CN110951700B

CN110951700B - 一种Diels-Alder反应酶及其应用

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Publication number: CN110951700B
Application number: CN201911136243.7A
Authority: CN
Inventors: 雷晓光; 戴均贵; 高磊; 苏聪
Original assignee: Peking University; Institute of Materia Medica of CAMS
Current assignee: Peking University; Institute of Materia Medica of CAMS
Priority date: 2019-11-19
Filing date: 2019-11-19
Publication date: 2021-10-08
Anticipated expiration: 2039-11-19
Also published as: US11293015B2; CN110951700A; EP3825398A1; US20210147820A1

Abstract

本发明提供一种Diels‑Alder反应酶及其应用，属于基因工程技术领域。所述的Diels‑Alder反应酶为MaDA酶，其氨基酸序列如SEQ ID No.1所示，编码其的基因序列如SEQ ID No.2所示。本发明还提供了MaDA酶的同源蛋白MaDA‑1和MaDA‑2，其氨基酸序列分别如SEQ ID No.10、12所示。本发明发现来源于桑树的MaDA酶及其同源蛋白能够以查尔酮和含有脱氢异戊烯基化合物为底物，立体专一性合成endo构型天然产物，体外制备D‑A类型天然产物及其类似物，有助于开发和利用这类天然产物的药用价值，为其他含有六元环的重要化工前体或天然产物的合成提供了可能性。

Description

一种Diels-Alder反应酶及其应用

技术领域

本发明属于基因工程技术领域，具体地说，涉及一种来源于桑树的Diels-Alder反应酶及其在促进Diels-Alder(D-A)反应中的应用。

背景技术

Diels-Alder(D-A)反应是共轭二烯(diene)与亲二烯体(dienophile)间发生的[4+2]环化反应，是有机化学中构建碳-碳键的重要方法之一，它能一步构建新的六元环和多个手性中心，迅速提高分子的复杂程度，在合成化学中扮演者重要的角色。自然界中存在大量含有六元环骨架的天然产物，这类分子往往结构复杂，但却具有良好的生物学活性，例如抗癌明星分子紫杉醇(taxol)以及dynemycin A。这类天然产物的全合成往往依赖D-A反应作为关键步骤来构建六元环骨架以及新的手性中心，但由于D-A反应缺乏良好催化剂来控制该反应的区域、endo/exo以及立体选择性，在合成过程中会出现很多副产物从而降低目标产物的产率以及立体选择性，如图1所示，这大大降低了D-A反应在全合成以及药物合成中的应用价值。因此开发和利用能够催化D-A反应进行的酶，使之能够选择性地产生某种特定立体结构(例如图1中圆框所示)的D-A产物不仅具有科学创新的价值，也具有很强的工业应用价值，但遗憾的是，目前从自然界中还未发现能够选择性催化分子间D-A反应的酶。

桑白皮(桑树的根皮或者茎皮)是传统中药，具有抗炎，利尿、平喘等等用途，同时也是治疗艾滋病的复方药物(司艾特散)中的有效成分。桑白皮中富含D-A类型的黄酮类天然产物，这些天然产物结构独特，具有良好的抗菌、抗病毒以及抗糖尿病等的生物活性，推测其是由桑树中的氧化酶以及D-A反应酶(DAase)共同参与而生成的，如图2所示。由于其结构复杂，含有多个手性中心，实现这类天然产物的不对称全合成面临着很大的挑战。虽然有少数几例利用手性硼酸复合物促进的不对称D-A反应来实现该类天然产物不对称全合成的报导，但合成化学仍然面临合成路线长，选择性差以及产率低的难题。相比于化学催化剂，酶具有高效性以及立体选择性，因此，发现桑树中分子间D-A反应酶不仅能够绿色高效实现桑树中endo-类型D-A天然产物及其类似物的合成，为开发和利用这类天然产物的药用价值奠定了基础，同时也为其他含有六元环的重要化工前体或天然产物的合成提供了新的可能性。

发明内容

本发明的目的是提供一种D-A反应酶及其在促进D-A反应中的应用。

第一方面，本发明提供了一种Diels-Alder反应酶，其来源于桑树，命名为MaDA酶，具有：1)如SEQ ID No.1所示的氨基酸序列；或2)SEQ ID No.1所示的氨基酸序列经取代、缺失和/或增加一个或多个氨基酸的序列与SEQ ID No.1同源性为80％、85％、90％、95％、98％、99％，且具有同等活性的由1)衍生的蛋白质。

进一步地，本发明还提供了MaDA酶的同源蛋白，其分别为MaDA-1、MaDA-2，分别具有：如SEQ ID No.10、12所示的氨基酸序列；其核苷酸序列分别如SEQ ID No.9、11所示。

本发明进一步提供编码所述Diels-Alder反应酶的基因，其具有：

1)SEQ ID No.2所示的核苷酸序列；或

2)SEQ ID No.2所示核苷酸序列经取代、缺失和/或增加一个或几个核苷酸；或

3)在严格条件下与1)限定的DNA序列杂交的核苷酸序列。

本发明从桑树中cDNA中扩增出MaDA基因，其核苷酸序列如SEQ ID No.2所示，该序列为一个完整的开放阅读框(ORF)，该开放阅读框是从ATG起始，以TGA结束，共有1653个核苷酸。其中，前81个核苷酸ATGCAGTACTTTTCCTTCCCTTCATCGTTAGCCAAAATCACCATCTTTCTGATCTTTTCATTTGTATTCGCAAGTTCAGCT为信号肽序列。

如SEQ ID No.1所示Diels-Alder反应酶MaDA含有550个氨基酸，其中前27个氨基酸(MQYFSFPSSLAKITIFLIFSFVFASSA)为基因编码的信号肽，其在成熟酶蛋白分泌到细胞外的过程中会被切除。因此成熟的MaDA是从Asn28开始，共计523个氨基酸，其理论分子量(MWt)为59075.78，酶蛋白的理论等电点(pI)为6.62。

第二方面，本发明还提供了含有MaDA酶编码基因的生物材料，所述生物材料为表达盒、质粒、载体、微生物、昆虫细胞、动物细胞、植物细胞。

优选地，所述生物材料为表达载体pI-sec-sumostar-tev2，其核苷酸序列如SEQID No.3所示。

本发明提供了表达载体pI-sec-sumostar-tev2在昆虫细胞中表达不含信号肽的成熟MaDA酶蛋白中的应用。

本发明实施例中构建包含MaDA基因序列的表达载体pI-sec-sumostar-tev2，并实现在昆虫细胞(Hi5)的大量表达。利用该载体在昆虫中表达出来的SUMO-MaDA蛋白在N端包含了信号肽、6×His标签以及SUMO标签，其氨基酸序列如SEQ ID No.4所示。

其中，前20个氨基酸(MVSAIVLYVLLAAAAHSAFA)为信号肽，HHHHHH为6×His标签，D SEVNQEAKPEVKPEVKPETHINLKVSDGSSEIFFKIKKTTPLRRLMEAFAKRQGKEMDSLTFLYDGIEIQADQTPE DLDMEDNDIIEAHREQIGG为SUMO标签，ENLYFQG为TEV酶切位点。利用昆虫表达体系表达纯化出来的成熟蛋白不含信号肽，其蛋白理论分子量(MWt)为73288.49，酶蛋白的理论等电点(pI)为5.76，利用TEV酶水解后，能得到MaDA不带信号肽的成熟蛋白。

第三方面，本发明提供了所述Diels-Alder反应酶或其编码基因或含有其的生物材料在催化Diels-Alder反应中的应用。

本发明提供了所述Diels-Alder反应酶或其编码基因或含有其的生物材料在催化Diels-Alder反应制备含有六元环骨架的天然产物，或制备立体专一性合成endo构型天然产物中的应用，优选在制备黄酮类天然产物或其类似物中的应用。

具体而言，上述应用是以亲二烯体和二烯体为底物，以本发明所述Diels-Alder反应酶MaDA、MaDA-1、MaDA-2或其编码基因或含有所述酶编码基因的生物材料为催化酶，进行反应，立体专一性合成桑树中存在的endo构型天然产物及其衍生物。

进一步地，对所述亲二烯体查尔酮来说，其苯环上不同位置可以有不同的取代基；对于二烯体来说，桑科植物中存在的含有脱氢异戊烯基结构单元的化合物，因此所述二烯体为包括脱氢异戊烯基黄酮类(dehydroprenyl flavonoids)、脱氢异戊烯基二苯乙烯类(dehydroprenyl stilbenes)、脱氢异戊烯基查尔酮(dehydroprenyl chalcone)以及脱氢异戊烯基苯并呋喃类(dehydroprenyl benzofurans)化合物，它们均可作为该类D-A反应酶的底物。

本发明的有益效果进一步地发现，来源于桑树的MaDA酶最适反应温度为50℃，反应pH为8.0，其催化形成chalcomoracin的效率非常高。

本发明的有益效果在于，本发明发现来/源于桑树的MaDA酶能够以查尔酮或其衍生物和含有脱氢异戊烯基化合物为底物，立体专一性合成endo构型天然产物，能够体外制备桑树中D-A类型天然产物及其衍生物。MaDA酶底物适应性良好，可识别不同取代的查尔酮及其衍生物作为亲二烯体生成天然产物mulberrofurans E/O，和chalcomoracin以及其衍生物，转化率达70％以上；本发明提供的MaDA酶对于桑科植物中含有脱氢异戊烯基结构单元的不同二烯体(dehydroprenyl-benzene diene)均具有一定的活性，能够特异性生成endo产物，展现出良好的底物适应性以及选择性。通过碱性条件下水解原位生成不稳定二烯体以及MaDA催化的不对称D-A反应这两步串联反应，能够以较高的收率(最高可达62％)得到桑科植物来源的不同类型的D-A类型天然产物。为开发和利用桑科中这类天然产物的药用价值奠定了基础，同时也为其他含有六元环的重要化工前体或天然产物的合成提供了新的可能性。

附图说明

图1为D-A反应以及其选择性。当催化剂不能很好的控制D-A反应的选择性时，理论上会有八种不同异构体同时生成。

图2为桑科植物中代表性的D-A类型天然产物及其生物合成途径。桑科植物来源的D-A类型天然产物是由相同的亲二烯体——查尔酮和不同二烯体，包括脱氢异戊烯基黄酮(dehydroprenyl flavonoids)，脱氢异戊烯基查尔酮(dehydroprenyl chalcone),脱氢异戊烯基二苯乙烯(dehydroprenyl stilbenes)，脱氢异戊烯基苯并呋喃(dehydroprenylbenzofurans)。

图3为昆虫表达载体pI-secSUMOstar的图谱。

图4为桑树愈伤组织粗提物的HPLC成分分析图。A为桑树愈伤组织化学成分的高效液相色谱(HPLC)分析图；B为天然产物chalcomoracin的标准品。

图5为不同纯化组分的活性测试结果图。A为阴性对照，该体系中没有任何蛋白；B中加入了桑树悬浮细胞粗酶液；C中加入了疏水柱纯化后的活性蛋白；D中加入了离子交换柱层析纯化后的活性蛋白；E中加入了分子筛柱层析纯化后的活性蛋白。

图6为不同蛋白活性组分的12％SDS-PAGE图。i)展示的是桑树悬浮细胞粗酶液中总蛋白；ii)展示的是桑树悬浮细胞粗酶液经过疏水柱层析纯化后的活性总蛋白；iii)展示的是在上一步疏水柱层析纯化中所得到的总蛋白又经过离子交换柱层析纯化后的活性总蛋白；iv)展示的桑树悬浮细胞粗酶液依次经过疏水柱层析、离子交换柱层析和分子筛柱层析纯化后得到的活性蛋白。

图7为被富集条带的质谱鉴定结果图。

图8为桑树中reticuline oxidase-like enzyme家族蛋白的转录水平。

图9为MaDA基因的琼脂糖凝胶电泳图。M为核酸marker，1为MaDA基因核酸

图10为SUMO-MaDA蛋白SDS-PAGE图。

图11A为不同亲二烯体以及对应D-A产物的结构；图11B为D-A产物的紫外吸收和质谱结果；图11C为活性测试的高效液相色谱结果。

图12为一些亲二烯体的转化率测定结果图。

图13为D-A类型天然产物的酶法合成。

图14为D-A产物chalcomoracin(4)对应立体选择性的测定。I)展示的是酶催化合成的chalcomoracin(4)的手性HPLC分析图；II)展示的是外消旋的chalcomoracin的手性HPLC分析图。

图15为MaDA蛋白的最适温度测定结果。

图16为MaDA蛋白的最适pH测定结果。

图17为MaDA-1与MaDA的蛋白序列比对分析。

图18为MaDA-1的活性测试结果。

图19为MaDA-2与MaDA的蛋白序列比对分析。

图20为MaDA-2催化的亲二烯体1与不同二烯体间的活性测试结果。

图21为MaDA-2催化的亲二烯体5与不同二烯体间的活性测试结果。

具体实施方式

以下实施例对本发明进行详细且具体的说明，但应理解本发明并不限定于以下的例子。若未特别说明，以下实施例所用的试剂、原料均为市售可得。以下实施例所用的菌株、载体、培养基和试剂主要为：

大肠杆菌E.coli DH5α以及DH10Bac的感受态细胞均买自庄盟生物有限公司。表达用昆虫细胞Sf21以及Hi5购买自invitrogen公司。

昆虫表达载体pI-secSUMOstar购买自LifeSensors公司，其谱图如图3所示，将上述pI-secSUMOstar载体中的一段核苷酸序列(AGAGACGATCTGCCGTCTCTCTAGAGCGGCC)置换成含有TEV酶切位点的核苷酸序列(GATTACGATATCCCAACGACCGAAAACCTGTATTTTCAGGGATCCGGAATTCAAAGGCCTACGTCGACGAGCTCACTAGTCGCGGCCGCTTTCGAATCTAGAGCCTGCAGTCTCGAGGCAT，SEQID No.15)，从而构建出pI-sec-SUMOstar-tev2载体。使用pI-sec-SUMOstar-tev2载体表达蛋白时，SUMO标签蛋白和目标蛋白之间新增TEV酶切位点，方便后续切除N端的SUMO标签。该载体的核苷酸序列如SEQ ID NO.3所示。

LB固体培养基：蛋白胨10g/L,酵母粉5g/L,NaCl 10g/L,1.5％的琼脂。

LB液体培养基：蛋白胨10g/L,酵母粉5g/L,NaCl 10g/L。

植物总RNA提取试剂盒、质粒小提试剂盒、胶回收试剂盒均买自天根生化有限公司；逆转录试剂盒买自Thermo公司。同源重组酶买自诺唯赞公司。PCR高保真酶买自全是金公司。PCR引物合成及质粒测序由金唯智生物技术有限公司完成。MS培养基购自北京索莱宝科技有限公司。SIM SF培养基购买自北京义翘神州科技有限公司。化合物2，亲二烯体6购买自云南西力公司。

亲二烯体1根据文献(Romano,J.J.&Casillas,E.A short synthesis ofmorachalcone A.Tetrahedron Lett.2005,46,2323-2326)合成。亲二烯体5根据文献(Han,J.,et al.Enantioselective biomimetic total syntheses of kuwanons I and J andbrosimones A and B,Angew.Chem.Int.Ed.2014,53,9257-9261)进行合成。亲二烯体11根据文献(Lee,Y.R.,et al.An Efficient and Rapid Synthetic Route to BiologicallyInteresting Pyranochalcone Natural Products,Molecules 2007,12,1420-1429)合成。

亲二烯体7的合成

在封管中将S1(29.3mg，0.055mmol)溶于丙酮(3mL)，然后加入1，4-环己二烯(52μL，0.27mmol)，甲酸(2μL，0.027mmol)，甲酸铵(3.5mg，0.056mmol)和钯/碳(11.6mg，0.011mmol)。干冰丙酮浴除氧后40℃搅拌反应2小时。冷却到室温后，硅藻土过滤，旋干溶剂。柱色谱纯化(乙酸乙酯/石油醚＝1/4)得到亲二烯体7(8.7mg，45％)。

¹H NMR(400MHz,Acetone-d₆)δ14.11(s,1H),8.22(d,J＝15.4Hz,1H),7.89(d,J＝8.8Hz,1H),7.83(d,J＝15.4Hz,1H),7.76(d,J＝8.4Hz,1H),6.62–6.38(m,3H),5.28(t,J＝7.2Hz,1H),3.81(s,3H),3.37(d,J＝7.2Hz,2H),1.78(s,3H),1.64(s,3H)；

¹³C NMR(101MHz,Acetone-d₆)δ193.4,165.1,164.1,162.5,159.7,140.4,131.5,131.4,130.0,123.3,118.4,116.2,114.5,107.9,107.5,102.2,55.7,25.8,22.3,17.9。

亲二烯体8的合成

在封管中将S2(175mg，0.32mmol)溶于丙酮(7mL)，然后加入1，4-环己二烯(150μL，1.59mmol)，甲酸(6μL，0.16mmol)，甲酸铵(20mg，0.32mmol)和钯/碳(67mg，0.064mmol)。干冰丙酮浴除氧后40℃搅拌反应2小时。冷却到室温后，硅藻土过滤，旋干溶剂。柱色谱纯化(乙酸乙酯/石油醚＝1/4)得到亲二烯体8(56mg，50％)。

¹H NMR(400MHz,Acetone-d₆)δ14.11(s,1H),8.18(d,J＝15.6Hz,1H),7.91(d,J＝8.8Hz,1H),7.77(d,J＝15.6Hz,1H),7.73(d,J＝8.4,Hz,1H),6.57(s,1H),6.52(m,2H),5.28(t,J＝6.6Hz,1H),3.93(s,3H),3.38(d,J＝7.0Hz,2H),1.78(s,3H),1.64(s,3H)；

¹³C NMR(101MHz,Acetone-d₆)δ193.4,165.1,162.6,162.5,161.7,140.2,131.6,131.4,130.0,123.3,118.1,116.5,116.1,114.5,109.0,107.9,99.9,56.0,25.9,22.3,17.9。

亲二烯体9的合成

在封管中将S3(80.2mg，0.15mmol)溶于丙酮(4mL)，然后加入1，4-环己二烯(70.9μL，0.75mmol)，甲酸(2.8μL，0.075mmol)，甲酸铵(9.5mg，0.15mmol)和钯/碳(31.8mg，0.030mmol)。干冰丙酮浴除氧后40℃搅拌反应2小时。冷却到室温后，硅藻土过滤，旋干溶剂。柱色谱纯化(二氯甲烷/甲醇＝19/1)得到亲二烯体9(25mg，47％)。

¹H NMR(400MHz,Acetone-d₆)δ13.92(s,1H),8.24(d,J＝15.4Hz,1H),8.05(d,J＝9.2Hz,1H),7.83(d,J＝15.4Hz,1H),7.70(d,J＝8.6Hz,1H),6.65(d,J＝9.0Hz,1H),6.52(d,J＝2.4Hz,1H),6.47(dd,J＝8.6,2.4Hz,1H),5.21(t,J＝7.2Hz,1H),3.93(s,3H),3.35(d,J＝7.2Hz,2H),1.77(s,3H),1.63(s,3H)；

¹³C NMR(101MHz,Acetone-d₆)δ193.8,163.9,163.7,162.4,160.0,141.2,131.8,131.5,130.4,123.2,117.5,117.4,115.5,115.2,109.2,103.6,103.0,56.2,25.8,22.2,17.8。

亲二烯体10的合成

0℃下将S4(26.5mg，0.048mmol)溶于四氢呋喃(0.6mL)和异丙醇(0.6mL)。缓慢加入3M盐酸(0.4mL)。缓慢升至室温，搅拌32小时后，加入水淬灭反应。乙酸乙酯萃取，无水硫酸钠干燥。制备TLC纯化得到亲二烯体10(16.5mg，74％)。

¹H NMR(400MHz,Acetone-d₆)δ13.95(s,1H),8.25(d,J＝15.4Hz,1H),8.04(d,J＝9.2Hz,1H),7.84(d,J＝15.4Hz,1H),7.71(d,J＝8.6Hz,1H),6.63(d,J＝9.0Hz,1H),6.53(d,J＝2.0Hz,1H),6.47(dd,J＝8.6,2.0Hz,1H),5.30(t,J＝7.0Hz,1H),3.44(d,J＝7.2Hz,2H),2.12–2.03(m,5H),2.01(t,J＝6.0Hz,2H),1.81(s,3H),1.77(t,J＝7.6Hz,2H),1.65(s,3H)；

¹³C NMR(101MHz,Acetone-d₆)δ193.8,163.8,162.8,162.4,160.0,141.3,131.8,131.5,130.3,123.4,117.8,117.4,115.6,115.2,109.2,103.7,103.6,83.5,70.6,64.0,54.9,33.4,33.1,25.9,22.4,18.1,13.6。

二烯体3的合成

S5(191.5mg，0.39mmol)和S6(301.2mg，1.53mmol)溶于二甲基甲酰胺(40mL)中，然后加入磷酸钾(823mg，3.9mmol)，三苯基胂(16.6mg，0.054mmol)和三(二亚苄基茚丙酮)二钯(24.8mg，0.027mmol)，向溶液中通入半小时氩气，然后50℃下搅拌5小时后，加入水淬灭反应，然后用乙酸乙酯萃取，无水硫酸钠干燥。旋干溶剂后，溶于二氯甲烷(20mL)，之后加入三乙胺(539μL，3.9mmol)和乙酸酐(220μL，2.33mmol)。室温搅拌5小时后，加入水淬灭反应，然后用二氯甲烷萃取，无水硫酸钠干燥。柱色谱纯化(乙酸乙酯/石油醚＝1/10)得到二烯体前体S7(155.3mg，92％)。

¹H NMR(400MHz,CDCl₃)δ7.54(dd,J＝8.6,4.8Hz,1H),7.45(d,J＝5.2Hz,2H),7.45(s,1H),7.26(s,1H),7.08–6.96(m,2H),6.92(d,J＝16.6Hz,1H),5.13(d,J＝9.6Hz,2H),2.34(s,3H),2.33(s,6H),1.93(s,3H)；

¹³C NMR(101MHz,CDCl₃)δ169.7,168.8,154.8,153.0,149.5,148.3,142.1,138.3,129.8,126.8,124.3,121.2,119.1,117.8,117.4,116.9,116.5,105.2,102.6,21.0,18.0。

二烯体3不稳定，只能通过原位水解其乙酰基前体S7来获取：将5体积的甲醇,3体积的水和1体积的碳酸钾水溶液(1M)混匀，然后加入1体积的S7 DMSO母液(100mM)，混匀后静置反应35分钟左右得到10mM的二烯体3的溶液。该溶液直接用于活性测试。二烯体23以及其乙酰基前体S10的合成：

化合物S8(15.9mg,0.0322mmol)和化合物S9(17.0mg,0.0476mmol)溶解在0.6毫升DMF中，然后在氩气的保护下向该溶液中加入三苯基砷(1.4mg,4.5μmol)和Pd₂(dba)₃(2.1mg,2.2μmol)。该混合液室温反应3.5小时后用饱和氯化铵溶液淬灭，然后用***萃取。有机相合并后旋干，经柱层析纯化后(乙酸乙酯/石油醚＝1/4)得到二烯体前体S10(13mg,0.03mmol,93％)。

¹H NMR(400MHz,CDCl₃)δ7.75(s,1H),7.45(d,J＝2.1Hz,2H),7.22(s,1H),6.99(s,1H),6.93(t,J＝2.0Hz,1H),6.86(d,J＝16.1Hz,1H),6.58(d,J＝16.1Hz,1H),5.14(s,1H),5.10(s,1H),2.38(s,3H),2.33(s,6H),1.97(s,3H)；

¹³C NMR(101MHz,CDCl₃)δ169.5,169.0,155.4,154.2,151.5,146.2,142.0,133.4,132.2,127.4,126.5,122.2,118.1,117.9,115.7,115.5,105.8,102.7,21.2,21.0,18.6；

二烯体前体S10(10.3mg,0.024mmol)溶解在0.8毫升甲醇和0.2毫升水的混合液中，然后在氩气的保护下向该溶液中加入碳酸钾(16.4mg,0.119mmol)。该混合液室温反应30分钟后用饱和氯化铵溶液淬灭，然后用乙酸乙酯萃取。有机相合并后旋干，经柱层析纯化后(乙酸乙酯/石油醚＝1/4)得到二烯体23(2.6mg,0.0084mmol,35％)。

¹H NMR(600MHz,Acetone-d6)δ8.78(s,1H),8.35(d,J＝6.3Hz,2H),7.74(s,1H),7.04(s,2H),7.02(s,1H),7.00(s,1H),6.86(d,J＝2.2Hz,2H),6.37(t,J＝2.2Hz,1H),5.11(d,J＝1.7Hz,1H),5.03(s,1H),1.99(s,3H)；

¹³C NMR(125MHz,Acetone-d6)159.8,156.1,155.9,154.3,143.6,133.2,131.2,124.8,123.1,122.7,118.4,116.5,103.8,103.6,102.3,98.4,18.8。

二烯体24以及其乙酰基前体S13的合成

化合物S11(68.8mg,0.194mmol)溶解在5毫升甲醇和5毫升二氯甲烷的混合液中，然后向该溶液中加入BTMA·ICl₂(67.5mg,0.194mmol)和碳酸钙(194mg,1.94mmol)。该混合液室温反应15小时后过滤除去碳酸钙，然后加入二氯甲烷萃取。有机相合并后旋干，经柱层析纯化后(甲醇/二氯甲烷＝1/10)得到S12的粗品。

将上诉S12(70mg,0.146mmol)的粗品和S6(113mg,0.584mmol)溶解在2毫升DMF中，然后加入磷酸钾(318mg,1.46mmol)和三苯基砷(6.4mg,0.0204mmol)。向该溶液中通入半小时氩气以除去溶液中的氧气，随后加入Pd₂(dba)₃(9.4mg,0.0102mol)。该反应液在50℃下反应5小时后过滤，收集滤液。滤液旋干后溶解在4毫升二氯甲烷中，然后加入三乙胺(122μL,0.875mmol)和醋酸酐(55.2μL,0.584mmol)，室温反应过夜。反应结束后，用二氯甲烷萃取，旋干。柱层析纯化后(丙酮/石油醚＝1/4)得到二烯体前体S13(12.0mg,三步总收率15％)。

¹H NMR(400MHz,Acetone-d6)δ13.97(s,1H),8.15(d,J＝8.6Hz,2H),7.38(dd,J＝12.5,9.2Hz,3H),7.03(s,1H),6.94(s,1H),6.56(d,J＝16.5Hz,1H),5.16(s,1H),5.12(s,1H),2.39(s,3H),2.31(s,3H),1.96(s,3H)；

¹³C NMR(101MHz,Acetone-d6)δ184.1,169.3,168.8,164.8,160.8,155.7,155.0,154.9,143.7,137.4,129.1,128.9,123.5,118.4,118.3,114.8,109.2,106.4,103.2,21.0,20.9,18.1。

二烯体24不稳定，只能通过原位水解其乙酰基前体S13来获取：将4体积的甲醇,3体积的水和1体积的碳酸钾水溶液(1M)混匀，然后加入2体积的S13 DMSO母液(50mM)，混匀后静置反应35分钟左右得到10mM的二烯体24的溶液。该溶液直接用于活性测试。

二烯体25和22的合成

二烯体前体S14参照文献(Gao,L.,Han,J.,Lei,X.Enantioselective totalsyntheses of kuwanon X,kuwanon Y,and kuwanol A,Org.Lett.2016,18,360-363)进行合成，然后利用碳酸钾原位水解生成二烯体25，其操作与合成二烯体3相同。二烯体前体S15参照文献(Han,J.,et al.Enantioselective biomimetic total syntheses of kuwanonsI and J and brosimones A and B,Angew.Chem.Int.Ed.2014,53,9257-9261)进行合成，然后利用碳酸钾原位水解生成二烯体22，其操作与合成二烯体3相同。

外消旋chalcomoracin(4)的合成

化合物S16参照文献(Han,J.,et al.Enantioselective biomimetic totalsyntheses of kuwanons I and J and brosimones A and B,Angew.Chem.Int.Ed.2014,53,9257-9261)进行合成。

(±)-BINOL(25.4mg,0.107mmol)溶解在1.5毫升THF中，然后加入BH₃·THF(51.5μL,0.0515mmol)和醋酸(3.0μL,0.0515mmol)。该反应液在室温下搅拌25分钟，然后抽干。向该固体中加入2.5毫升THF中，然后加入200毫克

分子筛和亲二烯体S16(20.0mg,0.0429mmol)，随后室温反应1.5小时后加入S7(22.4mg,0.0515mmol)。该混合物反应72小时后，用水淬灭。过滤后收集滤液，并用乙酸乙酯萃取后旋干。经过初步柱层析纯化后(乙酸乙酯/石油醚＝1/5到1/2)得到S17粗品。

将消旋体S17(4.4mg,0.00489mmol)加入到0.5毫升甲醇和0.25毫升的THF混合溶液中，然后加入碳酸钾(6.7mg,0.0489mmol)，室温下反应1小时后加入0.9毫升0.1N盐酸淬灭反应。该混合液用乙酸乙酯萃取后旋干。经柱层析纯化后(甲醇/二氯甲烷＝5：95)得到外消旋天然产物chalcomoracin(4)。其NMR数据与文献一致(Takasugi,M.,Nagao,S.,Masamune,T.,Shirata,A.,Takahashi,K.Chalcomoracin,a natural Diels-Alder adductfrom diseased mulberry.Chem.Lett.1980,9,1573-1576)。

实施例1

1、桑树愈伤组织的诱导和培养

将采集回来的幼叶用70％乙醇表面灭菌30s后，用饱和的次氯酸钠溶液灭菌10min，然后用5倍量的蒸馏水漂洗3次。将灭菌后的外植体剪成1cm²左右的小块，接种在MS+NAA(萘乙酸)0.5mg·L^-1+6-BA(6-苄氨基腺嘌呤)0.5mg·L^-1+2，4-D(2，4-二氯苯氧乙酸)0.2mg·L^-1，pH 5.8固体培养基上，在黑暗条件下进行愈伤组织的诱导，将诱导出的愈伤组织接种于上述MS固体培养基进行扩大培养，每4周继代1次，培养温度为(25±1)℃。选择生长状况良好的愈伤组织接种到相同的MS液体培养基中，建立桑树悬浮细胞系于(25±1)℃黑暗条件下110r·min^-1的摇床上培养。

2、桑树愈伤组织中D-A类型天然产物的成分分析。

称取烘干后的桑树愈伤组织0.1克，加入至1.5EP管中，然后加入1mL甲醇水溶液(甲醇：水＝4：1)后超声2次，用0.22微米滤膜过滤后得到愈伤组织粗提物。该粗提物用HPLC分析，得到如图4的A所示的结果，通过与chalcomoracin标准品的对照(图4的B)可以看出，桑树愈伤组织中富含D-A类型天然产物chalcomoracin。这说明在我们的桑树愈伤组织中催化chalcomoracin合成的D-A反应酶存在且可能高表达。

3、活性导向蛋白分离

1)细胞粗酶液的制备

将新鲜桑树细胞培养物(200g)添加到由50μM磷酸钠、pH 7.4、1μM EDTA、3μm巯基乙醇和100μM PMSF按1:100(vol/vol)的比例组成的破碎缓冲液(400ml)中，并在4℃下用温拌机处理。混合物在9000g下离心4C，30min，将上清液收集到500ml锥形瓶中作为沉淀。将固体硫酸铵加入到上清中，使其达到80％的饱和。在4℃下轻轻搅拌12小时后，将混合物分配到试管中，并在4℃下在9000g下离心30分钟。所得颗粒再悬浮在含有20mM Tris HCl、pH7.4、2mM EDTA和3mm 2-巯基乙醇的缓冲液中，并转移到新试管中。将蛋白质样品在160,000g、4℃下离心2h以去除微粒体，收集上清液并使用Amicon Ultra-30K(微孔)浓缩管离心浓缩得到细胞粗酶液。

2)疏水柱层析纯化

Hitrap Butyl FF柱(5ml)先用50mM磷酸钠缓冲液(pH＝7.0，含1.5M硫酸铵)平衡，然后再将上述细胞粗酶液装载到Hitrap Butyl FF柱(5ml)上，该柱使用50mM磷酸钠缓冲液(pH＝7.0)进行蛋白质洗脱。洗脱的梯度为0-20min 0％50mM磷酸钠缓冲液(pH＝7.0)(vol/vol)，20-70min 20％50mM磷酸钠缓冲液(pH＝7.0(vol/vol)，70-120min 100％50mM磷酸钠缓冲液(pH＝7.0)。流速为2mL/min。

3)离子交换柱层析纯化

将上述Hitrap Butyl FF色谱的活性组分收集，缓冲液交换至20mM Tris HCl，pH值8.0，并装载至事先用20mM Tris HCl，pH值8.0的缓冲液平衡后的Hitrap Q FF(5ml)柱(GE Healthcare，USA)上。蛋白质洗脱以2mL/min的流速进行，使用含有20mM Tris HCl、pH8.0和1M NaCl的缓冲液作为洗脱缓冲液，洗脱梯度为：0％(vol/vol)时梯度为0-20min，在10％(vol/vol)时梯度为20-40min，在20％(vol/vol)时梯度为40-60min，在100％时梯度为60-100min。

4)分子筛柱层析纯化

将上述Hitrap Q色谱的活性组分使用串联的SuperDextm 200Increase 10/300GL柱(GE Healthcare，USA)进行浓缩和分离。在0.25ml/min的流速下，使用含有20m m TrisHCl、pH 7.2、0.15M NaCl的缓冲液进行等比例蛋白质洗脱。用安捷伦1260高效液相色谱法测试洗脱部分的活性。使用NGC^TM色谱***(bio-rad)进行凝胶过滤层析(size-exclusionchromatography)。

5)将上述纯化之后的不同蛋白组分进行活性测试

向含有100μM亲二烯体morachalcone A(1)和100μM moracin C(2)的20mM Tris·HCl(pH 7.5)的反应液中加入9.8μg上述步骤1-4中的不同蛋白，最终体积为100μL。该反应混合物在30℃下孵育1小时后加入200μL冰甲醇终止反应，15000g离心30min，上清用HPLC-MS分析。当在反应液中不加入细胞粗酶液或者经过纯化后的活性蛋白组分时，亲二烯体1和二烯体前体moracin C(2)不会发生任何变化，如图5的A所示；加入细胞裂解液后，能检测到二烯体(diene)3以及对应的D-A天然产物chalcomoracin(4)的产生，如图5的B所示；将用疏水柱纯化后的活性蛋白组分加入反应液中，也能检测到二烯体(diene)3以及D-A天然产物chalcomoracin(4)，如图5的C所示；将用离子交换柱纯化之后的活性蛋白组分加入反应液中，天然产物4的含量增加，如图5的D所示；将经过凝胶过滤层析后的活性蛋白成分加入到反应液中，天然产物4的含量明显增加，如图5的E所示，这说明在这个活性组分中，D-A反应酶可能被富集。

4、不同蛋白活性组分的SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)

将各活性组份蛋白的浓度统一稀释到0.4μg/μL，取25μL的蛋白样品，加入5μLloading buffer，随后100℃处理5min后进行12％的SDS-PAGE电泳检测。结束电泳后，进行考马斯亮蓝染色，得到如图6所示的结果。通过比较不同组分中的蛋白条带，在凝胶柱纯化后的组分中看到明显的富集条带，如图6中箭头所示，该条带作为候选的蛋白条带，送交蛋白质谱检测。

5、LC-MS/MS蛋白质谱测定

将上述富集的条带切下后，送至北京生命科学研究所进行LC-MS/MS质谱鉴定，所得的肽段信息与川桑(Morus notabilis)蛋白序列做比对，从而得到该富集条带中的蛋白质信息，如图7所示。认为被富集出来的条带最有可能是桑树中一类reticuline oxidase-like protein，推测这类蛋白很可能就是催化分子间D-A反应的酶。

实施例2 桑树愈伤组织的转录组分析

向生长了10天左右的桑树愈伤组织培养液中加入0.1mM的茉莉酸甲酯，诱导培养20小时后，将愈伤组织送去华大基因公司进行转录组测序。在所得的转录组序列信息中，共找到了14个注释为reticuline oxidase-like oxidase或其同源蛋白(Cannabidiolicacid synthase)的转录本，根据其fragments per kilobase of exon per million readsmapped(FPKM)的大小，将这些蛋白根据转录水平的高低进行排序，得到图8所示结果。

1、桑树愈伤组织总RNA的提取

取大约100克新鲜愈伤组织放入研钵中，加入液氮后研末至粉末状，然后依照天根生化公司的植物总RNA提取试剂盒说明书提取桑树叶片总RNA。详细操作如下：

1)取大约100毫克磨碎后的样品加入至1.5mL的EP管中，加入450μL的裂解液，剧烈振荡混匀后离心(15，000×g，5min)，收集上清。

2)将上述上清转移至过滤柱CS上(过滤柱CS放在收集管中)，12,000rpm(13,400×g)离心2-5min，小心吸取收集管中的上清至RNase-Free的离心管中，吸头尽量避免接触收集管中的细胞碎片沉淀

3)缓慢加入0.5倍上清体积的无水乙醇(大约为225μL)，混匀，将得到的溶液和沉淀一起转入吸附柱CR3中，12,000rpm(～13,400×g)离心30-60sec，倒掉收集管中的废液，将吸附柱CR3放回收集管中。

4)向吸附柱CR3中加入350μL去蛋白液RW1，12,000rpm(～13,400×g)离心30-60sec，倒掉收集管中的废液，将吸附柱CR3放回收集管中。

5)向吸附柱CR3中央加入80μL的DNase I工作液，室温放置15min。

6)向吸附柱CR3中加入350μL去蛋白液RW1，12,000rpm(～13,400×g)离心30-60sec，倒掉收集管中的废液，将吸附柱CR3放回收集管中。

7)向吸附柱CR3中加入500μL漂洗液RW，室温静置2min，12,000rpm(～13,400×g)离心30-60sec，倒掉收集管中的废液，将吸附柱CR3放回收集管中。

8)重复步骤7.

9)12,000rpm(～13,400×g)离心2min，倒掉废液。将吸附柱CR3置于室温放置数分钟，以彻底晾干吸附材料中残余的漂洗液。

10)将吸附柱CR3放入一个新的RNase-Free离心管中，向吸附膜的中间部位悬空滴加30-100μL RNase-Free ddH₂O，室温放置2min，12,000rpm(～13,400×g)离心2min，得到RNA溶液。

2、桑树愈伤组织cDNA的制备

提取的总RNA用DNAase37℃处理半个小时后，用RNA纯化试剂盒进行纯化，用nanodrop测定回收浓度。用Thermo Scientific RevertAid First Strand cDNASynthesis Kit逆转得到cDNA。

3、MaDA基因的扩增

上游引物序列：

5’-AACCTGTATTTTCAGGGATCCAACGACACTCATGAAGCCTTTCTTG-3’(SEQ ID No.5)

下游引物序列:

5’-CTCGAGACTGCAGGCTCTAGATCACATTGCTGAATGTAGAGGAGGAAGAG-3’(SEQ ID No.6)

PCR反应体系(50μL)：

PCR循环条件(50μl体系)：95℃2min；98℃30s，52℃30s，72℃1min，共32个循环，72℃5min。

PCR结束后，对PCR产物进行1％的琼脂糖凝胶电泳，如图9所示，并回收该特异性条带，纯化。

4、杆状病毒构建

采用Invivogen公司所开发的“Bac-to-bac”方法：

pI-sec-sumostar-tev2空载用BamHI和XbaI双酶切过夜，1％琼脂糖凝胶电泳后，用胶回收试剂盒回收单一条带，用nanodrop测定回收的DNA浓度。利用Vazyme同源重组酶构建pI-sec-sumostar-tev2-MaDA质粒，10μL连接体系包括：1μL Exnase II酶，2μL 5×CEbuffer，3μL线性化载体，4μL MaDA PCR产物。

上述连接体系中，MaDA与线性化pI-sec-sumostar-tev2载体的摩尔数之比大致为2：1。上述反应体系在37℃反应30min后，立即置于冰上，随后将连接产物加入100μL DH5α感受态中,冰浴30min后42℃热激1min,然后立即冰浴3min,加入1mL LB培养基37℃，220rpm培养。大约1小时后，离心弃900μL培养基，将菌体重悬在剩余的100μL培养基中，然后用移液枪全部取出并涂布于含有氨苄青霉素(100μg/mL)的固体LB平板。37℃过夜培养后，挑取固体培养基上的单克隆于LB液体培养基中培养12-16小时后提取质粒并送测序。

1μg pI-sec-sumostar-tev2-MaDA加入到100μL DH10Bac的感受态细胞中，冰浴30min后42℃热激1min,随后冰上放置大约3min后，加入1mL LB液体培养基,37℃，220rpm培养大约4小时后，将菌液用5mL液体LB稀释，取100μL稀释后的菌液涂布在含有卡那霉素(50μg/mL)、庆大霉素(7μg/mL)、四环素(10μg/mL)、IPTG(40μg/mL)以及Bluo-gal(100μg/mL)的固体LB平板上。37℃静置过夜培养后，挑取3-4个大的白色克隆接种到含有卡那霉素(50μg/mL)、庆大霉素(7μg/mL)、四环素(10μg/mL)的液体LB中过夜培养。收集上述过夜培养的大肠杆菌，利用异丙醇沉淀的方法提取杆粒并进行PCR鉴定，PCR所用引物序列为：

上游引物序列：5’-AAATGATAACCATCTCGC-3’(SEQ ID No.7)

下游引物序列：5’-GGAGGATAACGATATTATTGAGGC-3’(SEQ ID No.8)

PCR体系为：

将含有目的基因的杆粒(PCR验证为阳性)转染昆虫细胞sf21，使用SIM-SF培养基贴壁培养96小时后得到P1代杆状病毒。悬浮培养sf21细胞，当细胞密度达到1.5×10⁶至2.5×10⁶个每毫升时，按1:200的体积比加入P1代杆状病毒，96小时后得到P2代杆状病毒。

5、分泌蛋白表达

采用昆虫细胞Hi5作为蛋白表达体系。Hi5细胞采用SIM-HF培养基悬浮培养，细胞密度在1.5×10⁵至2.5×10⁶个每毫升时感染杆状病毒，48小时后离心去掉细胞，收集上清。利用Sartorius公司的viva flow 200浓缩装置对上清进行浓缩和缓冲液置换，然后通过镍离子螯合亲和层析纯化带有His标签的目的蛋白，如图10所示。

实施例3 MaDA的酶活测试

1)亲二烯体底物适用范围的测定

向97μL反应缓冲液(20mM Tris·HCl,pH＝8.0)中加入1μL二烯体3(终浓度100μM)以及1μL不同查尔酮或其衍生物(终浓度100μM)，然后加入1μL带有SUMO标签的MaDA蛋白(终浓度2.7nM)，50℃下反应10分钟后，加入200μL甲醇淬灭反应，13,000rpm离心30min后,利用HPLC分析。

HPLC分析的条件为：

色谱柱：Shiseido MGIII C18(250mm×4.6mm，5μm)；流动相：甲醇-水(0.1％甲酸)梯度洗脱，0～15min，40→70％甲醇；15～35min，70→100％甲醇，35～45min，100→40％甲醇；流速：1.0mL·min^-1，检测波长：340nm，柱温：25℃；进样体积为10μL。

不同亲二烯体以及对应D-A产物的结构见图11A；D-A产物的紫外吸收和质谱结果见图11B，HPLC分析结果如图11C所示，MaDA可以识别不同取代的查尔酮及其衍生物(化合物1，6-11)生成天然产物mulberrofurans E/O，和chalcomoracin以及其衍生物，展现出良好的底物适应性，但不能识别不带异戊烯基的查尔酮5。为了进一步确定产物结构，本发明通过酶促的大量反应对天然产物chalcomoracin(4)以及其衍生物13进行了制备与结构鉴定，确定了其结构与报道的结构一致，详见实施例3。

2)一些亲二烯体底物转化率测定

本实施例还测定了亲二烯体1、5-9在酶促D-A反应条件下的转化率，测试条件如下：向96μL反应缓冲液(20Mm Tris·HCl,pH＝8.0)中加入2μL二烯体3(终浓度200μM)以及1μL不同查尔酮或其衍生物(即亲二烯体1，5-9，终浓度100μM)，然后加入1μL MaDA或者带有SUMO标签的MaDA蛋白(终浓度540nM)，50℃下反应5分钟后，加入200μL甲醇淬灭反应，用上述HPLC分析条件分析该反应液。经过三次重复实验后，计算可得到亲二烯体1、7、8、9、5、6的转化率为74％，55％，13％，78％，0％，71％，如图12所示。结果显示，在该反应条件下，MaDA蛋白能够比较高效识别并利用亲二烯体1、6、9合成对应的天然产物或者其衍生物。

3)二烯体底物适用范围的测定

本实施例通过化学合成的方式，还得到了许多带有脱氢异戊烯基的二烯体。随后测定了不同二烯体与亲二烯体1之间的反应效率，其反应条件和实验结果如图13所示，具体操作为：对应二烯体的乙酰基前体(0.026mmol，1.2当量)溶解在1毫升水和甲醇的混合溶液中(水：甲醇＝1：4)，然后加入碳酸钾(0.087mmol，5.0当量)，室温搅拌35分钟后，加入到48毫升的反应缓冲液中(20mM Tris·HCl,pH＝8.0),再向该反应体系中加入0.35毫克SUMO-MaDA酶和7.4毫克亲二烯体1(0.022mmol，1.0当量，溶解于0.34毫升的DMSO中)，混匀后37℃静置培养14-18小时，随后加入50毫升饱和氯化铵溶液淬灭反应，再用乙酸乙酯(50mL)萃取三次后旋干。旋干后利用C18反向高效液相色谱HPLC(Waters,XBridge@pre C18 OBDTM,150mm×19mm i.d.,5μm)进行分离纯化得到最终的产物，如图13所示，液相制备体系为水(A)和乙腈(B)，梯度为：50％-80％B,0-5min,80％-95％B,5-12min,95％-95％B,12-15min,95-50％B,15-16min,50％B,16-18min。

由上述结果可以看出，MaDA酶对于含有五种不同二烯体3、22-25均具有一定的活性，能够特异性生成endo产物，展现出良好的底物适应性以及选择性。通过碱性条件下水解原位生成不稳定二烯体以及MaDA催化的不对称D-A反应这两步串联反应，能够以较高的收率(最高可达62％)得到五种不同类型的D-A类型天然产物。

通过测定酶法制备的产物chalcomoracin(4)的ee值，证明了MaDA催化D-A反应除了具备endo选择性外，还具有立体专一性，如图14所示。这说明MaDA在立体专一性地合成D-A类型天然产物中具有一定的应用价值。

4)MaDA最适温度和最适pH的测定

以二烯体3和亲二烯体1为底物考察不同反应温度(25、30、35、40、45、50、55、60、70℃)对MaDA催化[4+2]环化反应的影响。反应体系如下0.1mM的二烯体3和亲二烯体1，0.02μg的MaDA总体积100μL在Tris-HCl在pH 7.5的缓冲溶液(缓冲液提前在不同温度下平衡15min)条件下反应5min，反应结束后加入200μL的冷甲醇终止反应，涡旋混匀，高速离心机15000g离心30min，取上清液，利用HPLC进行检测。每组反应三个平行。底物的转化率通过产物的峰面积代入标准曲线计算底物的减少量来计算，最终得到在不同温度下MaDA的相对活性，如图15所示。

以二烯体3和亲二烯体1为底物考察不同pH缓冲溶液(pH 4.0-6.0，柠檬酸-柠檬酸钠缓冲液；6.0-7.0，磷酸氢二钠-磷酸二氢钠缓冲液；7.0-9.0，Tris-HCl缓冲液；9.0-11.0，碳酸钠-碳酸氢钠缓冲液)对MaDA催化[4+2]环化反应的影响。反应体系如下：0.1mM的二烯体3和亲二烯体1，0.02μg的MaDA总体积100μL在不同pH和不同缓冲溶液(缓冲液提前在不同温度下平衡15min)条件下反应5min，反应结束后加入200μL的冷甲醇终止反应，涡旋混匀，高速离心机15000g离心30min，取上清液，利用HPLC进行检测。每组反应三个平行。底物的转化率通过产物的峰面积代入标准曲线计算底物的减少量来计算，得到MaDA在不同pH下得到相对活性，如图16所示。

实施例4 MaDA酶的应用

1、利用MaDA酶作为催化剂制备chalcomoracin(4)

二烯体前体S7(11.3mg,0.0261mmol)加入到1毫升的甲醇水溶液中(甲醇/水＝4：1)，然后加入碳酸钾(18.0mg,0.131mmol)。该反应液在室温下反应大概35分钟后原位产生二烯体3，然后将该溶液加入到98毫升的反应液(59nM MaDA，20mM Tris-HCl，pH＝8.0)中，最后加入亲二烯体morachalcone A(1，7.4毫克，溶解在0.37毫升的DMSO中)。该反应液在37℃下反应过夜后用乙酸乙酯萃取，合并有机相并旋干，最后通过HPLC纯化得到天然产物chalcomoracin(4)(7.2mg，51％)。

[α]_D ²⁰+178.8°(c 0.10,MeOH)；

¹H NMR(600MHz,Acetone-d₆)δ8.44(1H,d,J＝9.0Hz,H-14″),7.34(1H,d,J＝8.4Hz,H-4),6.98(1H,d,J＝8.4Hz,H-20″),6.93(1H,s,H-7),6.92(1H,s,H-3),6.76(2H,s,H-2′,H-6′),6.75(1H,dd,J＝8.4,2.4Hz,H-5),6.52(1H,d,J＝2.4Hz,H-17″),6.46(1H,d,J＝9.0Hz,H-13″),6.31(1H,dd,J＝8.4,2.0Hz,H-19″),5.77(1H,br s,H-2″),5.16(1H,t,J＝7.2Hz,H-22″),4.65(1H,t,J＝4.8Hz,H-4″),4.10(1H,br s,H-3″),3.75(1H,br s,H-5″),3.25(2H,d,J＝7.2Hz,H-21″),2.48(1H,m,H-6″),2.11(1H,m,H-6″),1.94(3H,s,H-7″),1.71(3H,s,H-24″),1.57(3H,s,H-25″)；

¹³C NMR(150MHz,Acetone-d₆)δ:155.4(C-2),101.9(C-3),121.9(C-4),113.2(C-5),156.6(C-6),98.4(C-7),122.7(C-3a),156.7(C-7a),131.6(C-1′),113.5(C-2′),157.9(C-3′,C-5′),116.6(C-4′),104.9(C-6′),133.8(C-1″),124.4(C-2″),33.2(C-3″),47.8(C-4″),36.6(C-5″),32.2(C-6″),23.9(C-7″),209.9(C-8″),113.2(C-9″),164.7(C-10″),116.0(C-11″),163.3(C-12″),108.2(C-13″),132.2(C-14″),122.7(C-15″),157.9(C-16″),103.6(C-17″),157.8(C-18″),107.6(C-19″),128.8(C-20″),22.2(C-21″),123.2(C-22″),131.8(C-23″),17.9(C-24″),25.9(C-25″)；

HRMS(ESI)理论值C₃₉H₃₇O₉[M+H]⁺649.2432,实际值649.2405。

2、利用MaDA酶作为催化剂制备18″-O-methychalcomoracin(13)

二烯体前体S7(10.0mg,0.023mmol)加入到1毫升的甲醇水溶液中(甲醇/水＝4：1)，然后加入碳酸钾(12.7mg,0.092mmol)。该反应液在室温下反应大概35分钟后原位产生二烯体3，然后将该溶液加入到98毫升的反应液(118nM MaDA，20mM Tris-HCl，pH＝8.0)中，最后加入亲二烯体7(6.8毫克，溶解在1毫升的DMSO中)。该反应液在37℃下反应过夜后用乙酸乙酯萃取，合并有机相并旋干，最后通过HPLC纯化得到18″-O-methychalcomoracin(13)(1.6mg,13％)。

[α]_D ²⁰+180.2°(c 0.10,MeOH)；

¹H NMR(Acetone-d₆,400MHz)δ:8.42(1H,d,J＝8.0Hz,H-14″),7.35(1H,d,J＝8.4Hz,H-4),7.09(1H,d,J＝8.4Hz,H-20″),6.93(1H,s,H-7),6.93(1H,s,H-3),6.77(2H,s,H-2′,H-6′),6.77(1H,dd,J＝8.4,2.4Hz,H-5),6.55(1H,d,J＝2.4Hz,H-17″),6.44(1H,d,J＝9.0Hz,H-13″),6.40(1H,dd,J＝8.4,2.0Hz,H-19″),5.78(1H,br s,H-2″),5.16(1H,t,J＝7.2Hz,H-22″),4.65(1H,t,J＝4.2Hz,H-4″),4.11(1H,br s,H-3″),3.79(1H,br s,H-5″),3.25(2H,d,J＝7.2Hz,H-21″),2.52(1H,m,H-6″),2.24(1H,m,H-6″),1.94(3H,s,H-7″),1.71(3H,s,H-24″),1.57(3H,s,H-25″),3.73(OCH₃)；

¹³C NMR(Acetone-d₆,100MHz)δ:155.3(C-2),101.9(C-3),121.9(C-4),113.0(C-5),156.5(C-6),98.3(C-7),122.6(C-3a),156.6(C-7a),131.5(C-1′),113.9(C-2′),157.6(C-3′,C-5′),117.7(C-4′),105.4(C-6′),133.8(C-1″),124.3(C-2″),33.2(C-3″),47.7(C-4″),36.5(C-5″),32.3(C-6″),23.8(C-7″),209.6(C-8″),113.4(C-9″),164.6(C-10″),115.9(C-11″),163.3(C-12″),108.1(C-13″),132.1(C-14″),123.1(C-15″),157.7(C-16″),102.4(C-17″),160.3(C-18″),107.1(C-19″),128.8(C-20″),22.2(C-21″),123.2(C-22″),132.1(C-23″),17.8(C-24″),25.8(C-25″),55.3(OCH₃)；

HRMS(ESI)理论值C₄₀H₃₉O₉[M+H]⁺663.2589,实际值663.2549。

3、利用MaDA酶作为催化剂制备guangsangon E(18)

二烯体前体S10(9.2mg,0.0212mmol)加入到1毫升的甲醇水溶液中(甲醇/水＝4：1)，然后加入碳酸钾(12.0mg,0.0870mmol)。该反应液在室温下反应大概35分钟后原位产生二烯体23，然后将该溶液加入到48毫升的反应液(118nM MaDA，20mM Tris-HCl，pH＝8.0)中，最后加入亲二烯体1(5.2毫克，溶解在0.26毫升的DMSO中)。该反应液在37℃下反应过夜后用乙酸乙酯萃取，合并有机相并旋干，最后通过HPLC纯化得到guangsangon E(13)(6.0mg,62％)。

[α]_D ²⁰+376.6°(c 0.11,MeOH)；

¹H NMR(Acetone-d₆,600MHz)δ:13.04(1H,s),9.04(1H,s),8.38(2H,br s),8.29(1H,s),8.02(1H,d,J＝8.8Hz,H-14″)，7.99(1H,s),7.86(1H,s),7.46(1H,s,H-4),7.04(1H,d,J＝0.7Hz,H-3)，6.87(1H,d,J＝8.4Hz,H-20″),6.84(2H,d,J＝2.2Hz,H-2',6'),6.82(1H,s,H-7),6.44(1H,d,J＝8.8Hz,H-13″),6.34(1H,t,J＝2.2Hz，H-4')，6.27(1H,d,J＝2.4Hz，H-17″),6.14(1H,dd,J＝8.4,2.4Hz,H-19″),5.57-5.56(1H,m,H-2″),5.17-5.09(1H,m,H-22″)，4.70(1H,dd,J＝9.7,5.4Hz，H-4″),4.39(1H,brs,H-3″),3.71-3.67(1H,m,H-5″),3.20(2H,d,J＝7.0Hz,H-21″),2.48-2.44(1H,m,H-6″),2.07-2.06(1H,m,H-6″),1.90(3H,s,H-7″),1.67(3H,s,H-24″),1.57(3H,s,H-25″)；

¹³C NMR(Acetone-d₆,150MHz)δ:155.1(C-2),102.6(C-3),123.8(C-4),125.5(C-5),156.4(C-6),97.2(C-7),121.9(C-3a),154.7(C-7a),129.7(C-1'),103.7(C-2'),159.7(C-3'),103.3(C-4'),159.7(C-5'),103.7(C-6'),135.1(C-1″),125.5(C-2″),37.8(C-3″),48.4(C-4″),33.5(C-5″),37.3(C-6″),23.6(C-7″),207.0(C-8″),115.7(C-9″),163.8(C-10″),115.3(C-11″),161.8(C-12″),107.2(C-13″),130.5(C-14″),123.1(C-15″),155.2(C-16″),103.8(C-17″),156.4(C-18″),107.5(C-19″),129.7(C-20″),22.2(C-21″),123.5(C-22″),131.1(C-23″),17.8(C-24″),25.8(C-25″)；

HRMS(ESI)理论值C₃₉H₃₇O₉[M+H]⁺649.2438,实际值649.2435。

4、利用MaDA酶作为催化剂制备kuwanol E(21)

乙酰基保护的前体S14(12.5mg,0.0261mmol)加入到1毫升的甲醇水溶液中(甲醇/水＝4：1)，然后加入碳酸钾(21.6mg,0.1567mmol)。该反应液在室温下反应大概35分钟后原位产生二烯体25，然后将该溶液加入到98毫升的反应液(59nM MaDA，20mM Tris-HCl，pH＝8.0)中，最后加入亲二烯体1(7.4毫克，溶解在0.37毫升的DMSO中)。该反应液在37℃下反应过夜后用乙酸乙酯萃取，合并有机相并旋干，最后通过HPLC纯化得到kuwnaol E(21)(6.4mg,45％)。

[α]_D ²⁰+160.0°(c 0.03,MeOH)；

¹H NMR(Acetone-d₆,600MHz)δ:13.00(1H,s),8.42(1H,d,J＝9.0Hz,H-14″),6.76(1H,d,J＝15.6Hz,H-β),6.43(1H,H-6′),7.21(1H,d,J＝15.6Hz,H-α),7.36(1H,d,J＝9.0Hz,H-6),6.99(1H,d,J＝8.0Hz,H-20″),6.50(1H,d,J＝2.4Hz,H-17″),6.40(1H,d,J＝2.4Hz,H-3),6.43(1H,H-2′),6.35(1H,dd,J＝2.4,9.0Hz,H-5),6.43(1H,d,J＝9.0Hz,H-13″),6.31(1H,dd,J＝2.4,8.4Hz,H-19″),5.77(1H,s,H-2″),5.17(1H,t,J＝7.2Hz,H-22″),4.61(1H,t,J＝4.0Hz,H-4″),4.08(1H br s,H-3″),3.74(1H br s,H-5″),3.27(2H,d,J＝7.2Hz,H-21″),2.50(1H,br d,J＝18.0Hz,H-6″),2.17(1H,br d,J＝18.0Hz,H-6″),1.92(3H,s,H-7″),1.71(3H,s,H-24″),1.58(3H,s,H-25″)；

¹³C NMR(Acetone-d₆,150MHz)δ:117.4(C-1),157.4(C-2),103.5(C-3),158.9(C-4),108.4(C-5),124.8(C-6),126.1(C-α),126.8(C-β),139.2(C-1′),106.6(C-2′),157.5(C-3′),115.8(C-4′),157.5(C-5′),106.6(C-6′),133.6(C-1″),123.9(C-2″),33.2(C-3″),47.9(C-4″),36.5(C-5″),32.3(C-3″,C-6″),23.9(C-7″),209.9(C-8″),113.6(C-9″),164.7(C-10″),115.9(C-11″),164.4(C-12″),108.1(C-13″),132.3(C-14″),122.0(C-15″),156.8(C-16″),103.5(C-17″),157.9(C-18″),107.5(C-19″),128.8(C-20″),22.3(C-21″),123.2(C-22″),131.6(C-23″),17.9(C-24″),25.9(C-25″).

HRMS(ESI)理论值C₃₉H₃₉O₉[M+H]⁺651.2549,实际值651.2589。

5、利用MaDA酶作为催化剂制备Kuwanon J(19)

乙酰基保护的前体S15(8.5mg,0.017mmol)加入到1毫升的甲醇水溶液中(甲醇/水＝4：1)，然后加入碳酸钾(11.2mg,0.081mmol)。该反应液在室温下反应大概35分钟后原位产生二烯体22，然后将该溶液加入到98毫升的反应液(59nM MaDA，20mM Tris-HCl，pH＝8.0)中，最后加入亲二烯体1(4.8毫克，溶解在0.5毫升的DMSO中)。该反应液在37℃下反应过夜后用乙酸乙酯萃取，合并有机相并旋干，最后通过HPLC纯化得到kuwanon J(19)(1.8mg,19％)。

[α]_D ²⁰+90.0°(c 0.03,MeOH)；

¹H NMR(Acetone-d₆,600MHz)δ:14.37(1H,s),12.88(1H,s),8.39(1H,d,J＝9.0Hz,H-14″),8.15(1H,d,J＝15.6Hz,H-β),7.85(1H,d,J＝9.0Hz,H-6′),7.72(1H,d,J＝15.6Hz,H-α),7.66(1H,d,J＝9.0Hz,H-6),6.98(1H,d,J＝8.0Hz,H-20″),6.53(1H,d,J＝2.4Hz,H-17″),6.48(1H,d,J＝2.4Hz,H-3),6.43(1H,d,J＝9.0Hz,H-5′),6.43(1H,dd,J＝2.4,9.0Hz,H-5),6.36(1H,d,J＝9.0Hz,H-13″),6.32(1H,dd,J＝2.4,8.4Hz,H-19″),5.68(1H,s,H-2″),5.16(1H,t,J＝7.2Hz,H-22″),4.67(1H,t,J＝4.0Hz,H-4″),4.14(1H br s,H-3″),3.78(1H br s,H-5″),3.26(2H,d,J＝7.2Hz,H-21″),2.53(1H,br d,J＝18.0Hz,H-6″),2.25(1H,br d,J＝18.0Hz,H-6″),1.92(3H,s,H-7″),1.71(3H,s,H-24″),1.58(3H,s,H-25″)；

¹³C NMR(Acetone-d₆,150MHz)δ:114.4(C-1),160.7(C-2),108.0(C-3),162.7(C-4),103.7(C-5),132.3(C-6),117.8(C-α),141.9(C-β),115.6(C-1′),163.9(C-2′),116.7(C-3′),165.8(C-4′),110.0(C-5′),131.0(C-6′),134.7(C-1″),123.9(C-2″),33.3(C-3″,C-6″),47.9(C-4″),36.7(C-5″),23.8(C-7″),209.8(C-8″),113.9(C-9″),164.5(C-10″),116.1(C-11″),163.9(C-12″),109.0(C-13″),132.3(C-14″),122.9(C-15″),157.0(C-16″),103.5(C-17″),157.8(C-18″),107.3(C-19″),129.0(C-20″),22.4(C-21″),123.6(C-22″),131.8(C-23″),17.9(C-24″),25.9(C-25″).

HRMS(ESI)理论值C₄₀H₃₉O₁₀[M+H]⁺679.2498,实际值679.2489。

6、利用MaDA酶作为催化剂制备deoxy-artonin I(20)

乙酰基保护的前体S13(11.0mg,0.0262mmol)加入到1毫升的甲醇水溶液中(甲醇/水＝4：1)，然后加入碳酸钾(11.1mg,0.105mmol)。该反应液在室温下反应大概35分钟后原位产生二烯体24，然后将该溶液加入到150毫升的反应液(118nM MaDA，20mM Tris-HCl，pH＝8.0)中，最后加入亲二烯体1(7.4毫克，溶解在0.37毫升的DMSO中)。该反应液在37℃下反应过夜后用乙酸乙酯萃取，合并有机相并旋干，最后通过HPLC纯化得到deoxy-artonin I(20)(6.9mg,47％)。

[α]_D ²⁰+176.8°(c 0.23,MeOH)；

¹H NMR(Acetone-d₆,600MHz)δ:13.46(1H,s),12.86(1H,s),9.42(1H,br s),9.22(1H,br s),8.89(1H,d,J＝4.9Hz),8.68(1H,br s),8.38-8.33(1H,m),8.10(1H,s),7.89(2H,d,J＝8.6Hz),7.02-6.98(2H,m),6.97(1H,d,J＝8.4Hz),6.55(1H,d,J＝2.5Hz),6.51(1H,s),6.46-6.44(2H,m),6.30(1H,dd,J＝2.4,8.4Hz),5.66(1H,s),5.15(1H,ddd,J＝1.3,4.2,7.1Hz),4.66(1H,t,J＝5.1Hz),4.15(1H,s),3.84(1H,s),3.25(2H,d,J＝7.2Hz),2.48(1H,br d,J＝17.9Hz),

2.25(1H,br d,J＝18.0Hz),1.92(3H,s),1.70(3H,s),1.58(3H,s)；

¹³C NMR(Acetone-d₆,150MHz)δ:209.3,183.1,164.9,164.5,163.4,163.3,161.9,161.1,157.9,156.9,156.5,134.8,132.0,131.4,129.2,128.8,123.3,123.1,123.0,121.9,116.8,115.8,113.5,112.4,108.1,107.6,104.8,103.8,103.7,95.8,47.8,36.3,32.9,32.6,25.8,23.8,22.1,17.8；HRMS(ESI)理论值C₄₀H₃₇O₁₀[M+H]⁺677.2387,实际值677.2383。

实施例5 MaDA的同源蛋白MaDA-1及其酶活测试结果

在桑树愈伤组织的转录组中，发明人除了对MaDA进行了表达和功能验证外，还对MaDA的同源蛋白MaDA-1进行了外源表达以及酶活测试。

1、MaDA-1基因的扩增

上游引物序列：5’-AACCTGTATTTTCAGGGATCCGATCAAATTGGTCATGAAGGC-3’(SEQ IDNo:13)

下游引物序列:5’-CTCGAGACTGCAGGCTCTAGATTACCTTTTGTAATGTGGTGAAAGAG-3’(SEQ ID No:14)

PCR扩增体系和方法同MaDA，扩增出来的MaDA-1不带信号肽的核苷酸序列如SEQID No:9。

2、pI-sec-sumostar-tev2-MaDA-1质粒的构建以及蛋白的表达

根据构建pI-sec-sumostar-tev2-MaDA质粒的方法，将MaDA-1基因序列***到pI-sec-sumostar-tev2载体上，并在昆虫细胞中进行表达，所得的蛋白氨基酸序列如SEQ IDNo:16所示。SEQ ID No:16所示序列中，前20个氨基酸(MVSAIVLYVLLAAAAHSAFA)为载体本身所含的信号肽，HHHHHH为6×His标签，DSEVNQEAKPEVKPEVKPETHINLKVSDGSSEIFFKIKKTTPLRRLMEAFAKRQGKEMDSLTFLYDGIEIQADQTPEDLDMEDNDIIEAHREQIGG为SUMO标签，ENLYFQG为TEV酶切位点。利用昆虫表达体系表达纯化出来的带有SUMO标签的成熟蛋白不含信号肽，共含648个氨基酸，其蛋白理论分子量(MWt)为73679.52，酶蛋白的理论等电点(pI)为5.96。利用TEV酶切去N端后，得到MaDA-1蛋白，其氨基酸序列如SEQ ID No:10所示。MaDA-1蛋白共含有524个氨基酸，其蛋白理论分子量(MWt)为59553.88，酶蛋白的理论等电点(pI)为7.19。通过对成熟MaDA蛋白和MaDA-1蛋白的氨基酸序列比对后发现，两者氨基酸序列高度相似，如图17所示，其中序列相同性(identity)为74％，这说明MaDA-1是MaDA的同源蛋白，可能也具有催化分子间D-A反应的活性。

3、MaDA-1酶活的测试对MaDA-1进行如下的活性测试：向97μL反应缓冲液(20mMTris·HCl,pH＝8.0)中加入1μL二烯体3(终浓度100μM)以及1μL亲二烯体1(终浓度100μM)，然后加入1μL带有SUMO标签的MaDA蛋白(终浓度27nM)或者MaDA-1蛋白(终浓度27nM)，50℃下反应10分钟后，加入200μL甲醇淬灭反应，13,000rpm离心30min后,利用HPLC分析。在对照组不加入任何蛋白，作为空白对照。当加入MaDA或者MaDA-1时，二烯体3和亲二烯体1基本消耗完全，均能产生对应的天然产物chalcomoracin(4)，如图18所示。

实施例6 MaDA的同源蛋白MaDA-2及其酶活测试结果

在桑树愈伤组织的转录组中，对MaDA的另一个同源蛋白MaDA-2进行了外源表达以及酶活测试。

1、MaDA-2基因的扩增

上游引物序列：5’-AACCTGTATTTTCAGGGATCCCATGAAGAGTTTCTTCAGTG

CC-3’(SEQ ID No:18)

下游引物序列:5’-CTCGAGACTGCAGGCTCTAGATTAATGGTGAAGAATAGGTGG-3’(SEQ IDNo:19)

PCR扩增体系和方法同MaDA，扩增出来的MaDA-2不带信号肽的核苷酸序列如SEQID No:11所示。

2、pI-sec-sumostar-tev2-MaDA-2质粒的构建以及蛋白的表达

根据构建pI-sec-sumostar-tev2-MaDA质粒的方法，将上述MaDA-2基因序列***到pI-sec-sumostar-tev2载体上，并在昆虫细胞中进行表达，所得的蛋白氨基酸序列如SEQID No:17所示。其中，前20个氨基酸(MVSAIVLYVLLAAAAHSAFA)为载体本身所含的信号肽，HHHHHH为6×His标签，DSEVNQEAKPEVKPEVKPETHINLKVSDGSSEIFFKIKKTTPLRRLMEAFAKRQGKEMDSLTFLYDGIEIQADQTPEDLDMEDNDIIEAHREQIGG为SUMO标签，ENLYFQG为TEV酶切位点。利用昆虫表达体系表达纯化出来的带有SUMO标签的成熟蛋白不含信号肽，共含638个氨基酸，其蛋白理论分子量(MWt)为72487.69，酶蛋白的理论等电点(pI)为6.13。利用TEV酶切去N端后，得到MaDA-2蛋白，其氨基酸序列SEQ ID No:12为：

MaDA-2蛋白共含有513个氨基酸，其蛋白理论分子量(MWt)为58274.97，酶蛋白的理论等电点(pI)为8.42。通过对成熟MaDA蛋白和MaDA-2蛋白的氨基酸序列比对后发现，两者氨基酸序列高度相似，如图19所示，其中序列相同性(identity)为72％，这说明MaDA-2是MaDA的同源蛋白，具有催化分子间D-A反应的活性。

3、MaDA-2的活性测试

测定了亲二烯体1与不同的二烯体3、22、23、24在MaDA-2存在下的反应活性，具体操作为：向98μL反应缓冲液(20Mm Tris·HCl,pH＝8.0)中加入1μL亲二烯体1(终浓度100μM)以及1μL不同的二烯体3、22、23、24(终浓度100μM)，然后加入1μL带有SUMO标签的MaDA-2蛋白(终浓度54nM)，50℃下反应5分钟后，加入200μL甲醇淬灭反应，用上述HPLC分析条件分析该反应液，得到如图20所示的活性测试结果。由图20可以看出，MaDA-2也可以催化亲二烯体1与不同的二烯体发生反应，形成对应的天然产物。除此之外，本发明还发现，MaDA-2还能识别亲二烯体5与不同的二烯体反应，生成对应天然产物，如图21所示。这些数据说明，MaDA-2与MaDA具有相同的功能，均能催化查尔酮类亲二烯体1与不同二烯体反应，生成D-A类型天然产物或者其类似物。但与MaDA不同的是，MaDA-2还能识别和利用亲二烯体5生成对应的天然产物或者其类似物。

虽然，上文中已经用一般性说明及具体实施方案对本发明作了详尽的描述，但在本发明基础上，可以对之作一些修改或改进，这对本领域技术人员而言是显而易见的。因此，在不偏离本发明精神的基础上所做的这些修改或改进，均属于本发明要求保护的范围。

序列表

<110> 北京大学

<120> 一种Diels-Alder反应酶及其应用

<130> KHP191114998.3

<160> 19

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 550

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 1

Met Gln Tyr Phe Ser Phe Pro Ser Ser Leu Ala Lys Ile Thr Ile Phe

1 5 10 15

Leu Ile Phe Ser Phe Val Phe Ala Ser Ser Ala Asn Asp Thr His Glu

20 25 30

Ala Phe Leu Glu Cys Leu Thr Thr Arg Ile Pro Ser Asn Ser Thr Phe

35 40 45

Thr Pro Gln Ser Ile Ile Tyr Thr Pro Asp Asn Pro Ser Tyr Ser Thr

50 55 60

Ile Leu Asp Ser Thr Thr Gln Asn Pro Arg Phe Leu Ser Ser Ser Thr

65 70 75 80

Arg Asn Pro Phe Ala Ile Ile Thr Pro Leu His Ala Ser His Ile Gln

85 90 95

Ala Ala Leu Tyr Cys Ser Gln Lys His Gly Glu Gln Met Arg Ile Arg

100 105 110

Ser Gly Gly His Asp Tyr Glu Gly Leu Ser Tyr Gln Ser Ser Val Pro

115 120 125

Phe Phe Ile Leu Asp Leu Arg Asn Leu Ser Ser Ile Ser Ile Asp Ala

130 135 140

Lys Ser Lys Ser Ala Trp Val Gln Ala Gly Ala Thr Ile Gly Glu Leu

145 150 155 160

Tyr Tyr Gly Ile Ala Lys Thr Ser Leu Asn Leu Ser Phe Pro Gly Gly

165 170 175

Val Ala His Thr Ile Gly Val Gly Gly Gln Leu Gly Gly Gly Gly Tyr

180 185 190

Gly Tyr Ser Thr Arg Lys Tyr Gly Leu Ala Ser Asp Asn Val Ile Asp

195 200 205

Ala Gln Leu Ile Asp Ala Arg Gly Arg Ile Leu Asp Arg Lys Thr Met

210 215 220

Gly Glu Asp Leu Phe Trp Ala Ile Arg Gly Gly Gly Ala Gly Ser Phe

225 230 235 240

Gly Ile Val Leu Ala Trp Lys Ile Arg Leu Val Asn Thr Pro Ser Thr

245 250 255

Val Thr Ile Phe Glu Ala Val Arg Ser Trp Glu Asn Asn Thr Thr Lys

260 265 270

Lys Phe Ile Arg Arg Tyr Gln Arg Arg Ala Ser Lys Thr Asp Lys Asp

275 280 285

Leu Thr Ile Phe Val Gly Phe Arg Thr Thr Ser Ser Thr Asp Glu Glu

290 295 300

Gly Asn Glu Arg Ile Ser Ile Leu Thr Ile Val Ser Ala Thr Phe His

305 310 315 320

Gly Ser Lys Asp Arg Leu Leu Gln Leu Val Gln Lys Glu Phe Pro Asp

325 330 335

Leu Gly Leu Val Ser Glu Glu Cys Thr Glu Met Ser Trp Val Arg Ser

340 345 350

Ile Ile His Phe Asn Leu Phe Gly Asp Glu Val Pro Leu Glu Val Leu

355 360 365

Leu Asn Arg Thr Leu Asn Phe Glu Met Lys Ala Phe Lys Leu Arg Ser

370 375 380

Asp Tyr Val Gln Lys Pro Ile Pro Asp Asp Val Leu Glu Lys Leu Leu

385 390 395 400

Ser Lys Leu Tyr Asp Glu Glu Thr Gly Glu Gly Tyr Ile Glu Phe Phe

405 410 415

Pro Tyr Gly Gly Lys Met Ser Lys Ile Ser Glu Ser Glu Ile Pro Phe

420 425 430

Pro Tyr Arg Ala Gly Asn Leu Tyr Asn Leu Arg Tyr Met Val Ser Trp

435 440 445

Lys Asp Asp Gly Asn Ile Thr Arg Thr Asn Met His Leu Ser Trp Ile

450 455 460

Lys Asp Ala Tyr Asp Tyr Met Thr Pro Tyr Val Ser Lys Asp Pro Arg

465 470 475 480

Gly Ala Tyr Leu Asn Phe Arg Asp Leu Asp Ile Gly Val Asn Val Asn

485 490 495

Glu Ser Asp Tyr Asp Tyr Val Ala Lys Ala Ser Val Trp Gly Thr Lys

500 505 510

Tyr Phe Arg Asn Asn Phe Tyr Arg Leu Val Asp Ile Lys Thr Ile Val

515 520 525

Asp Pro Thr Asn Phe Phe Lys Tyr Glu Gln Ser Ile Pro Pro Leu Pro

530 535 540

Pro Leu His Ser Ala Met

545 550

<210> 2

<211> 1653

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 2

atgcagtact tttccttccc ttcatcgtta gccaaaatca ccatctttct gatcttttca 60

tttgtattcg caagttcagc taacgacact catgaagcct ttcttgagtg cctgaccact 120

cgtataccct ccaactccac cttcaccccg caatccatca tctacactcc agataatccg 180

tcgtattcaa ctatattgga ttcaacgact caaaatcctc gttttctttc ttcttcgaca 240

agaaatccat ttgccatcat cacaccactt cacgcctccc acatacaagc cgctctttat 300

tgttcccaga aacatggcga gcagatgaga atccgaagcg gcggccatga ttatgaaggc 360

ctttcttacc agtccagtgt gccgtttttc atacttgact tgagaaactt gagttctatt 420

agtattgacg cgaagagcaa gtctgcgtgg gttcaggccg gagcgacgat tggtgaactt 480

tattatggga tagctaaaac gagcctgaat cttagctttc ccggcggcgt tgctcacact 540

atcggcgttg ggggacagtt aggtggagga ggctatggct attcgacgag aaaatatggg 600

ctcgcgtccg ataacgtcat cgacgcacag ttaatcgatg ctcgaggaag aattctcgat 660

cgaaaaacca tgggggaaga tttgttttgg gccatccgcg gtggtggagc gggaagcttc 720

ggaatcgttc ttgcctggaa aattcgcctt gttaacacac catcgacagt gactatattt 780

gaagccgtga ggagttggga aaacaataca acaaaaaagt tcatccgtcg atatcaacgt 840

cgcgcttcca aaaccgataa ggatctaacc atcttcgtcg gattccgaac tacgagttct 900

acagatgaag aagggaatga gagaatttca atactaacta tcgtctcggc cacattccac 960

ggcagcaagg ataggctcct tcagttagtg caaaaggagt ttcccgactt gggtttggtt 1020

agtgaagagt gcaccgaaat gtcatgggtt cgatccatta tccatttcaa tttattcggg 1080

gacgaagtac ccttggaggt tctactcaat agaacgctca atttcgaaat gaaggctttt 1140

aaattgagat ctgactatgt acaaaagcct attccagatg acgtgttaga aaaattattg 1200

agtaagttgt atgatgaaga gacaggagaa ggttacatcg aattttttcc ttatggagga 1260

aaaatgagta agatttcaga atctgaaatc ccgttcccat accgagccgg aaacctctac 1320

aaccttcggt acatggtgtc atggaaggat gatggaaaca ttacaagaac caacatgcat 1380

cttagctgga taaaagatgc ttacgattac atgacacctt acgtgtcaaa agatccgagg 1440

ggcgcatatc tgaacttcag agatctcgac atcggagtta atgtcaatga gagcgactac 1500

gattacgtcg cgaaagcaag cgtttggggt actaagtatt ttaggaataa tttttataga 1560

ttagttgata taaagacaat agttgatcca actaatttct ttaaatacga gcaaagtatc 1620

ccacctcttc ctcctctaca ttcagcaatg tga 1653

<210> 3

<211> 5254

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 3

gacgcgccct gtagcggcgc attaagcgcg gcgggtgtgg tggttacgcg cagcgtgacc 60

gctacacttg ccagcgccct agcgcccgct cctttcgctt tcttcccttc ctttctcgcc 120

acgttcgccg gctttccccg tcaagctcta aatcgggggc tccctttagg gttccgattt 180

agtgctttac ggcacctcga ccccaaaaaa cttgattagg gtgatggttc acgtagtggg 240

ccatcgccct gatagacggt ttttcgccct ttgacgttgg agtccacgtt ctttaatagt 300

ggactcttgt tccaaactgg aacaacactc aaccctatct cggtctattc ttttgattta 360

taagggattt tgccgatttc ggcctattgg ttaaaaaatg agctgattta acaaaaattt 420

aacgcgaatt ttaacaaaat attaacgttt acaatttcag gtggcacttt tcggggaaat 480

gtgcgcggaa cccctatttg tttatttttc taaatacatt caaatatgta tccgctcatg 540

agacaataac cctgataaat gcttcaataa tattgaaaaa ggaagagtat gagtattcaa 600

catttccgtg tcgcccttat tccctttttt gcggcatttt gccttcctgt ttttgctcac 660

ccagaaacgc tggtgaaagt aaaagatgct gaagatcagt tgggtgcacg agtgggttac 720

atcgaactgg atctcaacag cggtaagatc cttgagagtt ttcgccccga agaacgtttt 780

ccaatgatga gcacttttaa agttctgcta tgtggcgcgg tattatcccg tattgacgcc 840

gggcaagagc aactcggtcg ccgcatacac tattctcaga atgacttggt tgagtactca 900

ccagtcacag aaaagcatct tacggatggc atgacagtaa gagaattatg cagtgctgcc 960

ataaccatga gtgataacac tgcggccaac ttacttctga caacgatcgg aggaccgaag 1020

gagctaaccg cttttttgca caacatgggg gatcatgtaa ctcgccttga tcgttgggaa 1080

ccggagctga atgaagccat accaaacgac gagcgtgaca ccacgatgcc tgtagcaatg 1140

gcaacaacgt tgcgcaaact attaactggc gaactactta ctctagcttc ccggcaacaa 1200

ttaatagact ggatggaggc ggataaagtt gcaggaccac ttctgcgctc ggcccttccg 1260

gctggctggt ttattgctga taaatctgga gccggtgagc gtgggtctcg cggtatcatt 1320

gcagcactgg ggccagatgg taagccctcc cgtatcgtag ttatctacac gacggggagt 1380

caggcaacta tggatgaacg aaatagacag atcgctgaga taggtgcctc actgattaag 1440

cattggtaac tgtcagacca agtttactca tatatacttt agattgattt aaaacttcat 1500

ttttaattta aaaggatcta ggtgaagatc ctttttgata atctcatgac caaaatccct 1560

taacgtgagt tttcgttcca ctgagcgtca gaccccgtag aaaagatcaa aggatcttct 1620

tgagatcctt tttttctgcg cgtaatctgc tgcttgcaaa caaaaaaacc accgctacca 1680

gcggtggttt gtttgccgga tcaagagcta ccaactcttt ttccgaaggt aactggcttc 1740

agcagagcgc agataccaaa tactgtcctt ctagtgtagc cgtagttagg ccaccacttc 1800

aagaactctg tagcaccgcc tacatacctc gctctgctaa tcctgttacc agtggctgct 1860

gccagtggcg ataagtcgtg tcttaccggg ttggactcaa gacgatagtt accggataag 1920

gcgcagcggt cgggctgaac ggggggttcg tgcacacagc ccagcttgga gcgaacgacc 1980

tacaccgaac tgagatacct acagcgtgag cattgagaaa gcgccacgct tcccgaaggg 2040

agaaaggcgg acaggtatcc ggtaagcggc agggtcggaa caggagagcg cacgagggag 2100

cttccagggg gaaacgcctg gtatctttat agtcctgtcg ggtttcgcca cctctgactt 2160

gagcgtcgat ttttgtgatg ctcgtcaggg gggcggagcc tatggaaaaa cgccagcaac 2220

gcggcctttt tacggttcct ggccttttgc tggccttttg ctcacatgtt ctttcctgcg 2280

ttatcccctg attctgtgga taaccgtatt accgcctttg agtgagctga taccgctcgc 2340

cgcagccgaa cgaccgagcg cagcgagtca gtgagcgagg aagcggaaga gcgcctgatg 2400

cggtattttc tccttacgca tctgtgcggt atttcacacc gcagaccagc cgcgtaacct 2460

ggcaaaatcg gttacggttg agtaataaat ggatgccctg cgtaagcggg tgtgggcgga 2520

caataaagtc ttaaactgaa caaaatagat ctaaactatg acaataaagt cttaaactag 2580

acagaatagt tgtaaactga aatcagtcca gttatgctgt gaaaaagcat actggacttt 2640

tgttatggct aaagcaaact cttcattttc tgaagtgcaa attgcccgtc gtattaaaga 2700

ggggcgtggc caagggcatg gtaaagacta tattcgcggc gttgtgacaa tttaccgaac 2760

aactccgcgg ccgggaagcc gatctcggct tgaacgaatt gttaggtggc ggtacttggg 2820

tcgatatcaa agtgcatcac ttcttcccgt atgcccaact ttgtatagag agccactgcg 2880

ggatcgtcac cgtaatctgc ttgcacgtag atcacataag caccaagcgc gttggcctca 2940

tgcttgagga gattgatgag cgcggtggca atgccctgcc tccggtgctc gccggagact 3000

gcgagatcat agatatagat ctcactacgc ggctgctcaa acctgggcag aacgtaagcc 3060

gcgagagcgc caacaaccgc ttcttggtcg aaggcagcaa gcgcgatgaa tgtcttacta 3120

cggagcaagt tcccgaggta atcggagtcc ggctgatgtt gggagtaggt ggctacatca 3180

ccgaactcac gaccgaaaag atcaagagca gcccgcatgg atttgacttg gtcagggccg 3240

agcctacatg tgcgaatgat gcccatactt gagccaccta actttgtttt agggcgactg 3300

ccctgctgcg taacatcgtt gctgctgcgt aacatcgttg ctgctccata acatcaaaca 3360

tcgacccacg gcgtaacgcg cttgctgctt ggatgcccga ggcatagact gtacaaaaaa 3420

acagtcataa caagccatga aaaccgccac tgcgccgtta ccaccgctgc gttcggtcaa 3480

ggttctggac cagttgcgtg agcgcatacg ctacttgcat tacagtttac gaaccgaaca 3540

ggcttatgtc aactgggttc gtgccttcat ccgtttccac ggtgtgcgtc acccggcaac 3600

cttgggcagc agcgaagtcg aggcatttct gtcctggctg gcgaacgagc gcaaggtttc 3660

ggtctccacg catcgtcagg cattggcggc cttgctgttc ttctacggca aggtgctgtg 3720

cacggatctg ccctggcttc aggagatcgg aagacctcgg ccgtcgcggc gcttgccggt 3780

ggtgctgacc ccggatgaag tggttcgcat cctcggtttt ctggaaggcg agcatcgttt 3840

gttcgcccag gactctagct atagttctag tggttggcta cgtatactcc ggaatattaa 3900

tagatcatgg agataattaa aatgataacc atctcgcaaa taaataagta ttttactgtt 3960

ttcgtaacag ttttgtaata aaaaaaccta taaatattcc ggattattca taccgtccca 4020

ccatcgggcg cggatctagg tatgctacta gtaaatcagt cacaccaagg cttcaataag 4080

gaacacacaa gcaagatggt aagcgctatt gttttatatg tgcttttggc ggcggcggcg 4140

cattctgcct ttgcggcagg tatgggtcat caccatcatc atcacgggtc cctgcaggac 4200

tcagaagtca atcaagaagc taagccagag gtcaagccag aagtcaagcc tgagactcac 4260

atcaatttaa aggtgtccga tggatcttca gagatcttct tcaagatcaa aaagaccact 4320

cctttaagaa ggctgatgga agcgttcgct aaaagacagg gtaaggaaat ggactcctta 4380

acgttcttgt acgacggtat tgaaattcaa gctgatcaga cccctgaaga tttggacatg 4440

gaggataacg atattattga ggctcacaga gaacagattg gaggtgatta cgatatccca 4500

acgaccgaaa acctgtattt tcagggatcc ggaattcaaa ggcctacgtc gacgagctca 4560

ctagtcgcgg ccgctttcga atctagagcc tgcagtctcg aggcatgcgg taccaagctt 4620

gtcgagaagt actagaggat cataatcagc cataccacat ttgtagaggt tttacttgct 4680

ttaaaaaacc tcccacacct ccccctgaac ctgaaacata aaatgaatgc aattgttgtt 4740

gttaacttgt ttattgcagc ttataatggt tacaaataaa gcaatagcat cacaaatttc 4800

acaaataaag catttttttc actgcattct agttgtggtt tgtccaaact catcaatgta 4860

tcttatcatg tctggatctg atcactgctt gagcctagga gatccgaacc agataagtga 4920

aatctagttc caaactattt tgtcattttt aattttcgta ttagcttacg acgctacacc 4980

cagttcccat ctattttgtc actcttccct aaataatcct taaaaactcc atttccaccc 5040

ctcccagttc ccaactattt tgtccgccca cagcggggca tttttcttcc tgttatgttt 5100

ttaatcaaac atcctgccaa ctccatgtga caaaccgtca tcttcggcta ctttttctct 5160

gtcacagaat gaaaattttt ctgtcatctc ttcgttatta atgtttgtaa ttgactgaat 5220

atcaacgctt atttgcagcc tgaatggcga atgg 5254

<210> 4

<211> 668

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 4

Met Val Ser Ala Ile Val Leu Tyr Val Leu Leu Ala Ala Ala Ala His

1 5 10 15

Ser Ala Phe Ala Ala Gly Met Gly His His His His His His Gly Ser

20 25 30

Leu Gln Asp Ser Glu Val Asn Gln Glu Ala Lys Pro Glu Val Lys Pro

35 40 45

Glu Val Lys Pro Glu Thr His Ile Asn Leu Lys Val Ser Asp Gly Ser

50 55 60

Ser Glu Ile Phe Phe Lys Ile Lys Lys Thr Thr Pro Leu Arg Arg Leu

65 70 75 80

Met Glu Ala Phe Ala Lys Arg Gln Gly Lys Glu Met Asp Ser Leu Thr

85 90 95

Phe Leu Tyr Asp Gly Ile Glu Ile Gln Ala Asp Gln Thr Pro Glu Asp

100 105 110

Leu Asp Met Glu Asp Asn Asp Ile Ile Glu Ala His Arg Glu Gln Ile

115 120 125

Gly Gly Asp Tyr Asp Ile Pro Thr Thr Glu Asn Leu Tyr Phe Gln Gly

130 135 140

Ser Asn Asp Thr His Glu Ala Phe Leu Glu Cys Leu Thr Thr Arg Ile

145 150 155 160

Pro Ser Asn Ser Thr Phe Thr Pro Gln Ser Ile Ile Tyr Thr Pro Asp

165 170 175

Asn Pro Ser Tyr Ser Thr Ile Leu Asp Ser Thr Thr Gln Asn Pro Arg

180 185 190

Phe Leu Ser Ser Ser Thr Arg Asn Pro Phe Ala Ile Ile Thr Pro Leu

195 200 205

His Ala Ser His Ile Gln Ala Ala Leu Tyr Cys Ser Gln Lys His Gly

210 215 220

Glu Gln Met Arg Ile Arg Ser Gly Gly His Asp Tyr Glu Gly Leu Ser

225 230 235 240

Tyr Gln Ser Ser Val Pro Phe Phe Ile Leu Asp Leu Arg Asn Leu Ser

245 250 255

Ser Ile Ser Ile Asp Ala Lys Ser Lys Ser Ala Trp Val Gln Ala Gly

260 265 270

Ala Thr Ile Gly Glu Leu Tyr Tyr Gly Ile Ala Lys Thr Ser Leu Asn

275 280 285

Leu Ser Phe Pro Gly Gly Val Ala His Thr Ile Gly Val Gly Gly Gln

290 295 300

Leu Gly Gly Gly Gly Tyr Gly Tyr Ser Thr Arg Lys Tyr Gly Leu Ala

305 310 315 320

Ser Asp Asn Val Ile Asp Ala Gln Leu Ile Asp Ala Arg Gly Arg Ile

325 330 335

Leu Asp Arg Lys Thr Met Gly Glu Asp Leu Phe Trp Ala Ile Arg Gly

340 345 350

Gly Gly Ala Gly Ser Phe Gly Ile Val Leu Ala Trp Lys Ile Arg Leu

355 360 365

Val Asn Thr Pro Ser Thr Val Thr Ile Phe Glu Ala Val Arg Ser Trp

370 375 380

Glu Asn Asn Thr Thr Lys Lys Phe Ile Arg Arg Tyr Gln Arg Arg Ala

385 390 395 400

Ser Lys Thr Asp Lys Asp Leu Thr Ile Phe Val Gly Phe Arg Thr Thr

405 410 415

Ser Ser Thr Asp Glu Glu Gly Asn Glu Arg Ile Ser Ile Leu Thr Ile

420 425 430

Val Ser Ala Thr Phe His Gly Ser Lys Asp Arg Leu Leu Gln Leu Val

435 440 445

Gln Lys Glu Phe Pro Asp Leu Gly Leu Val Ser Glu Glu Cys Thr Glu

450 455 460

Met Ser Trp Val Arg Ser Ile Ile His Phe Asn Leu Phe Gly Asp Glu

465 470 475 480

Val Pro Leu Glu Val Leu Leu Asn Arg Thr Leu Asn Phe Glu Met Lys

485 490 495

Ala Phe Lys Leu Arg Ser Asp Tyr Val Gln Lys Pro Ile Pro Asp Asp

500 505 510

Val Leu Glu Lys Leu Leu Ser Lys Leu Tyr Asp Glu Glu Thr Gly Glu

515 520 525

Gly Tyr Ile Glu Phe Phe Pro Tyr Gly Gly Lys Met Ser Lys Ile Ser

530 535 540

Glu Ser Glu Ile Pro Phe Pro Tyr Arg Ala Gly Asn Leu Tyr Asn Leu

545 550 555 560

Arg Tyr Met Val Ser Trp Lys Asp Asp Gly Asn Ile Thr Arg Thr Asn

565 570 575

Met His Leu Ser Trp Ile Lys Asp Ala Tyr Asp Tyr Met Thr Pro Tyr

580 585 590

Val Ser Lys Asp Pro Arg Gly Ala Tyr Leu Asn Phe Arg Asp Leu Asp

595 600 605

Ile Gly Val Asn Val Asn Glu Ser Asp Tyr Asp Tyr Val Ala Lys Ala

610 615 620

Ser Val Trp Gly Thr Lys Tyr Phe Arg Asn Asn Phe Tyr Arg Leu Val

625 630 635 640

Asp Ile Lys Thr Ile Val Asp Pro Thr Asn Phe Phe Lys Tyr Glu Gln

645 650 655

Ser Ile Pro Pro Leu Pro Pro Leu His Ser Ala Met

660 665

<210> 5

<211> 46

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 5

aacctgtatt ttcagggatc caacgacact catgaagcct ttcttg 46

<210> 6

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<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 6

ctcgagactg caggctctag atcacattgc tgaatgtaga ggaggaagag 50

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<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

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<212> DNA

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<210> 9

<211> 1575

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 9

gatcaaattg gtcatgaagg ctttcttaag tgcctgatca ctcgtatatc caaatccaac 60

tctacctcca cttctgaatc cattatctac actcaaaata atccctctta ttcaactata 120

ttgacttcaa cgatgcagaa tcctcgtttt ctttctcttc caatcccaaa accattcgtt 180

atcgtaacac cattacatgt ctcccacgtc caagccactc tttactgcgc caagaaacat 240

gacatacaaa tcagaatccg aagtggtggc catgattacg agggcctttc ttatatgtct 300

aatgtcactt ttgtcatact tgacttgaga aacttaagtt ctattaacat tgacgtgaag 360

aggaagtctg catgggttca gtccggagca accattggcg aactttatta taggattgct 420

gagaaaagcc taagtcttgc cttccctgga gggcttggcc acactattgg tgttggagga 480

cagttaggtg gaggaggcta tggctattcg acgcgaaagt acgggctcgc atctgataat 540

attattgacg cccaatttat ggacgtgcaa ggaagaattc tcaatcggaa atctatgggg 600

gaagatttgt tttgggccat acgcggtggt ggagctggaa gcttcggaat tgttctcgcc 660

tggaaaatcc gactggtgga cgtgcctacg acagtgaccg tatttgaagc cgtaaggaag 720

tgggaaaaca atgcaacaaa gaagtttgtt catcggtatc aacgccgtat tgccgacatc 780

gataaggatc taactatctt tcttggattc caaactgcga atactggcga tgaacaaggg 840

aacacgaaaa ttgaagtatt agctgtcatc tcagcaacat ttcacggcag tcaagataag 900

gtccttccat tgatgcagaa ggagtttccc gagttgggtt tgcttaaaga agaatgcata 960

gaaatgccgt gggtccgatc cattatgcat tacaactttt tccgaaacgg agagccctta 1020

gaagttctac tcaatagaac acttaatttc gagatgaagg ctttcaaatt gaaatctgac 1080

tacgtgaaag agcctattcc agatgacgtg ttggaaaaat tgttgggcaa gttgtatgag 1140

gaagaaatag gagaaggtta cattgaactt tttccttatg gagggaagat gaatgagatt 1200

tcagaatctg aaattccgtt cccacatcga gctgggaacc tctacaacct tcggtacttg 1260

gtgtcatgga tagacgatgg aaatattacg agaaccaacg agcatattcg ctgggtaaga 1320

agtgcttacg attacatgac tccttttgtt tcaaagaatc ctaggggtgc gtatctcaac 1380

ttcagagacc ttgacatcgg gattaattcc gatgaggatg attacaacta tgttgcacaa 1440

gcaagcattt ggggcactaa gtattttaaa agcaatttct ataggttggt ttatgtaaag 1500

actttagttg atccgactaa tttctttaca tacgaacaaa gcatcccacc tctttcacca 1560

cattacaaaa ggtaa 1575

<210> 10

<211> 524

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 10

Asp Gln Ile Gly His Glu Gly Phe Leu Lys Cys Leu Ile Thr Arg Ile

1 5 10 15

Ser Lys Ser Asn Ser Thr Ser Thr Ser Glu Ser Ile Ile Tyr Thr Gln

20 25 30

Asn Asn Pro Ser Tyr Ser Thr Ile Leu Thr Ser Thr Met Gln Asn Pro

35 40 45

Arg Phe Leu Ser Leu Pro Ile Pro Lys Pro Phe Val Ile Val Thr Pro

50 55 60

Leu His Val Ser His Val Gln Ala Thr Leu Tyr Cys Ala Lys Lys His

65 70 75 80

Asp Ile Gln Ile Arg Ile Arg Ser Gly Gly His Asp Tyr Glu Gly Leu

85 90 95

Ser Tyr Met Ser Asn Val Thr Phe Val Ile Leu Asp Leu Arg Asn Leu

100 105 110

Ser Ser Ile Asn Ile Asp Val Lys Arg Lys Ser Ala Trp Val Gln Ser

115 120 125

Gly Ala Thr Ile Gly Glu Leu Tyr Tyr Arg Ile Ala Glu Lys Ser Leu

130 135 140

Ser Leu Ala Phe Pro Gly Gly Leu Gly His Thr Ile Gly Val Gly Gly

145 150 155 160

Gln Leu Gly Gly Gly Gly Tyr Gly Tyr Ser Thr Arg Lys Tyr Gly Leu

165 170 175

Ala Ser Asp Asn Ile Ile Asp Ala Gln Phe Met Asp Val Gln Gly Arg

180 185 190

Ile Leu Asn Arg Lys Ser Met Gly Glu Asp Leu Phe Trp Ala Ile Arg

195 200 205

Gly Gly Gly Ala Gly Ser Phe Gly Ile Val Leu Ala Trp Lys Ile Arg

210 215 220

Leu Val Asp Val Pro Thr Thr Val Thr Val Phe Glu Ala Val Arg Lys

225 230 235 240

Trp Glu Asn Asn Ala Thr Lys Lys Phe Val His Arg Tyr Gln Arg Arg

245 250 255

Ile Ala Asp Ile Asp Lys Asp Leu Thr Ile Phe Leu Gly Phe Gln Thr

260 265 270

Ala Asn Thr Gly Asp Glu Gln Gly Asn Thr Lys Ile Glu Val Leu Ala

275 280 285

Val Ile Ser Ala Thr Phe His Gly Ser Gln Asp Lys Val Leu Pro Leu

290 295 300

Met Gln Lys Glu Phe Pro Glu Leu Gly Leu Leu Lys Glu Glu Cys Ile

305 310 315 320

Glu Met Pro Trp Val Arg Ser Ile Met His Tyr Asn Phe Phe Arg Asn

325 330 335

Gly Glu Pro Leu Glu Val Leu Leu Asn Arg Thr Leu Asn Phe Glu Met

340 345 350

Lys Ala Phe Lys Leu Lys Ser Asp Tyr Val Lys Glu Pro Ile Pro Asp

355 360 365

Asp Val Leu Glu Lys Leu Leu Gly Lys Leu Tyr Glu Glu Glu Ile Gly

370 375 380

Glu Gly Tyr Ile Glu Leu Phe Pro Tyr Gly Gly Lys Met Asn Glu Ile

385 390 395 400

Ser Glu Ser Glu Ile Pro Phe Pro His Arg Ala Gly Asn Leu Tyr Asn

405 410 415

Leu Arg Tyr Leu Val Ser Trp Ile Asp Asp Gly Asn Ile Thr Arg Thr

420 425 430

Asn Glu His Ile Arg Trp Val Arg Ser Ala Tyr Asp Tyr Met Thr Pro

435 440 445

Phe Val Ser Lys Asn Pro Arg Gly Ala Tyr Leu Asn Phe Arg Asp Leu

450 455 460

Asp Ile Gly Ile Asn Ser Asp Glu Asp Asp Tyr Asn Tyr Val Ala Gln

465 470 475 480

Ala Ser Ile Trp Gly Thr Lys Tyr Phe Lys Ser Asn Phe Tyr Arg Leu

485 490 495

Val Tyr Val Lys Thr Leu Val Asp Pro Thr Asn Phe Phe Thr Tyr Glu

500 505 510

Gln Ser Ile Pro Pro Leu Ser Pro His Tyr Lys Arg

515 520

<210> 11

<211> 1542

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 11

catgaagagt ttcttcagtg cctgagctct cgtataccca agtccattat ctatgcttca 60

aataacccct cgtattcaaa tgtattagat tcgacgactc aaaatcctcg tttcctttct 120

tcttcgacca gaaatccatc tgttatcgtc acaccgttta aaatctccca catacaaccc 180

accatttact gctccaagaa acatggcgtg cagataagaa ttcgaagcgg tgggcatgat 240

tatgaaggcc tttcttatca gtccagtgtc ccatttttca tactcgactt gagaaacata 300

aattccattc aagttgatgt ggagaagaag agtgcatggg ttgaggcagg tgcgacgctc 360

ggcgaacttt actacagtat cgctaaaaaa agcaaaacgc ttggcttccc tggcggtctt 420

tgcagcaccg ttggtgtcgg tggacagtta ggtggaggag gctatggcta tcaatcgcga 480

acatatgggc tcgcatctga taatattatt gatgcgcaat taatcgacgc tcgaggaaga 540

attctcaatc ggaaatccat gggggaggat ttgttctggg ccattcgcgg tggtggagca 600

ggaagcttcg gaattgtaat tgcctggaag gttcgactca ttgacgtgcc ttcgacagtg 660

actgtctttg aaactgtacg catgtgggaa gataatgtaa cgaagaagtt tgttcatcga 720

tatcaacgtc gtgcttccaa catcgataag gatctaacta tcttcttggg attccgaacc 780

acaaatacta gtgatgaaca agggaattca aagattcaaa taataaccat catctcagcc 840

acattccatg gcagcaggga taggctcctt ccattgatgc aagaggagtt tcccgagttg 900

ggtttgggca aagaagattt caaagaaatg tcatgggtcc aatctattgt ccattacaat 960

aattacaaag acgatgatcc cttggaagtt ctactcaaca aaacagtcaa tttcgaaccc 1020

aaccctttca aattgaaatc tgactatgtg aaaaagccta ttccagatga cgtgttggaa 1080

aaattgctgg ctcggttgta cgaagaagac ataggatatg attttgtgga attttttcca 1140

tatggaggaa aattgagcga gatttcagaa tctgaaatcc cattcccaca tcgagctgga 1200

aacctctaca accttcggta catggcttca tggaaacaag gcgaaaatac tacaagaatc 1260

aacaaccatc ttagctgggt aagaagtgtt tatgattcca tgactcctta tgtgtcaaag 1320

aatccaaggg gtgcatatct caactttaga gaccttgaca tcggggttaa tcctaatgag 1380

agtgacccca caagtgctta taactatgtt aaacaagcaa gcgtttgggg tactaagtat 1440

tttaagaaca atttctacaa aatggtgttt ataaagactt tagttgatcc aactaatttc 1500

tttacatacg aacaaagcat cccacctatt cttcaccatt aa 1542

<210> 12

<211> 513

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 12

His Glu Glu Phe Leu Gln Cys Leu Ser Ser Arg Ile Pro Lys Ser Ile

1 5 10 15

Ile Tyr Ala Ser Asn Asn Pro Ser Tyr Ser Asn Val Leu Asp Ser Thr

20 25 30

Thr Gln Asn Pro Arg Phe Leu Ser Ser Ser Thr Arg Asn Pro Ser Val

35 40 45

Ile Val Thr Pro Phe Lys Ile Ser His Ile Gln Pro Thr Ile Tyr Cys

50 55 60

Ser Lys Lys His Gly Val Gln Ile Arg Ile Arg Ser Gly Gly His Asp

65 70 75 80

Tyr Glu Gly Leu Ser Tyr Gln Ser Ser Val Pro Phe Phe Ile Leu Asp

85 90 95

Leu Arg Asn Ile Asn Ser Ile Gln Val Asp Val Glu Lys Lys Ser Ala

100 105 110

Trp Val Glu Ala Gly Ala Thr Leu Gly Glu Leu Tyr Tyr Ser Ile Ala

115 120 125

Lys Lys Ser Lys Thr Leu Gly Phe Pro Gly Gly Leu Cys Ser Thr Val

130 135 140

Gly Val Gly Gly Gln Leu Gly Gly Gly Gly Tyr Gly Tyr Gln Ser Arg

145 150 155 160

Thr Tyr Gly Leu Ala Ser Asp Asn Ile Ile Asp Ala Gln Leu Ile Asp

165 170 175

Ala Arg Gly Arg Ile Leu Asn Arg Lys Ser Met Gly Glu Asp Leu Phe

180 185 190

Trp Ala Ile Arg Gly Gly Gly Ala Gly Ser Phe Gly Ile Val Ile Ala

195 200 205

Trp Lys Val Arg Leu Ile Asp Val Pro Ser Thr Val Thr Val Phe Glu

210 215 220

Thr Val Arg Met Trp Glu Asp Asn Val Thr Lys Lys Phe Val His Arg

225 230 235 240

Tyr Gln Arg Arg Ala Ser Asn Ile Asp Lys Asp Leu Thr Ile Phe Leu

245 250 255

Gly Phe Arg Thr Thr Asn Thr Ser Asp Glu Gln Gly Asn Ser Lys Ile

260 265 270

Gln Ile Ile Thr Ile Ile Ser Ala Thr Phe His Gly Ser Arg Asp Arg

275 280 285

Leu Leu Pro Leu Met Gln Glu Glu Phe Pro Glu Leu Gly Leu Gly Lys

290 295 300

Glu Asp Phe Lys Glu Met Ser Trp Val Gln Ser Ile Val His Tyr Asn

305 310 315 320

Asn Tyr Lys Asp Asp Asp Pro Leu Glu Val Leu Leu Asn Lys Thr Val

325 330 335

Asn Phe Glu Pro Asn Pro Phe Lys Leu Lys Ser Asp Tyr Val Lys Lys

340 345 350

Pro Ile Pro Asp Asp Val Leu Glu Lys Leu Leu Ala Arg Leu Tyr Glu

355 360 365

Glu Asp Ile Gly Tyr Asp Phe Val Glu Phe Phe Pro Tyr Gly Gly Lys

370 375 380

Leu Ser Glu Ile Ser Glu Ser Glu Ile Pro Phe Pro His Arg Ala Gly

385 390 395 400

Asn Leu Tyr Asn Leu Arg Tyr Met Ala Ser Trp Lys Gln Gly Glu Asn

405 410 415

Thr Thr Arg Ile Asn Asn His Leu Ser Trp Val Arg Ser Val Tyr Asp

420 425 430

Ser Met Thr Pro Tyr Val Ser Lys Asn Pro Arg Gly Ala Tyr Leu Asn

435 440 445

Phe Arg Asp Leu Asp Ile Gly Val Asn Pro Asn Glu Ser Asp Pro Thr

450 455 460

Ser Ala Tyr Asn Tyr Val Lys Gln Ala Ser Val Trp Gly Thr Lys Tyr

465 470 475 480

Phe Lys Asn Asn Phe Tyr Lys Met Val Phe Ile Lys Thr Leu Val Asp

485 490 495

Pro Thr Asn Phe Phe Thr Tyr Glu Gln Ser Ile Pro Pro Ile Leu His

500 505 510

His

<210> 13

<211> 42

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 13

aacctgtatt ttcagggatc cgatcaaatt ggtcatgaag gc 42

<210> 14

<211> 47

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 14

ctcgagactg caggctctag attacctttt gtaatgtggt gaaagag 47

<210> 15

<211> 121

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 15

gattacgata tcccaacgac cgaaaacctg tattttcagg gatccggaat tcaaaggcct 60

acgtcgacga gctcactagt cgcggccgct ttcgaatcta gagcctgcag tctcgaggca 120

t 121

<210> 16

<211> 669

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 16

Met Val Ser Ala Ile Val Leu Tyr Val Leu Leu Ala Ala Ala Ala His

1 5 10 15

Ser Ala Phe Ala Ala Gly Met Gly His His His His His His Gly Ser

20 25 30

Leu Gln Asp Ser Glu Val Asn Gln Glu Ala Lys Pro Glu Val Lys Pro

35 40 45

Glu Val Lys Pro Glu Thr His Ile Asn Leu Lys Val Ser Asp Gly Ser

50 55 60

Ser Glu Ile Phe Phe Lys Ile Lys Lys Thr Thr Pro Leu Arg Arg Leu

65 70 75 80

Met Glu Ala Phe Ala Lys Arg Gln Gly Lys Glu Met Asp Ser Leu Thr

85 90 95

Phe Leu Tyr Asp Gly Ile Glu Ile Gln Ala Asp Gln Thr Pro Glu Asp

100 105 110

Leu Asp Met Glu Asp Asn Asp Ile Ile Glu Ala His Arg Glu Gln Ile

115 120 125

Gly Gly Asp Tyr Asp Ile Pro Thr Thr Glu Asn Leu Tyr Phe Gln Gly

130 135 140

Ser Asp Gln Ile Gly His Glu Gly Phe Leu Lys Cys Leu Ile Thr Arg

145 150 155 160

Ile Ser Lys Ser Asn Ser Thr Ser Thr Ser Glu Ser Ile Ile Tyr Thr

165 170 175

Gln Asn Asn Pro Ser Tyr Ser Thr Ile Leu Thr Ser Thr Met Gln Asn

180 185 190

Pro Arg Phe Leu Ser Leu Pro Ile Pro Lys Pro Phe Val Ile Val Thr

195 200 205

Pro Leu His Val Ser His Val Gln Ala Thr Leu Tyr Cys Ala Lys Lys

210 215 220

His Asp Ile Gln Ile Arg Ile Arg Ser Gly Gly His Asp Tyr Glu Gly

225 230 235 240

Leu Ser Tyr Met Ser Asn Val Thr Phe Val Ile Leu Asp Leu Arg Asn

245 250 255

Leu Ser Ser Ile Asn Ile Asp Val Lys Arg Lys Ser Ala Trp Val Gln

260 265 270

Ser Gly Ala Thr Ile Gly Glu Leu Tyr Tyr Arg Ile Ala Glu Lys Ser

275 280 285

Leu Ser Leu Ala Phe Pro Gly Gly Leu Gly His Thr Ile Gly Val Gly

290 295 300

Gly Gln Leu Gly Gly Gly Gly Tyr Gly Tyr Ser Thr Arg Lys Tyr Gly

305 310 315 320

Leu Ala Ser Asp Asn Ile Ile Asp Ala Gln Phe Met Asp Val Gln Gly

325 330 335

Arg Ile Leu Asn Arg Lys Ser Met Gly Glu Asp Leu Phe Trp Ala Ile

340 345 350

Arg Gly Gly Gly Ala Gly Ser Phe Gly Ile Val Leu Ala Trp Lys Ile

355 360 365

Arg Leu Val Asp Val Pro Thr Thr Val Thr Val Phe Glu Ala Val Arg

370 375 380

Lys Trp Glu Asn Asn Ala Thr Lys Lys Phe Val His Arg Tyr Gln Arg

385 390 395 400

Arg Ile Ala Asp Ile Asp Lys Asp Leu Thr Ile Phe Leu Gly Phe Gln

405 410 415

Thr Ala Asn Thr Gly Asp Glu Gln Gly Asn Thr Lys Ile Glu Val Leu

420 425 430

Ala Val Ile Ser Ala Thr Phe His Gly Ser Gln Asp Lys Val Leu Pro

435 440 445

Leu Met Gln Lys Glu Phe Pro Glu Leu Gly Leu Leu Lys Glu Glu Cys

450 455 460

Ile Glu Met Pro Trp Val Arg Ser Ile Met His Tyr Asn Phe Phe Arg

465 470 475 480

Asn Gly Glu Pro Leu Glu Val Leu Leu Asn Arg Thr Leu Asn Phe Glu

485 490 495

Met Lys Ala Phe Lys Leu Lys Ser Asp Tyr Val Lys Glu Pro Ile Pro

500 505 510

Asp Asp Val Leu Glu Lys Leu Leu Gly Lys Leu Tyr Glu Glu Glu Ile

515 520 525

Gly Glu Gly Tyr Ile Glu Leu Phe Pro Tyr Gly Gly Lys Met Asn Glu

530 535 540

Ile Ser Glu Ser Glu Ile Pro Phe Pro His Arg Ala Gly Asn Leu Tyr

545 550 555 560

Asn Leu Arg Tyr Leu Val Ser Trp Ile Asp Asp Gly Asn Ile Thr Arg

565 570 575

Thr Asn Glu His Ile Arg Trp Val Arg Ser Ala Tyr Asp Tyr Met Thr

580 585 590

Pro Phe Val Ser Lys Asn Pro Arg Gly Ala Tyr Leu Asn Phe Arg Asp

595 600 605

Leu Asp Ile Gly Ile Asn Ser Asp Glu Asp Asp Tyr Asn Tyr Val Ala

610 615 620

Gln Ala Ser Ile Trp Gly Thr Lys Tyr Phe Lys Ser Asn Phe Tyr Arg

625 630 635 640

Leu Val Tyr Val Lys Thr Leu Val Asp Pro Thr Asn Phe Phe Thr Tyr

645 650 655

Glu Gln Ser Ile Pro Pro Leu Ser Pro His Tyr Lys Arg

660 665

<210> 17

<211> 658

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 17

Met Val Ser Ala Ile Val Leu Tyr Val Leu Leu Ala Ala Ala Ala His

1 5 10 15

Ser Ala Phe Ala Ala Gly Met Gly His His His His His His Gly Ser

20 25 30

Leu Gln Asp Ser Glu Val Asn Gln Glu Ala Lys Pro Glu Val Lys Pro

35 40 45

Glu Val Lys Pro Glu Thr His Ile Asn Leu Lys Val Ser Asp Gly Ser

50 55 60

Ser Glu Ile Phe Phe Lys Ile Lys Lys Thr Thr Pro Leu Arg Arg Leu

65 70 75 80

Met Glu Ala Phe Ala Lys Arg Gln Gly Lys Glu Met Asp Ser Leu Thr

85 90 95

Phe Leu Tyr Asp Gly Ile Glu Ile Gln Ala Asp Gln Thr Pro Glu Asp

100 105 110

Leu Asp Met Glu Asp Asn Asp Ile Ile Glu Ala His Arg Glu Gln Ile

115 120 125

Gly Gly Asp Tyr Asp Ile Pro Thr Thr Glu Asn Leu Tyr Phe Gln Gly

130 135 140

Ser His Glu Glu Phe Leu Gln Cys Leu Ser Ser Arg Ile Pro Lys Ser

145 150 155 160

Ile Ile Tyr Ala Ser Asn Asn Pro Ser Tyr Ser Asn Val Leu Asp Ser

165 170 175

Thr Thr Gln Asn Pro Arg Phe Leu Ser Ser Ser Thr Arg Asn Pro Ser

180 185 190

Val Ile Val Thr Pro Phe Lys Ile Ser His Ile Gln Pro Thr Ile Tyr

195 200 205

Cys Ser Lys Lys His Gly Val Gln Ile Arg Ile Arg Ser Gly Gly His

210 215 220

Asp Tyr Glu Gly Leu Ser Tyr Gln Ser Ser Val Pro Phe Phe Ile Leu

225 230 235 240

Asp Leu Arg Asn Ile Asn Ser Ile Gln Val Asp Val Glu Lys Lys Ser

245 250 255

Ala Trp Val Glu Ala Gly Ala Thr Leu Gly Glu Leu Tyr Tyr Ser Ile

260 265 270

Ala Lys Lys Ser Lys Thr Leu Gly Phe Pro Gly Gly Leu Cys Ser Thr

275 280 285

Val Gly Val Gly Gly Gln Leu Gly Gly Gly Gly Tyr Gly Tyr Gln Ser

290 295 300

Arg Thr Tyr Gly Leu Ala Ser Asp Asn Ile Ile Asp Ala Gln Leu Ile

305 310 315 320

Asp Ala Arg Gly Arg Ile Leu Asn Arg Lys Ser Met Gly Glu Asp Leu

325 330 335

Phe Trp Ala Ile Arg Gly Gly Gly Ala Gly Ser Phe Gly Ile Val Ile

340 345 350

Ala Trp Lys Val Arg Leu Ile Asp Val Pro Ser Thr Val Thr Val Phe

355 360 365

Glu Thr Val Arg Met Trp Glu Asp Asn Val Thr Lys Lys Phe Val His

370 375 380

Arg Tyr Gln Arg Arg Ala Ser Asn Ile Asp Lys Asp Leu Thr Ile Phe

385 390 395 400

Leu Gly Phe Arg Thr Thr Asn Thr Ser Asp Glu Gln Gly Asn Ser Lys

405 410 415

Ile Gln Ile Ile Thr Ile Ile Ser Ala Thr Phe His Gly Ser Arg Asp

420 425 430

Arg Leu Leu Pro Leu Met Gln Glu Glu Phe Pro Glu Leu Gly Leu Gly

435 440 445

Lys Glu Asp Phe Lys Glu Met Ser Trp Val Gln Ser Ile Val His Tyr

450 455 460

Asn Asn Tyr Lys Asp Asp Asp Pro Leu Glu Val Leu Leu Asn Lys Thr

465 470 475 480

Val Asn Phe Glu Pro Asn Pro Phe Lys Leu Lys Ser Asp Tyr Val Lys

485 490 495

Lys Pro Ile Pro Asp Asp Val Leu Glu Lys Leu Leu Ala Arg Leu Tyr

500 505 510

Glu Glu Asp Ile Gly Tyr Asp Phe Val Glu Phe Phe Pro Tyr Gly Gly

515 520 525

Lys Leu Ser Glu Ile Ser Glu Ser Glu Ile Pro Phe Pro His Arg Ala

530 535 540

Gly Asn Leu Tyr Asn Leu Arg Tyr Met Ala Ser Trp Lys Gln Gly Glu

545 550 555 560

Asn Thr Thr Arg Ile Asn Asn His Leu Ser Trp Val Arg Ser Val Tyr

565 570 575

Asp Ser Met Thr Pro Tyr Val Ser Lys Asn Pro Arg Gly Ala Tyr Leu

580 585 590

Asn Phe Arg Asp Leu Asp Ile Gly Val Asn Pro Asn Glu Ser Asp Pro

595 600 605

Thr Ser Ala Tyr Asn Tyr Val Lys Gln Ala Ser Val Trp Gly Thr Lys

610 615 620

Tyr Phe Lys Asn Asn Phe Tyr Lys Met Val Phe Ile Lys Thr Leu Val

625 630 635 640

Asp Pro Thr Asn Phe Phe Thr Tyr Glu Gln Ser Ile Pro Pro Ile Leu

645 650 655

His His

<210> 18

<211> 43

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 18

aacctgtatt ttcagggatc ccatgaagag tttcttcagt gcc 43

<210> 19

<211> 42

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 19

ctcgagactg caggctctag attaatggtg aagaataggt gg 42

Claims

1.一种Diels-Alder反应酶，其来源于桑树，命名为MaDA酶，氨基酸序列如SEQ ID No.1所示。

2.权利要求1所述Diels-Alder反应酶的同源蛋白，其为MaDA-1，其氨基酸序列如SEQID No.10所示。

3.权利要求1所述Diels-Alder反应酶的同源蛋白，其为MaDA-2，其氨基酸序列如SEQID No.12所示。

4.编码权利要求1所述Diels-Alder反应酶的基因，所述基因的核苷酸序列如SEQ IDNo.2所示。

5.编码权利要求2所述同源蛋白的基因，所述基因的核苷酸序列如SEQ ID No.9所示。

6.编码权利要求3所述同源蛋白的基因，所述基因的核苷酸序列如SEQ ID No.11所示。

7.含有权利要求4-6任一项所述基因的生物材料，所述生物材料为表达盒、质粒或载体。

8.如权利要求7所述的生物材料，其特征在于，所述生物材料为含有权利要求4-6任一项所述基因的表达载体pI-sec-sumostar-tev2，所述表达载体pI-sec-sumostar-tev2的核苷酸序列如SEQ ID No.3所示。

9.权利要求7所述的生物材料在昆虫细胞中表达MaDA酶蛋白的应用，所述MaDA酶蛋白的氨基酸序列如SEQ ID No.1所示；或如SEQ ID No.10所示；或如SEQ ID No.12所示。

10.权利要求1所述Diels-Alder反应酶或其编码基因或权利要求7所述的生物材料在催化Diels-Alder反应制备含有六元环骨架的桑树天然产物，或制备立体专一性合成endo构型的桑树天然产物中的应用。

11.如权利要求10所述的应用，其特征在于，所述桑树天然产物为黄酮类天然产物或其类似物。

12.如权利要求11所述的应用，其特征在于，以亲二烯体和二烯体为底物，以权利要求1所述Diels-Alder反应酶为催化酶，进行反应，立体专一性合成endo构型天然产物；所述二烯体为含有脱氢异戊烯基的化合物。

13.如权利要求12所述的应用，其特征在于，所述亲二烯体为查尔酮或其衍生物，所述二烯体为含有脱氢异戊烯基的黄酮、二苯乙烯、查尔酮或苯并呋喃。

14.如权利要求12所述的应用，其特征在于，所述反应的温度为50℃， pH为8.0。