CN110951620B - 抗幽门螺旋杆菌活性的化合物及其制备方法和应用 - Google Patents

抗幽门螺旋杆菌活性的化合物及其制备方法和应用 Download PDF

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Abstract

本发明为抗幽门螺旋杆菌活性的化合物及其制备方法和应用，公开了一株曲霉(Aspergillus sp.)ZJU5‑1及其制备化合物的方法，且该化合物对幽门螺旋杆菌耐药菌株(H.pylori BHKS159)具有很好的活性。

Description

抗幽门螺旋杆菌活性的化合物及其制备方法和应用
技术领域
本发明涉及抗幽门螺旋杆菌活性的化合物。
背景技术
幽门螺旋杆菌是一种革兰氏阴性菌，专一性定植于人胃粘膜,是人类慢性胃炎、消化性溃疡、胃癌和胃淋巴瘤的主要病因，全球每年因胃癌去世的人数逐渐增多。治疗胃癌等胃部疾病的关键在于杀死幽门螺旋杆菌，而药物治疗占有重要地位，以天然产物为来源的抗肿瘤药物具有活性显著、结构独特、作用机制不同于一般小分子化学治疗药物的优势。因此发现抑制幽门螺旋杆菌的药物对于胃癌等胃部疾病的治疗已迫切需要。
发明内容
本发明的第一目的是提供一株菌株，名称为ZJU5-1，属于曲霉(Aspergillussp.)，已于2019年11月06日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心(简称为CGMCC，地址为：北京市朝阳区北辰西路1号院3号)，保藏中心登记入册编号CGMCCNo.18829。
本发明的第二目的是提供两种抗幽门螺旋杆菌活性的化合物，其结构式如式Ⅰ所示：
Figure BDA0002270225630000011
本发明的第三目的是提供式Ⅰ所述化合物的制备方法，包括如下步骤：
在固体培养基中发酵曲霉(Aspergillus sp.)ZJU5-1，得到发酵产物，从所发酵产物中提取、分离和纯化，得到式Ⅰ所述化合物。
本发明提供的化合物具有较好的抗幽门螺旋杆菌(H.pylori BHKS159)活性，适宜于制备抗幽门螺旋杆菌药物。
附图说明
图1为化合物(1)的1H核磁共振图谱。
图2为化合物(1)的13C核磁共振图谱。
图3为化合物(2)的1H核磁共振图谱。
图4为化合物(2)的13C核磁共振图谱。
具体实施方式
以下的实施例便于更好地理解本发明，但并不限定本发明。下述实施例中的实验方法，如无特殊说明，均为常规方法。下述实施例中所用的试验材料，如无特殊说明，均来自常规生化试剂商店。以下实施例中的定量试验，均设置3次重复实验，结果取平均值。
实施例1
菌株ZJU5-1的分离和鉴定
一、菌株ZJU5-1的采集与分离
2012年7月从南大西洋沉积物中分离到一株菌，命名为菌株ZJU5-1。
菌株ZJU5-1为一种海洋来源的真菌。
二、菌株ZJU5-1的鉴定
1、分子鉴定
菌株ZJU5-1的18S ribosomal RNA部分序列见序列表的序列1，如GENBANKACCESSION NO.KR611594.1的序列相似性最高，相似性为99.81％。
根据以上鉴定结果，菌株ZJU5-1属于曲霉(Aspergillus sp.)。
三、菌株ZJU5-1的保藏
菌株ZJU5-1，属于曲霉(Aspergillus sp.)，已于2019年11月06日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心(简称CGMCC，地址为：北京市朝阳区北辰西路1号院3号)，保藏号为CGMCC No.18829。
实施例2
化合物的制备
PDA培养基：将马铃薯200g、葡萄糖20g、琼脂15g和水1000mL混匀，121℃高压蒸汽灭菌30min。
大米培养基：将200g大米在200mL水中浸泡过夜，121℃高压蒸汽灭菌30min。
1菌株ZJU5-1的固体发酵
1.1菌株ZJU5-1的活化，将2个3cm2大小的菌块连同培养基接种到含有大米培养基的1000mL三角瓶中，25℃无菌培养30d。
将菌株ZJU5-1在PDA平板上培养5d，等待菌落长满平板。
1.2菌株ZJU5-1的固体发酵
当菌落长满平板后，将5个3cm2大小的菌块连同培养基接种到含有大米培养基的1000mL三角瓶中，25℃无菌培养30d。
2化合物的提取
2.1在步骤1.2得到的三角瓶(含固体发酵物)中加入2.0L有机试剂(乙酸乙酯:甲醇＝4:1)，室温浸提24h，收集第一次上清液。
2.2在步骤2.1的三角瓶中再次加入2.0L有机试剂(乙酸乙酯:甲醇＝4:1)，室温浸提24h，收集第二次上清液。
2.3在步骤2.2的三角瓶中再次加入2.0L有机试剂(乙酸乙酯:甲醇＝4:1)，室温浸提24h，收集第三次上清液。
2.4将步骤2.1的第一次上清液、步骤2.2的第二次上清液、步骤2.3的第三次上清液合并，减压蒸馏至干燥，得到11g粗提物。
3、化合物的分离纯化
3.1减压硅胶柱层析得到洗脱液
将步骤2.4得到的粗提物进行减压硅胶柱层析。
柱子型号为：6×35cm；
填充物为：薄层层析硅胶H；
洗脱过程为：500mL洗脱液(由9.8体积份正己烷和0.2体积份二氯甲烷组成)，收集过柱后的洗脱液，流速为50mL/min。
3.2将层析洗脱液进行凝胶色谱分离得到凝胶洗脱液
所述凝胶色谱分离的参数具体如下：
柱子型号为：3×50cm；
填充物为：Sephadex LH-20；
流动相为2体积份二氯甲烷和1体积份甲醇的混合物，流速为0.5mL/min；
收集保留体积为40-80mL的过柱后的凝胶洗脱液。
3.3将凝胶洗脱液进行反相HPLC分离得HPLC洗脱液
所述反相HPLC分离的参数具体如下：
柱子型号为：Eclipse XDB-C18(5μm；9.4×250mm)；
洗脱过程为：用体积百分含量为35％的乙腈水溶液等度洗脱15min，体积百分含量为35-45％的乙腈水溶液梯度洗脱5min，体积百分含量为45-60％的乙腈水溶液梯度洗脱15min，流速为3mL/min。
收集保留时间为5.8-6.2min(峰值的保留时间tR为6.0min)和28.4-29.5min(峰值的保留时间tR为29.0min)的过柱后洗脱液。
3.4将步骤3.3收集的HPLC洗脱液减压蒸馏至干燥，分别得到3.3mg和4.4mg产物。
4化合物的表征
将步骤3.4的产物进行有机质谱和核磁共振谱分析。
产物的表征数据如下：
化合物(1)
黄色固体状；
分子式：C16H12O6；分子量：300；
1H核磁共振图谱见图1，13C核磁共振图谱见图2；
化合物(2)
黄色固体状；
分子式：C16H12O7；分子量：316；
1H核磁共振图谱见图3，13C核磁共振图谱见图4；
依据以上表征数据上述化合物的理化数据和图谱，步骤3.4的产物为式(I)所示的化合物。
Figure BDA0002270225630000041
实施例3
式(I)所示化合物对幽门螺旋杆菌(H.pylori BHKS159)的抑制作用。
采用微量稀释法检测式(I)所示化合物对幽门螺旋杆菌(H.pylori BHKS159)的最低抑菌浓度(MIC，100μL体系)。
将甲硝唑(Aladdin公司)作为化合物的阳性对照，进行平行实验。
本实施例所用细菌为：幽门螺旋杆菌(H.pylori BHKS159)。
实验具体步骤如下：
1.制备MIC板
第1孔先加脑心浸出液培养基(BHI)(具体成分包括：蛋白胨、脱水小牛脑浸粉、脱水牛心浸粉、氯化钠、葡萄糖、磷酸氢二钠，pH＝7.4)173.6μL，再加6.4μL待测化合物，倍比稀释至第7孔；第8孔不加，保留90μL培养基，作为加菌不加待测化合物对照。
2.制备菌液
取固体平板上对数期生长的幽门螺旋杆菌(H.pylori BHKS159)，用BHI培养基制作成菌悬液，调整浓度OD600为0.3(1×108CFU/mL)，稀释10倍，为1×107CFU/mL，备用。
3.接种菌液
取10μL加至第1-8孔(每孔菌液浓度约为1.0×106CFU/mL)。培养72h判断结果。第1孔至第7孔化合物浓度分别为64、32、16、8、4、2、1μg/mL。
4.结果判断
以在小孔内完全抑制细菌生长的最低待测化合物浓度为MIC。
当阳性对照孔第8孔(即不含抗生素)内细菌明显生长试验才有意义。
当在微量稀释法出现单一的跳孔时，应记录抑制细菌生长的最高化合物浓度。如出现多处跳孔，则不应报告结果，需重复试验。
式(I)所示化合物对幽门螺旋杆菌(H.pylori BHKS159)的抑菌作用需重复3次试验。
式(I)所示化合物(1)和(2)对幽门螺旋杆菌(H.pylori BHKS159)的MIC值均为16μg/mL。
甲硝唑对幽门螺旋杆菌(H.pylori BHKS159)的MIC值为大于16μg/mL。
序列表
<110> 中国科学院微生物研究所
<120> 抗幽门螺旋杆菌活性的化合物及其制备方法和应用
<160> 1
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 532
<212> DNA
<213> 曲霉(Aspergillus sp.)
<400> 1
tccgtaggtg aacctgcgga aggatcatta ctgagtgcgg gctgcctccg ggcgcccaac 60
ctcccacccg tgaataccta acactgttgc ttcggcgggg aaccccctcg ggggcgagcc 120
gccggggact actgaacttc atgcctgaga gtgatgcagt ctgagtctga atataaaatc 180
agtcaaaact ttcaacaatg gatctcttgg ttccggcatc gatgaagaac gcagcgaact 240
gcgataagta atgtgaattg cagaattcag tgaatcatcg agtctttgaa cgcacattgc 300
gccccctggc attccggggg gcatgcctgt ccgagcgtca ttgctgccca tcaagcccgg 360
cttgtgtgtt gggtcgtcgt cccccccggg ggacgggccc gaaaggcagc ggcggcaccg 420
tgtccggtcc tcgagcgtat ggggctttgt cacccgctcg actagggccg gccgggcgcc 480
agccgacgtc tccaaccatt tcttcaggtg acctcggatc agtagatgcc ac 532

Claims (4)

1.一株曲霉(Aspergillus sp.)ZJU5-1 CGMCC No.18829。
2.用权利要求1所述菌株生产抗幽门螺杆菌化合物的方法，其特征在于，包括以下步骤：
活化菌株ZJU5-1；
固体发酵菌株ZJU5-1；
用乙酸乙酯和甲醇浸提固体发酵物得粗提物；
用减压硅胶柱层析得到洗脱液；
用凝胶色谱分离得凝胶洗脱液；
用反相HPLC分离得包含化合物A或B HPLC洗脱液；
所述化合物A和B的结构式如下式所示：
Figure FDA0003283538820000011
3.权利要求2所述的化合物在制备抑制幽门螺旋杆菌活性药物中的应用。
4.根据权利要求3所述的应用，其特征在于，所述化合物抑制细菌生长的最低浓度为16μg/mL。
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