CN110951896A - 一种大肠杆菌志贺毒素ii型的cpa检测引物、试剂盒及方法 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种大肠杆菌志贺毒素II型的CPA检测引物、试剂盒及方法。本发明针对大肠杆菌志贺毒素II型特异性靶序列stx2设计了CPA检测引物，其引物序列如SEQ ID NO.1～5所示，该引物保证了检测结果的可靠性。本发明还提供了一种大肠杆菌志贺毒素II型的CPA检测试剂盒，其具有灵敏度高、适用性好，特异性好，操作简便快速，结果准确可靠，检测成本低等优点。利用上述CPA检测引物或CPA检测试剂盒对待测样品进行交叉引物恒温扩增反应，可通过荧光染料对结果直接进行肉眼判读，快速、准确的检测出待测样品中是否含有大肠杆菌志贺毒素II型，特别适用中小型单位及现场检测。

Description

一种大肠杆菌志贺毒素II型的CPA检测引物、试剂盒及方法

技术领域

本发明属于生物技术检测领域，特别涉及一种大肠杆菌志贺毒素II型的CPA检测引物、试剂盒及方法。

背景技术

产志贺毒素大肠杆菌是一种重要的人畜共患病病原菌，可以引起人类水样腹泻、出血性肠炎等轻度肠不适，严重时导致溶血性尿毒综合征、终末期肾病甚至死亡。产志贺毒素大肠杆菌主要毒力因子位于噬菌体上的stx1、stx2基因上，这两种基因分别编码志贺毒素stx1、stx2。志贺毒素stx1、stx2导致病人感染的剂量很低，可导致病人剧烈腹痛和腹泻，严重者发生急性肾衰竭而死亡。

目前传统的检测产志贺毒素大肠杆菌微生物的检测鉴定方法主要分为培养鉴定法、免疫检测法及核酸检测。培养法及免疫检测法操作繁琐、实验周期长，对实验人员专业水平要求高。而传统PCR检测方法实验周期长，需要3～4个小时。

交叉引物恒温扩增(Crossing Priming Amplification,CPA)技术与其他核酸扩增技术相比，可以在等温条件下快速、高效、特异地扩增靶序列，且操作简便，不需要精准的变温设备，成本较低，在食源性微生物检测领域显示出广阔的发展前景。但该反应引物设计难度较高，需要在有限的产物长度中设计五条引物，且避免五条引物自身发生非特异性扩增而影响结果，因此引物的设计尤为重要。

发明内容

本发明的首要目的在于克服现有技术的缺点与不足，提供一种大肠杆菌志贺毒素II型的CPA检测引物。

本发明的另一目的在于提供所述一种大肠杆菌志贺毒素II型的CPA检测试剂盒。

本发明的再一目的在于提供一种大肠杆菌志贺毒素II型的CPA检测方法。该方法具有灵敏度高、特异性好，操作简便快速，结果准确可靠，检测成本低，适合现场检测应用等特点。

本发明的目的通过下述技术方案实现：一种大肠杆菌志贺毒素II型的CPA检测引物，包括剥离引物4s、5a，交叉扩增引物2a1s，以及特异引物2a、3a；其核苷酸序列如下所示：

剥离引物4s：5’-GTTACGGGAAGGAATCAGG-3’(SEQ ID NO.1)；

剥离引物5a：5’-AAATCAGCCACCCACAGC-3’(SEQ ID NO.2)；

交叉引物2a1s：5’-CGAACTGACGGTTTACGCATGGGACTT GCCGGTGTT-3’(SEQ IDNO.3)；

特异引物2a：5’-CGAACTGACGGTTTACGC-3’(SEQ ID NO.4)；

特异引物3a：5’-TGGTCGTACGGACCTTTT-3’(SEQ ID NO.5)。

所述的志贺毒素II型大肠杆菌优选为大肠杆菌O157:H7 ATCC43895，大肠杆菌E019，大肠杆菌E020，大肠杆菌E043和大肠杆菌E044中的至少一种。

一种大肠杆菌志贺毒素II型的CPA检测试剂盒，包括上述大肠杆菌志贺毒素II型的CPA检测引物。

所述的大肠杆菌志贺毒素II型的CPA检测引物中各CPA检测引物的浓度均为10μmol/L。

所述的大肠杆菌志贺毒素II型的CPA检测试剂盒，还包括如下组分：

A、20×反应储液和/或2×反应储液；其中，

所述的20×反应储液为含有0.2M的氯化钾，0.2M的硫酸铵，160mM的硫酸镁和2％(v/v)Tween 20的20×反应储液；

所述的2×反应储液由如下方法配制得到：100μL 20×反应储液，500μL 3.2M甜菜碱，280μL 10mM dNTPs，27μL 1.5M Tris-HCl，93μL去核酸水；

B、Bst DNA聚合酶；

C、钙黄绿素和氯化锰的混合溶液。

组分B中所述的Bst DNA聚合酶优选为加水配制成的Bst DNA聚合酶水溶液；更优选为浓度8U/μL的Bst DNA聚合酶水溶液。

组分C中所述的钙黄绿素和氯化锰的混合溶液通过如下方法制备得到：

(i)将钙黄绿素溶于二甲基亚砜(DMSO)中，配制50μM的钙黄绿素溶液；将氯化锰溶于水中，配制1mM的氯化锰水溶液；

(ii)取25μL 50μM的钙黄绿素溶液与10μL1 mM的氯化锰水溶液混合均匀，得到钙黄绿素和氯化锰的混合溶液(钙黄绿素与氯化锰的物质的量浓度比为1:4)。

所述的大肠杆菌志贺毒素II型的CPA检测引物或所述的大肠杆菌志贺毒素II型的CPA检测试剂盒在检测大肠杆菌I I型志贺毒素中的应用。

一种大肠杆菌志贺毒素II型的CPA检测方法，为利用所述的大肠杆菌志贺毒素II型的CPA检测引物或所述的大肠杆菌志贺毒素II型的CPA检测试剂盒进行交叉引物恒温扩增反应，检测待检样品中的大肠杆菌I I型志贺毒素；具体包括如下步骤：

(1)提取待检样品的DNA作为模板DNA，并控制模板DNA水溶液的OD₂₆₀/OD₂₈₀值为1.8～2.0；

(2)建立检测大肠杆菌志贺毒素II型的交叉引物恒温扩增反应体系，于63℃水浴中保温至少60分钟进行交叉引物恒温扩增反应，待反应完成后于高于80℃的水浴中保温至少2分钟终止反应；

(3)终止反应后肉眼观察反应体系的颜色，若反应体系颜色变为绿色，说明待检测样品中含有大肠杆菌志贺毒素II型；若反应体系颜色为黄色(不变色)，则说明检测样品中不含有大肠杆菌志贺毒素II型。

步骤(2)中所述的交叉引物恒温扩增反应体系为26μL反应体系：2×反应储液12.5μL，10μM的剥离引物4s和10μM的剥离引物5a各1.5μL，10μM的交叉引物2a1s 2.5μL，10μM的特异引物2a和10μM的特异引物3a各1.25μL，DNA模板1.0μL，8U/μL的Bst DNA聚合酶1.0μL，加去核酸水补足至25μL；最后加入1μL的钙黄绿素与氯化锰的混合溶液。

所述的2×反应储液由如下方法配制得到：100μL 20×反应储液，500μL 3.2M甜菜碱，280μL 10mM dNTPs，27μL 1.5M Tris-HCl，93μL去核酸水。

所述的20×反应储液为含有0.2M的氯化钾，0.2M的硫酸铵，160mM的硫酸镁和2％(v/v)Tween 20的20×反应储液。

步骤(2)中所述的剥离引物4s的核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示，剥离引物5a的核苷酸序列如SEQ ID NO.2所示，交叉引物2a1s的核苷酸序列如SEQ ID NO.3所示，特异引物2a的核苷酸序列如SEQ ID NO.4所示，特异引物3a的核苷酸序列如SEQ ID NO.5所示。

本发明相对于现有技术具有如下的优点及效果：

(1)本发明提供了一组检测大肠杆菌志贺毒素II型的CPA引物，该引物对于大肠杆菌志贺毒素II型均可实现快速、准确的检出，适用性好，灵敏度高。

(2)本发明在恒温条件下扩增，不会因温度的改变而造成时间损失，耗时短，此外，该技术不需要特殊、昂贵的仪器和试剂，扩增产物不需要凝胶电泳，直接用荧光染料显色可凭肉眼判断结果(观察反应体系颜色变化，若反应体系颜色变为绿色，说明待检测样品中含有大肠杆菌志贺毒素II型；否则说明检测样品中不含有大肠杆菌志贺毒素II型)，其操作简便快捷，检测成本较低，特别适用中小型单位及现场检测。

(3)本发明中所提供的针对大肠杆菌志贺毒素II型特异性靶序列stx2所设计的交叉引物恒温扩增反应检测鉴定体系，解决现有技术方法所需周期长，灵敏度低，成本高，现场应用困难等缺陷。通过选择目标菌株的特异性序列stx2的保守区域，设计一对剥离引物、交叉引物和特异引物构建交叉引物恒温扩增反应体系，并在60分钟左右获得检测结果以缩短传统大肠杆菌志贺毒素II型检测的周期。

附图说明

图1为交叉引物恒温扩增反应技术检测stx2靶点的凝胶电泳结果及显色结果图；其中，A为交叉引物恒温扩增检测stx2靶点的凝胶电泳结果(泳道1：大肠杆菌O157:H7ATCC43895；泳道2：大肠杆菌E019；泳道3：大肠杆菌E020；泳道4：大肠杆菌E043；泳道5：大肠杆菌E044；NG：空白对照)；B为交叉引物恒温扩增反应技术检测stx2靶点的显色结果(1：大肠杆菌O157:H7 ATCC43895；2：大肠杆菌E019；3：大肠杆菌E020；4：大肠杆菌E043；5：大肠杆菌E044；NG：空白对照)。

图2为检测stx2靶点的特异性实验结果图(泳道1：大肠杆菌O157:H7ATCC43895；泳道2：大肠杆菌E019；泳道3：为大肠杆菌E020；泳道4：为大肠杆菌E043；泳道5：大肠杆菌E044；泳道6：耐甲氧西林金黄色葡萄球菌NCTC10442，泳道7：金黄色葡萄球菌ATCC23235；泳道8：金黄色葡萄球菌ATCC25923；泳道9：沙门氏菌ATCC29629；泳道10：沙门氏菌ATCC19585；泳道11：沙门氏菌ATCC14028；泳道12：沙门氏菌ATCC13076；泳道13：单增李斯特菌ATCC19116；泳道14：单增李斯特菌ATCC19114；泳道15：单增李斯特菌ATCC19115；泳道16：单增李斯特菌ATCC15313；泳道17：单增李斯特菌ATCC19113；泳道18：铜绿假单胞菌ATCC27853；泳道19：铜绿假单胞菌ATCC10145；泳道20：铜绿假单胞菌ATCC15442；泳道21：副溶血性弧菌ATCC17802；泳道22：副溶血性弧菌ATCC27969；泳道23：干酪乳杆菌BM-LC14617；泳道24：阴性对照)。

图3为检测靶点stx2灵敏度实验结果图(泳道1：3.28ng/μL；泳道2：328pg/μL；泳道3：32.8pg/μL；泳道4：3.28pg/μL；泳道5：328fg/μL；泳道6：32.8fg/μL；泳道7：3.28fg/μL；泳道8：328ag/μL；NG：阴性对照)。

具体实施方式

下面结合实施例对本发明作进一步详细的描述，但本发明的实施方式不限于此。除非特别说明，本发明采用的试剂和设备为本技术领域常规试剂和设备。除非特别说明，本发明所用菌株、试剂等均可通过市售获得。

本发明中的大肠杆菌E019，大肠杆菌E020，大肠杆菌E043和大肠杆菌E044可参考文献(周蓉.低温储藏对肠出血大肠杆菌VBNC状态的诱导及毒素表达量的影响研究[D].华南理工大学,2015.)获得。

本发明中的干酪乳杆菌BM-LC14617可参考文献(Junyan Liu,Lin Li,Bing Li,Brian M.Peters,Yang Deng*,Zhenbo Xu*,Mark E.Shirtliff.The viable butnonculturable state induction and genomic analyses of Lactobacillus casei BM-LC14617,a beer-spoilage bacterium.MicrobiologyOpen.2017；e506.)获得。

实施例1

1.设计引物

根据交叉引物恒温扩增(CPA)的扩增反应原理，使用Primer Premier软件针对靶点stx2分别设计如下引物，包括剥离引物4s、5a，交叉扩增引物2a1s，以及特异引物2a、3a；其核苷酸序列如下所示：

靶点stx2剥离引物4s：5’-GTTACGGGAAGGAATCAGG-3’(SEQ ID NO.1)；

靶点stx2剥离引物5a：5’-AAATCAGCCACCCACAGC-3’(SEQ ID NO.2)；

靶点stx2交叉引物2a1s：5’-CGAACTGACGGTTTACGCATGGGACTT GCCGGTGTT-3’(SEQID NO.3)；

靶点stx2特异引物2a：5’-CGAACTGACGGTTTACGC-3’(SEQ ID NO.4)；

靶点stx2特异引物3a：5’-TGGTCGTACGGACCTTTT-3’(SEQ ID NO.5)。

实施例2

基于交叉引物恒温扩增(CPA)反应技术检测大肠杆菌志贺毒素II型的方法，包括以下步骤：

(1)使用试剂：

a.浓度均为10μM的剥离引物4s、5a，交叉扩增引物2a1s，以及特异引物2a、3a，引物序列如实施例1中SEQ ID NO.1～5所示；

b.配制2×反应储液：

①20×反应储液：含0.2M的氯化钾，0.2M的硫酸铵，160mM的硫酸镁及2％(v/v)Tween 20(均为终浓度，用去核酸水配制)；

②2×反应储液：100μL 20×反应储液，500μL 3.2M甜菜碱，280μL 10mM dNTPs，27μL 1.5M Tris-HCl，93μL去核酸水；

c.浓度为8U/μL的Bst DNA聚合酶(大片段，NEB公司)水溶液；

d.钙黄绿素和氯化锰的混合溶液：先配制浓度为50μM的钙黄绿素溶液(二甲基亚砜溶解)，然后取25μL 50μM的钙黄绿素溶液与10μL 1mM的氯化锰水溶液混合均匀(钙黄绿素与氯化锰溶液的物质的量浓度比为1:4)。

(2)提取待检样品的DNA作为模板DNA：

本实施例同时设置实验组和空白对照组，其中，实验组为五株志贺毒素II型大肠杆菌，分别是大肠杆菌O157:H7 ATCC43895(购于美国菌种保藏中心ATCC；下同)，大肠杆菌E019，大肠杆菌E020，大肠杆菌E043以及大肠杆菌E044；以去核酸水作为空白对照。

采用细菌基因组DNA快速提取试剂盒(广东东盛生物科技有限公司，货号N1152)提取各组细菌DNA，按照试剂盒说明书操作，实验组所得细菌DNA水溶液的OD₂₆₀/OD₂₈₀的值(260nm和280nm下吸光光度比值)为1.8。

(2)建立检测stx2靶点的交叉引物恒温扩增反应：

在反应管中配制总体积为26μL的交叉引物恒温扩增反应体系：加入2×反应储液12.5μL，4s与5a等体积混合引物混合液3.0μL，交叉引物2a1s 2.5μL，特异引物2a与3a等体积混合液2.5μL，Bst DNA聚合酶1μL，DNA模板1.0μL，用去核酸水补充体积至25μL；最后加入上述浓度的钙黄绿素及氯化锰混合液溶液1μL，混匀即可。此时各物质浓度为：Tris-HCl20.0mM，硫酸铵10.0mM，氯化钾10.0mM，硫酸镁8.0mM，Tween 20 0.1％(v/v)，甜菜碱0.7M，dNTPs(each)1.4mM，Bst DNA聚合酶8U，剥离引物4s、5a各0.6μM，交叉引物2a1s 1.0μM，特异引物2a及3a各0.5μM。将反应管置于63℃水浴中保温反应60分钟，再于80℃水浴中保温2分钟终止反应。

(3)显色检测：待反应结束后，用肉眼观察颜色变化。

结果如图1所示，结果显示：stx2靶点对应的实验组(见图1B中的反应管1-5)的颜色变为绿色，说明含有志贺毒素II型大肠杆菌，而空白对照组不含有志贺毒素II型大肠杆菌，该反应管不变色且为橙黄色；随后对扩增产物进行2％的琼脂糖凝胶电泳，阳性组呈现梯形条带，阴性组无扩增条带，与预期结果一致(图1A)。

实施例3

交叉恒温扩增反应(CPA)检测志贺毒素II型大肠杆菌特异性试验，包括以下步骤：

将志贺毒素II型大肠杆菌的基因组DNA和其他菌株按照实施例2中的反应体系和条件建立交叉恒温扩增反应检测方法，进行特异性试验；其中，

非志贺毒素II型大肠杆菌为：耐甲氧西林金黄色葡萄球菌NCTC10442(购于英国NCTC菌种保藏中心)；金黄色葡萄球菌ATCC23235；金黄色葡萄球菌ATCC25923；沙门氏菌ATCC29629；沙门氏菌ATCC19585；沙门氏菌ATCC14028；沙门氏菌ATCC13076；单增李斯特菌ATCC19116；单增李斯特菌ATCC19114；单增李斯特菌ATCC19115；单增李斯特菌ATCC15313；单增李斯特菌ATCC19113；铜绿假单胞菌ATCC27853；铜绿假单胞菌ATCC10145；铜绿假单胞菌ATCC15442；副溶血性弧菌ATCC17802；副溶血性弧菌ATCC27969；干酪乳杆菌BM-LC14617。

设置志贺毒素II型大肠杆菌的基因组为阳性对照(大肠杆菌O157:H7ATCC43895，大肠杆菌E019，大肠杆菌E020，大肠杆菌E043以及大肠杆菌E044)，去核酸水为阴性对照。对扩增产物进行2％的琼脂糖凝胶电泳，结果如图2所示。

结果表明：只有含有志贺毒素II型大肠杆菌出现梯形条带(泳道1至泳道5)，非志贺毒素II型大肠杆菌则无。如此表明，基于交叉引物恒温扩增反应检测志贺毒素II型大肠杆菌的引物具有较高的特异性。

实施例4

交叉恒温扩增反应(CPA)检测志贺毒素II型大肠杆菌的灵敏度对比试验，包括以下步骤：

将志贺毒素II型大肠杆菌O157:H7 ATCC43895的基因组进行10倍浓度梯度稀释，分别为3.28ng/μL，328pg/μL，32.8pg/μL，3.28pg/μL，328fg/μL，32.8fg/μL，3.28fg/μL，328ag/μL。同时设置阴性对照(去核酸水)，按照实施例2中的反应体系构建交叉恒温扩增方法并对扩增产物进行2％的琼脂糖凝胶电泳，以确定检测方法的灵敏度。

结果如图3所示，结果表明：建立的志贺毒素II型大肠杆菌stx2靶点交叉引物恒温扩增反应方法可检测样品中3.28pg/μL的志贺毒素II型大肠杆菌DNA。

结论：

从上述实验结果可以看出，交叉恒温扩增反应扩增方法与常规PCR和荧光PCR具有如下优点：

操作和鉴定简便快捷：常规PCR整个过程在2～4个小时才能出结果，荧光定量PCR需要2～3小时，本发明所提供的检测方法在60分钟就可出现阳性结果。其次对仪器要求低，仅需要一个普通水浴锅，并可以通过荧光染料直接观测检测结果，省去了传统的电泳检测步骤。在快速检测及现场检测的实践中有广泛的应用前景。

特异性强：仅通过是否扩增就可判断目的基因的存在与否，从而完成了细菌的定性检测。

灵敏度高:针对志贺毒素II型大肠杆菌DNA的检测限为3.28pg/μL，是常规PCR的10～100倍左右，具有较高的灵敏度。

上述实施例为本发明较佳的实施方式，但本发明的实施方式并不受上述实施例的限制，其他的任何未背离本发明的精神实质与原理下所作的改变、修饰、替代、组合、简化，均应为等效的置换方式，都包含在本发明的保护范围之内。

序列表

<110> 华南理工大学

广东中轻枫泰生化科技有限公司

<120> 一种大肠杆菌志贺毒素II型的CPA检测引物、试剂盒及方法

<160> 5

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 19

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<220>

<223> 剥离引物4s

<400> 1

gttacgggaa ggaatcagg 19

<210> 2

<211> 18

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<220>

<223> 剥离引物5a

<400> 2

aaatcagcca cccacagc 18

<210> 3

<211> 36

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<220>

<223> 交叉引物2a1s

<400> 3

cgaactgacg gtttacgcat gggacttgcc ggtgtt 36

<210> 4

<211> 18

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<220>

<223> 特异引物2a

<400> 4

cgaactgacg gtttacgc 18

<210> 5

<211> 18

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<220>

<223> 特异引物3a

<400> 5

tggtcgtacg gacctttt 18

Claims (10)

1.一种大肠杆菌志贺毒素II型的CPA检测引物，其特征在于，包括剥离引物4s、5a，交叉扩增引物2a1s，以及特异引物2a、3a；其核苷酸序列如下所示：

剥离引物4s：5’-GTTACGGGAAGGAATCAGG-3’；

剥离引物5a：5’-AAATCAGCCACCCACAGC-3’；

交叉引物2a1s：5’-CGAACTGACGGTTTACGCATGGGACTT GCCGGTGTT-3’；

特异引物2a：5’-CGAACTGACGGTTTACGC-3’；

特异引物3a：5’-TGGTCGTACGGACCTTTT-3’。

2.一种大肠杆菌志贺毒素II型的CPA检测试剂盒，其特征在于：包括权利要求1所述的大肠杆菌志贺毒素II型的CPA检测引物。

3.根据权利要求2所述的大肠杆菌志贺毒素II型的CPA检测试剂盒，其特征在于：

所述的CPA检测引物的浓度均为10μmol/L。

4.根据权利要求2或3所述的大肠杆菌志贺毒素II型的CPA检测试剂盒，其特征在于，还包括如下组分：

A、20×反应储液和/或2×反应储液；其中，

所述的20×反应储液为含有0.2M的氯化钾，0.2M的硫酸铵，160mM的硫酸镁和2％(v/v)Tween 20的20×反应储液；

所述的2×反应储液由如下方法配制得到：100μL 20×反应储液，500μL 3.2M甜菜碱，280μL 10mM dNTPs，27μL 1.5M Tris-HCl，93μL去核酸水；

B、Bst DNA聚合酶；

C、钙黄绿素和氯化锰的混合溶液。

5.根据权利要求4所述的大肠杆菌志贺毒素II型的CPA检测试剂盒，其特征在于：

组分B中所述的Bst DNA聚合酶为浓度8U/μL的Bst DNA聚合酶水溶液。

6.根据权利要求4所述的大肠杆菌志贺毒素II型的CPA检测试剂盒，其特征在于：

组分C中所述的钙黄绿素和氯化锰的混合溶液通过如下方法制备得到：

(i)将钙黄绿素溶于二甲基亚砜中，配制50μM的钙黄绿素溶液；将氯化锰溶于水中，配制1mM的氯化锰水溶液；

(ii)取25μL 50μM的钙黄绿素溶液与10μL1 mM的氯化锰水溶液混合均匀，得到钙黄绿素和氯化锰的混合溶液。

7.权利要求1所述的大肠杆菌志贺毒素II型的CPA检测引物或权利要求2～6任一项所述的大肠杆菌志贺毒素II型的CPA检测试剂盒在检测大肠杆菌II型志贺毒素中的应用。

8.一种大肠杆菌志贺毒素II型的CPA检测方法，其特征在于：为利用权利要求1所述的大肠杆菌志贺毒素II型的CPA检测引物或权利要求2～6任一项所述的大肠杆菌志贺毒素II型的CPA检测试剂盒进行交叉引物恒温扩增反应，检测待检样品中的大肠杆菌II型志贺毒素。

9.根据权利要求8所述的大肠杆菌志贺毒素II型的CPA检测方法，其特征在于，具体包括如下步骤：

(1)提取待检样品的DNA作为模板DNA，并控制模板DNA水溶液的OD₂₆₀/OD₂₈₀值为1.8～2.0；

(2)建立检测大肠杆菌志贺毒素II型的交叉引物恒温扩增反应体系，于63℃水浴中保温至少60分钟进行交叉引物恒温扩增反应，待反应完成后于高于80℃的水浴中保温至少2分钟终止反应；

(3)终止反应后肉眼观察反应体系的颜色，若反应体系颜色变为绿色，说明待检测样品中含有大肠杆菌志贺毒素II型；若反应体系颜色为黄色，则说明检测样品中不含有大肠杆菌志贺毒素II型。

10.根据权利要求9所述的大肠杆菌志贺毒素II型的CPA检测方法，其特征在于：

步骤(2)中所述的交叉引物恒温扩增反应体系为26μL反应体系：2×反应储液12.5μL，10μM的剥离引物4s和10μM的剥离引物5a各1.5μL，10μM的交叉引物2a1s 2.5μL，10μM的特异引物2a和10μM的特异引物3a各1.25μL，DNA模板1.0μL，8U/μL的Bst DNA聚合酶1.0μL，加去核酸水补足至25μL；最后加入1μL的钙黄绿素与氯化锰的混合溶液。

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