CN110970087B - 一种鉴定调控细胞自噬的功能激酶的方法 - Google Patents

一种鉴定调控细胞自噬的功能激酶的方法 Download PDF

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Abstract

本发明公开了一种鉴定调控细胞自噬的功能激酶的方法，属于生物信息技术领域。包括以下步骤：对自噬诱导剂处理前后的细胞样本进行转录组、蛋白质组和磷酸化蛋白质组分析，获取自噬诱导剂处理前后的细胞样本的基因表达数据、蛋白质表达数据及磷酸化位点数据；将得到的磷酸化位点数据进行归一化处理，获取激酶强度信息；根据得到的激酶强度信息，计算自噬诱导剂处理前后细胞样本中显著变化的激酶；根据得到的显著变化的激酶，对其在转录表达、蛋白质表达和磷酸化修饰水平进行显著性变化分析，并结合已知激酶的自噬调控功能，得到调控细胞自噬的功能激酶。该方法能有效地缩小激酶筛选范围，减少实验验证的工作量，并准确鉴定调控细胞自噬的功能激酶。

Description

一种鉴定调控细胞自噬的功能激酶的方法
技术领域
本发明属于生物信息技术领域，更具体地，涉及一种鉴定调控细胞自噬的功能激酶的方法。
背景技术
蛋白质磷酸化是最重要的翻译后修饰之一，它们在不同的生物学过程和信号通路中发挥着关键的调控作用。从生物化学角度上，磷酸化反应的发生原理是在蛋白激酶的催化作用下，三磷酸腺苷上的γ-磷酸根基团转移到底物蛋白质上特定的受体残基，通常是丝氨酸、苏氨酸和酪氨酸。功能磷酸化事件的发现是理解磷酸化生物学效应的重要基础。传统的实验方法需耗费巨大的人力和财力，且时间周期长。借助于液相色谱-串联质谱检测方法的快速发展，蛋白质组鉴定技术已被运用于研究具体的磷酸化事件。虽然磷酸化蛋白质组数据中包含大量的磷酸化位点信息，但是，如何基于位点信息去发现关键的蛋白激酶仍十分困难。同时，伴随着下一代基因测序技术、蛋白质组鉴定技术的成熟，已产生了海量的转录组、定量蛋白质组等多组学数据。如何有效地分析和整合多组学数据用于发掘重要的功能修饰事件已成为亟待解决核心技术问题。当前主要存在主要技术问题在于： (1)未能有效地整合多组学数据；(2)预测功能激酶的准确性不高。
细胞自噬是细胞内物质分解代谢的重要途径，它在细胞生存、细胞免疫等生物学过程中发挥着关键功能。自噬起始于自噬泡的形成和延伸，进而形成成熟的自噬体。当自噬体与溶酶体融合后，体内的包含物质将被降解。它的发生可由多种刺激条件激活，例如：营养缺失、氧化应激和化学试剂等。自噬过渡激活和自噬体降解抑制通常导致自噬功能紊乱或失调，并与许多人类疾病的发生密切相关，包括神经退行性疾病、自发炎症疾病和肿瘤。参与调控自噬的核心分子机器是由不同的自噬核心基因组成。至今，酵母中已有42个自噬核心基因被鉴定，且约有一半在哺乳动物中存在直系同源基因。研究表明，从酵母到哺乳动物中，由蛋白激酶介导的磷酸化修饰通过调节自噬核心蛋白质的功能而参与自噬的发生过程。发现并揭示蛋白激酶参与细胞自噬的调节，不仅能够阐明自噬调控过程的分子作用机制，也为自噬相关疾病的治疗提供潜在的药物治疗靶点。因此，研究并发现参与调控自噬的重要激酶是自噬相关研究的重点和难点。然而，传统的实验方法验证并发现重要调控激酶主要的局限性在于：(1)实验周期长； (2)人力成本大和实验材料耗费成本高。
发明内容
本发明解决了现有技术中鉴定调控细胞自噬的蛋白激酶未能有效地整合多组学数据，以及鉴定调控细胞自噬的蛋白激酶准确性不高的技术问题。本发明基于转录组、定量蛋白质组和定量磷酸化蛋白质组的多组学数据，设计并建立基于多组学数据整合的调控自噬激酶的鉴定方法。首先，基于定量磷酸化蛋白质组数据，全面分析了在细胞自噬过程中各个激酶活性变化情况，推测潜在的重要调控激酶。然后，结合转录组、定量蛋白质组和定量磷酸化蛋白质组的数据，分析各个潜在重要蛋白激酶在转录水平、蛋白质表达水平及磷酸化修饰水平的改变情况，并综合激酶的已知自噬调控功能，从而鉴定重要的调控自噬激酶。
根据本发明的目的，提供了一种鉴定调控细胞自噬的功能激酶的方法，包括以下步骤：
(1)对自噬诱导剂处理前后的细胞样本进行转录组、蛋白质组和磷酸化蛋白质组分析，获取自噬诱导剂处理前后的细胞样本的基因表达数据、蛋白质表达数据及磷酸化位点数据；
(2)将步骤(1)得到的自噬诱导剂处理前后的细胞样本的磷酸化位点数据进行归一化处理，获取激酶强度信息；具体方法为：将归一化处理后的磷酸化位点数据利用激酶底物关联预测工具iGPS计算并构建激酶-底物网络关系；针对每个激酶，获取其在该磷酸化蛋白质组中的磷酸化底物位点信息，并将对应的每个位点强度值进行相加，得到每个激酶在该样本中量化的激酶强度值；针对该样本中所有激酶，将各自的激酶强度值相加，得到该样本中的总体激酶强度值；
(3)根据步骤(2)得到的激酶强度信息，对比自噬发生前后每个激酶的强度值；采用p<0.0001作为判断差异的阈值，根据步骤(2)得到的总体激酶强度值，利用卡方检验计算状态差异变化的蛋白激酶，将该状态差异变化的蛋白激酶作为自噬诱导剂处理前后细胞样本中显著变化的激酶；
(4)根据步骤(1)得到的基因表达数据、蛋白质表达数据及磷酸化位点数据，对步骤(3)得到的显著变化的激酶在转录表达水平、蛋白质表达水平和磷酸化修饰水平这三个层面进行差异性变化分析；利用Cufflinks 软件定量分析，获得在转录表达水平发生差异性变化的激酶；利用Perseus 软件定量分析，获得在蛋白质表达水平发生差异性变化的激酶；磷酸化修饰水平差异性变化判断如下：设置未处理的细胞样品为对照组，采用对照组磷酸化位点强度值上调二分之一作为判断差异的阈值A，采用对照组磷酸化位点强度值下调三分之一作为判断差异的阈值B，将诱导处理后的磷酸化位点强度值大于等于阈值A或小于等于阈值B作为差异性变化的磷酸化位点信息；将在该三个层面中至少在一个层面发生差异性变化的激酶记为集合A，将步骤(3)所述显著变化的激酶中已知的调控细胞自噬的激酶记为集合B，集合A和集合B的并集中的任一激酶，即为在所述诱导剂诱导情况下调控细胞自噬的功能激酶。
优选地，所述自噬诱导剂为雷帕霉素、Earle's平衡盐溶液、金纳米材料、银纳米材料或二氧化硅纳米材料。
优选地，所述细胞样本为哺乳动物细胞。
优选地，所述哺乳动物细胞为海拉细胞或大鼠肾细胞。
优选地，步骤(1)中所述进行转录组、蛋白质组和磷酸化蛋白质组分析，获取基因表达数据、蛋白质表达数据及磷酸化位点数据，具体方法为：
转录组分析：通过二代基因测序仪对自噬诱导剂处理前后的细胞样本进行转录组测序，获得测试数据后，利用Bowtie-Tophat-Cufflinks系列软件对所述数据进行搜库及定量分析，获得基因表达量信息和差异表达基因的信息；
蛋白质组分析：通过液相色谱质谱联用对自噬诱导剂处理前后的细胞样本进行蛋白质组分析，获得测试数据后，对该数据利用MaxQuant软件进行搜库及定量分析获得肽段分布和强度信息，利用Perseus软件分析肽段强度信息，获得差异表达蛋白质的信息；
磷酸化蛋白质组分析：通过液相色谱质谱联用对自噬诱导剂处理前后的细胞样本进行磷酸化蛋白质组分析，获得测试数据后，将该数据通过 MaxQuant软件进行搜库及定量分析获得磷酸化位点分布和强度信息。
优选地，步骤(2)中采用global centering方法将磷酸化位点数据进行归一化处理。
优选地，步骤(4)中所述已知的调控细胞自噬的激酶为THANATOS 数据库中已知的调控细胞自噬的激酶。
总体而言，通过本发明所构思的以上技术方案与现有技术相比，主要具备以下的技术优点：本发明结合转录组、定量蛋白质组和定量磷酸化蛋白质组的数据，分析各个潜在重要蛋白激酶在转录水平、蛋白质表达水平及磷酸化修饰水平的改变情况，并综合激酶的已知自噬调控功能，从而鉴定重要的调控自噬激酶。该发明方法通过分析和整合转录组、蛋白质组及磷酸化蛋白质组数据，全面分析蛋白激酶在转录层面、蛋白质表达层面和磷酸化修饰层面的差异性变化情况，为准确预测功能激酶提供支持。该方法能有效地缩小激酶筛选范围，减少实验验证的工作量，并准确鉴定调控细胞自噬的功能激酶。
附图说明
图1是基于多组学数据整合的调控自噬激酶预测方法的流程。
图2是基于多组学数据整合的调控自噬激酶预测方法的示意图。
图3是敲低CDK4能减少由纳米材料诱导的LC3-II蛋白质的表达量。
图4是敲低CDK4能减少由纳米材料诱导的GFP-LC3聚点的积累。
图5是敲低CDK7能减少由纳米材料诱导的LC3-II蛋白质的表达量。
图6是敲低CDK7能减少由纳米材料诱导的GFP-LC3聚点的积累。
具体实施方式
为了使本发明的目的、技术方案及优点更加清楚明白，以下结合附图及实施例，对本发明进行进一步详细说明。应当理解，此处所描述的具体实施例仅仅用以解释本发明，并不用于限定本发明。此外，下面所描述的本发明各个实施方式中所涉及到的技术特征只要彼此之间未构成冲突就可以相互组合。
一种鉴定调控细胞自噬的功能激酶的方法，包括以下步骤：
(1)利用细胞自噬诱导剂对细胞进行处理，得到自噬发生前后的细胞样品；
(2)对获得的每个细胞样品进行转录组、定量蛋白质组和定量磷酸化蛋白质组的组学鉴定，得到细胞样品的mRNA测序信息、蛋白质组鉴定信息、磷酸化位点鉴定信息；
(3)转录组数据利用Bowtie-Tophat-Cufflinks系列软件进行数据处理，获取基因的定量信息和基因的显著变化信息；
(4)定量蛋白质组数据使用MaxQuant分析软件对质谱数据进行搜库及定量分析，获得肽段分布及强度信息；利用Perseus软件分析肽段强度信息，获取蛋白质的显著变化信息；
(5)对定量磷酸化蛋白质组数据使用MaxQuant分析软件对质谱数据进行搜库及定量分析，获得磷酸化位点的分布及强度信息；
(6)定量磷酸化蛋白质组数据采用global centering(GC)方法进行归一化处理，得到归一化的磷酸化位点强度值；
(7)根据归一化处理后的定量磷酸化蛋白质组数据，设置未处理的细胞样品为对照组，采用磷酸化位点强度值上调或下调1.5倍作为判断差异的阈值，得到磷酸化位点的显著变化信息；
(8)将归一化后的定量磷酸化蛋白质组数据处理成ELM格式，利用激酶底物关联预测工具iGPS，获得位点特异性激酶-底物网络关系；
(9)针对每个激酶，获取其在该磷酸化蛋白质组中的磷酸化底物位点信息，并将对应的每个位点强度值进行相加，得到每个激酶在该样本中定量的激酶状态值；
(10)针对该样本中所有激酶，将它们的激酶状态值相加，得到该样本中的总体激酶状态值；
(11)利用自噬诱导剂处理前的样品作为对照组，自噬诱导剂处理后的样品作为实验组，对比自噬发生前后每个激酶的状态值，采用p<0.0001 作为判断差异的阈值，利用卡方检验计算状态差异变化的蛋白激酶，获得自噬发生前后显著变化的激酶；
(12)基于步骤(11)得到的显著变化的激酶信息，利用基因的显著变化信息，蛋白质的显著变化信息及磷酸化位点的显著变化信息分析激酶在转录层面、蛋白质层面及磷酸化修饰层面发生显著变化情况，获得在三个层面中至少某一层面发生显著变化的激酶信息；
(13)基于步骤(11)得到的显著变化的激酶信息，利用已知文献报道信息，结合THANATOS数据库的自噬基因信息，分析激酶是否为已知的、参与自噬调控的激酶，获得具有细胞自噬调控功能的激酶信息；
(14)综合整理步骤(12)和步骤(13)得到的激酶信息，获得参与调控细胞自噬的功能激酶信息。
实施例1
本实施例提供了一种基于多组学整合的调控自噬激酶预测的方法，如图1和图2所示，包括以下步骤：
使用尺度为16nm的二氧化硅纳米材料作为自噬诱导剂在终浓度60 ug/mL情况下对正常大鼠肾细胞处理分别处理0小时、8小时、16小时、 20小时、24小时，以处理0小时的正常大鼠肾细胞作为对照组，收集处理后4个时间点的细胞样品。
利用二代基因测序仪HiSeq 4000system对16nm的二氧化硅纳米材料处理前后的细胞样品进行RNA测序，获得转录组数据。
利用Bowtie-Tophat-Cufflinks系列软件对转录组数据进行分析处理，获得基因的定量信息。其中，共计6059个基因在纳米材料处理后发生显著变化。
利用液相色谱质谱联用(LC-MS)对16nm的二氧化硅纳米材料处理前后的细胞样品进行蛋白质组和磷酸化蛋白质组分析，获得定量蛋白质组和定量磷酸化蛋白质组的数据。
利用MaxQuant分析软件对定量蛋白质组进行搜库及定量分析，获得肽段分布及强度信息。利用Perseus软件对肽段强度信息进行分析，共有1452 个蛋白质在纳米材料处理后发生显著变化。
利用MaxQuant分析软件对定量磷酸化蛋白质组进行搜库及定量分析，获得磷酸化位点的分布及强度信息。
定量磷酸化蛋白质组数据采用global centering(GC)方法进行归一化处理。
设置未处理的细胞样品为对照组，采用磷酸化位点强度值上调或下调 1.5倍作为判断差异的阈值，得到磷酸化位点的显著变化信息。共有1660 个磷酸化蛋白质的3564个磷酸化位点在纳米材料处理后发生显著变化。
利用位点特异性激酶底物关系预测工具iGPS软件对归一化处理后的磷酸化位点数据计算注释位点对应的激酶，将每个激酶在磷酸化组数据中所对应的磷酸位点强度值进行相加，计算每个样品中各个激酶的强度及每个样品中所有激酶的强度值。
其中，iGPS软件为已有技术(http://igps.biocuckoo.org/)。
根据上述步骤分别获得未处理样品中每个激酶的强度值a和所有激酶的强度值A，二氧化硅纳米处理后样品中每个激酶的强度值b和所有激酶的强度值B。
对于每个激酶，使用2×2列联表对每个激酶在未处理样本及处理后样本中强度值进行统计比较。其中，在处理前后样品中某个激酶强度值分别记为a和b，则在处理前后样品中其他激酶强度值分别记为A-a和B-b。如下表所示：
未处理样品的磷酸化组 处理后样品的磷酸化组 总计
某个激酶 a b N<sub>y</sub>＝a+b
其他激酶 c＝A-a d＝B-b N<sub>n</sub>＝c+d
总计 N<sub>l</sub>＝a+c N<sub>w</sub>＝b+d N＝a+c+b+d
采用卡方检验分析每个激酶的强度值在处理前后样品中是否存在显著变化，利用p<0.0001作为判断显著变化的阈值，计算公式如下：
Figure BDA0002348874940000081
根据上一步骤的计算，筛选出显著变化的激酶。利用已获得的转录组，定量蛋白质组及定量磷酸化蛋白质组的数据，分别分析这些激酶基因在自噬发生前后的转录水平，蛋白质表达水平及磷酸化修饰水平是否发生显著变化。并结合已有文献报道和THANATOS数据库信息分析激酶在细胞自噬调控中的功能信息。
其中，THANATOS数据库为已有数据库(http://thanatos.biocuckoo.org/)。
综合考虑每个激酶自身在转录层面、蛋白质表达层面、磷酸化蛋白质层面及自噬调控功能层面这四个层面情况。
其中，转录层面上，某个激酶在两个或两个以上的时间点发生显著变化，则认为该激酶在转录层面发生显著变化。蛋白质层面和磷酸化层面上，某个激酶在一个或一个以上的时间点发生显著变化，则认为该激酶在蛋白质层面或磷酸化层面上转录层面发生显著变化。保留在三个层面上至少一个层面发生显著变化的激酶信息。
利用已知文献报道信息，结合THANATOS数据库的自噬基因信息，取这个数据库中2019年12月30日之前的自噬基因信息。分析激酶是否为已知的、参与自噬调控的激酶，保留已知的、具有自噬调控功能的激酶信息。
最终整理所保留的激酶信息，最终获得调控细胞自噬的功能激酶信息。
利用上述的自噬调控激酶预测方法，在正常大鼠肾细胞中共预测出21 个蛋白激酶可能参与调控细胞自噬。具体激酶信息如下：
Abl1；Cdk12；Cdk13；Cdk16；Cdk17；Cdk18；Cdk2；Cdk4；Cdk5；Cdk6； Cdk7；Cdk9；Cdkl5；Csnk2a2；Dapk1；Dapk2；Dapk3；Prkaa2；Sgk1；Sgk2； Stk17b.
实施例2
随后，针对以上的激酶基因设计小分子干扰RNA，利用免疫印迹方法检测自噬标志分子LC3-II表达变化情况，来探究蛋白激酶对细胞自噬的影响。同时，利用GFP-LC3细胞株来检测蛋白激酶对于自噬体形成的影响。如图3、图4所示，敲低Cdk4减少由纳米材料诱导的LC3-II蛋白质表达水平，并抑制由纳米材料诱导的GFP-LC3聚点积累。如图5和图6所示，敲降Cdk7降低由纳米材料诱导的LC3-II蛋白质表达量，并减少由纳米材料诱导的GFP-LC3聚点数量。通过证实两个蛋白激酶Cdk4和Cdk7在纳米材料诱导的细胞自噬中发挥了重要的调控功能。
基于以上的结果，证明该方法能够准确地预测参与调控细胞自噬的蛋白激酶，因此在生物学研究领域具有重要的应用价值。
本领域的技术人员容易理解，以上所述仅为本发明的较佳实施例而已，并不用以限制本发明，凡在本发明的精神和原则之内所作的任何修改、等同替换和改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。

Claims (7)

1.一种鉴定调控细胞自噬的功能激酶的方法，其特征在于，包括以下步骤：
(1)对自噬诱导剂处理前后的细胞样本进行转录组、蛋白质组和磷酸化蛋白质组分析，获取自噬诱导剂处理前后的细胞样本的基因表达数据、蛋白质表达数据及磷酸化位点数据；
(2)将步骤(1)得到的自噬诱导剂处理前后的细胞样本的磷酸化位点数据进行归一化处理，获取激酶强度信息；具体方法为：将归一化处理后的磷酸化位点数据利用激酶底物关联预测工具iGPS计算并构建激酶-底物网络关系；针对每个激酶，获取其在该磷酸化蛋白质组中的磷酸化底物位点信息，并将对应的每个位点强度值进行相加，得到每个激酶在该样本中量化的激酶强度值；针对该样本中所有激酶，将各自的激酶强度值相加，得到该样本中的总体激酶强度值；
(3)根据步骤(2)得到的激酶强度信息，对比自噬发生前后每个激酶的强度值；采用p<0.0001作为判断差异的阈值，根据步骤(2)得到的总体激酶强度值，利用卡方检验计算状态差异变化的蛋白激酶，将该状态差异变化的蛋白激酶作为自噬诱导剂处理前后细胞样本中显著变化的激酶；
(4)根据步骤(1)得到的基因表达数据、蛋白质表达数据及磷酸化位点数据，对步骤(3)得到的显著变化的激酶在转录表达水平、蛋白质表达水平和磷酸化修饰水平这三个层面进行差异性变化分析；利用Cufflinks软件定量分析，获得在转录表达水平发生差异性变化的激酶；利用Perseus软件定量分析，获得在蛋白质表达水平发生差异性变化的激酶；磷酸化修饰水平差异性变化判断如下：设置未处理的细胞样品为对照组，采用对照组磷酸化位点强度值上调1.5倍作为判断差异的阈值A，采用对照组磷酸化位点强度值下调1.5倍作为判断差异的阈值B，将诱导处理后的磷酸化位点强度值大于等于阈值A或小于等于阈值B作为差异性变化的磷酸化位点信息；将在该三个层面中至少在一个层面发生差异性变化的激酶记为集合A，将步骤(3)所述显著变化的激酶中已知的调控细胞自噬的激酶记为集合B，集合A和集合B的并集中的任一激酶，即为在所述诱导剂诱导情况下调控细胞自噬的功能激酶。
2.如权利要求1所述的鉴定调控细胞自噬的功能激酶的方法，其特征在于，所述自噬诱导剂为雷帕霉素、Earle's平衡盐溶液、金纳米材料、银纳米材料或二氧化硅纳米材料。
3.如权利要求1所述的鉴定调控细胞自噬的功能激酶的方法，其特征在于，所述细胞样本为哺乳动物细胞。
4.如权利要求3所述的鉴定调控细胞自噬的功能激酶的方法，其特征在于，所述哺乳动物细胞为海拉细胞或大鼠肾细胞。
5.如权利要求1所述的鉴定调控细胞自噬的功能激酶的方法，其特征在于，步骤(1)中所述进行转录组、蛋白质组和磷酸化蛋白质组分析，获取基因表达数据、蛋白质表达数据及磷酸化位点数据，具体方法为：
转录组分析：通过二代基因测序仪对自噬诱导剂处理前后的细胞样本进行转录组测序，获得测试数据后，利用Bowtie-Tophat-Cufflinks系列软件对所述数据进行搜库及定量分析，获得基因表达量信息和差异表达基因的信息；
蛋白质组分析：通过液相色谱质谱联用对自噬诱导剂处理前后的细胞样本进行蛋白质组分析，获得测试数据后，对该数据利用MaxQuant软件进行搜库及定量分析获得肽段分布和强度信息，利用Perseus软件分析肽段强度信息，获得差异表达蛋白质的信息；
磷酸化蛋白质组分析：通过液相色谱质谱联用对自噬诱导剂处理前后的细胞样本进行磷酸化蛋白质组分析，获得测试数据后，将该数据通过MaxQuant软件进行搜库及定量分析获得磷酸化位点分布和强度信息。
6.如权利要求1所述的鉴定调控细胞自噬的功能激酶的方法，其特征在于，步骤(2)中采用global centering方法将磷酸化位点数据进行归一化处理。
7.如权利要求1所述的鉴定调控细胞自噬的功能激酶的方法，其特征在于，步骤(4)中所述已知的调控细胞自噬的激酶为THANATOS数据库中已知的调控细胞自噬的激酶。
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