CN110964771A - 制备7-氨基头孢烷酸的方法 - Google Patents

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仝双明
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朱琳琳
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于慧敏
沈忠耀
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Abstract

本发明公开了一种制备7‑氨基头孢烷酸的方法，具体地，本发明的方法使头孢菌素C酰化酶和头孢菌素C在碳酸氢铵和/或碳酸铵水溶液中进行催化反应。本发明的方法能够显著改善头孢菌素C酰化酶的催化稳定性，延长酶的使用寿命。

Description

制备7-氨基头孢烷酸的方法
技术领域
本发明涉及一种制备7-氨基头孢烷酸的方法，具体涉及利用头孢菌素C酰化酶催化头孢菌素C制备7-氨基头孢烷酸的方法。
背景技术
7-氨基头孢烷酸(以下简称“7-ACA”)，分子式为C10H12N2O5S，是医药工业中合成多种头孢菌素类抗生素的母核，具有十分重要的市场开发价值。
7-ACA的生产方法有化学法和生物酶法两种。传统的化学法具有高污染、高能耗的缺点，其在工业生产中存在诸多问题。目前工业上主要采用一步酶法生产7-ACA，即在头孢菌素C酰化酶(以下简称“CPC酰化酶”)的作用下，底物头孢菌素C(CPC)直接水解生成α-氨基己二酸和产物7-ACA。
目前，在工业上应用的酶催化中普遍采用纯水体系。由于在CPC酰化酶催化CPC生成7-ACA的过程中产生酸性物质，因此需要不断加碱调节pH以维持催化反应的顺利进行，但是，加入强碱的操作会造成局部溶液的pH值过高，这可能会导致酶的失活，使得CPC酰化酶催化稳定性降低。
也有采用磷酸盐缓冲液体系，但是通常浓度的缓冲液的缓冲容量往往不足以维持反应体系的pH值不变，而且加入缓冲液会影响产物的后续分离(缓冲液中的盐成分随7-ACA结晶，使得产物7-ACA的纯度下降)，导致产品质量下降和成本增加。
因此，在工业上需要进一步提高CPC酰化酶的催化稳定性和简化操作工艺。
发明内容
本发明的目的是提高一步酶法制备7-ACA工艺中CPC酰化酶的催化稳定性，从而提高酶的使用寿命，降低成本。为此，本发明提出了利用碳酸氢铵和/或碳酸铵来改善CPC酰化酶的催化稳定性。
与经常用到的缓冲液(例如磷酸盐、乙酸盐、硼酸盐、Tris-HCl和碳酸钠等)不同，碳酸氢铵和/或碳酸铵本身非常不稳定，通常并不用它配制缓冲液。但本发明人通过研究出人意料地发现在催化体系中加入碳酸氢铵和/或碳酸铵能够显著提高CPC酰化酶的催化稳定性，从而延长酶的使用寿命。
另外，碳酸氢铵和/或碳酸铵很容易在催化产物的后续分离中除去(7-ACA通常采用盐酸调节pH至酸性来进行沉淀，在此过程中碳酸氢氨和/或碳酸铵会生成二氧化碳去除)，不会影响7-ACA的产品质量。就生产成本而言，碳酸氢铵和碳酸铵价格十分低廉。
附图说明
图1是分别在纯水、磷酸盐缓冲液以及碳酸氢铵水溶液中进行催化反应的CPC酰化酶微环境中的pH变化。
具体实施方式
使用CPC酰化酶以CPC为底物一步酶催化制备7-ACA的工艺是已知的。反应过程简单示意如下：
Figure BDA0001817158320000021
作为反应底物CPC，在实际使用中，CPC结构中的羧基在水溶液中电离为-COO-，其可以结合各种各样的阳离子，但是，无论是结合何种阳离子，所得到的CPC盐均包含在本发明的术语“头孢菌素C”或“CPC”的范围内。因此，在本发明上下文中，术语“头孢菌素C”或“CPC”应当广义理解，不仅包括CPC本身，还包括CPC的盐例如CPC钠盐和CPC锌盐等以及CPC发酵直通液等，CPC发酵直通液是指以发酵法制备CPC获得的发酵液经过初步纯化后获得的溶液。在本发明中，作为例举，使用了CPC钠盐。
在本发明中，可以以多种方式将碳酸氢铵和/或碳酸铵水溶液加入到反应体系中，例如将CPC酰化酶溶于碳酸氢铵和/或碳酸铵水溶液或将CPC酰化酶和底物CPC同时加入碳酸氢铵和/或碳酸铵水溶液。作为例举，本发明的具体实施中采用将CPC溶于碳酸氢铵和/或碳酸铵水溶液制得底物溶液备用。具体地，底物溶液的配制可以如下进行：可以先将碳酸氢铵和/或碳酸铵溶于水溶液，然后再加入CPC；也可以先将CPC溶于水溶液，然后再加入碳酸氢铵和/或碳酸铵；还可以将CPC以及碳酸氢铵和/或碳酸铵分别溶于水溶液，然后将二者的水溶液混合在一起，同时，保持pH7-9的范围内。pH值保持在7-9范围内，可以通过将CPC以及碳酸氢铵和/或碳酸铵溶于水溶液之后用稀盐酸或氨水进行调节，也可以在混合过程中调节，还可以通过估算调节二者混合前的pH，使得二者混合后的pH位于上述范围内。
优选地，碳酸氢铵和/或碳酸铵在水溶液中的浓度为10mmol/L～2mol/L，例如10mmol/L～500mmol/L，50mmol/L～400mmol/L，80mmol/L～300mmol/L，100mmol/L～300mmol/L，100mmol/L～280mmol/L。
作为用于本发明的催化剂CPC酰化酶，本领域技术人员知道，能催化CPC的CPC酰化酶都可以用于一步酶催化制备工艺中，在催化工艺中，可以采用游离细胞催化，也可以采用固定化酶催化。在本发明中作为例举，使用了固定化的CPC酰化酶。
作为详细介绍本发明的例子，列举了使用基因工程大肠杆菌BL21(DE3)/pET28-acy或者BL21(DE3)/pET28-CPCacy产生的CPC酰化酶(安明,于慧敏,罗晖,宋文斯,沈忠耀.CPC酰化酶基因的人工合成与重组表达.清华大学学报,2008,48(9):119-123；于慧敏，宋文斯，安明，罗晖，沈忠耀.一种头孢菌素C酰化酶及其载体和应用.专利号：ZL200810102219.7)。
在本发明的方法中，催化反应的进行是将CPC与CPC酰化酶在碳酸氢铵和/或碳酸铵水溶液中混合，在10℃-37℃下催化，在催化过程中加入碱液例如氨水来调节反应pH值，pH值通常控制在7-9，例如8-9，例如8.1、8.2、8.3、8.4、8.5、8.6、8.7、8.8、8.9，特别是8.5。通过定时取样进行HPLC检测反应剩余的CPC，直至反应结束，得到7-ACA反应液。
温度通常控制在10℃-37℃，例如，10℃，12℃，15℃，20℃，25℃，30℃，温度越高酶活越高，但酶的催化稳定性降低，且底物CPC容易降解。
在本发明的上下文中，术语“反应体系”或“催化体系”具有本领域通常的含义，包括在催化进行过程中参与反应的底物、酶以及所得到的产物和副产物，还包括溶剂以及其中加入的各种助剂；实践中，可以理解为进行催化反应的容器中除了反应器设备之外的内容物。
将反应得到的7-ACA反应液过滤得到上清液(过滤下来的固定化CPC酰化酶或游离细胞可以重复使用)，通过常规方法结晶获得7-ACA晶体，例如，加入盐酸调节其pH值至pH3.5，在4℃放置，析出7-ACA晶体，离心后用丙酮洗涤晶体，干燥得到7-ACA。
如上所述，在CPC酰化酶催化CPC制备7-ACA的过程中产生酸，使得反应体系pH不断下降，需要加入碱来升高pH以使得反应在最佳条件下进行。但是，强碱的加入会造成局部pH过高，这可能导致CPC酰化酶的失活，降低了酶的稳定性。
本发明人在实践中出人意料地发现，在反应体系中使用碳酸氢铵和/或碳酸铵，可以大幅度提高CPC酰化酶的催化稳定性，从而延长酶的使用寿命。不希望受任何理论的束缚，本发明人推测碳酸氢铵和/或碳酸铵的使用使得CPC酰化酶周围的微环境pH得以稳定地调节，从而保持了CPC酰化酶的稳定性。
参见图1，分别在纯水、磷酸盐缓冲液以及碳酸氢铵水溶液中进行催化反应的CPC酰化酶微环境中的pH变化。其中，在反应进行过程中，反应体系的主相的pH都保持在8.5。但是，在使用纯水的反应体系中，虽然一直通过滴加氨水来控制主体相溶液pH为8.5，但是固定化酶微环境pH有较大程度的降低，最低微环境pH值甚至达到7.2左右，远低于最佳pH值8.5。在加入了0.1M磷酸缓冲液的催化过程中，其固定化酶微环境pH有一定程度的控制，最低微环境pH在8以上。而在加入了0.1M碳酸氢氨作为缓冲溶液的催化过程中，固定化酶微环境pH一直控制在pH8.5左右。在实施例4中给出了图1中数据的获得方法。
实施例
以下通过实施例对本发明的方法进行详细的阐述。
测定或计算方法：
CPC的转化率的计算方法为：
CPC转化率＝(反应零时刻CPC浓度-反应结束时CPC浓度)/反应零时刻CPC浓度
7-ACA的摩尔收率的计算方法为：
7-ACA的摩尔收率＝反应结束时7-ACA摩尔浓度/(反应零时刻CPC摩尔浓度-反应结束时CPC摩尔浓度)
CPC浓度或7-ACA浓度的检测方法：
反应过程中，取20μL反应液加入180μL的终止液(50mmol/L的NaOH溶液与20％的冰醋酸溶液按1:2的体积比混合而成)，再取20μL的上述液体加至180μL的超纯水中，即将反应液稀释了100倍，取40μL进行液相色谱上样，根据7-ACA和CPC出峰的积分峰面积，根据标准曲线得出7-ACA和CPC的浓度。
液相色谱分析条件为：色谱柱为Phenomenex Luna C-18(4.6×150mm)，以15％甲醇-7.5％乙腈-1％乙酸为流动相，流速为0.8mL/min、检测波长为254nm。
酶的半衰期：是指催化获得相同的CPC转化率(例如95％的转化率)时所耗费的时间是初次催化时所耗费的时间的两倍时的使用批次。
固定化CPC酰化酶的制备
基因工程大肠杆菌BL21(DE3)/pET28-CPCacy的培养：
LBK培养基(胰蛋白胨1％、酵母粉0.5％、NaCl 1％，卡那霉素50μg/mL，pH7.0)
玉米浆培养基(5％玉米浆，0.017M KH2PO4，0.072M K2HPO4，0.4％葡萄糖，20mM乳糖，50μg/mL卡那霉素,pH7.5)
培养：在LBK培养基中，37℃，200r/min，对基因工程大肠杆菌BL21(DE3)/pET28-CPCacy进行培养10h，以4％接种量接种到玉米浆培养基中，30℃，200r/min，培养12h。
收集：10000rpm离心5min收获菌体。
称取收获的菌体1g用100ml去离子水重悬，超声波破碎菌体。超声的条件是：超声3秒，间隔3秒，99个循环，超声功率200W，共破碎两次。4℃下，10000rpm离心10min，上清液即为CPC酰化酶的酶液。
取上述获得的酶液，调节至pH8.5，加入共价偶联固定化酶载体LX1000-EP(西安蓝晓科技有限公司)，在20℃摇床中振荡24小时。用pH8.5、0.1mol/L的磷酸钠缓冲液清洗三次，真空抽滤得到所需的固定化CPC酰化酶，4℃保存备用。
实施例1：
CPC溶液的制备：称取CPC钠盐3g，溶解于250mM的100ml碳酸铵水溶液中，用氨水调节溶液至pH9，其中CPC浓度为70mmol/L。
催化：将3g的前述制备例中获得的固定化CPC酰化酶加入到30ml的上述CPC溶液中，在20℃下催化反应，用2M氨水调节反应体系pH8.5。在催化反应进行的同时监测反应体系中CPC含量的变化，经过40min的催化，CPC的转化率达到99.2％，7-ACA的摩尔收率95.2％。
实施例2：
CPC溶液的制备：称取CPC钠盐3g，溶解于200mM的100ml碳酸氢铵水溶液中，用氨水调节溶液至pH8，其中CPC浓度为70mmol/L。
催化：将1g的前述制备例中获得的固定化CPC酰化酶加入到10ml的上述CPC溶液中，在37℃下催化反应，用2M氨水调节反应体系pH8.5。在催化反应进行的同时监测反应体系中CPC含量的变化，经过30min的催化，CPC的转化率达到98.1％，7-ACA的摩尔收率92.5％。
抽滤得到固定化酶后，再以上述相同的反应条件进行催化，经过13批次催化后，固定化酶催化CPC使其转化率达到95％时，需要耗费63min，即此时固定化酶达到其活性的半衰期。说明在此条件下催化，固定化CPC酰化酶的半衰期为13批。
实施例3：
CPC溶液的制备：称取CPC钠盐3g，溶解于100mM的100ml碳酸氢铵水溶液中，用氨水调节溶液至pH8.5，其中CPC浓度为70mmol/L。
催化：将1g的前述制备例中获得的固定化CPC酰化酶加入到10ml的上述CPC溶液中，在25℃下催化反应，用2M氨水调节反应体系pH8.5。在催化反应进行的同时监测反应体系中CPC含量的变化，经过50min的催化，CPC的转化率达到98.5％，7-ACA的摩尔收率95.5％。
抽滤得到固定化酶后，再以上述相同的反应条件进行CPC的催化，经过50min的连续催化，CPC的转化率达到99.5％，7-ACA的摩尔收率96.3％。
抽滤得到固定化酶后，再以上述相同的反应条件进行CPC的催化，经过60批次催化后，固定化酶催化CPC使其转化率达到95％时，需要耗费105min，即此时固定化酶达到其活性的半衰期。此时，CPC的转化率为95.2％，7-ACA的摩尔收率达到92.3％。
7-ACA的分离与纯化：取所获得的催化反应液30ml，冷却至10℃，向反应液底部中缓慢加入15％的盐酸调节其pH为3.5，于4℃下放置5h，过滤，用丙酮淋洗。4℃干燥得到产物粉末，通过液相色谱测其纯度为98.3％，纯化过程的收率为91.1％。
对比例1
CPC溶液的制备：称取CPC钠盐3g，溶解于100ml纯水中，用氨水调节溶液至pH8.5，其中CPC浓度为70mmol/L。
催化：将1g的前述制备例中获得的固定化CPC酰化酶加入到10ml的上述CPC溶液中，在37℃下催化反应，用2M氨水调节催化体系为pH8.5，同时监测反应体系中头孢菌素C含量的变化，经过30min的催化，头孢菌素C的转化率达到95％。
抽滤得到固定化酶后，再以上述相同的反应条件进行头孢菌素C的催化，经过3批次催化后，固定化酶催化头孢菌素C使其转化率达到95％时，需要耗费62min，即此时固定化酶达到其活性的半衰期。说明在纯水配制的底物催化时，固定化CPC酰化酶的半衰期仅为3批。
对比例2
CPC溶液的制备：称取CPC钠盐3g，溶解于100ml纯水中，用氨水调节溶液至pH8.5，其中CPC浓度为70mmol/L。
催化：将1g的前述制备例中获得的固定化CPC酰化酶加入到10ml的上述CPC溶液中，在25℃下催化反应，用2M氨水调节催化体系pH8.5，同时监测反应体系中CPC含量的变化，经过50min的催化，CPC的转化率达到96％。
抽滤得到固定化酶后，再以上述相同的反应条件进行CPC的催化，经过24批次催化后，固定化酶催化CPC使其转化率达到95％时，需要耗费105min，即此时固定化酶达到其活性的半衰期。说明用纯水配制的底物在25℃下催化时，固定化CPC酰化酶的半衰期为24批。
将所获得的催化反应液100ml，冷却至10℃，向反应液底部中缓慢加入15％的盐酸调节其pH为3.5，于4℃下放置5h，过滤，用丙酮淋洗。4℃干燥得到产物粉末，通过液相色谱测其纯度为98.1％，纯化过程的收率为91.3％。
对比例3
CPC溶液的制备：称取CPC钠盐3g，溶解于100ml的100mmol/L磷酸钠缓冲液中，用氨水调节溶液至pH8.5，其中CPC浓度为70mmol/L。
催化：将1g的前述制备例中获得的固定化CPC酰化酶加入到10ml的上述CPC溶液中，在37℃下催化反应，用2M氨水调节催化体系pH8.5，同时监测反应体系中CPC含量的变化，经过30min的催化，CPC的转化率达到95％。
抽滤得到固定化酶后，再以上述相同的反应条件进行CPC的催化，经过5批次催化后，固定化酶催化CPC使其转化率达到95％时，需要耗费65min，即此时固定化酶达到其活性的半衰期。说明在100mmol/L磷酸钠缓冲液配制的底物催化时，固定化CPC酰化酶的半衰期仅为5批。
将所获得的催化反应液100ml，冷却至10℃，向反应液底部中缓慢加入15％的盐酸调节其pH为3.5，于4℃下放置5h，过滤，用丙酮淋洗。4℃干燥得到产物粉末，通过液相色谱测其纯度为82.5％，纯化过程的收率为90.8％。
对比例4
CPC溶液的制备：称取CPC钠盐3g，溶解于100ml的200mmol/L磷酸钠缓冲液中，用氨水调节溶液至pH8.5，其中CPC浓度为70mmol/L。
催化：将1g的前述制备例中获得的固定化CPC酰化酶加入到10ml的上述CPC溶液中，在37℃下催化反应，用2M氨水调节催化体系pH8.5，同时监测反应体系中CPC含量的变化，经过30min的催化，CPC的转化率达到95％。
抽滤得到固定化酶后，再以上述相同的反应条件进行CPC的催化，经过6批次催化后，固定化酶催化CPC使其转化率达到95％时，需要耗费63min，即此时固定化酶达到其活性的半衰期。说明在200mmol/L磷酸钠缓冲液配制的底物催化时，固定化CPC酰化酶的半衰期仅为6批。
实施例4：固定化酶催化过程中微环境pH的检测
CPC酰化酶的制备：
将保存的菌种E·coli BL21(DE3)/pET28-CPCAcy接种到LBK培养基(胰蛋白胨1％、酵母粉0.5％、NaCl 1％，卡那霉素50μg/mL，pH7.0)中，37℃，160rpm摇床培养12h，转接到新鲜的LBK培养基中，培养6h，保证菌种达到对数生长期。再将获得菌种以2.5％的接种量接入培养基(蛋白胨10g/L，酵母粉5g/L，Na2HPO4·12H2O 8.95g/L，KH2PO43.4g/L，NH4Cl2.67g/L，Na2SO40.7g/L，MgSO40.24g/L，甘油5g/L，葡萄糖0.5g/L，乳糖2g/L)中上罐发酵，具体发酵条件为：28℃，搅拌速度300rpm，料液体积3L，发酵24h。将获得的菌体用0.1mol/L、pH8.5的磷酸钠缓冲液重悬，用高压匀浆机进行细胞破碎，调节破碎压力800bar。破碎液在7000rpm下4℃离心10min，得到上清液即为所需CPC酰化酶的酶液。
标记5-氨基荧光素的固定化CPC酰化酶的制备：
称上述获得的CPC酰化酶的酶液100mL，加入pH8.0、1.25mol/L的磷酸钠缓冲液200mL，混匀。加入3g共价偶联固定化酶载体LX1000‐EPC(西安蓝晓科技有限公司)，加入0.015g 5‐氨基荧光素钠，混匀。在25℃摇床中振荡24小时。真空抽滤，用大量去离子水洗。用pH8.5、0.1mol/L的磷酸钠缓冲液清洗三次，抽滤得到所需的固定化CPC酰化酶，4℃保存备用。
CPC溶液的制备：
(1)称取CPC钠盐2.5g，溶解于100ml的100mM碳酸氢铵溶液中，用氨水调节溶液至pH8.5。
(2)称取CPC钠盐2.5g，溶解于100ml的100mM磷酸钠缓冲溶液中，用氨水调节溶液至pH8.5。
(3)称取CPC钠盐2.5g，溶解于100ml的水中，用氨水调节溶液至pH8.5。
催化：分别将2.5g的上述固定化CPC酰化酶加入到30ml的上述3种CPC溶液中，在37℃下催化反应，加入氨水控制催化主体溶液的pH8.5，同时用光纤pH传感器pH-1 mini v2(PreSens Precision Sensing GmbH)进行固定化酶微环境pH的监测。pH-1 mini v2检测得到催化体系的荧光强度，固定化酶微环境的pH值用所测荧光强度通过标准pH对应的荧光强度关系曲线来进行换算。将所得的曲线示于图1中。
最后所应说明的是：以上实施例仅用以说明而非限制本发明的技术方案，尽管参照上述实施例对本发明进行了详细说明，本领域的普通技术人员应该理解：依然可以对本发明进行修改或者等同替换；而不脱离本发明的精神和范围的任何修改或局部替换，均应涵盖在本发明的范围内。

Claims (9)

1.制备7-氨基头孢烷酸方法，其特征在于，使头孢菌素C酰化酶和头孢菌素C在碳酸氢铵和/或碳酸铵水溶液中进行催化反应。
2.如权利要求1所述的方法，其中，所述催化反应在pH7-9，例如pH8-9，特别是pH8.5下进行。
3.如权利要求1或2所述的方法，其中，使用氨水调节pH。
4.如权利要求1-3任一项所述的方法，其中，所述催化反应在10℃-37℃，例如10-25℃温度下进行。
5.如权利要求1-4任一项所述的方法，其中，所述碳酸氢铵和/或碳酸铵水溶液的浓度为10mmol/L～2mol/L，例如10mmol/L～500mmol/L。
6.如权利要求1-5任一项所述的方法，其中，所述头孢菌素C酰化酶是基因工程大肠杆菌BL21(DE3)/pET28-acy或者BL21(DE3)/pET28-CPCacy产生的头孢菌素C酰化酶。
7.如权利要求1-6任一项所述的方法，其中，所述头孢菌素C酰化酶是固定化头孢菌素C酰化酶。
8.碳酸氢铵和/或碳酸铵在用头孢菌素C酰化酶催化头孢菌素C制备7-氨基头孢烷酸中用于提高头孢菌素C酰化酶的稳定性的用途。
9.碳酸氢铵和/或碳酸铵在用于维持固定化头孢菌素C酰化酶的微环境pH的稳定性中的用途。
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