CN110935006B

CN110935006B - 地龙蛋白肽在制备预防和/或治疗血栓性疾病的药物中的应用

Info

Publication number: CN110935006B
Application number: CN201911098946.5A
Authority: CN
Inventors: 张九勋; 张学军; 田明展; 张西平; 魏玮
Original assignee: ZHONGSHI DUQING (SHANDONG) BIOTECH CO Ltd
Current assignee: ZHONGSHI DUQING (SHANDONG) BIOTECH CO Ltd
Priority date: 2019-11-12
Filing date: 2019-11-12
Publication date: 2021-05-18
Anticipated expiration: 2039-11-12
Also published as: US11141454B2; CN110935006A; US20210138022A1

Abstract

地龙蛋白肽在制备预防和/或治疗血栓性疾病的药物中的应用，属于心脑血管疾病防治技术领域；所述地龙蛋白肽选自Leu‑Val‑Thr‑Leu‑Gly‑Asn‑Glu、Leu‑Leu‑Ala‑Pro‑Pro、Leu‑Leu‑Pro‑Ala‑Pro和Thr‑Val‑Ala‑Pro‑Phe中的一种或几种。本发明的地龙蛋白肽能够显著抑制凝血酶活性，从而达到抗凝血的效果；在体内，本发明的地龙蛋白肽对角叉菜胶诱发大鼠尾部血栓形成具有显著性的抑制作用；在体外和血栓大鼠的体内，本发明的地龙蛋白肽都展现了良好的抗凝效果。本发明的地龙蛋白肽兼具抑制血栓形成、溶栓、抗凝血和促进纤维蛋白溶解的功效，能够有效防治血栓性疾病。

Description

地龙蛋白肽在制备预防和/或治疗血栓性疾病的药物中的应用

技术领域

本发明涉及心脑血管疾病防治技术领域，尤其涉及地龙蛋白肽在制备预防和/或治疗血栓性疾病的药物中的应用。

背景技术

血栓形成和血栓栓塞两种病理过程所引起的疾病，临床上称为血栓性疾病。血栓性疾病严重威胁人类的生命健康，其发病率高居各种疾病之首，且近年来还有渐增之势，是当代医学研究的重点和热点之一。

传统的抗血栓药物主要有抗凝血药物、抗血小板药物和溶栓药物。虽然这些药物有一定的作用，但是治疗效果单一，治疗效果并不理想。

发明内容

本发明的目的在于提供地龙蛋白肽在制备预防和/或治疗血栓性疾病的药物中的应用，本发明的地龙蛋白肽兼具抑制血栓形成、溶栓、抗凝血和促进纤维蛋白溶解的功效，能够有效防治血栓性疾病。

为了实现上述发明目的，本发明提供以下技术方案：

本发明提供了地龙蛋白肽在制备预防和/或治疗血栓性疾病的药物中的应用；

所述地龙蛋白肽选自第一地龙蛋白肽、第二地龙蛋白肽、第三地龙蛋白肽和第四地龙蛋白肽中的一种或几种；

所述第一地龙蛋白肽的氨基酸序列如SEQIDNO：1所示；

所述第二地龙蛋白肽的氨基酸序列如SEQIDNO：2所示；

所述第三地龙蛋白肽的氨基酸序列如SEQIDNO：3所示；

所述第四地龙蛋白肽的氨基酸序列如SEQIDNO：4所示。

优选的，所述预防和/或治疗血栓性疾病通过抑制血栓形成和/或溶栓和/或抗凝血和/或促进纤维蛋白溶解实现。

优选的，所述药物还包括药学可接受的辅料。

优选的，所述药物的剂型包括散剂、颗粒剂、丸剂、片剂、胶囊剂、膏剂或汤剂。

本发明的有益效果：地龙蛋白肽在制备预防和/或治疗血栓性疾病的药物中的应用；所述地龙蛋白肽选自Leu-Val-Thr-Leu-Gly-Asn-Glu、Leu-Leu-Ala-Pro-Pro、Leu-Leu-Pro-Ala-Pro和Thr-Val-Ala-Pro-Phe中的一种或几种。本发明的地龙蛋白肽具有显著的抗凝活性，能够显著抑制凝血酶活性，从而达到抗凝血的效果；在体内，本发明的地龙蛋白肽对角叉菜胶诱发大鼠尾部血栓形成具有显著性的抑制作用；在体外和血栓大鼠的体内，本发明的地龙蛋白肽都展现了良好的抗凝效果。本发明的地龙蛋白肽兼具抑制血栓形成、溶栓、抗凝血和促进纤维蛋白溶解的功效，能够有效防治血栓性疾病。

附图说明

图1为实施例1中地龙蛋白肽经Sephadex G50色谱柱分离后的分离色谱图；

图2为实施例1中地龙蛋白肽经Sephadex G50柱色谱分离各流分抗凝血效果图；

图3为实施例1中地龙蛋白肽组分通过制备型液相色谱仪分离纯化的色谱图；

图4为实施例1中沉淀圈直径测量结果图；

图5为实施例1中分析型液相(Waters XBridge C18柱)对地龙蛋白肽进行分离纯化的色谱图；

图6为实施例1中地龙蛋白肽组分质谱鉴定结果图；

图7为实施例2中地龙蛋白肽中的氨基酸分布分析图；

图8为实施例2中地龙蛋白肽的分子量分布测定结果图；

图9为实施例3中48h各组大鼠尾部血栓形成的长度柱形图；

图10为实施例3中不同时间对应的阿司匹林组大鼠血栓黑尾长度折线图；

图11为实施例3中阿司匹林组大鼠在72h时黑尾状况；

图12为实施例3中不同时间对应的地龙蛋白肽低剂量组大鼠血栓黑尾长度折线图；

图13为实施例3中地龙蛋白肽低剂量组大鼠在72h时黑尾状况；

图14为实施例3中不同时间对应的生理盐水组大鼠血栓黑尾长度折线图；

图15为实施例3中生理盐水组大鼠在72h时黑尾状况；

图16为实施例3中不同时间对应的地龙蛋白肽预防组大鼠血栓黑尾长度折线图；

图17为实施例3中地龙蛋白肽预防组大鼠在72h时黑尾状况；

图18为实施例3中不同时间对应的地龙蛋白肽高剂量组大鼠血栓黑尾长度折线图；

图19为实施例3中地龙蛋白肽高剂量组大鼠在72h时黑尾状况；

图20为实施例3中不同时间对应的地龙蛋白肽中剂量组大鼠血栓黑尾长度折线图；

图21为实施例3中地龙蛋白肽中剂量组大鼠在72h时黑尾状况；

图22为实施例3中不同时间对应的蚓激酶组大鼠血栓黑尾长度折线图；

图23为实施例3中蚓激酶组大鼠72h时黑尾状况。

具体实施方式

本发明提供了地龙蛋白肽在制备预防和/或治疗血栓性疾病的药物中的应用；所述地龙蛋白肽选自第一地龙蛋白肽、第二地龙蛋白肽、第三地龙蛋白肽和第四地龙蛋白肽中的一种或几种；所述第一地龙蛋白肽的氨基酸序列如SEQ ID NO：1所示，具体为：Leu-Val-Thr-Leu-Gly-Asn-Glu，分子量为745.4Da；所述第二地龙蛋白肽的氨基酸序列如SEQID NO：2所示，具体为：Leu-Leu-Ala-Pro-Pro，分子量为510.3Da；所述第三地龙蛋白肽的氨基酸序列如SEQ ID NO：3所示，具体为Leu-Leu-Pro-Ala-Pro，分子量为510.3Da；所述第四地龙蛋白肽的氨基酸序列如SEQ ID NO：4所示，具体为：Thr-Val-Ala-Pro-Phe，分子量为535.3Da。

本发明中，所述预防和/或治疗血栓性疾病优选的通过抑制血栓形成和/或溶栓和/或抗凝血和/或促进纤维蛋白溶解实现。

本发明中，所述药物优选的还包括药学可接受的辅料。

本发明中，所述药物的剂型优选的包括散剂、颗粒剂、丸剂、片剂、胶囊剂、膏剂或汤剂。

下面结合实施例对本发明提供的技术效果进行详细的说明，但是不能把它们理解为对本发明保护范围的限定。

实施例1地龙蛋白肽的分离纯化

地龙蛋白肽的分离纯化步骤，包括以下步骤：

1)地龙蛋白肽(由中食都庆(山东)生物有限公司提供)10g，加入200mL2％醋酸水溶液搅拌溶解0.5h。将地龙蛋白肽离心处理，离心条件为8000r/min，15℃，15min，经孔径为0.45μm滤头过滤后备用。

2)Sephadex G50色谱柱分离：首先用超纯水平衡柱子冲洗3～5个柱体积后上样，然后超纯水2.5mL/min冲柱2h，将过膜后的地龙蛋白肽按照色谱峰收集流份并将各流份浓缩后用真空干燥机冷冻干燥成粉。

分离条件为：洗脱液为超纯水；洗脱时间2h；洗脱速度：2.5mL/min；色谱柱600mm*25mm；检测波长：214nm。分离色谱图参见图1。由图1可以看出地龙蛋白肽经过Sephadex G50色谱柱进行了初步分离，并依据其吸光度收集了不同的组分。

3)地龙蛋白肽经Sephadex G50柱色谱分离各流分实物图参见图2。将收集的不同的组分通过纤维蛋白平板法以及体外抗凝血试验来验证不同组分的抗凝活性。结果显示：吸光度为70A～77A组分的抗凝效果最佳。

4)将步骤3)中抗凝活性最好的地龙蛋白肽组分进一步通过制备型液相色谱仪分离纯化。将粉末状样品称取10mg于10mL容量瓶中，加入10mL纯水，超声使其溶解。用液相色谱仪测定之前，样品溶液用0.45μm的滤膜过膜。

色谱条件：流速为20mL/min，流动相比例为80％缓冲液A和20％缓冲液B，时间从0min到5min；从5min至35min，流动相比例80％缓冲液A和20％缓冲液B变为流动相比例20％缓冲液A和80％缓冲液B；从35min至40min，流动相比例为20％缓冲液A和80％缓冲液B，缓冲液A为0.1％三氟乙酸和水，缓冲液B为0.1％三氟乙酸和乙腈。制备型液相色谱图参见图3。由图3可以看出利用液相制备机地龙蛋白肽进行分离纯化，将不同时间段出峰的流份收集并利用纤维蛋白平板法判断其抗凝效果。

将收集的不同峰通过纤维蛋白平板法以及体外抗凝血试验来验证不同组分的抗凝活性。具体的是：以纤维蛋白原作为底物，在纤维蛋白原平板上进行免疫扩散反应，精确测量沉淀圈直径，并利用沉淀线圈的直径来判断不同组分地龙蛋白肽的溶栓活性。最后通过液相制备机(采用Waters XBridge C18柱(185μm*4.6μm*250mm)，以水-乙腈为流动相，流速为0.8ml/min。检测波长为214nm)对地龙蛋白肽进行分离纯化，发现了三个具有良好溶栓活性的组分，分别为组分3、组分4和组分6。并针对这三个组分进行下一步的序列测定。沉淀圈直径测量结果参见图4，其中图4-A为组分3(23min～24min)溶栓线圈；图4-B为组分4(23min～24min)溶栓线圈；图4-C为蚓激酶溶栓线；图4-D为组分6(29min～32min)溶栓线圈；由图4可以看出组分3、4、6均呈现了不同直径的溶栓线圈，表明其中含有具有良好抗凝溶栓活性的多肽组分，需要进一步对其进行分析检测。液相制备机纯化结果参见图5，由图5可以看出地龙蛋白肽分析型液相色谱参见图5，通过图5我们可以看出地龙蛋白肽在没有进行分离纯化时组分较为复杂，需要对其进行下一步的处理。

6)将步骤5)中抗凝活性最好的地龙蛋白肽组分(组分3、组分4和组分6)进一步通过质谱仪进行测序。

质谱条件：色谱仪：WATERS ACQUITY UPLC；检测器：WATERS ACQUITY PDA；检测波长：520nm；分析柱：BEH C182.1X100mm 1.7um；流动相：A:1％甲酸，B:100％乙腈；流速为0.8ml/min；检测波长为214nm；离子方式：ESI+；离子源温度(Source Block Temp)：100℃；脱溶剂气温度(Desolvation Temp)：400℃；碰撞能量：Collision Energy(eV):6/20Volts；质量范围：20～1500m/z；Detector电压：1800Volts。质谱鉴定结果参见图6。结果发现组分3、组分4和组分6中均含有四条具有抗凝血活性的氨基酸序列，分别为：Leu-Val-Thr-Leu-Gly-Asn-Glu、Leu-Leu-Ala-Pro-Pro、Leu-Leu-Pro-Ala-Pro和Thr-Val-Ala-Pro-Phe。

实施例2

1)地龙蛋白肽基本理化性质的测定

蛋白质含量测定(GB5009.9-凯氏定氮仪)、水分含量的测定(GB5009.3)、灰分含量的测定(GB5009.4)，测定结果参见表1。

表1地龙蛋白肽基本理化性质的测定结果

蛋白质	水分	灰分
			75.7％	5.29％	5.1％

2)地龙蛋白肽中的氨基酸分布分析

利用日立L-8900氨基酸自动分析仪对地龙蛋白肽的氨基酸组成进行分析。分析结果详见图7。由图7可知地龙蛋白肽的氨基酸组成分布情况。

3)地龙蛋白肽的分子量分布测定

利用Waters 2489液相色谱仪对地龙蛋白肽的分子量分布进行测定。测定结果详见图8。由图8可知。地龙蛋白肽的分子量主要集中在1000Da以下，表明发挥抗凝血活性主要为小分子多肽。

实施例3地龙蛋白肽对角叉菜胶诱发大鼠尾部血栓形成的抑制作用

1)试剂及仪器

角叉菜胶为Sagma公司提供；游标卡尺；秒表；手术刀、地龙蛋白肽，黄色粉末状，由中食都庆(山东)生物有限公司提供，阿司匹林，白色片状，批号为H51021360，百奥蚓激酶胶囊，黄色胶囊，批号为H11021129，盐酸利多卡因注射液，针剂，批号为H37022147。

2)造模方法

称取角叉菜胶，并用0.9％NaCl配制成浓度为2mg/mL角叉菜胶溶液(2％)；给大鼠称重，于大鼠皮下注射角叉菜胶，剂量为80mg/kg，预防组提前5天进行灌胃处理，造模后30min对除预防组外的其余4组按照相关剂量进行灌胃操作，然后将大鼠置于(18±2)℃恒温环境，自由饮食、饮水。

随机选取42只SD大鼠利用角叉菜胶进行血栓造模，观察大鼠的生理活动，用生理盐水为空白对照组，以阿司匹林组为阳性对照组，多肽(实施例1中制备得到的包含Leu-Val-Thr-Leu-Gly-Asn-Glu、Leu-Leu-Ala-Pro-Pro、Leu-Leu-Pro-Ala-Pro和Thr-Val-Ala-Pro-Phe等四种抗凝血活性多肽的地龙蛋白肽)和相关药物均用生理盐水进行溶解，灌胃剂量按照表2进行操作。并分别在24，36，48，60，72，96h，用游标卡尺测量血栓黑尾长度并计算血栓黑尾比率。各试验组及生理盐水组于注射角叉菜胶后，造模后3～14h大鼠出现不同程度的瘀血、黑尾，并逐渐向尾根部扩大。将测得的数据采用spss18.0软件进行处理，为了比较不同组别之间的差异，采用单因素方差分析，结果表明不同组别之间有显著性的差异，P<0.05表明有显著性的差异。喂养10天后，于大鼠下腔静脉取血，并进行凝血四项及血常规检测。检测结果参见表3、表4和图9～图23。

表2各组灌胃剂量

表3不同组大鼠黑尾率

表3为不同组大鼠黑尾率，如表3所示，48h后生理盐水组黑尾率达到了83.3％，蚓激酶组、低剂量组、高剂量组黑尾率分别为33.4％，中剂量组与阿司匹林组黑尾率为(16.7％)，预防组暂时没有出现黑尾大鼠。

表4不同组大鼠血液的凝血四项及血常规检测数据

表4为不同组大鼠血液的凝血四项及血常规检测数据，由表4可以看出，与正常对照组相比，生理盐水组大鼠血液凝血酶原时间(APPT)显著缩短(P<0.01)，纤维蛋白原含量(Fib)明显升高(P<0.01)，差异具有统计学意义。与生理盐水组相比，高、低剂量组均能使APPT延长，纤维蛋白原含量下降，其中高剂量组APPT显著延(P<0.05)，维蛋白原含量明显降低(P<0.05)，差异具有统计学意。结果表明，地龙蛋白肽提高了机体的纤溶功能，具有预防和抑制血栓形成的作用。

图9为48h各组大鼠尾部血栓形成的长度柱形图；如图9所示，生理盐水生理盐水组黑尾比率最高且黑尾长度最长为(100.52mm)，与生理盐水相比，黑尾抑制率分别为：蚓激酶组(44.6％)、阿司匹林组(75.8％)、低剂量组(48.78％)、中剂量组(64.5％)、高剂量组(44.9％)、预防组(72.9％)。与生理盐水相比，地龙蛋白肽具有显著性的治疗以及预防血栓的作用。其他组别均与生理盐水组有显著性差异(P<0.01)。其中预防组(27.13mm)治疗效果最好，与阿司匹林组(24.24mm)没有显著性差异(P>0.05)，中剂量组(35.5mm)次之，其中低剂量组(51.34mm)和高剂量组(55.14mm)与蚓激酶组(55.43mm)治疗效果相当，没有显著性差异(P<0.01)。

图10为不同时间对应的阿司匹林组大鼠血栓黑尾长度折线图；图11为阿司匹林组大鼠在72h时黑尾状况；由图10可以观察到，SD大鼠在前5天对血栓具有明显的抑制作用，第6天大鼠的黑尾长度有明显增加，后续分析得出，与自身抗凝血机制有很大关系；由图11可以观察到，在72h时只有三只大鼠有明显的黑尾迹象。

图12为不同时间对应的地龙蛋白肽低剂量组大鼠血栓黑尾长度折线图；图13为地龙蛋白肽低剂量组大鼠在72h时黑尾状况；由图12可以观察到，地龙蛋白肽低剂量组大鼠黑尾长度变化波动明显，总体黑尾长度有明显下降；由图13可以观察到，在72h时，地龙蛋白肽低剂量组有四只大鼠出现明显的黑尾情况，其余两只大鼠的尾部具有明显的血栓迹象，通过与生理盐水组相比较具有明显的血栓治疗作用。

图14为不同时间对应的生理盐水组大鼠血栓黑尾长度折线图；图15为生理盐水组大鼠在72h时黑尾状况；由图14可以观察到，生理盐水组大鼠黑尾长度变化明显，与自身抗凝机制有关，总体黑尾长度是不断上升，于造模第六天黑尾长度达到最大值，造模后的第十天出现断尾迹象；由图15可以观察到，在72h时，生理盐水组大鼠有五只大鼠出现黑尾的状况，其余一只有明显的血栓迹象在第二天观察时出现黑尾，通过SPSS软件分析得，生理盐水组与其他六组具有显著性差异(P<0.01)。

图16为不同时间对应的地龙蛋白肽预防组大鼠血栓黑尾长度折线图；图17为地龙蛋白肽预防组大鼠在72h时黑尾状况；由图16可以观察到，地龙蛋白肽预防组黑尾长度最短，对于血栓的治疗和预防具有显著性的作用，后续观察，黑尾长度稍有增长，没有出现伤亡的情况，总体治疗效果最好；由图17可以观察到，在72h时，地龙蛋白肽预防组只有一只大鼠具有黑尾迹象，其余三只有明显的血栓迹象，在造模之后的48h内伤亡两只老鼠，解剖观察没有发现炎症致死的迹象，同时观察其他组别大鼠排除因为造模导致伤亡的原因。

图18为不同时间对应的地龙蛋白肽高剂量组大鼠血栓黑尾长度折线图；图19为地龙蛋白肽高剂量组大鼠在72h时黑尾状况；由图18可以观察到，地龙蛋白肽高剂量组大鼠的黑尾长度在72h时达到最高值，在第四天之后黑尾长度得到控制，黑尾长度明显变小，与生理盐水组比较具有显著性差异(P<0.01)；由图19可以观察到，在72h时，地龙蛋白肽高剂量组大鼠有三只大鼠的黑尾情况较为明显，两只大鼠有轻微黑尾情况。

图20为不同时间对应的地龙蛋白肽中剂量组大鼠血栓黑尾长度折线图；

图21为地龙蛋白肽中剂量组大鼠在72h时黑尾状况；由图20可以观察到，地龙蛋白肽中剂量组大鼠的黑尾长度波动较为明显，造模后的第六天黑尾长度明显增加，但是总体的黑尾长度较短，与生理盐水比较，具有明显的血栓治疗作用；由图21可以观察到，在72h时，地龙蛋白肽中剂量组有四只大鼠黑尾迹象较为明显，其余两只具有明显的血栓迹象，本组的治疗效果仅次于预防组，对于以后患者的服用剂量具有明显的说服力。

图22为不同时间对应的蚓激酶组大鼠血栓黑尾长度折线图；图23为蚓激酶组大鼠72h时黑尾状况；由图22可以观察到，蚓激酶组对于血栓的治疗效果和地龙蛋白肽低剂量组以及高剂量组的治疗效果接近，在造模后的72h时黑尾长度达到最高值，以后经过治疗大鼠的黑尾长度得到了控制；由图23可以观察到，在72h时，蚓激酶组大鼠有三只大鼠黑尾迹象较为明显，还有两只大鼠有轻微的黑尾迹象。

以上所述仅是本发明的优选实施方式，应当指出，对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明原理的前提下，还可以做出若干改进和润饰，这些改进和润饰也应视为本发明的保护范围。

序列表

<110> 中食都庆（山东）生物技术有限公司

<120> 地龙蛋白肽在制备预防和/或治疗血栓性疾病的药物中的应用

<160> 4

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 7

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 1

Leu Val Thr Leu Gly Asn Glu

1 5

<210> 2

<211> 5

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 2

Leu Leu Ala Pro Pro

1 5

<210> 3

<211> 5

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 3

Leu Leu Pro Ala Pro

1 5

<210> 4

<211> 5

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 4

Thr Val Ala Pro Phe

1 5

Claims

1.地龙蛋白肽在制备预防和/或治疗血栓性疾病的药物中的应用；

所述地龙蛋白肽由第一地龙蛋白肽、第二地龙蛋白肽、第三地龙蛋白肽和第四地龙蛋白肽组成；

所述第一地龙蛋白肽的氨基酸序列如SEQ ID NO：1所示；

所述第二地龙蛋白肽的氨基酸序列如SEQ ID NO：2所示；

所述第三地龙蛋白肽的氨基酸序列如SEQ ID NO：3所示；

所述第四地龙蛋白肽的氨基酸序列如SEQ ID NO：4所示。

2.根据权利要求1所述的应用，其特征在于，所述预防和/或治疗血栓性疾病通过抑制血栓形成和/或溶栓和/或抗凝血和/或促进纤维蛋白溶解实现。

3.根据权利要求1或2所述的应用，其特征在于，所述药物还包括药学可接受的辅料。

4.根据权利要求1或2所述的应用，其特征在于，所述药物的剂型包括散剂、颗粒剂、丸剂、片剂、胶囊剂、膏剂或汤剂。