CN110951635A - 一种调节酿酒酵母细胞膜磷脂抵御盐胁迫的方法 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种调节酿酒酵母细胞膜磷脂抵御盐胁迫的方法，属于生物工程技术领域。通过模块化组装CDS1和CHO1，构建出耐盐的工程菌株，使得酵母菌株抗盐胁迫能力增加。结果表明，酿酒酵母模块化组装CDS1和CHO1基因，与出发菌株相比，在盐胁迫条件下模块化组装菌株生物量提高14.2％，存活率增加39.2％，半抑制浓度提高了17.82％，细胞膜完整性提高了51.34％。

Description

一种调节酿酒酵母细胞膜磷脂抵御盐胁迫的方法

技术领域

本发明涉及一种调节酿酒酵母细胞膜磷脂抵御盐胁迫的方法，属于生物工程技术领域。

背景技术

微生物在发酵和生长过程中容易受到各种环境的干扰，包括外源环境和内源环境。而微生物细胞工厂则提供了一种经济和环保的方式来生产高价值的化学品，包括生物燃料、大宗化学品和可再生原料制药。微生物细胞工厂的效率取决于它们的生产性能、生长状态和抗胁迫能力。酿酒酵母作为工业模式菌株，细胞工厂的建立使得其被广泛应用于生产酒精、有机酸、蛋白质等。然而，不利的环境因素往往造成酿酒酵母难以维持高强度的发酵生产。

为了增加工业微生物对环境胁迫的耐受能力，一系列的应对策略已经被开发，包括适应性进化、诱变育种、转运蛋白工程等。这些耐受策略虽然能够提高微生物的环境耐受能力，但是它们都需要耗费大量的时间才能实现，而膜工程策略仅需要进行简单的分子生物学操作即可提高微生物的耐受能力。除此之外，这些耐受策略仅能够针对某一种特定的胁迫进行改造，而膜工程的改造可以有效应对多种胁迫。

目前，膜工程策略增加工业菌株耐受性的方法主要分为三种：改造细胞膜组分、改造细胞膜功能、改造细胞膜形态。例如，解脂耶式酵母中通过改变甾醇路径酶ERG3，ERG4，ERG6，ERG12的表达提高了有机溶剂的耐受性；光滑球拟酵母中转录因子CgRDS2通过提高细胞膜完整性来抵御盐胁迫环境；大肠杆菌中通过过表达膜弯曲蛋白扩展细胞膜的表面积从而提高疏水化合物的耐受性。然而，这些方法虽然提高了微生物的耐受性，但是与传统的菌株改造方法相比，它们的菌株耐受能力仍然较低。此外，这些研究仅仅是对膜组分进行改造，未对膜功能、形态变化等因素进行考虑，而这些也可能是影响其耐受性的关键。目前，还未出现将代谢工程与膜工程策略相结合，并且综合考虑膜组分、膜功能、膜形态等因素的提高微生物耐受性的方法。

发明内容

技术问题：本发明有效解决了酿酒酵母盐胁迫抗性低的问题，使得酿酒酵母菌株在盐胁迫条件下生存能力有所提高，为提高酿酒酵母发酵生产大宗化学品的性能提供潜在策略。

技术方案：为了解决上述问题，本发明提供了一种调节酿酒酵母抵御盐胁迫的方法，通过调控编码磷脂路径酶的基因CDS1和CHO1表达来调节酿酒酵母的盐胁迫抗性。

在本发明的一种实施方式中，所述方法通过模块化组装CDS1和CHO1基因后，增强酿酒酵母的盐胁迫抗性；所述模块化组装是：将共表达CDS1基因和CHO1基因的质粒转入酿酒酵母中，获得共表达CDS1和CHO1基因的菌株。

在本发明的一种实施方式中，用弱启动子ADH1表达CDS1基因，用强启动子TEF1表达CHO1基因。

在本发明的一种实施方式中，所述CDS1基因的核苷酸序列如NCBI上gene ID:852317的核苷酸序列所示。

在本发明的一种实施方式中，所述CHO1基因的核苷酸序列如NCBI上gene ID:856748的核苷酸序列所示。

在本发明的一种实施方式中，所述酿酒酵母是酿酒酵母(Saccharomycescerevisiae)BY4741(见https://www.yeastgenome.org/strain/S000203456)。基因型为MATa his3Δ1leu2Δ0met15Δ0ura3Δ0。

在本发明的一种实施方式中，所述共表达CDS1基因和CHO1基因的质粒是PY17-(ADH1)-CDS1-(TEF1)-CHO1。

本发明还提供一种改变酿酒酵母细胞膜完整性的方法，通过模块化组装CDS1和CHO1基因后，改变细胞膜磷脂组分的分布；所述模块化组装是：将共表达CDS1基因和CHO1基因的质粒转入酿酒酵母中，获得共表达CDS1和CHO1基因的菌株，改变细胞膜磷脂组分的分布。

本发明还要求保护所述方法在工业生产大宗化学品方面的应用。

在本发明的一种实施方式中，所述大宗化学品包括但不限于有机酸、氨基酸或糖类。

有益效果：本发明通过模块化组装磷脂路径酶CDS1和CHO1基因增强了酿酒酵母的盐胁迫耐受能力，可以使菌株在工业发酵过程中抗压能力变强，提高发酵生产产品的产量。结果表明，在共表达CDS1和CHO1后，与出发菌株相比，在盐胁迫条件下模块化组装菌株生物量提高14.2％，存活率增加39.2％，半抑制浓度提高了17.82％，细胞膜完整性提高了51.34％。

附图说明

图1：模块化组装菌株的构建：A是不同强度启动子的筛选；B是模块化组装CDS1和CHO1基因。

图2：各菌株在正常条件和1.2M NaCl条件下的平板生长实验。

图3：菌株Y03在正常条件和1.2M NaCl条件下的的生长曲线；A：正常条件下菌株Y03的生长曲线；B：1.2M NaCl条件下菌株Y03的生长曲线。

图4：菌株Y03在0M，0.4M，0.8M，1.2M NaCl下的存活率。

图5：菌株Y03在不同浓度NaCl条件下的IC₅₀的测定。

图6：菌株Y03在正常条件和1.2M NaCl条件下的细胞膜完整性的测定结果，图中左侧为活细胞，右侧为死细胞。

图7：pY15质粒图谱。

图8：PY17-(ADH1)-CDS1-(TEF1)-CHO1质粒图谱。

具体实施方式

实施例1：模块化组装菌株的构建

对一株耐盐菌株进行代谢组学数据分析，发现磷脂代谢路径是影响菌株耐受盐胁迫的关键路径。以此耐盐菌株为模板，对与磷脂代谢路径相关的13个基因进行转录水平的分析，发现其中7个基因CDS1(NCBI gene ID:852317)、CHO1(NCBI gene ID:856748)、PIS1(NCBI gene ID:856229)、PSD1(NCBI gene ID:855552)、PSD2(NCBI gene ID:853080)、CHO2(NCBI gene ID:853061)、OPI3(NCBI gene ID:853536)在0M NaCl和1.2M NaCl条件下表达水平显著上升。将这7个基因分别过表达，并通过平板点钟筛选出CDS1和CHO1的过表达明显提高了菌株耐受性，因此选用CDS1和CHO1作为研究盐胁迫耐受的关键基因。

以野生型酿酒酵母基因组为模板，分别以P1/P2、P3/P4、P5/P6、P7/P8、P9/P10为引物(序列见表1)，分别扩增出不同启动子CHO1(核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示)、TEF2(核苷酸序列如SEQ ID NO.2所示)、TEF1(核苷酸序列如SEQ ID NO.3所示)、GPD(核苷酸序列如SEQ ID NO.4所示)、ADH1(核苷酸序列如SEQ ID NO.5所示)。将不同启动子分别同源重组至PY17质粒上，并将其用化学转化法分别导入出发菌株Saccharomyces cerevisiae BY4741，利用亮氨酸标记基因来筛选阳性转化子。将EGFP(NCBI gene ID:20473140)报告基因与启动子连接，依据基因表达强度将启动子分为三个水平：TEF1启动子为高水平，GPD启动子为中水平，ADH1启动子为低水平(图1A)。

将不同强度启动子模块化组装磷脂路径酶CDS1和CHO1基因(图1B)，得到待测菌株Y01-Y09。

以菌株Y03为例，模块化组装磷脂路径酶CDS1和CHO1基因的方法为：在已商业化的质粒PY15(质粒图谱见图7)的基础上，利用酶切和同源重组的方法将TEF1启动子替换为ADH1启动子，ADH1启动子位于CYC1终止子上游，再利用酶切和同源重组的方法在CYC1终止子下游添加TEF1启动子；利用酶切和同源重组的方法，将CDS1基因连接到启动子ADH1下游，用弱启动子ADH1表达CDS1基因；利用酶切和同源重组的方法，将CHO1基因连接到启动子TEF1下游，用强启动子TEF1表达CHO1基因，得到的重组质粒为PY17-(ADH1)-CDS1-(TEF1)-CHO1(质粒图谱见图8)，然后将重组质粒转化到酵母中，利用重组质粒上的LEU2基因来筛选阳性转化子，最后提取质粒验证，得到菌株Y03。

其他待测菌株的构建方法参照上述过程。

表1引物

引物名称	序列(5’-3’)
		P1	CGAGCTCTCAGCAGCATCTGGCT
P2	GCTCTAGATTTTTAATATATAGTTTTATTTTTG
		P3	CGAGCTCGGGCGCCATAACCAAGG
P4	GCTCTAGAGTTTAGTTAATTATAGTTCG
		P5	CGAGCTCATAGCTTCAAAATGTTTCTACTCC
P6	GCTCTAGAAAACTTAGATTAGATTGCTATGCTT
		P7	CGAGCTCGTTTATCATTATCAATACTCGCCAT
P8	GCTCTAGATCCGTCGAAACTAAGTTCTGGT
		P9	CGAGCTCGGGTGTACAATATGGACTTC
P10	GCTCTAGATGTATATGAGATAGTTGATTGT

实施例2：各菌株生长性能的测定

(1)平板生长实验：将待测菌株的单菌落接种于25mL的YNB(0.67％YeastNitrogen Base without Amino Acids,2％Glucose)液体培养基中过夜活化，再转接到YNB培养基培养至对数期，用1.2M NaCl对菌株处理4h，测定菌体浓度并将菌悬液调节至OD₆₀₀＝1.0，以此为初始浓度，进行5次10倍梯度稀释，依次将4μL菌液点种在相应的固体YNB培养基上，30℃培养2-3天，观察菌体的生长情况并拍照(图2)。

正常条件下，模块化组装CDS1和CHO1并不影响菌株的生长；在浓度为1.2M NaCl条件下，模块化组装CDS1和CHO1增强了菌株的生长。表明磷脂路径酶基因CDS1和CHO1能够调节细胞对盐环境的耐受能力。

(2)生长曲线测性：将待测菌株的单菌落接种于25mL的YNB(0.67％YeastNitrogen Base without Amino Acids,2％Glucose)液体培养基中过夜活化，再分别转接到正常的YNB液体培养基和含有1.2M NaCl的YNB液体培养基中，控制起始OD₆₀₀＝0.1，30℃，200rpm培养，每隔4小时取样测定OD值，绘制生长曲线(图3)。

正常条件下，模块化组装CDS1和CHO1并不影响菌株的生长；在浓度为1.2M NaCl条件下，培养56h后，菌株Y03的OD₆₀₀值为3.238，比野生菌株高出14.2％。

实施例3：各菌株细胞存活率的测定

将菌株BY4741、待测菌株的单菌落接种于YNB液体培养基过夜培养，再转接到100mL的YNB液体培养基中，控制起始OD₆₀₀＝0.1，30℃，200rpm摇床培养至对数期，控制培养基NaCl浓度为0M，0.4M，0.8M，1.2M，30℃，200rpm培养4h后离心收集菌体，无菌水清洗菌体2次后重悬并稀释菌体。取相同数量不同条件下的菌液涂布于YNB平板上，30℃培养2-4天，观察各菌株的生长状态并计数。定义正常条件下细胞存活率为100％，则胁迫条件下细胞存活率＝胁迫平板上的菌落数/正常平板上的菌落数×100％，最后绘制细胞存活率折线图。

如图4所示，在1.2M NaCl条件下，与出发菌株(细胞存活率为40.3％)相比，菌株Y03的细胞存活率增加了39.2％。上述结果表明磷脂路径酶基因CDS1和CHO1有利于酿酒酵母在1.2M NaCl条件下生长。

实施例4：各菌株半抑制浓度的测定

将菌株BY4741、待测菌株的单菌落接种于YNB液体培养基过夜培养，再转接到100mL的YNB液体培养基中，控制起始OD₆₀₀＝0.1，30℃，200rpm摇床培养至对数期，添加不同浓度的NaCl调节培养基的渗透压，30℃，200rpm培养4h后离心收集菌体，无菌水清洗菌体2次后重悬并稀释菌体。取相同数量不同条件下的菌液涂布于YNB平板上，30℃培养2-4天，观察各菌株的生长状态并计数。将不同NaCl条件下的待测菌株的细胞存活率通过非线性拟合绘制存活率曲线，定义半抑制浓度IC₅₀为存活率50％情况下的NaCl浓度。

如图5所示，与出发菌株(半抑制浓度为1.01M NaCl)相比，菌株Y03半抑制浓度提高了17.82％。上述结果表明磷脂路径酶基因CDS1和CHO1有利于酿酒酵母在盐胁迫下生长。

实施例5：各菌株细胞膜完整性的测定

将菌株BY4741、待测菌株的单菌落接种于YNB液体培养基过夜培养，再转接到100mL的YNB液体培养基中，控制起始OD₆₀₀＝0.1，30℃，200rpm摇床培养至对数期，随后在无胁迫或者1.2M NaCl胁迫条件下处理4h，4℃，6000rpm离心收集菌体，菌泥经PBS(NaCl8.0g/L，KH₂PO₄ 0.2g/L，Na₂HPO₄·H₂O 2.9g/L，KCl 0.2g/L)缓冲液清洗后重悬，稀释至适当的浓度。取1mL稀释后的样品，平均分为两份，一份加入5μL SYTOX，立即避光反应10min，收菌清洗后用0.5mL PBS重悬细胞；另一份不做任何处理。用PBS缓冲液校对荧光分光光度计，随后在激发波长488nm和发射波长512nm条件下检测未染色和染色后细胞中的荧光值。

如图6所示，在无胁迫条件下，两株菌的细胞膜完整性(活细胞占比)没有显著差别；而在1.2M NaCl条件下，与出发菌株(细胞膜完整性为63.1％)相比，菌株Y03中细胞膜完整性提高了51.34％。这些结果表明盐胁迫下磷脂路径酶基因CDS1和CHO1有助于提高细胞膜的完整性。

对比例1

模块化组装CDS1和CHO1，采用GPD启动子表达CDS1，采用TEF1启动子表达CHO1，平板点种实验结果显示，在0M NaCl条件下，Y06菌株的生长能力与野生型菌株相似；在1.2MNaCl条件下，该菌株的生长能力并没有提升(图2)。

对比例2

模块化组装CDS1和CHO1，采用GPD启动子表达CDS1，采用GPD启动子表达CHO1，平板点种实验结果显示，在0M NaCl条件下，Y05菌株的生长能力与野生型菌株相似；在1.2MNaCl条件下，与野生型菌株相比，该菌株的生长能力有所提升，但是并不明显(图2)。

虽然本发明已以较佳实施例公开如上，但其并非用以限定本发明，任何熟悉此技术的人，在不脱离本发明的精神和范围内，都可做各种的改动与修饰，因此本发明的保护范围应该以权利要求书所界定的为准。

SEQUENCE LISTING

<110> 江南大学

<120> 一种调节酿酒酵母细胞膜磷脂抵御盐胁迫的方法

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<170> PatentIn version 3.3

<210> 1

<211> 1000

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 1

tcagcagcat ctggctgaaa aaaaagcgaa tcatgtagat gatagcaaat tgagtaagag 60

acctatgagc gctcgctcga gaatcgcatt ggagatagaa aaggaaccag atgacatggg 120

cgatggttac actcgttttc acgatgagac ccccgctaaa cctaatttag agtacactca 180

agatatacct gctgtgttca ccgacccaaa tgtaatggaa caatattatt tgacacttga 240

tcagcagcaa aataatcacc aaaatatggc ctggttgact cctccacaac tgccacctca 300

tttagaaaac gtcattttga atagttactc aaacgcgcaa actgataata cgtctggcgc 360

ccttcccatt ccgaaccatg ttatattgaa ccatctggcg acaagcagta ttaagcataa 420

tacattatgt gtcgcatcca ttgttaggta taaacaaaaa tacgtgaccc aaatactgta 480

tacaccattg caatagatat gattatagag cttatagcta catcttttta gataaaagcg 540

aagatgtttc tgcgattttt ccattatagc tctccatgat actaaatatc aaggtctaca 600

tgtaagtatt tgtatatatg ggttggaatg tatatacgta tatacgtacg tacgtacgta 660

tatgcacata attgttacgg gatgtatata taaattagta gcattataga agatatccct 720

aacatcaatc cccactcctt ctcaatgtgt gcagacttct gtgccagaca ctgaatatat 780

atcagtaatt ggtcaaaatc actttgaacg ttcacacggc accctcacgc ctttgagctt 840

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Claims (10)

1.一种调节酿酒酵母抵御盐胁迫的方法，其特征在于，通过调控编码磷脂路径酶的基因CDS1和CHO1表达来调节酿酒酵母的盐胁迫抗性。

2.如权利要求1所述的方法，其特征在于，所述方法通过模块化组装CDS1和CHO1基因后，增强酿酒酵母的盐胁迫抗性；所述模块化组装是：将共表达CDS1基因和CHO1基因的质粒转入酿酒酵母中，获得共表达CDS1和CHO1基因的菌株。

3.如权利要求2所述的方法，其特征在于，用弱启动子ADH1表达CDS1基因，用强启动子TEF1表达CHO1基因。

4.如权利要求2所述的方法，其特征在于，所述CDS1基因的核苷酸序列如NCBI上geneID:852317的核苷酸序列所示。

5.如权利要求2所述的方法，其特征在于，所述CHO1基因的核苷酸序列如NCBI上geneID:856748的核苷酸序列所示。

6.如权利要求2所述的方法，其特征在于，所述共表达CDS1基因和CHO1基因的质粒是PY17-(ADH1)-CDS1-(TEF1)-CHO1。

7.如权利要求1-6任一所述的方法，其特征在于，所述酿酒酵母是酿酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)BY4741。

8.一种改变酿酒酵母细胞膜完整性的方法，其特征在于，通过模块化组装CDS1和CHO1基因后，改变细胞膜磷脂组分的分布；所述模块化组装是：将共表达CDS1基因和CHO1基因的质粒转入酿酒酵母中，获得共表达CDS1和CHO1基因的菌株，改变细胞膜磷脂组分的分布。

9.权利要求1-8任一所述的方法在工业生产大宗化学品方面的应用。

10.如权利要求9所述的方法，其特征在于，所述大宗化学品包括但不限于有机酸、氨基酸或糖类。

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