CN110938642B

CN110938642B - 靶向CD123-BBz-IL1RN的嵌合抗原受体

Info

Publication number: CN110938642B
Application number: CN201811119865.4A
Authority: CN
Inventors: 刘雅容; 邹雪梅
Original assignee: Shanghai Hengrun Dasheng Biotechnology Co ltd
Current assignee: Shanghai Hengrun Dasheng Biotechnology Co ltd
Priority date: 2018-09-25
Filing date: 2018-09-25
Publication date: 2023-08-29
Anticipated expiration: 2038-09-25
Also published as: CN110938642A

Abstract

本发明涉及靶向CD123的嵌合抗原受体及其用途。具体而言，本发明提供一种多核苷酸序列，选自：(1)含有依次连接的抗CD123单链抗体的编码序列、人CD8α铰链区的编码序列、人CD8跨膜区的编码序列、人41BB胞内区的编码序列、人CD3ζ胞内区的编码序列和IL‑1RN编码序列的多核苷酸序列；和(2)(1)所述多核苷酸序列的互补序列。本发明还提供相关的融合蛋白、含所述编码序列的载体，以及所述融合蛋白、编码序列、载体的用途。本发明制备的CART细胞体外功能好，能够有效的抑制细胞因子风暴的发生。

Description

靶向CD123-BBz-IL1RN的嵌合抗原受体

技术领域

本发明属于嵌合抗原受体领域，具体涉及靶向CD123的嵌合抗原受体及其用途。

背景技术

急性髓系白血病是一类严重威胁人类健康的血液***恶性肿瘤。目前除急性早幼粒细胞白血病以外的AML疗效均不容乐观，预后大多不良。传统的化疗药物无法从根本上解决复发和耐药的巨大难题，而造血干细胞移植费用高昂，风险很大，且移植后也有复发的可能，因此急需深入探讨AML发生、发展、复发及耐药的机制，研发新的治疗药物以改善疗效。

美国Jordan等对急性髓系白血病(AML)干细胞的研究表明，CD123是该种细胞特异性抗原，这一发现为彻底治疗AML提供了新的思路(Leukemia 2000，14∶1777)。CD123是IL-3受体的α链的跨膜片段，主要表达在急性髓系白血病细胞中(Targeting myeloid leukemiastem cells，Sci Transl Med.，2010；2(31):31ps21)，同时也表达在正常的造血干细胞中，在功能上与造血干细胞的分化相关(Humanhemato-lymphoid system mice:current useand future potential for medicine，Annu Rev Immunol，2013；31:635-674)；有研究表明用CD123抗体治疗急性髓系白血病具有比较好的耐受，CD123-CART的临床前实验也表明其对造血干细胞没有明显的毒性(T cells expressing CD123-specific chimericantigen receptors exhibitspecific cytolytic effector functions and antitumoreffects againshuman acute myeloid leukemia.Blood.2013；122(18):3138-3148)；CD123是白细胞介素3受体α链，能特异识别并结合白细胞介素3。IL-3主要由受到抗原剌激而被活化的辅助T细胞产生，可促进细胞的生长和增殖。它与肿瘤、过敏性炎症、自身免疫性疾病的发生有关。CD123在大多数AML患者原始白血病细胞中表达。

嵌合抗原受体(Chimeric Antigen Receptor-T cell，CAR-T)T细胞是指经基因修饰后，能以MHC非限制性方式识别特定目的抗原，并且持续活化扩增的T细胞。2012年国际细胞治疗协会年会中指出生物免疫细胞治疗已经成为手术、放疗、化疗外的第四种***的手段，并将成为未来肿瘤治疗必选手段。CAR-T细胞回输治疗是当前肿瘤治疗中最明确有效的免疫治疗形式。大量研究表明，CAR-T细胞可以有效的识别肿瘤抗原，引起特异性的抗肿瘤免疫应答，显著改善患者的生存状况。

嵌合抗原受体(CAR)是CAR-T的核心部件，赋予T细胞HLA非依赖的方式识别肿瘤抗原的能力，这使得经过CAR改造的T细胞相较于天然T细胞表面受体TCR能够识别更广泛的目标。CAR的基础设计中包括一个肿瘤相关抗原(tumor-associated antigen，TAA)结合区(通常来源于单克隆抗体抗原结合区域的scFV段)，一个胞外铰链区，一个跨膜区和一个胞内信号区。目标抗原的选择对于CAR的特异性、有效性以及基因改造T细胞自身的安全性来讲都是关键的决定因素。

随着嵌合抗原受体T细胞(Chimeric Antigen Receptor-T cell，CAR-T)技术的不断发展，目前CAR-T主要可划分为四代。

第一代CAR-T细胞由胞外结合区-单链抗体(single chain fragment variable，scFV)、跨膜区(transmembrane region，TM)和胞内信号区-免疫受体酪氨酸活化基序(immunoreceptor tyrosine based activation motif，ITAM)组成，其中嵌合抗原受体各部分按如下形式连接：scFv-TM-CD3ζ。第一代CAR虽然能够看到一些特异性的细胞毒性，但2006年对其进行临床试验总结的时候却发现疗效差强人意。究其原因是因为第一代CAR-T细胞在病人体内很快就会耗竭，其持久性很差，以至于CAR-T细胞还没有来得及接触到大量的肿瘤细胞时就已经凋亡了该种CAR-T细胞可以激发抗肿瘤的细胞毒性效应，但是细胞因子分泌比较少，但其在体内的存活期较短不能激发持久的抗肿瘤效应〔Chimeric NKG2D-modified T cells inhibit systemic T-cell lymphoma growth in a mannerinvolving multiple cytokines and cytotoxic pathways.Cancer Res.2007，67(22)：11029-11036.〕。

第二代CAR-T细胞优化CAR设计中T细胞活化信号区仍然是研究的热点。T细胞的完全活化有赖于双信号和细胞因子的作用。其中第一信号为特异性信号，由TCR识别抗原递呈细胞表面的抗原肽-MHC复合物所启动；第二信号为协同刺激信号。早在1998年就出现了第二代CAR(Finney HM等，J Immunol.1998；161(6)：2791-7)。第2代CAR在胞内信号肽区添加了一个协同刺激分子，即把协同刺激信号组装到CAR里面，能够更好的为CAR-T细胞提供活化信号，这样CAR识别肿瘤细胞后能够同时活化协同刺激分子和胞内信号，实现双重活化，能明显提高T细胞增殖分泌能力和抗肿瘤效应。第一个被详细研究的T细胞共刺激信号受体是CD28，它能够与靶细胞表面的B7家族成员结合。CD28的共刺激能够促进T细胞的增殖，IL-2的合成和表达以及增强T细胞抵抗凋亡的能力。随后又出现了CD134(OX40)和41BB(4-1BB)等共刺激分子，以提高T细胞的细胞毒性、增殖活性，维持T细胞应答，延长T细胞存活时间等。这样的第二代CAR在随后的临床试验中产生了意想不到的效果，从2010年起基于第二代CAR的临床报道屡次引发震动，特别是对于复发性、难治性的ALL病人，其完全缓解率高达90％以上。

第三代CAR信号肽区整合2个以上的协同刺激分子，可使T细胞持续活化增殖，细胞因子持续分泌，T细胞杀伤肿瘤细胞的能力更加显著，即新一代的CAR可获得更强的抗肿瘤应答。最典型的就是U Pen Carl June在CD28刺激因子的作用下又加了一个41BB的刺激因子。

***的CAR-T细胞则加入了细胞因子或共刺激配体，例如四代CAR可以产生IL-12，其能够调节免疫微环境-增加T细胞的激活，同时激活固有免疫细胞使其发挥作用来清除靶抗原阴性的癌细胞，从而达到双向调节的作用〔Chmielewski M，Abken H.TRUCKs：thefourth generation of CARs.Expert Opin Biol Ther.2015；15(8)：1145-54〕。

尽管CD123表达于某些正常造血干细胞，在大多数的AML细胞表面高表达，因此，CD123作为AML潜在治疗靶点，正越来越引起人们的关注。Saar Gill 等(Preclinicaltargeting of human acute myeloid leukemia and myeloablation using chimericantigen receptor–modified T cells.Blood.2014Apr 10；123(15):2343-54)使用慢病毒***构建抗CD123-41BB-CD3ζCAR T细胞，此CAR T细胞具备体内外特异性抗AML能力同时，能够引发机体针对AML的免疫记忆，并于再接种小鼠内产生相应应答。同时，他们发现所构建细胞对正常造血细胞具有一定毒性，这可能限制CD123靶向制剂的临床应用。此外，基于CD123设计的抗体正不断被设计并进入临床试验，其中一种策略是通过化学法将抗CD123单抗与CD3单抗交联形成双特异性抗体，此种抗体一方面通过抗CD123单抗封闭细胞表面CD123表位，另一方面通过抗体另一头CD3连接T细胞，介导体内T细胞对AML细胞的杀伤。Al-Hussaini M等设计了CD3-CD123双亲和性抗体，发现此抗体能够在体内外促进T细胞增殖、激活，并在体内外呈现剂量依赖性AML细胞杀伤功能(Targeting CD123in acute myeloidleukemia using a T cell directed dual affinity retargetingplatform.Blood.2016Jan 7；127(1):122-31.)。研究利用抗体可变区制得重组毒素，丧失了利用抗体恒定区与免疫细胞Fc受体间的交联作用介导免疫杀伤效应来靶向治疗AML的可能(Monoclonalantibody-mediated targeting of CD123,IL-3receptor alpha chain,eliminates human acute myeloid leukemic stem cells.Cell Stem Cell.2009；5:3 1-42.)。抗体恒定区与免疫细胞Fc受体间的交联不仅能通过ADCC、CDC等先天免疫效应杀伤肿瘤细胞，还能通过交叉呈递作用活化CD8+的细胞毒T细胞，发挥后天免疫抗肿瘤作用。利用先天和后天抗肿瘤免疫机制，逆转肿瘤免疫耐受，建立免疫记忆效应，根除AML微小残留病灶，阻断疾病复发，才有可能根治AML。此外，抗CD123CAR T细胞也已被应用于包括AML在内的临床试验中，值得注意的是，在造血干细胞移植后，第二次病毒(包括EBV，adv等)感染是HSCT后死亡的重要原因，Li Zhou等首先使用EBV、adv、CMV相关肽段冲击DC后与抗CD123CART细胞共孵育后构建抗CD123CARVST细胞，这种抗CD123CAR VST细胞除能特异性杀伤CD123+AML细胞，也特异性识别EBV、Adv、CMV表位，并特异性杀伤经这些病毒感染的细胞(CD123redirected multiple virus-specific T cells for acute myeloidleukemia.Leuk Res.2016Feb；41:76-84)。

CAR-T疗法中的细胞因子风暴一直是该热门癌症治疗方法的安全隐患。最近，两个来自美国和意大利的研究团队分别提出了避免CAR-T细胞疗法治疗白血病患者过程中出现细胞因子风暴(CRS)的新方法。两项研究都把CRS的关键因子锁定在IL-1上。来自意大利圣拉菲尔医院-圣拉菲尔科学研究所和MSKCC(Memorial Sloan Kettering癌症中心)的两个研究团队的两项独立试验均证明了：CRS是由炎性分子IL-1引发的，在治疗方案中加入抑制IL-1的阿那白滞素(IL-1抑制剂阿那白滞素anakinra)能够有效控制CRS和神经毒性。Anakinra(抑制IL-1)消除神经毒性，tocilizumab(抑制IL-6)不能消除神经毒性(Monocyte-derived IL-1and IL-6are differentially required for cytokine-release syndrome and neurotoxicity due to CAR T cells.Nat Med.28May 2018)。另外，MSKCC的研究人员还设计了能够产生和分泌IL-1活性阻断剂的CAR-T细胞，以此预防而非治疗CRS(CAR T cell–induced cytokine release syndrome is mediated bymacrophages and abated by IL-1blockade.Nat Med.28May 2018)。

巨噬细胞需要一个被称为IL-1的分子来完成他们的工作，因此阻断这种分子能够提供抑制巨噬细胞活性，从而抑制CRS的方式。Giavridis表示，医生可以通过两种方法阻止IL-1：为病人提供称为IL-1阻滞剂的药物，这些药物很容易获得，安全且已获得FDA批准。他指出，这是医生可能首先尝试的，目前，MSK的医疗团队已经准备在临床上测试阻断IL-1对CRS的影响。第二种方法是设计能够产生和分泌IL-1活性阻断剂的CAR-T细胞，这是一种更高科技的方法，从长远来看，可能会有更多的吸引力。

本发明为了解决细胞因子风暴，靶向CD123CART细胞上设计能够产生和分泌IL-1活性阻断剂的CAR-T细胞。此CD123-BBz-IL1RN具有很好的功能，为接下来临床转化奠定了基础。

发明内容

本发明第一方面提供一种多核苷酸序列，所述多核苷酸序列选自：

(1)含有依次连接的抗CD123单链抗体的编码序列、人CD8α铰链区的编码序列、人CD8跨膜区的编码序列、人41BB胞内区的编码序列、人CD3ζ胞内区的编码序列和IL-1RN的编码序列的多核苷酸序列(2)(1)所述多核苷酸序列的互补序列。

在一个或多个实施方案中，在所述抗CD123单链抗体的编码序列前的所述信号肽的编码序列如SEQ ID NO:1第1-69位核苷酸序列所示。在一个或多个实施方案中，所述抗CD123单链抗体的轻链可变区的编码序列如SEQ ID NO:1第70-402位核苷酸序列所示。在一个或多个实施方案中，所述抗CD123单链抗体的重链可变区的编码序列如SEQ ID NO:1第448-801位核苷酸序列所示。在一个或多个实施方案中，所述人CD8α铰链区的编码序列如SEQ ID NO:1第802-942位核苷酸序列所示。在一个或多个实施方案中，所述人CD8跨膜区的编码序列如SEQ ID NO:1第943-1008位核苷酸序列所示。在一个或多个实施方案中，所述人41BB胞内区的编码序列如SEQ ID NO:1第1009-1152位核苷酸序列所示。在一个或多个实施方案中，所述人CD3ζ胞内区的编码序列如SEQ ID NO:1第1153-1485位核苷酸序列所示。在一个或多个实施方案中，连接所述GM-CSF受体α链信号肽与所述人CD3ζ胞内区的所述接头序列的编码序列如SEQ ID NO:1第1486-1563位核苷酸序列所示。在一个或多个实施方案中，所述IL-1RN的片段的编码序列如SEQ ID NO:1第1486-2019位核苷酸序列所示。

本发明第二方面提供一种融合蛋白，所述融合蛋白选自：

(1)含有依次连接的抗CD123单链抗体、人CD8α铰链区、人CD8跨膜区、人41BB胞内区和人CD3ζ胞内区的融合蛋白和IL-1RN的编码序列；和

(2)在(1)限定的氨基酸序列中经过取代、缺失或添加一个或几个氨基酸且保留活化T细胞活性的由(1)衍生的融合蛋白；

优选地，所述抗CD123单链抗体为抗CD123单克隆抗体32716。

在一个或多个实施方案中，所述多核苷酸序列在所述抗CD123单链抗体的编码序列前还含有信号肽的编码序列。在一个或多个实施方案中，所述信号肽的氨基酸序列如SEQID NO:2第1-23位氨基酸所示。在一个或多个实施方案中，所述抗CD123单链抗体的轻链可变区的氨基酸序列如SEQ ID NO:2第24-134位氨基酸所示。在一个或多个实施方案中，所述抗CD123单链抗体的重链可变区的氨基酸序列如SEQ ID NO:2第150-267位氨基酸所示。在一个或多个实施方案中，所述人CD8α铰链区的氨基酸序列如SEQ ID NO:2第268-314位氨基酸所示。在一个或多个实施方案中，所述人CD8跨膜区的氨基酸序列如SEQ ID NO:2第315-336位氨基酸所示。在一个或多个实施方案中，所述人41BB胞内区的氨基酸序列如SEQ IDNO:2第337-384位氨基酸所示。在一个或多个实施方案中，所述人CD3ζ胞内区的氨基酸序列如SEQ ID NO:2第385-495位氨基酸所示。在一个或多个实施方案中，所述IL-1RN的氨基酸序列如SEQ ID NO:2第496-672位氨基酸所示。

本发明第三方面提供一种核酸构建物，所述核酸构建物含有本文所述的多核苷酸序列。

在一个或多个实施方案中，所述核酸构建物为载体。在一个或多个实施方案中，所述核酸构建物为逆转录病毒载体，含有复制起始位点，3’LTR，5’LTR，本文所述的多核苷酸序列，以及任选的可选择的标记。

本发明第四方面提供一种逆转录病毒，所述逆转录病毒含有本文所述的核酸构建物，优选含有所述载体，更优选含有所述逆转录病毒载体。

本发明第五方面提供一种基因修饰的T细胞，所述细胞含有本文所述的多核苷酸序列，或含有本文所述的核酸构建物，或感染了本文所述的逆转录病毒，或稳定表达本文所述的融合蛋白。

本发明第六方面提供一种含本文所述的基因修饰的T细胞的药物组合物。

本发明第七方面提供本文所述的多核苷酸序列、融合蛋白、核酸构建物或逆转录病毒在制备活化的T细胞中的应用。

本发明第八方面提供本文所述的多核苷酸序列、融合蛋白、核酸构建物、逆转录病毒、或基因修饰的T细胞或其药物组合物在制备治疗CD123介导的疾病的药物中的用途。

在一个或多个实施方案中，所述CD123介导的疾病为为急性髓系白血病。

附图说明

图1为CD123-BBz-IL1RN CAR逆转录病毒表达载体(CD123-BBz-IL1RN)示意图。

图2为流式细胞仪显示逆转录病毒感染T细胞72小时的CD123-BBz-IL1RNCAR+表达效率。

图3为流式细胞仪显示靶细胞CD123表达。

图4为制备5天的CD123-BBz-IL1RN-CART细胞与靶细胞共培养5小时CD107a表达。

图5为制备5天的CD123-BBz-IL1RN-CART细胞与靶细胞共培养5小时INF-γ的分泌。

图6为制备5天的CD123-BBz-IL1RN-CART细胞与靶细胞共培养20小时后对肿瘤细胞的杀伤作用。

具体实施方式

本发明提供一种靶向CD123的嵌合抗原受体(CAR)。该CAR含有依次连接的抗CD123单链抗体、人CD8α铰链区、人CD8跨膜区、人41BB胞内区、人CD3ζ胞内区和IL1RN的片段。

适用于本发明的抗CD123单链抗体可衍生自本领域周知的各种抗CD123单克隆抗体。

任选地，所述轻链可变区和重链可变区可通过接头序列连接在一起。可举例的这类单链抗体包括但不限于26292,32701。在某些实施方案中，所述单克隆抗体是克隆号为32176的单克隆抗体。在某些实施方案中，所述抗CD123单链抗体的轻链可变区的氨基酸序列如SEQ ID NO:2的第24-134位氨基酸残基所示。在其它实施方案中，所述抗CD123单链抗体的重链可变区的氨基酸序列如SEQ IDNO:2的第150-267位氨基酸残基所示。

适用于本发明的人CD8α铰链区的氨基酸序列可如SEQ ID NO:2第268-314位氨基酸所示。

适用于本发明的人CD8跨膜区可以是本领域常用于CAR的各种人CD8跨膜区序列。在某些实施方案中，所述人CD8跨膜区的氨基酸序列如SEQ ID NO:2第315-336位氨基酸所示。

适用于本发明的41BB可以是本领域已知的各种用于CAR的41BB。作为示范性例子，本发明使用SEQ ID NO:2第337-384位氨基酸序列所示的41BB。

适用于本发明的人CD3ζ胞内区可以是本领域常规用于CAR的各种人CD3ζ胞内区。在某些实施方案中，所述人CD3ζ胞内区的氨基酸序列如SEQ ID NO:2第385-495位氨基酸所示。

形成本发明的融合蛋白的上述各部分，如抗CD123单链抗体的轻链可变区和重链可变区、人CD8α铰链区、人CD8跨膜区、41BB和人CD3ζ胞内区等，相互之间可直接连接，或者可通过接头序列连接。接头序列可以是本领域周知的适用于抗体的接头序列，例如含G和S的接头序列。通常，接头含有一个或多个前后重复的基序。例如，该基序可以是GGGS、GGGGS、SSSSG、GSGSA和GGSGG。优选地，该基序在接头序列中是相邻的，在重复之间没有***氨基酸残基。接头序列可以包含1、2、3、4或5个重复基序组成。接头的长度可以是3～25个氨基酸残基，例如3～15、5～15、10～20个氨基酸残基。在某些实施方案中，接头序列是多甘氨酸接头序列。接头序列中甘氨酸的数量无特别限制，通常为2～20个，例如2～15、2～10、2～8个。除甘氨酸和丝氨酸来，接头中还可含有其它已知的氨基酸残基，例如丙氨酸(A)、亮氨酸(L)、苏氨酸(T)、谷氨酸(E)、苯丙氨酸(F)、精氨酸(R)、谷氨酰胺(Q)等。在某些实施方案中，本发明抗CD123单链抗体的轻链可变区和重链可变区之间由(GGGGS)_n连接，其中n为1～5的整数。

在某些实施方案中，本发明CAR的氨基酸序列如SEQ ID NO:2第24-495位氨基酸所示或如SEQ ID NO:2第1-495位氨基酸所示。

应理解，在基因克隆操作中，常常需要设计合适的酶切位点，这势必在所表达的氨基酸序列末端引入了一个或多个不相干的残基，而这并不影响目的序列的活性。为了构建融合蛋白、促进重组蛋白的表达、获得自动分泌到宿主细胞外的重组蛋白、或利于重组蛋白的纯化，常常需要将一些氨基酸添加至重组蛋白的N-末端、C-末端或该蛋白内的其它合适区域内，例如，包括但不限于，适合的接头肽、信号肽、前导肽、末端延伸等。因此，本发明的融合蛋白(即所述CAR)的氨基端或羧基端还可含有一个或多个多肽片段，作为蛋白标签。任何合适的标签都可以用于本文。例如，所述的标签可以是FLAG，HA，HA1，c-Myc，Poly-His，Poly-Arg，Strep-TagII，AU1，EE，T7，4A6，ε，B，gE以及Ty1。这些标签可用于对蛋白进行纯化。

本发明也包括SEQ ID NO:2第24-495位氨基酸序列所示的CAR、SEQ ID NO:2第24-878位氨基酸序列所示的CAR、SEQ ID NO:2第1-495位氨基酸序列所示的CAR或SEQ ID NO:2所示的CAR的突变体。这些突变体包括：与该CAR具有至少80％，优选至少85％，优选至少90％，优选至少95％，优选至少97％的序列相同性并保留该CAR的生物学活性(如活化T细胞)的氨基酸序列。可采用例如NCBI的BLASTp计算两条比对的序列之间的序列相同性。

突变体还包括：在SEQ ID NO:2第24-495位所示的氨基酸序列、SEQ ID NO:2第24-878位所示的氨基酸序列、SEQ ID NO:2第1-495位所示的氨基酸序列或SEQ ID NO:2所示的氨基酸序列中具有一个或数个突变(***、缺失或取代)、同时仍保留该CAR的生物学活性的氨基酸序列。所述数个突变通常指1－10个以内，例如1－8个、1－5个或1－3个。取代优选是保守性取代。例如，在本领域中，用性能相近或相似的氨基酸进行保守性取代时，通常不会改变蛋白质或多肽的功能。“性能相近或相似的氨基酸”包括例如，具有相似侧链的氨基酸残基的家族，这些家族包括具有碱性侧链的氨基酸(例如赖氨酸、精氨酸、组氨酸)、具有酸性侧链的氨基酸(例如天冬氨酸、谷氨酸)、具有不带电荷的极性侧链的氨基酸(例如甘氨酸、天冬酰胺、谷氨酰胺、丝氨酸、苏氨酸、酪氨酸、半胱氨酸)、具有非极性侧链的氨基酸(例如丙氨酸、缬氨酸、亮氨酸、异亮氨酸脯氨酸、苯丙氨酸、甲硫氨酸、色氨酸)、具有β-分支侧链的氨基酸(例如苏氨酸、缬氨酸、异亮氨酸)和具有芳香侧链的氨基酸(例如酪氨酸、苯丙氨酸、色氨酸、组氨酸)。因此，在本发明多肽中用来自同一侧链类的另一氨基酸残基替换一个或几个位点，将不会在实质上影响其活性。

本发明包括编码本发明融合蛋白的多核苷酸序列。本发明的多核苷酸序列可以是DNA形式或RNA形式。DNA形式包括cDNA、基因组DNA或人工合成的DNA。DNA可以是单链的或是双链的。DNA可以是编码链或非编码链。本发明也包括编码融合蛋白的多核苷酸序列的简并变异体，即编码相同的氨基酸序列但核苷酸序列有所不同的核苷酸序列。

本文所述的多核苷酸序列通常可以用PCR扩增法获得。具体而言，可根据本文所公开的核苷酸序列，尤其是开放阅读框序列来设计引物，并用市售的cDNA库或按本领域技术人员已知的常规方法所制备的cDNA库作为模板，扩增而得有关序列。当序列较长时，常常需要进行两次或多次PCR扩增，然后再将各次扩增出的片段按正确次序拼接在一起。例如，在某些实施方案中，编码本文所述融合蛋白的多核苷酸序列如SEQ ID NO:1第69－1485位核苷酸所示，或如SEQ ID NO:1第1-1485位核苷酸所示。

本发明也涉及核酸构建物，该核酸构建物含有本文所述的多核苷酸序列，以及与这些序列操作性连接的一个或多个调控序列。本发明所述的多核苷酸序列可以多种方式***作以保证所述融合蛋白(CAR)的表达。在将核酸构建物***载体之前可根据表达载体的不同或要求而对核酸构建物进行操作。利用重组DNA方法来改变多核苷酸序列的技术是本领域已知的。

调控序列可以是合适的启动子序列。启动子序列通常与待表达蛋白的编码序列操作性连接。启动子可以是在所选择的宿主细胞中显示转录活性的任何核苷酸序列，包括突变的、截短的和杂合启动子，并且可以从编码与该宿主细胞同源或异源的胞外或胞内多肽的基因获得。调控序列也可以是合适的转录终止子序列，由宿主细胞识别以终止转录的序列。终止子序列与编码该多肽的核苷酸序列的3’末端操作性连接。在选择的宿主细胞中有功能的任何终止子都可用于本发明。调控序列也可以是合适的前导序列，对宿主细胞翻译重要的mRNA的非翻译区。前导序列与编码该多肽的核苷酸序列的5′末端可操作连接。在选择的宿主细胞中有功能的任何终止子都可用于本发明。

在某些实施方案中，所述核酸构建物是载体。通常通过可操作地连接本发明的多核苷酸序列至启动子，并将构建体并入表达载体，实现本发明多核苷酸序列的表达。该载体对于复制和整合真核细胞可为合适的。典型的克隆载体包含可用于调节期望核酸序列表达的转录和翻译终止子、起始序列和启动子。

本发明的多核苷酸序列可被克隆入许多类型的载体。例如，可被克隆入质粒、噬菌粒、噬菌体衍生物、动物病毒和粘粒。进一步地，载体是表达载体。表达载体可以以病毒载体形式提供给细胞。病毒载体技术在本领域中是公知的并在例如Sambrook等(2001，Molecular Cloning:A Laboratory Manual，Cold Spring Harbor Laboratory，New York)和其他病毒学和分子生物学手册中进行了描述。可用作载体的病毒包括但不限于逆转录病毒、腺病毒、腺伴随病毒、疱疹病毒和慢病毒。

通常，合适的载体包含在至少一种有机体中起作用的复制起点、启动子序列、方便的限制酶位点和一个或多个可选择的标记(例如，WO 01/96584；WO01/29058；和美国专利号6,326,193)。

例如，在某些实施方案中，本发明使用逆转录病毒载体，该逆转录病毒载体含有复制起始位点，3’LTR，5’LTR，本文所述的多核苷酸序列，以及任选的可选择的标记。

合适的启动子的一个例子为即时早期巨细胞病毒(CMV)启动子序列。该启动子序列是能够驱动可操作地连接至其上的任何多核苷酸序列高水平表达的强组成型启动子序列。合适的启动子的另一个例子为延伸生长因子-1α(EF-1α)。然而，也可使用其他组成型启动子序列，包括但不限于类人猿病毒40(SV40)早期启动子、小鼠乳癌病毒(MMTV)、人免疫缺陷病毒(HIV)长末端重复(LTR)启动子、MoMuLV启动子、鸟类白血病病毒启动子、EB病毒即时早期启动子、鲁斯氏肉瘤病毒启动子、以及人基因启动子，诸如但不限于肌动蛋白启动子、肌球蛋白启动子、血红素启动子和肌酸激酶启动子。进一步地，也可考虑使用诱导型启动子。诱导型启动子的使用提供了分子开关，其能够在期限表达时打开可操作地连接诱导型启动子的多核苷酸序列的表达，而在当表达是不期望的时关闭表达。诱导型启动子的例子包括但不限于金属硫蛋白启动子、糖皮质激素启动子、孕酮启动子和四环素启动子。

为了评估CAR多肽或其部分的表达，被引入细胞的表达载体也可包含可选择的标记基因或报道基因中的任一个或两者，以便于从通过病毒载体寻求被转染或感染的细胞群中鉴定和选择表达细胞。在其他方面，可选择的标记可被携带在单独一段DNA上并用于共转染程序。可选择的标记和报道基因两者的侧翼都可具有适当的调节序列，以便能够在宿主细胞中表达。有用的可选择标记包括例如抗生素抗性基因，诸如neo等等。

报道基因用于鉴定潜在转染的细胞并用于评价调节序列的功能性。在DNA已经被引入受体细胞后，报道基因的表达在合适的时间下进行测定。合适的报道基因可包括编码荧光素酶、β-半乳糖苷酶、氯霉素乙酰转移酶、分泌型碱性磷酸酶或绿色萤光蛋白基因的基因。合适的表达***是公知的并可利用已知技术制备或从商业上获得。

将基因引入细胞和将基因表达入细胞的方法在本领域中是已知的。载体可通过在本领域中的任何方法容易地引入宿主细胞，例如，哺乳动物、细菌、酵母或昆虫细胞。例如，表达载体可通过物理、化学或生物学手段转移入宿主细胞。

将多核苷酸引入宿主细胞的物理方法包括磷酸钙沉淀、脂质转染法、粒子轰击、微注射、电穿孔等等。将感兴趣的多核苷酸引入宿主细胞的生物学方法包括使用DNA和RNA载体。将多核苷酸引入宿主细胞的化学手段包括胶体分散***，诸如大分子复合物、纳米胶囊、微球、珠；和基于脂质的***，包括水包油乳剂、胶束、混合胶束和脂质体。

将多核苷酸引入宿主细胞的生物学方法包括使用病毒载体，特别是逆转录病毒载体，这已经成为最广泛使用的将基因***哺乳动物例如人细胞的方法。其他病毒载体可源自慢病毒、痘病毒、单纯疱疹病毒I、腺病毒和腺伴随病毒等等。已经开发了许多基于病毒的***，用于将基因转移入哺乳动物细胞。例如，逆转录病毒提供了用于基因传递***的方便的平台。可利用本领域中已知的技术将选择的基因***载体并包装入逆转录病毒颗粒。该重组病毒可随后被分离和传递至体内或离体的对象细胞。许多反转录病毒***在本领域中是已知的。在一些实施方案中，使用腺病毒载体。许多腺病毒载体在本领域中是已知的。在一个实施方案中，使用慢病毒载体。

因此，在某些实施方案中，本发明还提供用于活化T细胞的逆转录病毒，该病毒含有本文所述的逆转录病毒载体以及相应的包装基因，如gag、pol和vsvg。

适用于本发明的T细胞可以是各种来源的各种类型的T细胞。例如，T细胞可来源于B细胞恶性肿瘤患者的PBMC。

在某些实施方案中，获得T细胞后，可先用适量的(例如30～80ng/ml，如50ng/ml)的CD3抗体刺激活化，然后在含有适量的(例如30～80IU/ml，如50IU/ml)的IL2培养基进行培养备用。

因此，在某些实施方案中，本发明提供一种基因修饰的T细胞，该基因修饰的T细胞含有本文所述的多核苷酸序列，或含有本文所述的逆转录病毒载体，或感染了本文所述的逆转录病毒，或采用本文所述的方法制备得到，或稳定表达本文所述的融合蛋白。

本发明的CAR-T细胞可经历稳固的体内T细胞扩展并在血液和骨髓中以高水平持续延长的时间量，并形成特异性记忆T细胞。不希望被任何具体的理论所束缚，在遇到并随后消除表达替代抗原的靶细胞后，本发明的CAR-T细胞可体内分化成中心记忆样状态。

本发明还包括一类细胞疗法，其中T细胞被基因修饰以表达本文所述的CAR，和CAR-T细胞被注入需要其的接受者中。注入的细胞能够杀死接受者的肿瘤细胞。不像抗体疗法，CAR-T细胞能够体内复制，产生可导致持续肿瘤控制的长期持久性。

由CAR-T细胞引起的抗肿瘤免疫应答可为主动或被动免疫应答。另外，CAR介导的免疫应答可为过继免疫疗法步骤的一部分，其中CAR-T细胞诱导对CAR中的抗原结合部分特异性的免疫应答。

因此，可采用本发明的CAR、其编码序列、核酸构建物、表达载体、病毒以及CAR-T细胞治疗的疾病优选为CD123介导的疾病。

本发明的CAR-修饰的T细胞可被单独施用或作为药物组合物与稀释剂和/或与其他组分诸如相关的细胞因子或细胞群结合施用。简单地说，本发明的药物组合物可包括如本文所述的CAR-T细胞，与一种或多种药学或生理学上可接受载体、稀释剂或赋形剂结合。这样的组合物可包括缓冲液诸如中性缓冲盐水、硫酸盐缓冲盐水等等；碳水化合物诸如葡萄糖、甘露糖、蔗糖或葡聚糖、甘露醇；蛋白质；多肽或氨基酸诸如甘氨酸；抗氧化剂；螯合剂诸如EDTA或谷胱甘肽；佐剂(例如，氢氧化铝)；和防腐剂。

本发明的药物组合物可以以适于待治疗(或预防)的疾病的方式施用。施用的数量和频率将由这样的因素确定，如患者的病症、和患者疾病的类型和严重度。

当指出“免疫学上有效量”、“抗肿瘤有效量”、“肿瘤-抑制有效量”或“治疗量”时，待施用的本发明组合物的精确量可由医师确定，其考虑患者(对象)的年龄、重量、肿瘤大小、感染或转移程度和病症的个体差异。可通常指出：包括本文描述的T细胞的药物组合物可以以10⁴至10⁹个细胞/kg体重的剂量，优选10⁵至10⁶个细胞/kg体重的剂量。T细胞组合物也可以以这些剂量多次施用。细胞可通过使用免疫疗法中公知的注入技术(见例如Rosenberg等，New Eng.J.of Med.319:1676，1988)施用。对于具体患者的最佳剂量和治疗方案可通过监测患者的疾病迹象并因此调节治疗由医学领域技术人员容易地确定。

对象组合物的施用可以以任何方便的方式进行，包括通过喷雾法、注射、吞咽、输液、植入或移植。本文描述的组合物可被皮下、皮内、瘤内、结内、脊髓内、肌肉内、通过静脉内注射或腹膜内施用给患者。在一个实施方案中，本发明的T细胞组合物通过皮内或皮下注射被施用给患者。在另一个实施方案中，本发明的T细胞组合物优选通过静脉注射施用。T细胞的组合物可被直接注入肿瘤、***或感染位置。

在本发明的一些实施方案中，本发明的CAR-T细胞或其组合物可与本领域已知的其它疗法结合。所述疗法包括但不限于化疗、放疗和免疫抑制剂。例如，可结合本领域周知的治疗CD123介导的疾病的放疗或化疗制剂进行治疗。

本文中，“抗肿瘤效应”指一种生物学效应，其可由肿瘤体积的减少、肿瘤细胞数的减少、转移数的减少、预期寿命的增加或与癌相关的各种生理症状的改善表示。

“患者”、“对象”、“个体”等等在本文中可交换使用，指可引起免疫应答的活有机体，如哺乳动物。例子包括但不限于人、狗、猫、小鼠、大鼠和其转基因物种。

本发明采用抗CD123抗体(具体是衍生自克隆号32716的scFV)的基因序列，并从NCBI GenBank数据库中搜索到人的CD8α铰链区、人的CD8跨膜区、人的41BB胞内区和人的CD3ζ胞内区基因序列信息，全基因合成嵌合抗原受体抗CD123scFv-CD8铰链区-CD8TM-41BB-CD3ζ-IL1RN的基因片段，***到逆转录病毒载体中。重组质粒在293T细胞中包装病毒，感染T细胞，使T细胞表达该嵌合抗原受体。本发明实现嵌合抗原受体基因修饰的T淋巴细胞的转化方法是基于逆转录病毒转化方法。该方法具有转化效率高，外源基因能够稳定表达，且可以缩短体外培养T淋巴细胞到达临床级数量的时间等优点。在该转基因T淋巴细胞表面，转化的核酸通过转录、翻译表达在其上。本发明制备的CAR-T细胞对特异性肿瘤细胞具强烈的杀伤功能，效靶比是10比1的情况下，杀伤效率超过70％。更进一步地，本发明的CAR还携带IL1RN组件，该组件可以有效的抑制细胞因子风暴的发生。

本发明通过参考以下实验实施例进一步详细地进行描述。这些实施例仅出于说明性的目的提供，并不意欲为限制性的，除非另有规定。因此，本发明决不应被解释为限于以下实施例，而是应被解释为包括由于本文提供的教导变得显而易见的任何和全部的变化。实施例中所用的方法和试剂，除非另有说明，否则为本领域常规的方法和试剂。

实施例中所用的NT细胞为与实施例3相同来源的未转染的T细胞，用作对照细胞。K562细胞来源于ATCC细胞库，为阴性表达CD123的细胞，用作对照细胞。MOLM-13细胞是自身高表达CD123的细胞，来源于ATCC细胞库。Raji-CD123的细胞为本司构建的高表达CD123的细胞。

实施例1：CD123-scFv-CD8α-CD8-41BB-CD3ζ-IL1RN基因序列的确定

从NCBI网站数据库搜索到人CD8α铰链区、人CD8α跨膜区、41BB胞内区和人CD3ζ胞内区、和IL1RN基因序列信息，抗CD123单链抗体克隆号为32716，这些序列在网站http://sg.idtdna.com/site上进行密码子优化，保证在编码氨基酸序列不变的情况下更适合人类细胞表达。

采用重叠PCR将上述序列依次按抗CD123scFv、人CD8α铰链区基因、人CD8α跨膜区基因、41BB胞内区基因、人CD3ζ胞内区基因和和IL1RN基因序列进行连接，在各序列连接处引入不同酶切位点，形成完整的CD123-BBz-IL1RN CAR基因序列信息。

用NotI(NEB)和EcoRI(NEB)双酶切该CAR分子的核苷酸序列，经T4连接酶(NEB)连接***逆转录病毒MSCV(Addgene)的NotI-EcoRI位点，转化到感受态大肠杆菌(DH5α)。

将重组质粒送上海生工生物技术有限公司进行测序，将测序结果与拟合成的CD123-BBz-IL1RN CAR序列比对来验证序列是否正确。测序引物为：

正义：AGCATCGTTCTGTGTTGTCTC(SEQ ID NO:3)；

反义：TGTTTGTCTTGTGGCAATACAC(SEQ ID NO:4)。

经测序正确后，使用Qiagen公司的质粒纯化试剂盒提取并纯化质粒，纯化质粒的质粒磷酸钙法转染293T细胞进行逆转录病毒包装实验。

本实施例所构建得到的质粒图谱如图1所示。

实施例2：逆转录病毒包装

1、第1天：293T细胞应是小于20代，不过分长满的。以0.6×10⁶细胞/ml铺板，10cm皿添加10ml的DMEM培养基，充分混匀细胞，37℃培养过夜；

2、第2天：293T细胞融合度达到90％左右进行转染(通常是铺板14-18h左右)；准备质粒复合物，各种质粒的量为MSCV骨架12.5ug，Gag-pol 10ug，VSVg 6.25ug，CaCl₂ 250ul，H₂O 1ml，总体积为1.25ml；在另一个管里添加跟质粒复合物等体积的HBS，边加质粒复合物边涡旋震荡20s。温柔地将混合物沿着边加入到293T皿中，37℃培养4h，去除培养基，PBS洗一遍，重新加入预热的新鲜培养基。

3、第4天：转染48h后收集上清并用0.45um滤器过滤后分装保存于-80℃，继续添加预热的新鲜DMEM培养基。

实施例3：逆转录病毒感染人的T细胞

1、用Ficcol分离液(天津灏洋)分离获得较纯的CD3+T细胞，用含5％AB血清X-VIVO(LONZA)培养基调整细胞密度为1×10⁶/mL。将细胞以1ml/孔接种到预先用抗人50ng/mlCD3抗体(北京同立海元)和50ng/ml CD28抗体(北京同立海元)，再加入100IU/ml的白细胞介素2(北京双鹭)，刺激培养48小时后用实施例3制备得到的病毒感染；

2、T细胞活化培养后隔天，PBS稀释至终浓度为15μg/ml的Retronectin(Takara)包被非组织处理培养板，24孔板每孔250μl。避光，4℃过夜备用。

3、T细胞活化培养两天后，取出2块包被好的24孔板，吸弃包被液，加入含2％BSA的HBSS室温封闭30min。封闭液体积为每孔500μl，吸弃封闭液，用含2.5％HEPES的HBSS洗板两次。

4、将用实施例3制备得到的病毒液加入孔内，每孔加2ml病毒液，32℃，2000g，离心2h。

5、弃去上清液，24孔板每孔加入活化后的T细胞1×10⁶个，体积1ml，培养基为T细胞培养基中添加IL-2 200IU/ml。30℃，1000g，离心10min。

6、离心完毕后，将培养板置于37℃，5％CO₂培养箱中培养。

7、感染后24h，将细胞悬液吸出，1200rpm，4℃，离心7min。

8、细胞感染后，每天观察细胞的密度，适时补加含IL-2 100IU/ml的T细胞培养液，使T细胞的密度维持在5×10⁵/ml左右，使细胞扩增。

由此获得分别感染了实施例2所示逆转录病毒的CART细胞，分别命名为CD123-BBz-IL1RN CART细胞(表达实施例1的CD123-BBz-IL1RN CAR)。

实施例4：流式细胞仪检测感染后T淋巴细胞的比例及表面CAR蛋白的表达

分别离心收集感染后72小时的实施例4制备得到的CAR-T细胞和NT细胞(对照组)，PBS洗涤1次后弃上清，加入相应的抗体避光30min后PBS洗涤，重悬，最后流式细胞仪检测。CAR+由抗小鼠IgG F(ab')抗体(Jackson Immunoresearch)检测。

图2显示，使用实施例2制备得到的逆转录病毒感染T细胞72小时后，CD123-BBz-IL1RN CAR+的表达效率达84.4％。

实施例5：CAR-T细胞与靶细胞共培养后CD107a表达检测

1.取一块V底96孔板，每孔分别加实施例4制备得到的CART或NT细胞2×10⁵个，以及靶细胞(Raji-CD123和MOLM-13)或对照细胞(K562)2×10⁵个，重悬为100ul不含IL-2的X-VIVO完全培养基，加入BD GolgiStop(含巴西金叶树甙，每1ml培养基中加入1μl BDGolgiStop)，每孔加入2ul CD107a抗体(1:50)，37℃孵育4小时，收集细胞。

2.将样品离心去除培养基，PBS洗细胞一次，400g，4℃离心5分钟。弃上清，每管加入适量特异性表面抗体(CD107a抗体，Biolegend)，重悬体积100ul，冰上避光孵育30分钟。

3.每管用3mL的PBS清洗细胞1次，400g离心5分钟。仔细吸去上清。

4.适量PBS重悬，流式细胞仪检测CD107a。

显示在图4中。图4显示，CD123-BBz-IL1RN CART细胞在CD3阳性的Raji-CD123和MOLM-13细胞中CD107a分泌的百分率分别为64％和44％，CD123-tEGFR细胞在CD3阳性的Raji-CD123和MOLM-13细胞中CD107a分泌的百分率分别为56％和52％。

实施例6：CAR-T细胞与靶细胞共培养后INF-γ分泌检测

1.取制备好的CAR-T细胞，重悬于Lonza培养基中，调整细胞浓度为1×10⁶/mL。

2.实验组每孔含靶细胞(Raji-CD123和MOLM-13)或阴性对照细胞(K562)2×10⁵个，CD123-BBz-IL1RN CAR-T细胞2×10⁵个，200μl不含IL-2的Lonza培养基。充分混匀后加入96孔板中。同时加入BD GolgiPlug(含蛋白转运抑制剂布雷非德菌素A(Brefeldin A))，每1ml细胞培养基中加入1μl BD GolgiPlug)，充分混匀后，37℃孵育5-6小时。收集细胞，作为实验组。

3.每管用1mL的PBS清洗细胞1次，300g离心5分钟。仔细吸去或倒掉上清。

4.PBS洗细胞后，加入250μl/EP管固定/渗透液，4℃孵育20分钟以固定细胞及破膜。用1×BD Perm/Wash^TM缓冲液清洗细胞2次，1mL/次。

5.进行胞内因子染色，取适量IFN-γ细胞因子荧光抗体或阴性对照，用BDPerm/Wash^TM缓冲液稀释至50μl。用此抗体稀释液充分重悬已固定破膜的细胞，4℃避光孵育30min，1×BD Perm/Wash^TM缓冲液1mL/次清洗细胞2次，然后用PBS重悬。

6.流式细胞仪检测。

显示在图5中。图5显示，CD123-BBz-IL1RN CART细胞在CD3阳性的Raji-CD123和MOLM-13细胞中IFN-γ分泌的百分率分别为73％和26％，CD123-tEGFR细胞在CD3阳性的Raji-CD123和MOLM-13细胞中IFN-γ分泌的百分率分别为59％和34％。

实施例7：CAR-T细胞与靶细胞共培养后检测肿瘤特异性细胞杀伤作用

1.K562细胞(不含CD123靶蛋白，为靶细胞的阴性对照细胞)重悬在无血清培养基(1640)中，调整细胞浓度为1×106/ml，加入荧光染料BMQC(2,3,6,7-tetrahydro-9-bromomethyl-1H,5Hquinolizino(9,1-gh)coumarin)至终浓度为5μM。

2.混匀，37℃孵育30min。

3.室温，1500rpm离心5min，弃上清，并重悬细胞于细胞毒性培养基(无酚红1640+5％AB血清)中，37℃孵育60min。

4.新鲜细胞毒性培养基清洗细胞两遍，并重悬在新鲜细胞毒性培养基中，密度1×106/ml。

5.Raji-CD123和MOLM-13细胞(含CD123靶蛋白，为靶细胞)悬浮在含有0.1％BSA的PBS中，调整浓度为1×106/ml。

6.加入荧光染料CFSE(carboxyfluoresceindiacetatesuccinimidyl ester)至终浓度为1μM。

7.混匀，37℃孵育10min。

8.孵育结束后，加入与细胞悬液等体积的FBS，室温孵育2min以终止标记反应。

9.9、清洗细胞并重悬在新鲜细胞毒性培养基中，密度1×106/ml。

10.清洗效应T细胞并悬浮在细胞毒性培养基中，调整浓度为5×106/ml。

11.在所有的实验中，CAR-T细胞的细胞毒性和未感染的阴性对照效应T细胞(NTcell)的细胞毒性做比较，并且这些效应T细胞来自同一个病人。

12.CAR-T和NT，按照效应细胞：靶细胞＝5:1，1:1，的比例，于5ml无菌试验管(BDBiosciences)进行培养，每组设置两复孔。每一个共培养组中，靶细胞为L363细胞50,000个(50μl)，阴性对照细胞为50,000个K562细胞(50μl)。同时设置一组只包含Raji-CD123和MOLM-13靶细胞和K562阴性对照细胞。

13.将共培养细胞置于37℃孵育5h。

14.孵育完成后，PBS清洗细胞，然后立即按照说明书推荐的浓度快速加入7-AAD(7-aminoactinomycin D)，冰上孵育30min。

15.不需清洗，直接进行流式上机检测，数据用Flow Jo进行分析。

16.分析使用7AAD阴性的活细胞设门，测定T细胞和靶细胞共培养后活的Raji-CD123和MOLM-13靶细胞和活的K562阴性对照细胞的比例。

17.对于每一组共培养的T细胞和靶细胞

18.细胞毒性杀伤细胞％＝100-校准的靶细胞存活％，即(无效应细胞时靶细胞数-含效应细胞时靶细胞数)/K562活细胞数的比例。

结果显示在图6中。图6显示，在效靶比为10:1情况下，CD123-BBz-IL1RN CART细胞对靶细胞的杀伤率超过为60％。

Claims

1.一种多核苷酸，所述多核苷酸其序列是含有依次连接的抗CD123单链抗体的编码序列、人CD8α铰链区的编码序列、人CD8跨膜区的编码序列、人41BB胞内区的编码序列、人CD3ζ胞内区的编码序列和IL-1RN的编码序列的多核苷酸序列，

所述抗CD123单链抗体的轻链可变区的编码序列如SEQ ID NO:1第70-402位核苷酸序列所示；

所述抗CD123单链抗体的重链可变区的编码序列如SEQ ID NO:1第448-801位核苷酸序列所示；

所述人CD8α铰链区的编码序列如SEQ ID NO:1第802-942位核苷酸序列所示；

所述人CD8跨膜区的编码序列如SEQ ID NO:1第943-1008位核苷酸序列所示；

所述人41BB胞内区的编码序列如SEQ ID NO:1第1009-1152位核苷酸序列所示；

所述人CD3ζ胞内区的编码序列如SEQ ID NO:1第1153-1485位核苷酸序列所示；

所述IL-1RN的片段的编码序列如SEQ ID NO:1第1486-2019位核苷酸序列所示；

所述抗CD123单链抗体的轻链可变区和重链可变区、人CD8α铰链区、人CD8跨膜区、41BB和人CD3ζ胞内区相互之间直接连接或者通过接头序列连接。

2.如权利要求1所述的多核苷酸，其特征在于，在所述抗CD123单链抗体的编码序列前还有信号肽的编码系列。

3. 如权利要求2所述的多核苷酸，其特征在于，所述信号肽的编码序列如SEQ ID NO:1第1-69位核苷酸序列所示。

4.如权利要求1所述的多核苷酸，其特征在于，所述抗CD123单链抗体为抗CD123单克隆抗体32716。

5.一种核酸构建物，所述核酸构建物含有权利要求1-4中任一项所述的多核苷酸。

6.根据权利要求5所述的核酸构建物，其特征在于，所述核酸构建物为载体。

7.根据权利要求6所述的核酸构建物，其特征在于，所述核酸构建物为逆转录病毒载体，含有复制起始位点，3’LTR，5’LTR。

8.一种逆转录病毒，所述逆转录病毒含有权利要求5-7任一所述的核酸构建物。

9.一种基因修饰的T细胞或含该基因修饰的T细胞的药物组合物，其特征在于，所述细胞含有权利要求1-4中任一项所述的多核苷酸，或含有权利要求5-7任一所述的核酸构建物，或感染了权利要求8所述的逆转录病毒。

10.权利要求1-4中任一项所述的多核苷酸、权利要求5-7任一所述的核酸构建物或权利要求8所述的逆转录病毒在制备活化的T细胞中的应用。

11.权利要求1-4中任一项所述的多核苷酸、权利要求5-7任一所述的核酸构建物、权利要求8所述的逆转录病毒、或权利要求9所述的基因修饰的T细胞或其药物组合物在制备治疗CD123介导的疾病的药物中的用途；所述CD123介导的疾病为急性髓系白血病。