酰-CoA含量最高，分别为0.442nmol/mg DW、0.241nmol/mgDW、0.967nmol/mg DW，相对大肠杆菌BL21(DE3)原始菌株分别提高1.56、4.21和7.45倍。

实施例3动态调控***构建及功能验证

基于我们前期的研究(Zhou SH et al.,2019,Biotechnol Bioeng,116:1392-1404，DOI：10.1002/bit.26941)，得到了优化的柚皮素合成途径模块A(pCDM-P_ssrA-UTR_rpsT-CHS-PUTR_glpD-CHI和pETM-PUTR_trxA-TAL-PUTR_talB-4CL)，结合实施例2的优化结果模块B(pACM-FdeR-acpH-asacpT-asacpS)，将模块A和模块B的质粒(图3A、3B)组合构建得到柚皮素响应的动态循环放大***，即将pACM-FdeR-acpH-asacpT-asacpS转入仅含有pCDM-P_ssrA-UTR_rpsT-CHS-PUTR_glpD-CHI和pETM-PUTR_trxA-TAL-PUTR_talB-4CL的9G3菌株中，获得单菌落。

为验证柚皮素对此***的放大效果，挑取上述单菌落于LB培养基中过夜培养；次日以1％的接种量接种到25mL的MOPS培养基中，30℃、220rpm培养48h。不同时间取样，同时测定柚皮素产量、acpS和acpT的反义RNA以及acpH基因的表达水平。分析基因表达水平与柚皮素产量之间的变化关系。检测结果显示：随着发酵的进行，柚皮素产量逐渐增加，同时acpS和acpT的反义RNA以及acpH基因的mRNA表达水平与柚皮素产量呈线性关系(图3C)。因此，说明所构建的动态调控***具有较灵敏的响应效果。

实施例4动态调控强度优化

以实施例3所构建得到的动态放大***的放大强度直接影响了对脂肪酸合成途径的抑制强度(图3A)。对脂肪酸合成抑制太强将影响细胞生长，而抑制太弱则达不到强化丙二酰-CoA积累的效果。因此，为调节图3A的动态调控响应强度，利用三种不同拷贝数的质粒(pRSM3(高拷贝)、pCOM4(中拷贝)和pACM4(低拷贝))表达模块B基因。构建得到模块B分别命名为：pRSM-FdeR-acpH-asacpT-asacpS、pCOM-FdeR-acpH-asacpT-asacpS和pACM-FdeR-acpH-asacpT-asacpS，分别转入仅含有pCDM-P_ssrA-UTR_rpsT-CHS-PUTR_glpD-CHI和pETM-PUTR_trxA-TAL-PUTR_talB-4CL的9G3菌株中，获得单菌落。

进行摇瓶发酵(挑取上述单菌落于LB培养基中过夜培养；次日以1％的接种量接种到25mL的MOPS培养基中，30℃、220rpm培养)，不同时期取样检测柚皮素产量(图5)。检测结果显示：动态调控菌株对香豆酸积累显著降低(>55％)。同时研究发现原始菌株与动态调控菌株生长并无显著差异。三个模块中，pACM-FdeR-acpH-asacpT-asacpS和pRSM-FdeR-acpH-asacpT-asacpS最终产量基本相同，因此认为低拷贝的pACM-FdeR-acpH-asacpT-asacpS模块可节省更多细胞生长资源更具有优势。相比较于对照菌株，利用pACM-FdeR-acpH-asacpT-asacpS模块后，柚皮素产量提升到原来的3.2倍，达95.1mg/L。

虽然本发明已以较佳实施例公开如上，但其并非用以限定本发明，任何熟悉此技术的人，在不脱离本发明的精神和范围内，都可做各种的改动与修饰，因此本发明的保护范围应该以权利要求书所界定的为准。

SEQUENCE LISTING

<110> 江南大学

<120> 一种动态调控脂肪酸代谢途径强化柚皮素合成的方法

<160> 18

<170> PatentIn version 3.3

<210> 1

<211> 309

<212> PRT

<213> 人工序列

<400> 1

Met Arg Phe Asn Lys Leu Asp Leu Asn Leu Leu Val Ala Leu Asp Ala

1 5 10 15

Leu Leu Thr Glu Met Ser Ile Ser Arg Ala Ala Glu Lys Ile His Leu

20 25 30

Ser Gln Ser Ala Met Ser Asn Ala Leu Ala Arg Leu Arg Glu Tyr Phe

35 40 45

Asp Asp Glu Leu Leu Ile Gln Val Gly Arg Arg Met Glu Pro Thr Pro

50 55 60

Arg Ala Glu Val Leu Lys Asp Ala Val His Asp Val Leu Arg Arg Ile

65 70 75 80

Asp Gly Ser Ile Ala Ala Leu Pro Ala Phe Val Pro Ala Glu Ser Thr

85 90 95

Arg Glu Phe Arg Ile Ser Val Ser Asp Phe Thr Leu Ser Val Leu Ile

100 105 110

Pro Arg Val Leu Ala Arg Ala His Ala Glu Gly Lys His Ile Arg Phe

115 120 125

Ala Leu Met Pro Gln Val Gln Asp Pro Thr Arg Ser Leu Asp Arg Ala

130 135 140

Glu Val Asp Leu Leu Val Leu Pro Gln Glu Phe Cys Thr Pro Asp His

145 150 155 160

Pro Ala Glu Glu Val Phe Arg Glu Arg His Val Cys Val Val Trp Arg

165 170 175

Asp Ser Ala Leu Ala Gln Gly Glu Leu Thr Leu Glu Arg Tyr Met Ala

180 185 190

Ser Gly His Val Val Met Val Pro Pro Gly Ala Asn Ala Ser Ser Val

195 200 205

Glu Ala Trp Met Ala Arg Lys Leu Gly Phe Ala Arg Arg Val Glu Val

210 215 220

Thr Ser Phe Ser Phe Ala Ser Ala Leu Ala Leu Val Gln Gly Thr Asp

225 230 235 240

Arg Ile Ala Thr Val His Ala Arg Leu Ala Gln Leu Leu Ala Pro Gln

245 250 255

Trp Pro Val Val Ile Lys Glu Ser Pro Leu Ser Leu Gly Glu Met Arg

260 265 270

Gln Met Met Gln Trp His Arg Tyr Arg Ser Asn Asp Pro Gly Ile Gln

275 280 285

Trp Leu Arg Arg Val Phe Leu Glu Ser Ala Gln Glu Met Asp Ala Ala

290 295 300

Leu Pro Gly Ile Cys

305

<210> 2

<211> 930

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 2

atgcgtttca acaagctcga cctcaatctt ctggtcgccc tggatgcact gctcacggag 60

atgagcatca gccgcgccgc cgaaaagatc catctgagcc agtcggccat gagcaatgcc 120

ctggcgcggc tgcgcgagta tttcgatgat gaattgctga tccaggtggg ccggcgcatg 180

gagcccacgc cgcgcgccga ggtgctcaag gatgcggtgc atgatgtgct gcggcgtatc 240

gatggctcca tcgcggcgct gccggccttc gtgccggccg agtccacgcg cgagtttcgc 300

atctcggttt cggactttac gctctccgtc ctcatccccc gggtgctggc gcgcgcgcac 360

gccgagggca agcacatccg ctttgccctg atgccgcagg tgcaagaccc gacccgctcg 420

ctggatcggg ccgaggtgga cctgctggtc ttgccgcagg aattctgcac gcccgatcat 480

cctgccgaag aggtcttccg cgaacggcat gtctgcgtgg tctggcgcga cagtgcgctg 540

gcgcaaggcg agctgacgct ggaacgctac atggcctcag gccatgtggt gatggtgccg 600

cctggggcca atgcgtcgtc ggtggaggcg tggatggcca ggaagctggg ctttgcgcgc 660

cgggtggaag tgaccagctt cagcttcgct tctgcgctgg cgctggtaca ggggacggac 720

cgcatcgcca cggtgcatgc ccggctggcg cagctgctgg ctccgcaatg gccggtggtg 780

atcaaggaga gtccgctgtc gctgggcgag atgcggcaga tgatgcagtg gcatcgctac 840

cgcagcaatg atcctggcat ccagtggctg cgtcgggtgt ttctggagag tgcgcaggag 900

atggatgcgg cgctgccagg catctgctga 930

<210> 3

<211> 288

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 3

ggcgctggtc tccgttgttg tgcttgttct tgccgaccct cggatagacg acggatgggg 60

tggtcaatgt attgatgccg tccatatcat gaatcaaaac aatccatttg atcaatatca 120

agctcactct taagcttcac tcatccgctg catggcccca ccagaaaggg ctggcgcggc 180

aagccggcgg cgcactcgca ctggatgcgc cgctgttgag cctggccatg acaacgcgcc 240

gatagcggcc acaccccgcc aggcagggta ggagacaagg agacaggg 288

<210> 4

<211> 582

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 4

atgaattttt tagctcacct gcatttagcc catctcgcgg aaagctcgct ttccggcaat 60

ttactggctg atttcgtacg cggaaatcct gaagaaagtt ttccgcccga cgtcgtggct 120

ggcattcata tgcatcgacg tatcgacgta ttgactgaca atctgccgga agtccgcgaa 180

gcacgggagt ggtttcgtag tgaaacgcgc cgcgttgcgc ctattacgct ggatgtcatg 240

tgggatcact ttctttcccg ccactggtcg cagctgtcgc cggactttcc gctacaggaa 300

tttgtctgtt atgcccgcga gcaagtgatg acgattttgc cggactcacc gccacgtttt 360

atcaatctga acaattactt gtggtcagag cagtggctgg tgcgctatcg cgatatggat 420

ttcatccaga acgtgttaaa cggcatggca agccgccgcc cacgtctgga tgccctgcgt 480

gactcctggt acgatttaga cgctcattat gacgccctcg aaacccgctt ctggcagttt 540

tatccgcgga tgatggcgca ggcgtcacgc aaggcgttat aa 582

<210> 5

<211> 570

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 5

gcggccgcag gaggaattaa ccatgcagtg gtggtggtgg tggtgccatt cgttatcgct 60

taatacgcgg cgtgccaggc gatcaccgga tcgggcgatc accgcttcga tgcgagcgat 120

ctccacaata tccgtgccta aacctaatat tgccattagc cacgcgcttc cagcatcaga 180

cgcttcattt ctgccaccgc atctttcagt ccggtcatca ctgcacgacc aataatggca 240

tgaccgatat tcagttcatg catctcaggg atgggagcac caccaccacc accactgcat 300

ggttaattcc tccttagttt tggcggatga gagaagattt tcagcctgat acagattaaa 360

tcagaacgca gaagcggtct gataaaacag aatttgcctg gcggcagtag cgcggtggtc 420

ccacctgacc ccatgccgaa ctcagaagtg aaacgccgta gcgccgatgg tagtgtgggg 480

tctccccatg cgagagtagg gaactgccag gcatcaaata aaacgaaagg ctcagtcgaa 540

agactgggcc tttcgtttta tctgcctagg 570

<210> 6

<211> 621

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 6

gcggccgcag gaggaattaa ccatgcagtg gtggtggtgg tggtgcatag atgatctccg 60

gtagcgggga aagcgtgtgc gaaagcaatg cacgccccgc cagccagcgt tcgcgtcgtg 120

gaccttgcgg tgcttgctcg cgtaaacccg gtggcagtgg agctgcgctt aaggtcgaaa 180

ctttccccag aactatccga tacatatcag ggccaacgtt taatggaaaa tgaaagtgcg 240

tatcgtatca cttgtcgcct catcccggta accgactttt cggtctgccc ggccccagta 300

aaatcgccag tttgctaccg cctttgagca ccaccaccac caccactgca tggttaattc 360

ctccttagtt ttggcggatg agagaagatt ttcagcctga tacagattaa atcagaacgc 420

agaagcggtc tgataaaaca gaatttgcct ggcggcagta gcgcggtggt cccacctgac 480

cccatgccga actcagaagt gaaacgccgt agcgccgatg gtagtgtggg gtctccccat 540

gcgagagtag ggaactgcca ggcatcaaat aaaacgaaag gctcagtcga aagactgggc 600

ctttcgtttt atctgcctag g 621

<210> 7

<211> 502

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 7

gcggccgcag gaggaattaa ccatgcagtg gtggtggtgg tggtgcggtg tcaagagaat 60

ccgcgcccag gtcttcaacg aaagaagcat tgttggtaac ttcttcctgc ttaacgccca 120

gctgttcgcc gataattttc ttaacgcgtt cttcgatagt gctcatactc ttaaatttcc 180

tatcaaaact cgctttcgcg atggttgagc accaccacca ccaccactgc atggttaatt 240

cctccttagt tttggcggat gagagaagat tttcagcctg atacagatta aatcagaacg 300

cagaagcggt ctgataaaac agaatttgcc tggcggcagt agcgcggtgg tcccacctga 360

ccccatgccg aactcagaag tgaaacgccg tagcgccgat ggtagtgtgg ggtctcccca 420

tgcgagagta gggaactgcc aggcatcaaa taaaacgaaa ggctcagtcg aaagactggg 480

cctttcgttt tatctgccta gg 502

<210> 8

<211> 572

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 8

gcggccgcag gaggaattaa ccatgcagtg gtggtggtgg tggtgcgaag cttcagcaaa 60

cgtttcttcg acaattggat agctcgccgc catatcagcc agcattccaa cggtttgaga 120

accctgtcca gggaacacaa atgcaaattg cgtcatgttt taatccttat cctagaaacg 180

aaccagcgcg gagccccagg tgaatccacc gccaaaggct tcaagcagaa ccaactgccc 240

cggcttaatg cgcccgtcgc gtacagcttc atccaggagc accaccacca ccaccactgc 300

atggttaatt cctccttagt tttggcggat gagagaagat tttcagcctg atacagatta 360

aatcagaacg cagaagcggt ctgataaaac agaatttgcc tggcggcagt agcgcggtgg 420

tcccacctga ccccatgccg aactcagaag tgaaacgccg tagcgccgat ggtagtgtgg 480

ggtctcccca tgcgagagta gggaactgcc aggcatcaaa taaaacgaaa ggctcagtcg 540

aaagactggg cctttcgttt tatctgccta gg 572

<210> 9

<211> 88

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 9

aatgtattga tgccgtccat atcatgaatc aaaacaatcc atttgatcaa tatcaagctc 60

actcttaagc ttcactcatc cgctgcat 88

<210> 10

<211> 51

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 10

ctcggaggag gccatggtac ctgatcaata tcaagctcac tcttaagctt c 51

<210> 11

<211> 48

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 11

ctcggaggag gccatggtac caatgtattg atgccgtcca tatcatga 48

<210> 12

<211> 42

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 12

ctcggaggag gccatggtac cctcggatag acgacggatg gg 42

<210> 13

<211> 41

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 13

ctcggaggag gccatggtac cggcgctggt ctccgttgtt g 41

<210> 14

<211> 47

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 14

ttctccctta cccatactag tgtctgtctc cttgtctcct accctgc 47

<210> 15

<211> 46

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 15

ttctccctta cccatactag tctccttcgc gttgtcatgg ccaggc 46

<210> 16

<211> 46

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 16

ttctccctta cccatactag tctccttatc cagtgcgagt gcgccg 46

<210> 17

<211> 52

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 17

ttctccctta cccatactag tctccttatg cagcggatga gtgaagctta ag 52

<210> 18

<211> 56

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 18

ttctccctta cccatactag tctccttaat ggattgtttt gattcatgat atggac 56

Claims

1.一种动态响应柚皮素含量调控脂肪酸合成途径的方法，是利用动态响应柚皮素含量的生物传感器调控脂肪酸合成途径，所述生物传感器包括柚皮素响应的调控蛋白FdeR和受FdeR调控的启动子P_fdeA，所述调控蛋白FdeR的氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示；所述调控脂肪酸合成途径是利用启动子P_fdeA抑制acpS和acpT基因表达，并过表达acpH基因。

2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，编码所述调控蛋白FdeR的基因的核苷酸序列如SEQ ID NO.2所示。

3.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述启动子P_fdeA包括P_fdeA(180-1)、P_fdeA(223-1)、P_fdeA(250-1)、P_fdeA(288-1)、P_fdeA(223-50+RBS)、P_fdeA(223-83+RBS)、P_fdeA(223-135+RBS)或P_fdeA(223-180+RBS)；所述P_fdeA(288-1)的核苷酸序列如SEQ ID NO.3所示，所述RBS的核苷酸序列为AAGGAG。

4.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述acpH的核苷酸序列如SEQ ID NO.4所示，所述acpS的反义RNA的核苷酸序列如SEQ ID NO.5所示，所述acpT的反义RNA的核苷酸序列如SEQ ID NO.6所示。

5.一种动态响应对柚皮素含量的工程菌株，其特征在于，以动态响应柚皮素含量的载体为表达载体；所述表达载体含有脂肪酸响应的调控蛋白FdeR和受FdeR调控的启动子P_fdeA，所述调控蛋白FdeR的氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示；所述工程菌株以大肠杆菌为宿主；所述工程菌株抑制acpS和acpT基因表达，并过表达acpH基因。

6.权利要求5所述的工程菌株在食品或制药领域中的应用。