CN110927389B - 一种癌症生物标志物、用途 - Google Patents

Abstract

本发明涉及肿瘤分子生物学领域，具体涉及一种癌症生物标志物、用途，所述癌症生物标志物包括肿瘤细胞中的程序化死亡分子PD‑1、基因PDCD1和/或PD‑1mRNA；PD‑1在肿瘤细胞中广谱性表达并且起到了抑制肿瘤细胞生长的作用。上述的癌症生物标志物，用于预测、评估或鉴定出PD‑1抗体对免疫缺陷或免疫低下的肿瘤患者治疗的有效性，预测出不适宜PD‑1抗体治疗的肿瘤患者，为肿瘤患者提供更加有效的用药和疗法选择的建议，为今后免疫治疗在临床上的应用给与了重要的警示，降低肿瘤患者治疗风险，减少患者的痛苦，延长患者寿命，解决了现有技术中没有一种用于PD‑1抗体***的预测性生物标志物，无法评估采用PD‑1抗体治疗可能不适宜的肿瘤患者的问题。

Description

一种癌症生物标志物、用途

技术领域

本发明涉及肿瘤分子生物学领域，具体涉及一种癌症生物标志物、用途。

背景技术

程序化死亡分子1(programmed cell death protein 1，PD-1)为I型跨膜糖蛋白，是免疫反应中重要的负性调控因子。在正常情况下，PD-1通过与其配体PD-L1，PD-L2结合抑制T淋巴细胞的功能，从而抑制自身免疫应答。PD-1抗体和PD-L1抗体治疗机制就是分别与T细胞表面的PD-1和肿瘤细胞表面的PD-L1结合，使肿瘤细胞表面的PD-L1不能与T细胞表面的PD-1结合，然后T细胞被活化，最终识别杀伤肿瘤细胞。目前，免疫检查点阻滞剂抗PD-1、抗PD-L1治疗性抗体已用于治疗多种人类肿瘤，如黑色素瘤、肾细胞癌、NSCLC和霍奇金淋巴瘤。但是，对于这些抗体的治疗反应，也只是对一小部分病人起作用，而有些病人在接受治疗后非但没有起到治疗作用，反而出现了假性进展和超进展模式。假性进展是指，病人接受抗体治疗后，会在短时间内出现肿瘤增大的现象，之后再变小。超进展模式是指，病人接受抗体治疗后，肿瘤反而增大，病情加剧。对于这两种治疗后的异常反应，目前还没有找到明确的发生机制。因此，尽管采用抗体治疗获得了重大进展，仍然需要寻找改良的疗法。预先鉴定出肿瘤患者最可能适宜的抗体治疗方法，将降低患者的治疗风险，减少患者的痛苦，促进患者的提早康复，延长患者寿命。

近来的综述文章表明，非常需要加速研发生物标志物及它们的用途，以用于改善癌症的诊断和治疗。由上述可见，为了改善癌症的诊断和治疗，癌症生物标志物也越来越受到重视。目前，已知三种不同类型的癌症生物标志物：(1)预后性生物标志物；(2)预测性生物标志物；以及(3)药效动力学(PD)生物标志物。预测性生物标志物用于评估特定患者将受益于使用特定药品治疗的可能性。例如，患有乳癌的患者，其ERBB2(HER2)基因被扩增，可能受益于使用曲妥单抗的治疗，然而不具有ERBB2基因扩增的患者可能不受益于使用曲妥单抗的治疗。上述的预测性生物标志物将有助于肿瘤患者最可能适宜的药品和疗法的筛选鉴定。

然而，目前还没有人提出关于PD-1抗体***的预测性生物标志物，仅仅发现有些肿瘤患者对于PD-1抗体治疗无响应、响应性低或出现超进展的现象，尚不清楚PD-1抗体治疗所适宜的肿瘤患者，增大了采用PD-1抗体治疗的肿瘤患者的治疗风险，无法有效的针对适宜PD-1抗体治疗的肿瘤患者进行治疗，同时更无法对不适宜采用PD-1抗体治疗的肿瘤患者提出更优选的用药选择和疗法。

发明内容

因此，本发明要解决的技术问题在于克服现有技术中没有一种用于PD-1抗体***的预测性生物标志物，无法评估采用PD-1抗体治疗可能不适宜的肿瘤患者，造成肿瘤患者采用PD-1抗体治疗的风险增大，增加患者的痛苦，容易延误患者的最佳治疗时机，进而提出一种癌症生物标志物，所述癌症标志物可以用于预测、评估或鉴定出PD-1抗体对肿瘤患者治疗的有效性，预测出不适宜PD-1抗体治疗的肿瘤患者，为肿瘤患者提供更加有效的用药和疗法选择的建议，降低肿瘤患者治疗风险，减少患者的痛苦，延长患者寿命。

为此，本发明提供如下技术方案：

本发明提供了一种癌症生物标志物，所述癌症生物标志物包括肿瘤细胞中的程序化死亡分子、基因PDCD1和/或PD-1mRNA；所述癌症生物标志物具有抑制肿瘤的作用。

优选的，所述癌症包括血癌、乳腺、结肠癌、胰腺癌、***癌、骨癌、肾癌、皮肤癌、子***、脑癌、肝癌、胃癌或肺癌中的任意一种。

优选的，血癌的细胞包括Raji，K-562，Jeko-1，U-937或Jurkat；乳腺癌的细胞包括MCF-7，SK-BR-3或T47D；肠癌的细胞包括HT-29，RKO，SW480或HCT116；胰腺癌的细胞包括HPDE6C，BxpC-3或AsPC-1；***癌的细胞包括PC-3，22Rv1，DU145或LNCaP；骨癌的细胞包括CRL8303或U-2OS；肾癌的细胞包括ACHN，769-P，786-O或Caki-1；皮肤癌的细胞包括B16F10或A-375；子***的细胞包括Ca Ski或Hela；脑癌的细胞包括M059J，SKNSH，M059K或SK-N-BE(2)；肝癌的细胞包括Huh-7或HepG2；胃癌的细胞包括HGC-27；肺癌的细胞包括A549、HCC827、Calu-1或NCI-H1299。

本发明提供了癌症生物标志物在抑制上述的肿瘤中的用途。

进一步的，所述的用途包括所述癌症生物标志物在体外抑制上述的肿瘤生长的用途。

进一步的，所述的用途包括在制备抑制肿瘤产品中的用途。

本发明提供了癌症生物标志物在降低肿瘤中p-ERK和p-AKT表达水平的用途。

进一步的，所述的用途包括所述癌症生物标志物在体外降低肿瘤中p-ERK和p-AKT表达水平的用途。

进一步的，所述的用途包括在制备降低肿瘤中p-ERK和/或p-AKT表达水平的产品。

本发明提供了癌症生物标志物或者检测其存在或水平的试剂在预测、评估或鉴定PD-1抗体对癌症抑制有效性、指导用药选择或疗法选择的用途。

进一步的，所述的用途包括制备预测、评估或鉴定PD-1抗体对癌症抑制有效性、指导用药选择或疗法选择的产品的用途；优选的，所述癌症处于免疫缺陷或免疫功能低下环境中。

进一步的，所述PD-1抗体包括Nivolumab或Pembrolizumab。

进一步的，所述的试剂包括利用RT-PCR、荧光实时定量PCR、ImmunoBlot或FACS检测所述的癌症生物标志物存在或水平的试剂。

本发明提供了一种预测、评估或鉴定PD-1抗体对癌症患者治疗有效抑制、用药选择或疗法选择的方法，包括：

测定所述的癌症生物标志物在免疫缺陷或免疫功能低下的癌症患者的肿瘤样品中是否存在，若测定结果显示存在，则指示PD-1抗体对治疗所述癌症患者无效或可能出现超进展现象；或者

测定所述的癌症生物标志物在免疫缺陷或免疫功能低下的癌症患者的肿瘤样品中是否存在，若测定结果显示存在，则指示所述癌症患者不宜选用PD-1抗体药物治疗；或者

测定所述的癌症生物标志物在免疫缺陷或免疫功能低下的癌症患者的肿瘤样品中是否存在，若测定结果显示存在，则指示所述癌症患者不宜选用包括PD-1抗体药物的治疗方法。

进一步的，在所述的方法中，所述癌症包括上述的血癌、乳腺、结肠癌、胰腺癌、***癌、骨癌、肾癌、皮肤癌、子***、脑癌、肝癌、胃癌或肺癌中的任意一种。

进一步的，在所述的方法中，血癌的细胞包括Raji，K-562，Jeko-1，U-937或Jurkat；乳腺癌的细胞包括MCF-7，SK-BR-3或T47D；肠癌的细胞包括HT-29，RKO，SW480或HCT116；胰腺癌的细胞包括HPDE6C，BxpC-3或AsPC-1；***癌的细胞包括PC-3，22Rv1，DU145或LNCaP；骨癌的细胞包括CRL8303或U-2OS；肾癌的细胞包括ACHN，769-P，786-O或Caki-1；皮肤癌的细胞包括B16F10或A-375；子***的细胞包括Ca Ski或Hela；脑癌的细胞包括M059J，SKNSH，M059K或SK-N-BE(2)；肝癌的细胞包括Huh-7或HepG2；胃癌的细胞包括HGC-27；肺癌的细胞包括A549、HCC827、Calu-1或NCI-H1299。

本发明技术方案，具有如下优点：

1.本发明提供的一种癌症生物标志物，所述癌症生物标志物包括肿瘤细胞中的程序化死亡分子1(PD-1)、基因PDCD1和/或PD-1mRNA；随着发明人对PD-1分子的进一步深入研究发现，PD-1在肿瘤细胞中广谱性表达并且起到了抑制肿瘤细胞生长的作用。并且本发明利用商业化PD-1抗体Nivolumab,Pembrolizumab等进行抗体阻断实验，发现其对肿瘤细胞的生长也有一定的促进作用(体内和体外实验)，同时还发现PD-1在肿瘤细胞中通过AKT和ERK两大信号通路影响了细胞的增殖，因此在上述基础上，本发明提出了一种新的免疫相关的治疗性PD-1抗体应用的癌症生物标志物，用于预测、评估或鉴定出PD-1抗体对免疫缺陷或免疫功能低下的肿瘤患者治疗的有效性，预测出不适宜PD-1抗体治疗的肿瘤患者，为肿瘤患者提供更加有效的用药和疗法选择的建议，为今后免疫治疗在临床上的应用给与了重要的警示，降低肿瘤患者治疗风险，减少患者的痛苦，延长患者寿命，解决了现有技术中没有一种用于PD-1抗体***的预测性生物标志物，无法评估采用PD-1抗体治疗可能不适宜的肿瘤患者，造成肿瘤患者采用PD-1抗体治疗的风险增大，增加患者的痛苦，容易延误患者的最佳治疗时机的问题。

2.本发明提供的癌症生物标志物所述的广谱性表达包括但不限于在所述癌症中的表达，所述癌症为血癌、乳腺癌、结肠癌、胰腺癌、***癌、骨癌、肾癌、皮肤癌、子***、食管癌、脑癌、肝癌、胃癌或肺癌中的任意一种或多种，供选择的癌细胞系为血癌的细胞包括Raji，K-562，Jeko-1，U-937或Jurkat；乳腺癌的细胞包括MCF-7，SK-BR-3或T47D；肠癌的细胞包括HT-29，RKO，SW480或HCT116；胰腺癌的细胞包括HPDE6C，BxpC-3或AsPC-1；***癌的细胞包括PC-3，22Rv1，DU145或LNCaP；骨癌的细胞包括CRL8303或U-2OS；肾癌的细胞包括ACHN，769-P，786-O或Caki-1；皮肤癌的细胞包括B16F10或A-375；子***的细胞包括Ca Ski或Hela；脑癌的细胞包括M059J，SKNSH，M059K或SK-N-BE(2)；肝癌的细胞包括Huh-7或HepG2；胃癌的细胞包括HGC-27；肺癌的细胞包括A549、HCC827、Calu-1或NCI-H1299的一种或多种；上述癌细胞包括12种癌症下40种不同细胞系，还有4种肺癌细胞系，7个肺癌临床病人样本中肿瘤细胞的普遍表达。可见PD-1分子在不同种类的肿瘤细胞中表达的普遍性。

进一步的，在肿瘤细胞上PD-1分子的敲减和过表达实验(体内和体外实验)，结果对比后，发现PD-1分子对上述肿瘤细胞的生长也有一定的抑制作用。

进一步的，同时通过对比实验还发现PD-1在肿瘤细胞中通过AKT和ERK两大信号通路影响了肿瘤细胞的增殖。

综上，本发明证实了PD-1分子的存在对免疫缺陷或免疫功能低下的肿瘤细胞的生长起到了抑制作用，PD-1分子的缺失对免疫缺陷或免疫功能低下的肿瘤细胞的生长起到了促进作用。因此，本发明的癌症标志物在免疫缺陷或免疫功能低下具有对肿瘤细胞生长的抑制作用，同时可以弥补临床常用的PD-1抗体抑制肿瘤细胞生长治疗方式时产生过度治疗的缺陷。

同时，考察肿瘤细胞上PD-1分子的敲减和过表达后对肿瘤细胞的影响，本发明证实了在免疫缺陷或免疫功能低下条件下PD-1分子的存在对蛋白ERK和AKT的磷酸化水平起到了抑制作用，进而证明了PD-1在信号通路上对免疫细胞增长的影响作用。

3.在上述基础上，本发明提出了一种PD-1抗体应用的癌症生物标志物新的免疫相关的治疗用途，利用PD-1抗体对肿瘤细胞增长的有效抑制这一用途，筛选适宜PD-1抗体治疗的肿瘤细胞，为肿瘤患者提供一种新的、有效的用药和疗法，为今后免疫治疗在临床上的应用给与了重要的警示，降低肿瘤患者治疗风险，减少患者的痛苦，延长患者寿命，解决了现有技术中没有一种用于PD-1抗体***的预测性生物标志物，无法评估采用PD-1抗体治疗最可能不适宜的肿瘤患者，造成肿瘤患者采用PD-1抗体治疗的风险增大，增加患者的痛苦，容易延误患者的最佳治疗时机。

4.本发明提供的一种预测、评估或鉴定PD-1抗体对癌症抑制有效性、指导用药选择或疗法选择的方法；本发明发现上述肿瘤细胞表面表达PD-1，因此可以预测患有上述肿瘤且免疫缺陷或免疫功能低下的病人，可能并不适合PD-1抗体的治疗，这些病人在使用PD-1抗体治疗后，由于自身免疫功能低下，且PD-1抗体对肿瘤细胞上存在的PD-1分子的阻断，使得PD-1分子对肿瘤细胞增长的抑制失效，导致肿瘤细胞快速增长，最终可能出现超进展现象。因此，本发明的癌症生物标志物能够预测出不适宜PD-1抗体治疗的肿瘤细胞，为肿瘤患者提供更加有效的用药和疗法选择的建议，且为临床上出现的超进展现象提供了一个新的机制。

附图说明

为了更清楚地说明本发明具体实施方式或现有技术中的技术方案，下面将对具体实施方式或现有技术描述中所需要使用的附图作简单地介绍，显而易见地，下面描述中的附图是本发明的一些实施方式，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动的前提下，还可以根据这些附图获得其他的附图。

图1A为本发明实施例1提供35种肿瘤细胞系中PD-1mRNA的RT-PCR结果；

图1B是发明实施例2提供的35种肿瘤细胞系中PD-1mRNA的荧光实时定量PCR结果；

图1C是发明实施例3提供的PD-1在4种肺癌细胞系中的ImmunoBlot，RT-PCR和荧光实时定量PCR结果；

图1D是发明实施例4提供的PD-1在4种肺癌细胞系中的FACS检测结果；

图1E是发明实施例5提供的PD-1在7个临床病人样本中的FACS检测结果；

图2A是发明实施例6提供的两株肺癌细胞系中，PD-1敲减后的QPCR检测结果；

图2B是发明实施例7提供的两株肺癌细胞系中，PD-1敲减组与对照组的生长曲线；

图2C是发明实施例8提供的两株肺癌细胞系中，PD-1敲减组与对照组的ImmunoBlot检测结果；

图2D是发明实施例9提供的两株肺癌细胞系中，PD-1过表达后的QPCR检测结果

图2E是发明实施例10提供的两株肺癌细胞系中，PD-1过表达组与对照组的生长曲线；

图2F是发明实施例11提供的两株肺癌细胞系中，PD-1过表达组与对照组的ImmunoBlot检测结果；

图3A是发明实施例12提供的稳定细胞系PD-1敲减组和对照组分别注入小鼠皮下后，体内肿瘤的生长曲线测量结果；

图3B是发明实施例12提供的小鼠体内PD-1敲减组和对照组瘤子的大小测量结果；

图4是发明实施例13提供的小鼠体内PD-1敲减组和对照组瘤子的免疫组化染色代表图和统计结果；

图5A是本发明实施例14用PD-1抗体处理经CFSE染色的细胞后细胞内平均荧光强度的检测及统计结果；

图5B是本发明实施例15用PD-1抗体处理Calu-1细胞后细胞内AKT和ERK的磷酸化水平；

图5C是本发明实施例16中PD-1抗体注射小鼠腹腔后，小鼠皮下肿瘤的生长曲线测量结果；

图5D是本发明实施例16中PD-1抗体注射小鼠腹腔后，小鼠皮下肿瘤的大小测量及统计结果；

图5E是本发明实施例17中将PD-1抗体注入小鼠腹腔后，小鼠皮下肿瘤的AKT的磷酸化水平；

图5F是本发明实施例16将PD-1抗体注入小鼠腹腔后，小鼠皮下肿瘤的ERK的磷酸化水平。

具体实施方式

提供下述实施例是为了更好地进一步理解本发明，并不局限于所述最佳实施方式，不对本发明的内容和保护范围构成限制，任何人在本发明的启示下或是将本发明与其他现有技术的特征进行组合而得出的任何与本发明相同或相近似的产品，均落在本发明的保护范围之内。

实施例中未注明具体实验步骤或条件者，按照本领域内的文献所描述的常规实验步骤的操作或条件即可进行。所用试剂或仪器未注明生产厂商者，均为可以通过市购获得的常规试剂产品。

实施例1

本实施例利用RT-PCR方法检测了12种癌种，包括35种细胞系中的PD-1的mRNA水平。

癌细胞分别为：血癌的细胞包括Raji，K-562，Jeko-1，U-937和Jurkat；乳腺癌的细胞包括MCF-7，SK-BR-3和T47D；肠癌的细胞包括HT-29，RKO，SW480和HCT116；胰腺癌的细胞包括HPDE6C，BxpC-3和AsPC-1；***癌的细胞包括PC-3，22Rv1，DU145和LNCaP；骨癌的细胞包括CRL8303或U-2OS；肾癌的细胞包括ACHN，769-P，786-O和Caki-1；皮肤癌的细胞包括B16F10和A-375；子***的细胞包括Ca Ski和Hela；脑癌的细胞包括M059J，SKNSH，M059K和SK-N-BE(2)；肝癌的细胞包括Huh-7和HepG2；胃癌的细胞包括HGC-27。上述癌细胞均为市售产品。

所述RT-PCR方法包括如下步骤：

1、细胞总RNA提取

1)取癌细胞用PBS清洗两遍，加适量的RNAiso Plus Reagent裂解细胞(一般一个10cm皿加1ml)，用移液器反复吹打至细胞全部裂解下来后转至新的RNase Free EP管中，室温静置5min；

2)置于微量冷冻离心机12,000rpm，4℃，离心10min；

3)将离心后的上清液转入新的RNase Free EP管中(注意避免吸入沉淀)，加入氯仿(上清体积：氯仿体积＝5:1)，然后快速上下颠倒混匀，室温静置5min；

4)置于冷冻离心机12,000rpm，4℃，离心15min；

5)将最上层透明液体转移至新的RNase Free EP管中，加入等体积的异丙醇(提RNA专用)，充分混匀后室温静置10min或者-20℃静置1h；

6)置于冷冻离心机12,000rpm，4℃，离心10min；

7)弃掉上清，用体积浓度75％乙醇溶液(用DEPC处理水和配制)悬浮底部沉淀，4℃，12,000rpm离心10min；

8)重复使用体积浓度75％乙醇溶液清洗沉淀一次，12,000rpm，4℃，离心10min；

9)去除体积浓度75％乙醇溶液，将带有沉淀的EP管放置在超净工作台中晾干，直至乙醇挥发完；

10)根据沉淀的量加入适量的DEPC处理水(55℃金属浴预热)将沉淀溶解，取2ul用Nanodrop检测RNA浓度。一般OD260/280在1.8-2.0之间，OD260/230大于2.0，说明RNA的质量良好。

2、去除基因组DNA反应

进行反转录前先去除提取的RNA中基因组DNA，反应体系如下表1：

表1反应体系

试剂	用量
		5×gDNAEraser Buffer	2.0μl
gDNAEraser	1.0μl
		Total RNA	1.0μg
RNase Free dH2O	up to 10.0μl

反应条件：42℃孵育2min。

3、RT-PCR反应

去除基因组DNA之后，再对RNA进行反转录反应，使用RNA反转录试剂盒(Takara公司)进行RT-PCR反应，反转录体系如下表2：

表2反转录体系

反应条件：37℃，15min；85℃，5s。

RT-PCR试验结果见附图1A，图1A中条带结果显示PD-1mRNA在12种癌症的35种癌细胞系中均有表达。条带越明显，表明PD-1mRNA的含量越高。

实施例2

本实施例利用荧光实时定量PCR(Q-PCR)技术检测12种癌种，包括35种细胞系的PD-1的mRNA水平。

所述癌细胞如实施例1中的癌细胞。

所述Q-PCR方法包括如下步骤：

1、Q-PCR引物，所述引物如下表3：

表3引物

2、Q-PCR反应体系：采用的是SYBR Green染料(Takara)，每种cDNA做三个复孔检测，每孔按如下表4的反应体系配制，表4中的cDNA为实施例1中RT-PCR获得的含有cDNA的反应液：

表4反应体系

3、Q-PCR反应程序：95℃，10min；35个循环数：95℃,15s；60℃，1min。

Q-PCR试验结果见附图1B，图1B中的纵坐标表示Delta CT值(目标基因CT值减去内参CT值)，Delta CT值越高，说明PD-1表达水平越低。结果表明PD-1在12种癌种的35种肿瘤细胞系中均有表达。

实施例3

本实施例采用免疫印迹(Immunoblot)技术、RT-PCR和荧光实时定量PCR检测四种肺癌细胞系的PD-1的表达。

所述四种肺癌细胞系为A549、HCC827、Calu-1和NCI-H1299。上述癌细胞均为市售产品。

一、免疫印迹检测四种肺癌细胞系的PD-1的表达

包括如下步骤：

(1)蛋白提取：在显微镜下观察细胞状态和密度，达到实验需求后，去除上清，用PBS洗一遍，去掉PBS，尽量吸干，加入适量的细胞裂解液，用细胞刮轻轻将细胞从皿底上刮下，然后将刮下的细胞转移到EP管中，冰上裂解20min，然后于4℃，12,000rpm离心20min,取上清，备用。

(2)蛋白浓度检测：用BCA试剂盒检测蛋白浓度，配制混合液，A液：B液＝1:50，每个样品设3个复孔进行检测，每个孔加入200ul混合液，再加入1ul步骤(1)中所述上清，将酶标板放入37℃培养箱中，反应30min。酶标仪测吸光值，根据标准曲线，计算蛋白浓度。

(3)制样：最后向蛋白样品中加入5×SDS Loading Buffer，100℃金属浴煮蛋白样品10min；

(4)制胶：下层根据蛋白大小选择浓度适合的分离胶，上层5％浓缩胶；

(5)SDS-PAGE：蛋白上样量一般为30-50μg，根据蛋白丰度进行适当调整，一开始可以恒压90V跑，待样品跑过浓缩胶，可以换成高电压跑：120V跑1.5h(在冰上跑可以跑得比较平整，1×Running Buffer可以放4℃预冷)，待溴酚蓝跑到底部后停止电泳；

(6)转膜：电泳结束之后，小心地拆开胶板，将蛋白胶转移到NC膜或者PVDF膜(需预先浸泡无水甲醇)的上方，放在转膜夹中，然后浸入加了1×Transfer buffer的转膜槽中，一般设置为恒定电流约200mA转50min，蛋白越大可适当延长转膜的时间(注意：转膜的时候不能将胶放反，并且用恒定电流转膜的时候需要置于冰水中，防止热量太高影响转膜结果)；

(7)封闭：转膜结束后，取出NC或PVDF膜，用5％脱脂奶粉封闭，在室温封闭1h；

(8)孵育一抗：封闭结束之后，1×TBST洗膜3遍，每次10min，然后孵育一抗(PDCD1抗体，公司：ORIGEN)。一抗4℃过夜，一抗浓度一般1：1,000，用5％BSA加抗体原液再加千分之五的抑菌剂配制而成，根据说明书和实验结果调整；

(9)洗膜：将一抗回收，用1×TBST洗膜3遍，每次10min；孵育二抗(HRP标记的山羊抗小鼠/兔)：室温孵育1.5h，二抗用5％脱脂奶粉配制，一般是1：2,000-1：5,000，二抗可放4℃保存，重复使用2-3次。洗膜：1×TBST洗膜3次，每次10min；

(10)曝光：将膜表面的TBST尽量吸干之后，放置在化学发光成像***仪器中，在膜的表面滴加配制好的发光液，自动曝光，随后根据结果手动调整曝光时间，然后保存图片的原格式和TIFF格式。

免疫印迹试验结果见图1C，由图中可看到中PD-1条带颜色越明显，表明PD-1含量越高，结果显示PD-1在检测的四种肺癌细胞系中均有表达。

二、利用RT-PCR技术检测四种肺癌细胞系中PD-1mRMA的表达水平所述RT-PCR技术按照实施例1中的RT-PCR方法实施。

RT-PCR试验结果见图1C中PDCD1条带，条带颜色越明显，表明PD-1含量越高，结果显示PD-1mRNA在检测的四种肺癌细胞系中均有表达。

三、利用Q-PCR技术检测四种肺癌细胞系的mRNA水平

所述Q-PCR技术按照实施例2中的Q-PCR方法实施。

Q-PCR试验结果见图1C中柱状图。图1C柱状图中的纵坐标表示DeltaCT值(目的基因CT值减去内参CT值)，Delta CT值越高，说明PD-1表达水平越低。结果表明PD-1在四种肺癌细胞中均有表达。

实施例4

本实施例采用流式细胞术技术检测四种肺癌细胞系的PD-1表达群体数，流式细胞术检测的是细胞表面的PD-1表达情况，代表的是表达PD-1的细胞所占的一个群体比例。

所述四种肺癌细胞系与实施例3中的相同。

取四种肺癌细胞系按照如下流式细胞术方法进行检测：

1)待细胞长到大约90％，弃掉上清，PBS洗一遍，再加入2ml 0.25％EDTA-2Na，放入37℃培养箱，消化10min。待细胞消化完，将其吹打下来，转移到ep管中，2000rpm，离心6min；

2)弃掉上清，再用0.5％BSA洗一遍，2000rpm，离心6min；

3)弃掉上清，每管加入95ul 0.5％BSA，再加入5ul封闭液，混匀；

室温封闭10min(封闭完以后，按实验需求将样品分为数管，一个样品至少分为一管实验组和一管同型对照组)

4)每管加入100ul 0.5％BSA，加入相应的抗体(实验组：PDCD1抗体，公司ORIGEN；对照组：Purified Mouse IgG2a,κIsotype Ctrl Antibody，公司：Biolegend)(一般1：100稀释，具体使用浓度根据说明书调整)；

5)放4℃摇床，一个小时(每隔半小时可将样品轻轻弹起，以便抗体结合充分)；

6)敷完一抗(PDCD1抗体)，直接向样品中加入1ml的0.5％BSA，吹匀，2000rpm，离心6min；

7)弃掉上清，每管加入100ul 0.5％BSA，加入相应的二抗(标记PD-1的二抗：APCGoat anti-mouse IgG(minimal x-reactivity)Antibody)；

8)避光，室温放置一个小时(每隔半小时可将样品轻轻弹起，以便抗体结合充分)。

9)敷完二抗，加入1ml的0.5％BSA，吹匀，2000rpm，离心6min.

10)弃掉上清(尽量吸干)，每管加入300ul PBS，通过尼龙网膜过滤到流式管中(防止流式细胞仪堵塞)。

11)上机(流式细胞仪型号：BD FACSCelestaTM)，检测。

检测结果见图1D中散点趋势图，趋势图位置越高表明总体癌细胞中带有PD-1分子表达的癌细胞比例越高，结果显示PD-1分子在所检测的四种肺癌细胞系中均有表达。

实施例5

本实施例采用流式细胞术技术检测了七个肺癌病人(七个肺癌病人的样本来自北大肿瘤医院)的瘤块中PD-1的表达情况，检测样本是利用从7个肺癌病人病变组织中取下的瘤块制成单细胞悬液，然后进行流式细胞术检测，流式细胞术检测按照实施例4中的实施。

检测结果见图1E中散点图，散点位置越高表明总体检测癌细胞中带有PD-1分子表达的癌症分子比例越高，结果显示PD-1分子在临床病人病变组织上取得的肿瘤细胞中均有表达。

实施例6PD-1敲减对癌症细胞增殖的影响试验

本实施例采用Q-PCR方法检测两株肺癌细胞系(Calu-1和NCI-H1299)中PD-1敲减前后的表达水平，包括如下步骤：

一、慢病毒包装实验

在本实验中将带有PDCD1shRNA的质粒和不带有PDCD1shRNA的空白质粒，分别导入肺癌细胞Calu-1和NCI-H1299两种细胞系中，获得PD-1分子敲减细胞系实验组和空白对照组细胞系。PDCD1shRNA质粒的作用是用来降低PD-1的表达，PDCD1shRNA序列为GCTTCGTGCTAAACTGGTACC，带有PD-1shRNAPDCD1shRNA的重组质粒pSIH-H1-Puro质粒的细胞为敲减组，不带有PDCD1shRNA的空白质粒pSIH-H1-Puro的细胞作为对照组。上述带有PDCD1shRNA重组质粒pSIH-H1-Puro(shRNA序列由金唯智生物科技有限公司合成，带有PDCD1shRNA重组质粒pSIH-H1-Puro采用现有的常规方法合成，也可委托金唯智生物科技有限公司合成)，空白质粒pSIH-H1-Puro为市售产品。具体包括如下步骤：

1)第一天：铺293T-Lenti-X细胞(市售产品)(一般使用6cm培养皿)，保证第二天细胞密度达到70％-80％。

第二天：转染

配制质粒转染体系如下(目的质粒为带有PDCD1shRNA的重组质粒pSIH-H1-Puro或不带有PDCD1shRNA的空白质粒pSIH-H1-Puro)：

A管：

试剂	用量
		PSPAX2	3μg
PMD2G	2.5μg
		目的质粒	4μg
Opti-MEM	up to 100μl

B管：

试剂	用量
		PEI Reagent	25.5μl
Opti-MEM	up to 100μl

2)将B管配好后，轻轻涡旋2-5s，室温静置5min；然后将B管中混合液转入A管中，再轻轻涡旋2-5s，室温静置15-20min；

3)293T-Lenti-X细胞用2ml Opti-MEM或者无FBS的DMEM铺满底层(6cm皿一般加入2ml铺底)，然后将转染混合液加入即可。转染6h左右将含转染试剂的基本培养基换成含10％FBS的DMEM完全培养基培养。

4)铺目的细胞(肺癌细胞)：保证每皿细胞密度第二天达到30％-40％。

第三天：开始感染。分别收取步骤3)中24h、48h和72h慢病毒去连续感染目的细胞。每次感染完，六小时后换液(细胞状态好的话也可以不换)

5)感染完72h病毒的目的细胞要进行抗生素筛选，转入带pSIH-H1-Puro载体的质粒的细胞用嘌呤霉素(puromycin)筛选，筛选结束之后便可进行下一步的实验。

二、Q-PCR方法检测

将步骤一中导入带有PDCD1shRNA的质粒和不带有PDCD1shRNA的空白质粒的肺癌细胞系进行Q-PCR方法检测，所述Q-PCR方法与实施例2中的Q-PCR方法相同。

Q-PCR技术检测肺癌细胞系的两种细胞株的PD-1敲减细胞系敲减组和对照组PD-1分子的表达水平。结果见图2A，图中左侧柱形图为Calu-1细胞株的PD-1敲减细胞系敲减组和对照组PD-1分子的表达水平，图中右侧柱形图为NCI-H1299细胞株的PD-1敲减细胞系敲减组和对照组PD-1分子的表达水平。

实施例7两株肺癌细胞系增殖实验

利用实施例6中获得的肺癌细胞系的两种细胞株的PD-1分子敲减组细胞系和空白对照组细胞系通过细胞增殖实验检测PD-1对肿瘤细胞增殖能力的影响。

所述细胞增殖实验包括如下步骤：

准备细胞：PBS洗一遍细胞，用胰酶消化约2min，加入胰酶两倍量的10％FBS培养基中止消化，将细胞吹打下来之后转移至15ml的离心管中，1000rpm离心5min，弃上清，加入2-3ml完全培养基彻底吹匀、悬浮细胞；

细胞计数：每种细胞准备一个干净的EP管，加入180μl PBS和20μl细胞悬液，混匀(可以轻轻弹匀，能避免太多气泡)，相当于将细胞浓度稀释至原来的1/10。取10μl稀释后的细胞悬液加入细胞计数板与盖玻片中间，在显微镜下找出四个大4×4大方格区域进行计数，酌情重复3-4次以取得更准确的数字，最后计算平均每个大方格区域的细胞数，记录为a，则未稀释细胞浓度为a×105cells/ml；

对每组细胞准备一个15ml的离心管，加入相应的培养基(根据铺板所需量决定，一般4-5ml)根据细胞计数的结果向其中加入细胞悬液(加之前要再次吹打保证细胞充分均匀)，使得细胞终浓度为5×104cells/ml，轻轻上下颠倒离心管，保证在没有太多气泡的情况下，将细胞混匀；

细胞充分混匀后向96孔板中每孔各加100μl细胞悬液，每种细胞三个复孔，再加入100μl CTG(

Luminescent Cell ViabilityAssay中文：

发光法细胞活力检测试剂盒)，轻轻混匀，吸取其中100μl混合液到黑色96孔微孔板中，用多功能酶标仪进行读数(发光)。根据读数结果对15ml离心管中的细胞浓度进行调整，确保不同组读数相近，且读数在100-300之间(这个数值表示细胞数为1000个左右)；

铺96孔版(使用排枪)：将每种细胞浓度调整的接近一致后，开始铺板。每个孔中加100μl，每组每次读数至少分配三个复孔，96孔板最外侧一圈不用于读数，可以加多余的细胞培养液，也可加PBS；

第0天读数：向每组细胞的其中三个复孔中加入100μl CTG，混匀后转移100ul到黑色96孔板，放入酶标仪读数。然后再向96孔板中使用过的孔加入100μl干净的培养基或者PBS，确保其他孔周围环境不变。然后放入37℃培养箱培养；之后每隔一天或两天读一次数(根据每种细胞的生长速度)，每次读数后记得补液再放回培养箱继续培养。

注：CTG需要避光使用，并且需分装放入-20保存。读数用96孔黑色/透明底部微孔板。

两株肺癌细胞系中PD-1敲减组与对照组的生长曲线检测结果见图2B，图中左侧图为Calu-1细胞株的PD-1敲减细胞系敲减组和对照组的生长曲线，图中右侧图为NCI-H1299细胞株的PD-1敲减细胞系敲减组和对照组PD-1的生长曲线，结果表明肺癌细胞系的两种细胞株PD-1敲减组细胞系中癌细胞增殖速度明显加快。

实施例8

利用Immunoblot技术检测实施例6中获得的肺癌细胞系的两种细胞株PD-1敲减组和对照组中的信号通路中的蛋白的表达情况。

所述Immunoblot技术与实施例3中的Immunoblot方法相同。

检测结果见图2C，结果表明发现PD-1敲低的细胞株，两个磷酸化蛋白(p-AKT和p-ERK)的表达水平升高。

由实施例7和本实施例的检测结果可知，肺癌细胞系的两种细胞株的PD-1分子的敲减组细胞系中癌细胞增长速度加快，以及癌细胞增殖相关的信号通路上两个蛋白(p-AKT和p-ERK)表达水平的提高表明PD-1分子在癌细胞的表面的缺失有促进癌细胞增殖的作用，且具有促进癌细胞增殖相关的信号通路上两个蛋白p-AKT和p-ERK的作用。

实施例9PD-1过表达对癌症细胞增殖的影响试验

本实施例采用Q-PCR方法检测两株肺癌细胞系(Calu-1和NCI-H1299)中PD-1过表达后的表达水平，包括如下步骤：

一、慢病毒包装实验

在本实验中将带有PD-1表达序列的质粒和不带有PD-1表达序列的空白质粒，分别导入肺癌细胞Calu-1和NCI-H1299两种细胞系中，获得PD-1分子表达升高细胞系实验组和PD-1分子没有表达升高细胞系空白对照组。PD-1表达序列质粒的作用是用来升高PD-1的表达，导入带有PD-1表达序列质粒PLVX-IRES-Neo(采用现有常规方法将PD-1表达序列导入PLVX-IRES-Neo，也可委托金唯智生物科技有限公司合成)的细胞为过表达组，导入不带有PD-1表达序列的空白质粒PLVX-IRES-Neo(市售产品)的细胞作为空白对照组。

所述慢病毒包装实验具体步骤与实施例6相同。转入带PLVX-IRES-Neo载体的质粒的细胞用G418筛选。

二、Q-PCR方法检测

将步骤一中导入带有PD-1表达序列的质粒和不带有PD-1表达序列的空白质粒PLVX-IRES-Neo的肺癌细胞系进行Q-PCR方法检测，所述Q-PCR方法与实施例2中的Q-PCR方法相同。

利用Q-PCR技术检测肺癌细胞系的两种细胞株PD-1过表达细胞系组和PD-1空白细胞系对照组PD-1分子的表达水平。结果见图2D，图中左侧柱形图为Calu-1细胞株的PD-1过表达细胞系组和对照组，图中右侧柱形图为NCI-H1299细胞株的PD-1过表达细胞系组和对照组。

实施例10两株肺癌细胞系增殖实验

利用实施例9中获得的肺癌细胞系的两种细胞株的PD-1分子过表达细胞系组和PD-1空白细胞系对照组通过细胞增殖实验检测PD-1对肿瘤细胞增殖能力的影响。

所述细胞增殖实验与实施例7的细胞增殖实验相同。

检测结果见图2E，结果表明肺癌细胞系的两种细胞株PD-1过表达组细胞系中癌细胞增殖速度明显减慢，图中左侧图为Calu-1细胞株的PD-1过表达组和对照组，图中右侧图为NCI-H1299细胞株的PD-1过表达组和对照组。

实施例11

利用Immunoblot技术检测实施例9中获得的肺癌细胞系的两种细胞株的PD-1分子过表达细胞系组和PD-1空白细胞系对照组中的信号通路中的蛋白的表达情况。

所述Immunoblot技术与实施例3中的Immunoblot方法相同。

检测结果见图2F，结果表明，发现PD-1过表达的肺癌细胞系的两种细胞株中，两个磷酸化蛋白(p-AKT和p-ERK)的表达水平均降低。

由实施例10和本实施例的检测结果可知，肺癌细胞系的两种细胞株的PD-1分子的过表达组细胞系中癌细胞增长速度减慢，以及癌症细胞增殖相关的信号通路上两个蛋白(p-AKT和p-ERK)表达水平的降低表明PD-1分子在癌细胞的表面的表达有抑制癌细胞增殖的作用，且具有抑制癌细胞增殖相关的信号通路上两个蛋白p-AKT和p-ERK的作用。

实施例12

本实施例提供了免疫缺陷小鼠中注入了稳定细胞系PD-1敲低组和对照组后体内肿瘤生长曲线的检测，包括如下步骤：

1)从江苏集萃药康生物科技有限公司中购买NSG雄性小鼠(周龄：4-5周)，待小鼠在鼠房中稳定一周以后进行实验；

2)准备细胞：实施例6获得的NCI-H1299细胞系PD-1敲减组和对照组；

3)按小鼠体重进行分组，小鼠皮下注射肿瘤细胞，将步骤2)准备的细胞按照6×10⁶个细胞/只小鼠分别注射到NSG小鼠皮下，每个细胞系注射5只小鼠；

4)待小鼠皮下肿瘤长到150mm³-200mm³。每隔一天称量小鼠的体重，以及量瘤的大小。记录小鼠肿瘤的生长曲线；

5)待小鼠肿瘤的体积达到1500mm³左右，给与小鼠安乐死；

6)取出小鼠体内的肿瘤组织，放4％的多聚甲醛中固定，以备后续实验。

小鼠肿瘤的生长曲线如图3A所示，由图中可看出，敲减组(PDCD1shRNA)的肿瘤体积大于对照组(Vector control)的肿瘤体积，且随着天数的增加，两者之间的差距增大。

小鼠肿瘤大小测量结果如图3B所示(图中的肿瘤为最终肿瘤的大小，每组分别有5个重复)，由图中可看出，敲减组(PDCD1shRNA)的肿瘤体积大于对照组(Vector control)的肿瘤体积。

实施例13

取实施例12中获得的肿瘤组织进行免疫组化实验，包括如下步骤：

1)60℃烤片30min，常规脱蜡水化；脱蜡：组织芯片置于二甲苯浸泡10min；更换二甲苯再浸泡10min，更换50％的二甲苯再浸泡5min。水化：无水乙醇中浸泡5min，更换无水乙醇再浸泡5min，更换95％乙醇浸泡5min，更换80％乙醇浸泡5min，更换70％乙醇浸泡5min，最后用自来水洗三次：过两次水，最后一次泡1min.

抗原修复：将脱蜡水化后的组织切片置于耐高温塑料切片上，放入pH为8.0的柠檬酸缓冲液中，盖上锅盖，高温10min，至沸腾。放气，关阀至高压锅显示计时，5分钟后开盖，修复盒可在自来水笼头下加速冷却，切片冷却至室温，自来水洗涤3次，每次5min。

3)用3％H2O2-甲醇封闭内源性过氧化物酶，室温10min，PBS洗3次，每次5min；

4)滴加正常非免疫动物血清，室温10min；

5)除去多余血清，滴加一抗(p-AKT和p-ERK的抗体)，4℃冰箱过夜；

6)用0.1％Tween-20PBS洗3次，每次5；

7)滴加生物素标记的二抗HRP-conjugated goat anti-rabbit，室温孵育10min；

8)用0.1％Tween-20PBS洗3次，每次5min；

9)DAB显色剂配好后滴加于切片，室温镜检反应5min，自来水冲洗干净，蒸馏水终止显色；

10)苏木素复染1min，可视情况而定延长至2min，清水冲洗3次，每次1,1％的盐酸酒精分化，清水冲洗3次，每次1min，分化后充分水洗返蓝20min，晾干；

11)常规脱水透明，中性树胶封片，镜检。

免疫组化染色结果和统计结果如图4所示，由图中可以看到，检测AKT和ERK的磷酸化水平，发现在PD-1敲减组的小鼠瘤子中，AKT和ERK的磷酸化水平升高。

实施例14

本实施例提供了采用PD-1抗体处理经CFSE染色的Calu-1细胞后，检测细胞增殖。

所示CFSE细胞增殖检测实验步骤如下：

1)准备一盘十厘米皿细胞，PBS洗一遍，加入0.2％EDTA，放入37℃培养箱中，大约消化10min左右。

2)待细胞消化下来，用枪轻轻吹打细胞，将其转移到15ml离心管中，1000rpm，离心5min。去除上清，加入CFSE染色液(1：1000稀释)，即1ml PBS加1ul CFSE，PBS预先37℃预热。

3)将细胞放入37℃水浴锅，30min，避光(建议每隔5-10min混匀一次)。

4)加入完全培养基混匀，终止染色。

5)37℃孵育5min。

6)1000rpm，离心5min,去除上清。

7)用新鲜预热的培养基重悬细胞。

8)取适量细胞上机检测第0天，看细胞整体的染色效率。其余细胞按需求铺到几个6cm培养皿中，然后加入相应的抗体。分组：IgG，Nivo-100ug/ml，Nivo-10ug/ml，Nivo-1ug/ml，Pem-100ug/ml，Pem-10ug/ml，Pem-1ug/ml。

9)注意：染色前取少量未染色细胞做阴性对照。

10)48h后，去除培养基，PBS洗一遍，加入EDTA，37℃消化10min左右，将细胞吹起，转移到ep管中，1000rpm离心5min，去除上清，加入300ul PBS重悬，滤膜过滤后，上流式细胞仪，(流式细胞仪型号：BDFACSCelestaTM)检测，注意：需要未染色细胞做阴性对照。

结果如图5A所示，发现Nivo(PD-1抗体)，Pem(PD-1抗体)处理过的Calu-1细胞的荧光强度小于IgG处理过的细胞的荧光强度，这说明，经Nivo，Pem处理过后，Calu-1细胞生长加快。

实施例15

通过Immunoblot技术检测实施例14中分别经IgG，Nivo，Pem抗体处理后的Calu-1细胞内AKT和ERK的磷酸化水平情况

所述Immunoblot技术与实施例3中的Immunoblot方法相同。

结果见图5B，表明经Nivo，Pem处理过后，细胞内AKT和ERK的磷酸化水平升高。

实施例16

检测经IgG，Nivo抗体处理过后的免疫缺陷小鼠皮下的瘤子生长曲线

向免疫缺陷小鼠中注入稳定NCI-H1299癌症细胞系，方法参照实施例12。

将NCI-H1299癌症细胞系注入免疫缺陷小鼠皮下(10⁷个细胞/小鼠)，待小鼠皮下成瘤，且瘤子长到200mm³左右以后，将小鼠随机分为两组(每组5只)，分别腹腔注射IgG，Nivo抗体(每隔一天注射一次)，量取瘤子的大小，制成生长曲线。结果见图5C。待小鼠瘤子长到接近1500mm³后，将小鼠进行安乐死，将瘤子取出，每组从大到小排序，拍照。结果见图5D。

由图5C-图5D所示，结果表明，Nivo抗体处理组和IgG空白对照组相比，瘤子生长速度明显加快。

实施例17

本实施例提供了用PD-1抗体注入射小鼠腹腔后，小鼠皮下肿瘤内AKT和ERK的磷酸化水平

取出实施例16中所述的Nivo抗体处理的瘤子和IgG空白对照组瘤子进行免疫组化实验，所述免疫组化实验与实施例13相同。

AKT磷酸化水平如图5E所示，ERK的磷酸化水平如图5F所示，由结果表明，经Nivo抗体的小鼠瘤子中，AKT和ERK的磷酸化水平升高。

经肺癌细胞感染的免疫缺陷的小鼠，经过PD-1抗体处理后肺癌细胞株增长速度加快，以及癌细胞增殖相关的信号通路上两个蛋白(p-AKT和p-ERK)表达水平的增加表明PD-1抗体在具有免疫缺陷的癌细胞环境中有促进癌细胞增殖的作用，且具有促进癌细胞增殖相关的信号通路上两个蛋白p-AKT和p-ERK表达的作用。

因此，PD-1作为一种癌症生物标志物对癌症治疗方法的选择上起到了预测作用，试验结果表明，免疫低下的情况下，使用PD-1抗体药会促进癌细胞的过度增长，不建议使用。

显然，上述实施例仅仅是为清楚地说明所作的举例，而并非对实施方式的限定。对于所属领域的普通技术人员来说，在上述说明的基础上还可以做出其它不同形式的变化或变动。这里无需也无法对所有的实施方式予以穷举。而由此所引伸出的显而易见的变化或变动仍处于本发明创造的保护范围之中。

Claims (3)

1.一种癌症生物标志物在制备降低肿瘤中p-ERK和/或p-AKT表达水平的产品中的用途，其特征在于，所述癌症生物标志物为肿瘤细胞中的程序化死亡分子1、基因PDCD1和/或PD-1mRNA；所述肿瘤为肺癌；所述肺癌的细胞为Calu-1或NCI-H1299。

2.一种癌症生物标志物或者检测其存在或水平的试剂在制备预测、评估或鉴定PD-1抗体对癌症抑制有效性、指导用药选择或疗法选择的产品中的用途，其特征在于，所述癌症生物标志物为肿瘤细胞中的程序化死亡分子1、基因PDCD1和/或PD-1mRNA；所述癌症为肺癌；所述肺癌的细胞为Calu-1或NCI-H1299；

所述癌症处于免疫缺陷或免疫功能低下环境中。

3.根据权利要求2所述的用途，其特征在于，包括：

测定所述的癌症生物标志物在免疫缺陷或免疫功能低下的癌症患者的肿瘤样品中是否存在，若测定结果显示存在，则指示PD-1抗体对治疗所述癌症患者无效或可能出现超进展现象；或者

测定所述的癌症生物标志物在免疫缺陷或免疫功能低下的癌症患者的肿瘤样品中是否存在，若测定结果显示存在，则指示所述癌症患者不宜选用PD-1抗体药物治疗；或者

测定所述的癌症生物标志物在免疫缺陷或免疫功能低下的癌症患者的肿瘤样品中是否存在，若测定结果显示存在，则指示所述癌症患者不宜选用包括PD-1抗体药物的治疗方法。

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