CN110974940A - Ihh在制备预防或治疗生长板损伤的药物中的应用 - Google Patents

Abstract

本发明涉及一种Ihh在制备预防和/或治疗生长板损伤的药物中的应用，本发明通过使用过表达Ihh药物，即Ihh重组蛋白治疗生长板损伤发现，过表达Ihh药物可早期抑制生长板损伤区域新骨形成，或抑制软骨转化成骨过程，即防止生长板损伤后骨桥的形成，并具有促进骨骺损伤部位软骨细胞增殖，促进软骨再生作用，从非手术治疗角度提供了一种有效预防或治疗生长板损伤的药物，为生长板损伤修复提供新的治疗策略。

Description

Ihh在制备预防或治疗生长板损伤的药物中的应用

技术领域

本发明属于分子生物技术领域，涉及Ihh在制备预防和/或治疗生长板损伤的药物中的应用。

背景技术

生长板(Growth Plate),又称骨骺(Epiphysis)或骺软骨(EpiphysisCartilage)，是儿童骨骼***所特有的结构，位于骨骺与干骺端间生长活跃的软骨区，呈波浪状薄板样，从骨骺向干骺端延伸可分为静止区(Resting Zone，RZ)、增殖区(Proliferative Zone，PZ)、钙化区(Calcification Zone,CZ)以及肥大区(HypertrophyZone，HZ)。随着生长板内的软骨细胞不断***增殖，软骨基质生成，同时软骨细胞向成熟区及肥大区移行，间质钙化，软骨细胞坏死、分解，逐渐被干骺端骨组织替代，进而维持骨干纵向生长。生长板损伤(Growth Plate Injury，GPI)多由创伤、感染、肿瘤、发育障碍及遗传畸形等引起的较为常见的儿童骨关节疾病，其损伤特点主要表现为位于骨骺及干骺端薄弱的骺板组织在损伤后骨桥形成以及钙盐沉积，致使骺板组织出现不同程度病理性愈合，如肢体不等长、胫骨成角和旋转畸形，严重影响肢体形态和功能。生长板损伤修复是小儿基础与临床研究过程中面临的重要难题，如何预防或避免损伤后骨桥形成及后遗畸形的发生已成为临床矫形医师的研究热点，生长板损伤修复更是小儿矫形外科实验研究和临床治疗面临的一大难题。目前，在基础应用研究中，运用游离血管化生长板软骨移植，非软骨组织工程材料，软骨细胞及组织工程软骨移植等方法修复生长板损伤，但是游离生长板软骨移植,因缺乏血供而应用困难；血管化生长板移植解决了血循环问题，但是自体移植供体来源有限,异体移植存在免疫排斥；非软骨组织材料只能阻止小面积生长板缺损内骨桥形成,无再生修复能力。而在临床治疗上，主要采取手术切除骨桥(骺板阻滞术)，肢体延长(矫形截骨术)等方法治疗骺板损伤及后遗畸形。这些都是需要开放性手术，尽管人们针对生长板损伤修复已进行一个多世纪的不懈探索，然而至今未能发现理想的解决方法。如果能从分子生物学角度探讨明确生长板损伤后骨桥形成及软骨修复过程的具体作用机制，将是防止和延缓生长板损伤后骨桥形成进而预防肢体生长畸形的关键。

发明内容

有鉴于此，本发明的目的在于提供一种Ihh在制备预防和/或治疗生长板损伤的药物中的应用。

为达到上述目的，本发明提供如下技术方案：

本发明通过构建生长板损伤(GPI)动物模型并注射rhIhh，发现过表达的rhIhh有效抑制软骨向成骨转化，同时促进生长板软骨细胞生长，并在一定程度促进软骨修复，可有效成为修复生长板损伤相关疾病的重要治疗手段。

1.Ihh在制备预防和/或治疗生长板损伤的药物中的应用。

进一步，所述应用为Ihh减少生长板损伤中骨桥的生成。

进一步，所述应用为Ihh促进软骨细胞增殖。

进一步，所述应用为Ihh加速生长板软骨层再生愈合。

更进一步，Ihh促进软骨再生。

进一步，所述Ihh为可过表达Ihh的制剂。

进一步，所述过表达Ihh的制剂为灭活的病毒包装，去毒性的Ihh重组蛋白，或者过表达Ihh质粒。

进一步，所述Ihh为重组人印度刺猬因子蛋白(rhIhh)。

本发明还提高供Ihh联合基底膜基质在制备预防和/或治疗生长板损伤的药物中的应用。

本发明通过以基底膜基质为溶剂制备的80ug/ml rhIhh-Matrigel，注射生长板损伤(GPI)动物模型后发现，80ug/ml rhIhh-Matrigel组生长板损伤区域骨桥形成少，和其他对比组相比差异具有统计学意义(P<0.05)，说明高剂量组(80ug/ml rhIhh-Matrigel组)可早期抑制生长板区域骨形成，或软骨转化成骨过程，即早期防止骨桥的形成。在给药后第8周高剂量治疗组观察到成团簇集的红染生长板软骨细胞，与Saline组及Matrigel组相比，80ug/ml rhIhh-Matrigel组损伤区域红染软骨细胞面积更大；相反，80ug/ml rhIhh-Matrigel组损伤区域骨小梁(新生骨桥)组织形成面积较小，差异具有统计学意义(“*P<0.05,**是P<0.01”)。充分说明rhIhh可抑制生长板损伤后骨桥形成，并具有软骨修复能力，可以成为防止和延缓生长板损伤后骨桥形成进而预防肢体生长畸形的关键。

进一步，所述Ihh为可过表达Ihh的制剂。

所述过表达Ihh的制剂包括但不限于重组蛋白，还可以为灭活的病毒包装，去毒性的Ihh重组蛋白，或者过表达Ihh质粒。

进一步，所述Ihh为重组人印度刺猬因子蛋白(rhIhh)。

本发明的有益效果在于：本发明通过使用过表达Ihh药物，即Ihh重组蛋白治疗生长板损伤发现，过表达Ihh药物可早期抑制生长板损伤区域新骨形成，或抑制软骨转化成骨过程，即早期防止生长板损伤部位骨桥的形成，并有具有促进骨骺损伤部位软骨细胞增殖，促进软骨再生作用，从非手术治疗角度提供了一种有效预防和/或治疗生长板损伤的药物，为生长板损伤修复提供新的治疗策略。

附图说明

为了使本发明的目的、技术方案和有益效果更加清楚，本发明提供如下附图进行说明：

图1为GPI造模成功后的电镜扫描图；

图2为GPI造模成功后的二维结果(左边)和三维重建图(右边)；

图3为各实验组Micro-CT定量分析术后2周各治疗组生长板损伤区域新骨形成情况；

图4为各实验组Micro-CT二维图(左边)及三维重建图(右边)；

图5为各实验组术后8周大鼠行胫骨平台大体照片；

图6为各实验组大鼠左侧膝关节胫骨近端软骨进行Safrain O/Fast Green染色；

图7为各实验组损伤区域红染软骨细胞面积及各组损伤区域骨小梁(新生骨桥)组织形成面积比较柱形图；

图8为各实验组的切片HE染色和Masson染色图；

图9为各实验组软骨细胞和成骨细胞在HE染色和Masson染色下对比柱状图；

图10为术后2周Saline对照组和高剂量组的OCN免疫组化染色图；

图11为术后8周Saline对照组和高剂量组的OCN免疫组化染色图；

图12为术后8周Saline对照组和高剂量组的COL II免疫组化染色图；

图13为Saline对照组和80μg/ml rhIhh-Matrigel组术后2w OCN、术后8w OCN及术后8w COL II免疫组化染色结果对比柱状图。

图14为各组大鼠生长板损伤区域组织RT-PCR结果。

具体实施方式

下面将结合附图，对本发明的优选实施例进行详细的描述。实施例中未注明具体条件的实验方法，通常按照常规条件或按照制造厂商所建议的条件。

实验部分材料和仪器：

1)Recombinant Protein Indian Hedgehog Homolog(rhIhh)Ihh重组蛋白：R&DSystems，规格：25ug/支，美国；

2)Matrigel：基底膜基质，基底膜凝胶，也叫BME(Basement Membrane Extract，基底膜提取物)。Cultrex基底膜提取物(BME)美国Trevigen货号：3431-001-02；

3)碘佛醇：江苏恒瑞医药股份有限公司(国药准字H20067896),中国江苏；

4)苏木素-伊红(HE)染色液:碧云天生物技术有限公司，中国；

5)Masson染色、Safrain O/Fast Green:Sigma公司，美国；

6)兔抗鼠Agg、COL II、COL X、OCN、OPG、RANKL、BMP-2、RUNX2一抗：博士德生物工程有限公司，中国武汉；

7)Prime ScriptTM RT Master Mix试剂盒：Takara公司，日本；

8)SYBR Premix Ex TaqTM II试剂盒：Takara公司，日本；

9)β-actin、Agg、COL II、COL X、OCN、OPG、RANKL、BMP-2、RUNX2引物：上海生工，中国上海

10)Leica M720 OH5手术显微镜：徕卡(Leica)显微***德国；

11)MicroCT/uCT：SCANCO Medical AG，瑞士；

12)X线成像***：UltraFocus100X射线柜，Faxitron公司，美国；

13)扫描电子显微镜(SEM)：EVO MA 15/LS 15，德国卡尔蔡司。

实施例1构建成功的生长板损伤(GPI)动物模型

选用健康5周龄Sprague Dawley(SD)大鼠100只，随机平均分为5组，每组20只，实验组通过2.0mm针头行大鼠左侧胫骨近端内侧平台中央钻孔建立生长板损伤(Growthplate injury，GPI)模型，假手术组采用手术切开膝关节囊，不做胫骨近端钻孔损伤。

GPI模型采用打开左侧膝关节关节囊后使用2.0mm注射器针头钻孔形式创建成功的生长板损伤模型，造模方式具体操作过程为：a)取左膝关节，备皮，常规消毒、铺巾；b)膝关节竖直切口，充分暴露髌韧带，沿髌韧带旁打开关节腔，去除内侧半月板；c)2.0mm注射器针头旋转破坏大鼠生长板；d)可见2.0mm孔损伤位置；e)注射药物20ul；f)术毕，缝合皮肤。术后1天随机处死各组大鼠1只，沿胫骨内外侧平台中间平行长轴矢状位水平切开胫骨近端，扫描电镜下观察。电镜结果如图1所示，图1中A图为可见钻孔损伤位置成功穿透生长板(红色箭头)，损伤为规则圆形(直径＝2.0mm)且损伤面积约占内侧胫骨平台30.00±0.0070％，占整个胫骨平台面积15.59±0.0017％，证实2.0mm针刺生长板损伤有效，且损伤面积大于整个平台面积的10％以上。图1中B图为5周龄大鼠胫骨近端生长板组织结果(右边箭头所示)，以及骨小梁结果(左边箭头所示)。为了确定药物成功注射，术中钻孔损伤后立即注射造影剂碘佛醇，立刻缝合关节腔与表面皮肤，即刻将大鼠置于Micro-CT上，观察造影剂所处位置情况，碘佛醇造影剂充填钻孔缺损处，见高密度影，如图2所示，其中CT二维结果(图2左图)及三维重建(图2右图)结果显示碘佛醇造影剂充填大鼠胫骨近端钻孔缺损处(高密度影)，与周围骨组织，生长板组织层次清晰，仅少量周围遗漏，说明碘佛醇造影剂进入钻孔损伤区域，可侧面证明目标药物的成功注射。

实施例2

rhIhh-Matrigel：将rhIhh作为溶质，使用Matrigel凝胶混合稀释，分别制备40ug/ml和80ug/ml rhIhh-Matrigel混合溶液，用于实验注射治疗。

Matrigel在此作为凝胶溶剂作用，并无治疗作用。

实验具体分组分为五组，包括：(1)Sham(假手术组)；(2)模型组对照组(注射20μl生理盐水，附图标记为Saline)；(3)空白对照组(注射20μl Matrigel，附图标记为Matrigel)Matrigel；(4)低剂量组(注射20μl 40ug/ml Recombinant Ihh Protein(rhIhh)-Matrigel，附图标记为40ug/ml rhIhh-Matrigel)，(5)高剂量组(注射20μl 80ug/ml Recombinant Ihh Protein(rhIhh)-Matrigel，附图标记为80ug/ml rhIhh-Matrigel)。此处高低剂量只是区别实验中2组的区别用。

将实施例1手术钻孔损伤后的大鼠立即分别注射各组所对应的药物，术后第2周时生长板损伤处逐渐被骨桥组织替代，取术后第2周每组大鼠各3只，全麻下行Micro-CT检查，并定量分析生长板缺陷处骨桥形成，对比各组骨桥形成情况。Micro-CT定量分析术后2周各治疗组生长板损伤区域新骨形成情况，表1为各实验组新骨骨量数据，如图3所示，与Saline组相比，80ug/ml rhIhh-Matrige组骨桥形成较少，差异具有统计学意义(*P<0.05)。

表1 Micro-CT定量术后2周新骨形成

图4为各组Micro-CT二维图(左边)及三维重建图(右边)，由各小图对比均可见生长板损伤区域不等量新骨(骨桥)形成，使用Micro-CT分析软件定量分析生长板损伤区域冠状位各层面骨组织替代面积，结果显示：相比Saline组，Matrigel、40ug/ml rhIhh-Matrigel组以及80ug/ml rhIhh-Matrigel组生长板损伤区域骨桥形成较少，差异具有统计学意义(P<0.05)；与其余各组相比，80ug/ml rhIhh-Matrigel组生长板损伤区域骨桥形成少，差异具有统计学意义(P<0.05)，初步说明高剂量组(80ug/ml rhIhh-Matrigel组)可早期抑制生长板区域骨形成，或软骨转化成骨过程，即早期防止骨桥的形成。

实施例3

于术后第8周安乐死各组大鼠2只，截取大鼠左膝关节，打开关节囊，去除半月板、肌腱、以及软组织，充分暴露左侧胫骨膝关节胫骨平台，行胫骨平台大体拍照，拍照结果如图5所示，结果显示：术后8周，假手术组(Sham组)胫骨平台表面光滑，表面软骨色泽正常；Saline组内侧胫骨平台塌陷明显，软骨表面粗糙糜烂，凹凸不平，色泽灰暗，软骨表面有较多裂隙，偶有软骨大块缺损，80ug/ml rhIhh-Matrigel组内侧胫骨平台表面轻度塌陷，软骨表面未见明显裂纹，较光滑。Matrigel组较模型组胫骨平台表面均塌陷明显，软骨粗糙，平整度差，平台表面出现裂纹缺损；40ug/ml rhIhh-Matrigel组较Saline组和Matrigel组内侧胫骨平台塌陷稍减轻，但缺损面积较小，偶见裂纹，色泽稍灰暗。

再将其置入4％多聚甲醛固定1-2天后，使用15％EDTA-2Na 20℃脱钙20天(以骨组织柔软或针能够轻松刺透为止点)。石蜡包埋：脱钙完成后应使用切片刀沿内外侧平台矢状位剖面切开，保留内侧平台，剖面与包埋盒贴附，组织放置方向与包埋盒边缘垂直或平行。制作石蜡切片：切片刀消除蜡块周围多余石蜡，置于冰块中冷冻10-15min，调整切片厚度为5um，切下来后放入50℃摊片机上，待石蜡切片完全展开后(肉眼或捞片后显微镜观察损伤部位在切片上，可逐一层面寻找损伤平面)，使用载玻片捞片，室温干燥后，70℃烤片1h。

将各组大鼠左侧膝关节胫骨近端软骨进行Safrain O/Fast Green染色，染色结果如图6所示，图6中，A为Sham组，B为Saline组，C为Matrigel组、D为40ug/ml rhIhh-Matrigel组，E为80ug/ml rhIhh-Matrigel组，显示经高剂量80ug/ml rhIhh-Matrigel联合治疗与经Saline处理的大鼠之间存在显著差异，经80ug/ml rhIhh-Matrigel治疗组大鼠的生长板损伤区域，相较于经Matrigel和40ug/ml rhIhh-Matrigel治疗的生长板损伤区域有更多的软骨红染面积；较其余各治疗组相比，80ug/ml rhIhh-Matrigel组见损伤区域软骨细胞数量较多，簇集成团，分布生长板层，呈软骨红染；Saline组无明显红染，损伤区域未见明显软骨细胞充填，局部见新生骨细胞簇集。Matrigel和40ug/ml rhIhh-Matrigel病理学评价介于前两者之间，但40ug/ml rhIhh-Matrigel组软骨细胞簇集程度明显优于Matrigel组。图7为各组损伤区域红染软骨细胞面积及各组损伤区域骨小梁(新生骨桥)组织形成面积比较柱形图，由图7可知，术后第8周高剂量治疗组观察到成团簇集的红染生长板软骨细胞，与Saline组及Matrigel组相比，80ug/ml rhIhh-Matrigel组损伤区域红染软骨细胞面积更大；相反，80ug/ml rhIhh-Matrigel组损伤区域骨小梁(新生骨桥)组织形成面积较小，差异具有统计学意义(“*P<0.05,**P<0.01”)。充分说明rhIhh可抑制生长板损伤后骨桥形成，并具有软骨修复能力，可以成为防止和延缓生长板损伤后骨桥形成进而预防肢体生长畸形的关键。

实施例4

将实施例3制备的切片进行HE染色和Masson染色，并于光镜下观察。光镜下观察各组切片的HE染色及Masson染色，染色结果如图8所示，其中上图为HE染色，下图为Masson染色，A为Sham组，B为Saline组，C为Matrigel组、D为40ug/ml rhIhh-Matrigel组，E为80ug/mlrhIhh-Matrigel组。由图8可知Sham组生长板结构完整，软骨细胞排列规整，沿生长板横行分布均匀，层次清楚，软骨细胞数量正常，未见明显簇集。80ug/ml rhIhh-Matrigel组均可见成团、簇集的软骨细胞沿损伤区域分布，与少量成骨细胞及骨小梁交错排列，且软骨细胞面积较大，骨桥细胞面积较小；Saline组见生长板区域中断，损伤区域大量成骨细胞充填，见明显骨桥形成，充填大部分损伤区域，未见明显软骨细胞簇集；Matrigel组见损伤造成生长板区域中断，区域内少量成骨细胞充填，骨桥形成较少，未见明显软骨细胞充填；40ug/mlrhIhh-Matrigel组HE染色及Masson染色介于经Matrigel和80ug/ml rhIhh-Matrige治疗组之间，但80ug/ml rhIhh-Matrige组软骨数量更多，成骨细胞数量更少，差异具有统计学意义(P<0.05)，参见图9各组软骨细胞和成骨细胞在HE染色和Masson染色下对比柱状图。通过HE染色和Masson染色初步结果说明，过表达Ihh有效抑制软骨向成骨转化，同时一定程度促进软骨修复，可能有效成为修复生长板损伤相关疾病(如骨骺骨折、软骨发育不全等)的重要治疗手段。

实施例5

术后第2周，在OCN(Osteocalcin，成骨标志)的免疫组化染色上，80μg/ml rhIhh-Matrigel组损伤区域局部骨组织染色较少、着色较浅，新生骨组织较少(即骨桥形成较少)，且在损伤区域OCN免疫组化染色低于Saline组,差异具有统计学意义(P<0.05)，如图10所示。术后第8周，在OCN(成骨Marker)的免疫组化染色上，与Saline组相比，80ug/ml rhIhh-Matrigel组损伤区域局部骨组织染色较少、着色较浅，见少量软骨细胞充填，差异具有统计学意义(P<0.05)(如图11所示)。术后第8周，在COL II的免疫组化染色上，与Saline组相比，见80μg/ml rhIhh-Matrigel组软骨细胞胶原着色深，着色面积较大，生成的软骨组织较多，差异具有统计学意义(P<0.05)，如图12所示。图13为Saline组和80μg/ml rhIhh-Matrigel组术后2w OCN、术后8w OCN及术后8w COL II免疫组化染色结果对比柱状图，与Saline组相比，*P<0.05表示差异具有统计学意义。充分说明过表达Ihh可抑制生长板损伤处软骨成骨过程，同时促进生长板软骨细胞生长，如用于治疗发育期骨骺损伤疾病，可能达到较好的治疗效果，延缓骨骺损伤后并发症(如骨骼成角畸形或短缩畸形)的发生。

实施例6

实时定量PCR(RT-PCR)

术后8周每组随机选取3只大鼠，只保留胫骨近端部分，剔除表面的组织，在手术显微镜下用手术刀片切开骨，去除骨膜及近端软骨层、骨层，显露完整的生长板软骨组织，手术显微镜保留全层生长板软骨(包括静止区、增生区、肥大区、钙化区)组织，手术刀片切取损伤部位(面积略宽于损伤部位，颜色较正常软骨不同)。采用RT-qPCR法检测Sham组、Saline组、Matrigel组、40ug/ml rhIhh-Matrigel组以及80ug/ml rhIhh-Matrigel组的Agg、COL II、COL X、OCN、OPG、RANKL、BMP-2、RUNX2 mRNA表达情况，每组标本重复实验3次，实验结果数据以“均数±标准误(x±s)”表示。使用SPSS 22.0数据软件处理，组与组间数据对比采用单因素方差分析；P<0.05表示差异有统计学意义。其中RT-qPCR所用引物序列如表1所示。

表1 RT-qPCR引物序列

各组大鼠生长板损伤区域组织RT-PCR结果如图14所示表明：在Agg、COL II的mRNA表达上，80ug/ml rhIhh-Matrigel组Agg、COL II的mRNA表达最高，呈剂量依赖关系，即80ug/ml rhIhh-Matrigel组较40ug/ml rhIhh-Matrigel组mRNA表达高，差异具有统计学意义(P<0.05)；且Saline组Agg、COL II表达最低，说明rhIhh-Matrigel具有促进软骨再生作用。

在COL X表达上，与Sham组相比，80ug/ml rhIhh-Matrigel组COL X的mRNA表达稍高，但两者无统计学意义(P<0.05)；Saline组、Matrigel组及40ug/ml rhIhh-Matrigel组的mRNA表达无明显差异，但这三组COL X的mRNA表达均高于80ug/ml rhIhh-Matrigel组，差异具有统计学意义(P<0.05)；在OCN、OPG、RANKL、BMP-2、RUNX2的mRNA表达上，Saline组表达较80ug/ml rhIhh-Matrigel组、40ug/ml rhIhh-Matrigel组及Matrigel组明显增高。在OCN、OPG、RANKL、BMP-2的mRNA表达上，治疗组呈剂量依赖关系，Matrigel、40ug/ml rhIhh-Matrigel及80ug/ml rhIhh-Matrigel组OCN、OPG、RANKL、BMP-2的mRNA表达依次降低，差异具有统计学意义(P<0.05)；在RUNX2表达上，Matrigel组较40ug/ml rhIhh-Matrigel组降低，差异具有统计学意义(P<0.05)。结果表明：rhIhh联合Matrigel具有明显的抑成骨相关因子的表达，促进软骨相关因子表达，且高剂量rhIhh联合Matrigel抑制骨相关因子和促进软骨因子作用较好，具有较好的抑制骨桥形成以及促进生长板软骨修复作用。

通过本发明多方面证明直接注射重组蛋白Ihh，可抑制生长板损伤处软骨成骨过程，同时促进生长板软骨细胞生长，可用于治疗发育期骨骺损伤疾病，达到较好的治疗效果，并延缓骨骺损伤后并发症(如骨骼成角畸形或短缩畸形)的发生。

药剂形式包括但不限于重组蛋白Ihh，还可使用不同方法构建过表达Ihh制剂，如灭活的病毒包装，去毒性的Ihh重组蛋白，或者过表达Ihh质粒包装等方法均可。治疗方法可采用直接关节内注射后沿骨折损伤处渗透至软骨细胞，或者静脉注射经血管渗透至损伤部等。

最后说明的是，以上优选实施例仅用以说明本发明的技术方案而非限制，尽管通过上述优选实施例已经对本发明进行了详细的描述，但本领域技术人员应当理解，可以在形式上和细节上对其作出各种各样的改变，而不偏离本发明权利要求书所限定的范围。

Claims (9)

1.Ihh在制备预防和/或治疗生长板损伤的药物中的应用。

2.根据权利要求1的应用，其特征在于，所述应用为Ihh减少生长板损伤后损伤部位骨桥的形成。

3.根据权利要求1的应用，其特征在于，所述应用为Ihh促进软骨细胞增殖。

4.根据权利要求1的应用，其特征在于，所述应用为Ihh加速生长板软骨层再生愈合。

5.根据权利要求1的应用，其特征在于，所述Ihh为可过表达Ihh的制剂。

6.根据权利要求1的应用，其特征在于，所述Ihh为重组人印度刺猬因子蛋白。

7.Ihh联合基底膜基质在制备预防和/或治疗生长板损伤的药物中的应用。

8.根据权利要求6的应用，其特征在于，所述Ihh为可过表达Ihh的制剂。

9.根据权利要求6的应用，其特征在于，所述Ihh为重组人印度刺猬因子蛋白。

Images