CN110938670A - 微生物菌液与血清囊泡反应在检测微生物感染中的应用 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了微生物菌液与血清囊泡反应在检测微生物感染中的应用。发明人在研究中意外发现，患者的血清提取物会与菌液产生凝集反应，通过检测凝集块的数目及类型，可以方便快捷准确地确定微生物感染的类型。本发明的一些实例，可以方便快速地检测出微生物感染，其检测结果可靠，可以更好地指导临床用药。
Description
技术领域
本发明涉及微生物感染检测领域，特别涉及微生物菌液与血清囊泡反应在检测微生物感染中的应用。
背景技术
骨折内固定术后感染是骨科医生所面临的临床难题之一，原因在于其诊断时常困难，治疗相对棘手，一旦不能及时有效控制感染，极易产生慢性骨髓炎，导致感染迁延不愈、复发率高、致残率高。同时，骨折内固定术后感染也是灾难性的，给患者及其家庭带来沉重的社会、经济负担。早期准确诊断与合理规范治疗是提高治愈率、降低复发率与致残率、恢复肢体功能、改善患者生活质量的关键。
现有诊断骨折内固定术后感染特异性细菌种类的方法主要为微生物的培养与鉴定，通过手术取出特异性组织进行微生物的培养，培养出特异性微生物后，诊断即可成立。而聚合酶链反应(PCR)技术在细菌鉴定方面具有方便，快捷、高分辨率与高敏感型等优势，也逐渐成为诊断特异性感染的常用方法。
在现有诊断方法中，对于微生物的培养与鉴定而言，其培养率较低也成为影响其发展的重要因素之一，为了提高术中感染组织培养的阳性率，不建议术前常规应用抗生素治疗。而对于有明确与外界相通窦道的患者，由于存在外界污染因素，使其细菌培养结果可信度较低。此外，微生物培养需要时间较长，在此期间需经验性使用抗生素，对患者病情的治疗产生一定影响。对于PCR技术而言，由于其尚处于探索阶段，加之其存在一定的缺陷，如标本污染易导致假阳性、不能鉴别细菌存活状态、提供的药敏信息有限等，不建议将该技术作为微生物鉴定的常规检测方式。
现有技术中，缺乏一种快速有效、可信度高的微生物感染检测技术。
发明内容
本发明的目的在于克服现有技术的不足，提供菌液在制备微生物感染检测试剂盒中的应用。
发明人在研究中意外发现，患者的血清提取物会与菌液产生凝集反应，通过检测凝集块的数目及类型，可以方便快捷准确地确定微生物感染的类型。
本发明所采取的技术方案是：
微生物菌液在制备对应微生物感染检测试剂盒中的应用，优选的，所述检测通过将微生物菌液与血清囊泡接触反应实现。
在一些应用的实例中，所述微生物感染为骨折内固定术后微生物感染。
在一些应用的实例中，所述试剂盒的检测对象为患者的血清提取物。
在一些应用的实例中，所述血清提取物为囊泡。
在一些应用的实例中，所述囊泡的提取方法如下：
1)取静脉血4℃离心，3000g4℃离心10min，分离血清；
2)将血清转移至离心管中，4000g4℃离心10min，收集上清液；
3)将上清经5μm过滤器过滤，取滤液；
4)将滤液100,000g4℃离心1h，取原血清1/5体积的HBSS盐溶液重悬得到所述囊泡。
在一些应用的实例中，所述微生物为金黄色葡萄球菌、铜绿假单胞菌、表皮葡萄球菌和大肠杆菌中的至少一种。
在一些应用的实例中，所述微生物菌液使用的溶液为添加有防冻剂的水性溶液，优选的防冻剂为10～20v/v％DMSO。
在一些应用的实例中，所述微生物菌液中，单一微生物的浓度为(2～9)×108CFU/mL，优选为(2～3)×108CFU/mL。
在一些应用的实例中，所述试剂盒还包括粒径计数板和血清提取试剂中的至少一种。
在一些应用的实例中，所述粒径计数板具有边长为3～5μm的正方形网格。
在一些应用的实例中，所述血清提取试剂为囊泡提取试剂。
本发明的有益效果是：
本发明的一些实例，可以方便快速地检测出微生物感染，其检测结果可靠，可以更好地指导临床用药。
附图说明
图1～4分别是不同来源囊泡与不同细菌反应形成团块的对比结果，图中，A1.HBSS与S.aureu；A2.EV-S.aureu与S.aureu.B1.HBSS与S.epidermidis；B2.EV-S.epidermidis与S.epidermidis.C1.HBSS与E.coli；A2.EV-E.coli与E.coli.D1.HBSS与P.aeruginosa；D2.EV-P.aeruginosa与P.aeruginosa.；
图5是EVs与细菌共培养的聚集效应统计(聚集体>3μm)。
具体实施方式
感染个体的血清囊泡在制备对应微生物感染检测试剂盒中的应用。
发明人在研究中意外发现，病人的血清提取物，特别是血清囊泡会与菌液产生凝集反应，通过检测凝集块的数目及类型，可以方便快捷准确地确定微生物感染的类型。例如相对其他的微生物，感染金黄色葡萄球菌的病人，其血清囊泡与金黄色葡萄球菌液反应会产生显著更为明显的凝集反应，通过粒径大于某一阀值(如3μm)的凝集块数目，可以方便快速地确定微生物感染的类型，进而更好地指导临床用药。
微生物菌液在制备对应微生物感染检测试剂盒中的应用，优选的，所述检测通过将微生物菌液与血清囊泡接触反应实现。
在一些应用的实例中，所述微生物感染为骨折内固定术后微生物感染。
在一些应用的实例中，所述试剂盒的检测对象为患者的血清提取物。
在一些应用的实例中，所述血清提取物为囊泡。
在一些应用的实例中，所述囊泡的提取方法如下：
1)取静脉血4℃离心，3000g4℃离心10min，分离血清；
2)将血清转移至离心管中，4000g4℃离心10min，收集上清液；
3)将上清经5μm过滤器过滤，取滤液；
4)将滤液100,000g4℃离心1h，取原血清1/5体积的HBSS盐溶液重悬得到所述囊泡。
当然，也可以采取其他公知的血清囊泡提取方法得到血清囊泡。
在一些应用的实例中，所述微生物为金黄色葡萄球菌、铜绿假单胞菌、表皮葡萄球菌和大肠杆菌中的至少一种。还可以是其他致病菌。
在一些应用的实例中，所述微生物菌液使用的溶液为添加有防冻剂的水性溶液，优选的防冻剂为10～20v/v％DMSO。防冻剂的作用在于保证微生物在低温保存备用时不会因为菌液冻结而死亡。
在一些应用的实例中，所述微生物菌液中，单一微生物的浓度为(2～9)×108CFU/mL，优选为(2～3)×108CFU/mL。
在一些应用的实例中，所述试剂盒还包括粒径计数板和血清提取试剂中的至少一种。
在一些应用的实例中，所述粒径计数板具有边长为3～5μm的正方形网格。优选为3μm的正方形网格。这样有利于快速确定凝集块的大小。
在一些应用的实例中，所述血清提取试剂为囊泡提取试剂。
下面结合实验，进一步说明本发明的技术方案。
菌液的制备：
将金黄色葡萄球菌和铜绿假单胞菌菌液分别悬浮于15％v/v的DMSO液中，细菌的浓度为3×108CFU/mL。-20℃保存备用。
粒径计数板：为一种含有4个20μl容量凹槽的一体化的载玻片+盖玻片，凹槽底部印有多条纵行和横行线条组成的正方形网格，小方格的边长为3μm。
血清提取物的制备：
1)用无添加处理的采血管采集患者静脉血约2ml，在4℃下3000g离心10分钟，分离血清；
2)将血清转移至离心管中，再次以4000g,4℃离心10分钟，收集上清液；
3)将上清液经5μm过滤器过滤后，取滤液；
4)将滤液在100,000g,4℃离心1小时，弃掉上清，用过滤的1/5原血清体积的HBSS
(Hank's平衡盐溶液)重悬沉淀物，得血清提取物(主要为囊泡)。
检测过程：
吸取上述制备得到的血清提取物20μl，分别滴于分别添加有2μL金黄色葡萄球菌、铜绿假单胞菌、表皮葡球菌和大肠杆菌菌液的粒径计数板的4个凹槽内，将计数板置于37℃反应30分钟，显微镜下手动或自动检查大于3μm凝集块的数目，其中细菌聚集最为明显的，即为病原菌。
Wistar大鼠模型的检测数据
根据囊泡来源，将：
假手术来源定义为Sham组，其来源的囊泡定义为EVs-NS；
金葡菌(S.aureu)感染来源定义为EVs-S.aureu；
铜绿假单胞菌(P.aeruginosa)感染来源定义为EVs-P.aeruginosa；
表皮葡萄球菌(S.epidermidis)感染来源定义为EVs-S.epidermidis；
大肠杆菌(E.coli)感染来源定义为EVs-E.coli。
实验结果如图1～4所示，图中，A1.S.aureu+HBSS共培养，阴性结果；A2.S.aureu+EV-S.aureu，阳性结果；B1.S.epidermidis+HBSS共培养，阴性结果；B2.S.epidermidis+EV-S.epidermidis，阳性结果；C1.E.coli+HBSS共培养，阴性结果；C2.E.coli+EV-E.coli，阳性结果；D1.P.aeruginosa+HBSS共培养，阴性结果；D2.P.aeruginosa+EV-P.aeruginosa，阳性结果。
图5是EVs与细菌共培养的聚集效应统计(聚集体>3μm)。从图中可以看出，不同细菌感染与不同的菌液反应具有不同的聚集结果，提取自感染特定细菌Wistar大鼠的囊泡对相应菌液具有更为显著的聚集反应，与其他菌液基本不发生明显的聚集，具有很好的符合性。可见本发明技术可以方便快速地检测出微生物感染，其检测结果可靠，可以更好地指导临床用药。
Claims (10)
1.微生物菌液在制备对应微生物感染检测试剂盒中的应用，优选的，所述检测通过将微生物菌液与血清囊泡接触反应实现。
2.根据权利要求1所述的应用，其特征在于：所述微生物感染为骨折内固定术后微生物感染。
3.根据权利要求1或2所述的应用，其特征在于：所述试剂盒的检测对象为患者的血清提取物。
4.根据权利要求3所述的应用，其特征在于：所述血清提取物为囊泡。
5.根据权利要求4所述的应用，其特征在于：所述囊泡的提取方法如下：
1)取静脉血4℃离心，3000g4℃离心10min，分离血清；
2)将血清转移至离心管中，4000g4℃离心10min，收集上清液；
3)将上清经5μm过滤器过滤，取滤液；
4)将滤液100,000g4℃离心1h，取原血清1/5体积的HBSS盐溶液重悬得到所述囊泡。
6.根据权利要求1或2所述的应用，其特征在于：所述微生物为金黄色葡萄球菌、铜绿假单胞菌、表皮葡萄球菌和大肠杆菌中的至少一种。
7.根据权利要求1或2所述的应用，其特征在于：所述微生物菌液使用的溶液为添加有防冻剂的水性溶液，优选的防冻剂为10～20v/v％DMSO。
8.根据权利要求1或2所述的应用，其特征在于：所述微生物菌液中，单一微生物的浓度为(2～9)×108CFU/mL，优选为(2～3)×108CFU/mL。
9.根据权利要求1或2所述的应用，其特征在于：所述试剂盒还包括：粒径计数板和血清提取试剂中的至少一种。
10.根据权利要求9所述的应用，其特征在于：
所述粒径计数板具有边长为3～5μm的正方形网格；
所述血清提取试剂为囊泡提取试剂。
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Legal Events
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| PB01 | Publication | ||
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| GR01 | Patent grant | ||
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