CN110927385A - 先兆子痫的早期检测 - Google Patents

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Abstract

本发明涉及先兆子痫的早期检测。本发明提供了非侵入性测定以可靠地鉴定患有或有倾向发生先兆子痫(PE)的女性。所述方法包括测量从对象获得的测试样品中膜联蛋白A2(ANXA2)的水平；以及当所述测试样品中ANXA2的水平相对于对照样品降低时，鉴定所述对象为患有先兆子痫或发生先兆子痫的风险提高。还提供了治疗鉴定为患有PE或发生先兆子痫风险提高之对象的方法。

Description

先兆子痫的早期检测
本申请是申请号为201580021153.7的中国专利申请的分案申请，原 申请是2015年3月19日提交的PCT国际申请PCT/IB2015/001404于2016 年10月21日进入中国国家阶段的申请。
相关申请
本申请根据35U.S.C.§119(e)要求于2014年3月21日提交的美国临 时申请序列号61/968,728和于2014年3月24日提交的美国临时申请序列 号61/969,520的权益，其内容通过引用整体并入本文。
技术领域
本发明一般地涉及先兆子痫的生物标志物以及用于治疗该疾病的方 法。
背景技术
先兆子痫(preeclampsia，PE)是产妇和胎儿发病率和死亡率的首要 原因，其影响4％至8％的妊娠，在全世界范围内每年导致超过800万病 例。在临床上，先兆子痫由存在高血压、蛋白尿、水肿，以及在一些患者 中存在HELLP综合征和子痫来定义。已进行了大量努力来开发可准确预 测先兆子痫的标志物。已对产妇子宫动脉中的生化标志物和血流多普勒超 声测量(Doppler ultrasound measurement)进行大量测试，但迄今为止 这些中没有一种实现了广泛的临床应用(Conde-Agudelo等，Obstet General 2004；104：1367-91)。仍然需要开发用于预测先兆子痫的可靠且临 床上可用的标志物。能够鉴定处于患先兆子痫之风险中的孕妇可允许使用 已知有效预防先兆子痫发生的预防剂。
发明内容
本发明提供了非侵入性测定以可靠地鉴定有倾向发生PE的女性。这 允许用合适的治疗进行早期干预以预防或减轻PE。本发明至少部分地基 于如下发现：与具有正常(健康)妊娠的女性中的水平相比，在其先前妊 娠中患有先兆子痫(PE)的女性中子宫内膜膜联蛋白A2(annexin A2， ANXA2)水平降低。
根据本发明的某一方面，提供了用于治疗先兆子痫的方法。所述方法 包括如下确定对象发生先兆子痫的风险是否提高：通过测量从对象获得的 测试样品中膜联蛋白A2(ANXA2)的水平，将测试样品中ANXA2的水 平与ANXA2的对照水平进行比较以确定对象发生先兆子痫的风险是否 提高；以及向确定发生先兆子痫风险提高的对象施用有效量的糖胺聚糖。
在一些实施方案中，对象无先兆子痫病史。在一些实施方案中，样品 选自：子宫内膜组织、子宫内膜基质细胞和子宫内膜流体的样品。在一些 实施方案中，ANXA2的对照水平来自于有过成功妊娠并且无先兆子痫病 史的对象。在一些实施方案中，糖胺聚糖选自：低分子量肝素、硫酸乙酰 肝素、经化学修饰的肝素或硫酸乙酰肝素、低分子量硫酸皮肤素及其混合 物。在一些实施方案中，使用选自ELISA、Western印迹和免疫组织化学 染色的免疫测定来确定ANXA2的水平。在一些实施方案中，对象已知怀 孕。在一些实施方案中，对象试图怀孕。
本发明的一些方面提供了用于诊断先兆子痫或帮助诊断先兆子痫的 方法。所述方法包括测量从对象获得的测试样品中膜联蛋白A2(ANXA2) 的水平；并将测试样品中ANXA2的水平与ANXA2的对照水平进行比较 以确定对象发生先兆子痫的风险是否提高。
在一些实施方案中，对象无先兆子痫病史。在一些实施方案中，样品 选自：子宫内膜组织、子宫内膜基质细胞和子宫内膜流体的样品。在一些 实施方案中，对照样品获自有过成功妊娠并且无先兆子痫病史的对象。在 一些实施方案中，使用选自ELISA、Western印迹和免疫组织化学染色的 免疫测定来确定ANXA2的水平。在一些实施方案中，对象已知怀孕。在 一些实施方案中，对象试图怀孕。
本发明的一些方面提供了用于治疗先兆子痫的方法。所述方法包括获 得目前未患先兆子痫的对象的子宫内膜流体样品，其中所述对象怀孕或者 其中所述对象计划怀孕；进行测定以确定子宫内膜流体样品中ANXA2的 水平；将子宫内膜流体样品中ANXA2的水平与ANXA2的对照水平进行 比较以确定对象发生先兆子痫的风险是否提高；以及如果确定对象发生先 兆子痫的风险提高，向所述对象施用有效量的糖胺聚糖。
在一些实施方案中，对象无先兆子痫病史。在一些实施方案中， ANXA2的对照水平来自于有过成功妊娠并且无先兆子痫病史的对象。在 一些实施方案中，糖胺聚糖选自：低分子量肝素、硫酸乙酰肝素、经化学 修饰的肝素或硫酸乙酰肝素、低分子量硫酸皮肤素及其混合物。在一些实 施方案中，使用选自ELISA、Western印迹和免疫组织化学染色的免疫测 定来确定ANXA2的水平。
本发明的一些方面提供了用于治疗先兆子痫的方法。所述方法包括鉴 定与ANXA2的对照水平相比具有低ANXA2水平、计划怀孕并且无先兆 子痫病史的对象；以及向所述对象施用足以提高对象中ANXA2水平之量 的糖胺聚糖。
在一些实施方案中，ANXA2的对照水平来自于有过成功妊娠并且无 先兆子痫病史的对象。在一些实施方案中，糖胺聚糖选自：低分子量肝素、 硫酸乙酰肝素、经化学修饰的肝素或硫酸乙酰肝素、低分子量硫酸皮肤素 及其混合物。在一些实施方案中，使用选自ELISA、Western印迹和免疫 组织化学染色的免疫测定来确定ANXA2的水平。
本发明的一些方面提供了用于评估糖胺聚糖治疗对先兆子痫之效力 的方法。所述方法包括用有效量的糖胺聚糖治疗患有先兆子痫或发生先兆 子痫风险提高的对象；在用糖胺聚糖治疗之前和之后测量从对象获得的测 试样品中膜联蛋白A2(ANXA2)的水平，其中治疗后的ANXA2水平相 对于治疗前水平提高表明糖胺聚糖治疗是有效的。
在一些实施方案中，糖胺聚糖选自：低分子量肝素、硫酸乙酰肝素、 经化学修饰的肝素或硫酸乙酰肝素、低分子量硫酸皮肤素及其混合物。在 一些实施方案中，使用选自ELISA、Western印迹和免疫组织化学染色的 免疫测定来确定ANXA2的水平。
本发明的每种限制可涵盖本发明的多个实施方案。因此，可以预期， 涉及任一个要素或要素组合的本发明每种限制可包含在本发明的每个方 面之中。本发明并不将其应用限制于以下说明书中阐述或附图中所例示的 结构细节和组件布置。本发明能够具有其他实施方案并且能够以多种方式 实践或实施。此外，本文中使用的措辞和术语是为了描述的目的并且不应 被视为限制。本文中使用“包括”、“包含”或“具有”、“含有”、“涉及”及其变化形式意在涵盖此后列出的项目及其等同物以及另外的项目。
附图说明
图1示出了在先前妊娠中患有sPE的患者中的体外hESC蜕膜化(decidualization)。图1A和1B示出了通过ELISA测量的来自在其先前 妊娠中患重度先兆子痫(severe preeclampsia，sPE)的女性(n＝13)和 对照患者(非PE)(n＝13)的蜕膜hESC与未蜕膜hESC的催乳素和 IGFBP-1分泌。催乳素和IGFBP-1分泌显示为未蜕膜(黑条)和蜕膜(灰 条)的ng/ml(平均值±sd)，并且在图中示意地示出中值(media value)。 图1B示出了通过ELISA测量的IGFBP-1分泌。图1C示出了当与未蜕 膜hESC相比对来自sPE和非PE的hESC诱导体外蜕膜化时的F-肌动蛋 白重构。＊，P＜0.05；＊＊，P＜0.005
图2示出了sPE中ANXA2的免疫组织化学和western印迹分析。图 2A示出了从重度先兆子痫(sPE)子宫内膜的活检中提取的总细胞蛋白 质，其经受SDS-PAGE，并用ANXA2抗体和持家蛋白(housekeeping protein)β肌动蛋白进行免疫印迹。由3次不同的实验进行ANXA2的光 密度分析(densitometric analysis)并用GAPDH进行归一化。图2B示 出了在非PE和sPE子宫内膜组织中观察到的ANXA2含量的染色轮廓 (staining profile)。图2C示出了获得自sPE患者和非PE患者的hESC 蜕膜子宫内膜和未蜕膜子宫内膜的总细胞蛋白质提取物的ANXA2 western印迹和光密度分析。图2D分别示出了蛋白质提取物和条件培养 基hESC的细胞内和细胞外ANXA2分析。通过ELISA由3次不同的实 验测量ANXA2蛋白质并表示为ng/mL(平均值±sd)。＊，P＜0.05；＊＊，P＜ 0.005
图3示出了ANXA2抑制对体外蜕膜化的影响。图3A示出了与未经 处理的hESC相比通过两个***：P4+E2和cAMP+MPA进行的蜕膜hESC 的ANXA2western印迹和光密度测定分析。图3B示出了在3次不同的实 验中通过ELISA测量的蜕膜hESC和未经处理的hESC的条件培养基的 细胞外ANXA2水平。通过RT-PCR和western印迹分析评价对照细胞(未 转染)、用乱序序列(scramble sequence)(对照siRNA)转染的细胞或用 ANXA2特异性siRNA(ANXA2siRNA)转染的细胞的mRNA(图3C) 和蛋白质ANXA2水平(图3D)。图3E和3F示出了通过ELISA测量的 对照和ANXA2siRNA抑制的hESC的条件培养基的PRL和IGFBP-1水 平。图3G示出了通过罗丹明鬼笔环肽染色可视化的对照、对照siRNA和 ANXA2抑制的hESC的F-肌动蛋白结构。图3H示出了通过体内测定分 析的G-肌动蛋白(可溶的)、F-肌动蛋白(丝状的)和总肌动蛋白级分， 并通过ANXA2抑制的hESC和对照hESC中的western印迹分析观察结 果。由3次不同的实验进行光密度分析，表示为G/F肌动蛋白比例，并 用总肌动蛋白进行归一化。
图4示出了ANXA2抑制的hESC的运动性(motility)、滋养层扩散 和侵袭分析。图4A示出了对照和ANXA2抑制的hESC的创伤愈合测定。 在受伤后0小时和24小时测量创伤宽度。通过图像分析确定创伤闭合百 分比。值为来自3次不同实验的10次测量的平均值。图4B示出了用 ANXA2 siRNA转染，然后与小鼠胚泡共培养直至发生胚胎附着的hESC。 48小时后，将hESC用波形蛋白(vimentin)免疫染色并将小鼠滋养层细 胞用E-钙黏蛋白(E-cadherin)免疫染色。小鼠胚泡在hESC上的扩散用 白线圈出并以像素为单位测量面积。图4C示出了用于测量人滋养层 JEG-3细胞侵袭对ANXA2抑制的hESC的影响的胶原transwell侵袭测 定的示意图。直方图示出了JEG-3侵入细胞的百分比，将对照细胞的侵 袭指定为100％。数据代表3次独立实验的平均值。＊，P＜0.05；＊＊，P＜0.005
图5示出了ANXA2抑制的hESC和sPE hESC的纤溶活性。图5A 示出了在3次不同的实验中通过ELISA评价的来自sPE患者的ANXA2 抑制的hESC和hESC的条件培养基的纤溶酶原水平并表示为中值 pg/mL。图5B示出了hESC条件培养基具有的通过荧光功能测定评价的纤溶酶活性并表示为活性纤溶酶的mM浓度。在3次不同的实验中通过 ELISA评估ANXA2抑制的hESC和sPE hESC的条件培养基的MMP2 (图5C)和MMP9(图5D)蛋白质水平。图5E示出了对照、对照siRNA、 ANXA2siRNA和sPE hESC，其用50μg/mL或100μg/mL肝素处理以及 未经处理并在0分钟、15分钟、30分钟和60分钟的间隔期间分析纤溶酶 原水平。图5E示出了用100μg/mL肝素处理或未经处理的ANXA2抑制 的hESC和sPE hESC的条件培养基的纤溶酶活性。图5F示出了用肝素 剂量处理的hESC之条件培养基的分泌的ANXA2蛋白质。通过ELISA 评价经肝素处理的hESC之条件培养基的MMP2(图5H)和MMP9(图 5G)水平。
图6示出了作为PE的母系原因的模型，所述模型整合了存在于sPE 中的至少部分地由ANXA2缺失介导的hESC蜕膜化抗性与浅滋养层侵袭 和纤溶改变。
图7示出了子宫内膜流体中ANXA2水平的研究。
具体实施方式
本发明至少部分地基于如下发现：与正常妊娠的女性中的水平相比， 在其先前妊娠中患有先兆子痫(PE)的女性中子宫内膜膜联蛋白A2 (ANXA2)水平降低。本发明的方法提供非侵入性测定以可靠地鉴定有 倾向发生PE的女性。因此，本发明使得可以在症状出现之前早期检测患 PE的倾向，从而允许及时开始合适的治疗。本发明的另一个优点在于可 用提高ANXA2水平的药剂治疗已确定发生先兆子痫风险提高的女性以 便预防或减轻先兆子痫。
先兆子痫(PE)是以先前血压正常的女性在妊娠20周后出现高血压 (收缩压≥140mmHg和/或舒张压≥90mmHg)为特征的病症。此外，与 正常水平相比，尿中的蛋白质水平提高。将提高的蛋白尿定义为在24小 时收集的尿中≥300mg(The National High BloodPressure Education Program Working Group Report on High Blood Pressure inPregnancy. Am J Obstet General 2000；183：S1-S22)。随着血压的升高，可能出现相 关体征和症状，例如头痛、腹痛、出血问题、癫痫发作和并发症，例如胎 儿生长不良、早产以及甚至胎儿或母亲死亡。频率占所有妊娠的5％至 8％，但在某些群体(例如怀双胞胎的女性)中可大得多。
根据本发明的一个方面，提供了用于治疗先兆子痫的方法。所述方法 包括如下确定对象是否患有先兆子痫或发生先兆子痫的风险是否提高：通 过测量从对象获得的测试样品中膜联蛋白A2(ANXA2)的水平，将测试 样品中ANXA2的水平与ANXA2的对照水平相比以确定对象是否患有先 兆子痫或发生先兆子痫的风险是否提高；以及向确定发生先兆子痫风险提 高的对象施用有效量的已知提高ANXA2水平的药剂。
在一些实施方案中，所述方法包括如下确定对象发生先兆子痫的风险 是否提高：通过测量从对象获得的测试样品中膜联蛋白A2(ANXA2)的 水平，将测试样品中ANXA2的水平与ANXA2的对照水平相比以确定对 象发生先兆子痫的风险是否提高；以及向确定发生先兆子痫风险提高的对 象施用有效量的糖胺聚糖。
根据本发明的一个方面，提供了用于诊断先兆子痫或帮助诊断先兆子 痫的方法。所述方法包括测量从对象获得的测试样品中膜联蛋白A2 (ANXA2)的水平；并将测试样品中ANXA2的水平与ANXA2的对照 水平相比以确定对象发生先兆子痫的风险是否提高。
根据本发明的一个方面，用于治疗先兆子痫的方法。所述方法包括获 得目前不患先兆子痫的对象的子宫内膜流体样品，其中所述对象怀孕或者 其中所述对象计划怀孕；进行测定以确定子宫内膜流体样品中ANXA2的 水平；将子宫内膜流体样品中ANXA2的水平与ANXA2的对照水平相比 以确定对象发生先兆子痫的风险是否提高；以及如果确定对象发生先兆子 痫的风险提高，向所述对象施用有效量的糖胺聚糖。
根据本发明的一个方面，提供了用于治疗先兆子痫的方法。所述方法 包括鉴定与ANXA2的对照水平相比具有低的ANXA2水平、计划怀孕并 且无先兆子痫病史的对象；以及向所述对象施用足以提高对象中ANXA2 水平之量的糖胺聚糖。
根据本发明的一个方面，提供了用于评估糖胺聚糖治疗对先兆子痫之 效力的方法。所述方法包括用有效量的糖胺聚糖治疗患有先兆子痫或发生 先兆子痫风险提高的对象；在用糖胺聚糖治疗之前和之后测量从对象获得 的测试样品中膜联蛋白A2(ANXA2)的水平，其中治疗后的ANXA2的 水平相对于治疗前水平的提高表明糖胺聚糖治疗是有效的。
本文中使用的“对象”包括所有哺乳动物，包括但不限于狗、猫、马、 绵羊、山羊、牛、猪、人和非人灵长类动物。在一些实施方案中，对象是 女性。本文中使用的“发生先兆子痫的风险提高”的对象包括当与群体的平 均代表相比时患先兆子痫的可能性更高的对象。在一些实施方案中，对象 已知怀孕。在一些实施方案中，对象试图怀孕。对象可以先前未有过妊娠、 先前有过一次或更多次正常妊娠、或者在先前妊娠中患有PE。在一些实 施方案中，对象具有先兆子痫的一个或更多个风险因素。例如，对象可具 有以下一个或以下的任意组合：怀有多于一个婴儿的对象；有慢性高血压、 糖尿病、肾病或器官移植病史的对象；初次怀孕的对象；肥胖(特别是身 体质量指数(Body Mass Index，BMI)为30或更高)的对象；40岁以上 或18岁以下的对象；具有先兆子痫家族史(即，母亲、姐妹、外祖母或 阿姨患病)的对象；具有***的对象；具有狼疮或其他自身免 疫疾病(包括类风湿性关节炎、结节病和多发性硬化症)的对象；已进行 体外受精或患有镰状细胞疾病的对象。
在一些实施方案中，本文中描述的方法包括鉴别与ANXA2的对照水 平相比具有低ANXA2水平、计划怀孕并且无先兆子痫病史的对象。本文 中使用的“识别与ANXA2的对照水平相比具有低ANXA2水平、计划怀 孕并且无先兆子痫病史的对象”意指选择与ANXA2的对照水平相比具有 低ANXA2水平、计划怀孕并且无先兆子痫病史的对象。通过向如此鉴定 或选定的对象施用足以提高所述对象中ANXA2水平之量的糖胺聚糖来 对所述对象进行PE治疗。
术语“测试样品”是指来自于使用本发明方法评价的对象(例如，怀孕 或试图怀孕的对象)的样品。样品的非限制性实例包括子宫内膜组织、子 宫内膜基质细胞和子宫内膜流体。获得对象的样品意指取得对象的样品。 获得来自对象的样品意指从对象中取出样品。因此，获得对象的样品并测 量样品中ANXA2水平的人不一定从所述对象获得样品。在一些实施方案 中，可由医疗从业者(例如，医生、护士或临床实验室从业者)从对象中 取出样品，然后提供给测量ANXA2水平的人。可由对象或由医疗从业者 (例如，医生、护士或临床实验室从业者)将样品提供给测量ANXA2水 平的人。在一些实施方案中，测量ANXA2水平的人通过从对象中取出样 品而从所述对象获得样品。
膜联蛋白A2(ANXA2)是钙调节的磷脂结合蛋白，其在人子宫内膜 的分泌中期和分泌后期显著上调。这种蛋白质是通过调节F-肌动蛋白网 由子宫内膜上皮获得接受表型的关键。ANXA2是在人子宫内膜基质细胞 (human endometrial stromal cell，hESC)上存在并起作用的原纤溶受体 (pro-fibrinolytic receptor)。其充当纤溶酶原及其激活物tPA的细胞表面 共受体(co-receptor)，显著增强细胞表面纤溶酶形成。本文中使用的术 语“膜联蛋白A2”是指膜联蛋白A2的任何已知同种型。不受此限制，其 包括核酸序列NM_001002858.2、NM_001136015.2、NM_004039.2、和 NM_001002857.1以及蛋白质序列NP_001002858.1、NP_001129487.1、 NP_004030.1和NP_001002857.1。其他已知的膜联蛋白A2核酸和编码的 多肽描述于WO 2009/143633(通过引用并入本文)中。
本文中公开的方法通常包括测量样品中ANXA2的水平或者进行测 定以确定ANXA2的水平。通常可通过检测来自细胞的mRNA和/或检测 表达产物(例如多肽和蛋白质)来检测ANXA2的水平。由核酸编码的转 录物和/或蛋白质的表达可通过本领域中任何多种已知的方法来测量。例 如，测量ANXA2蛋白水平的方法包括但不限于酶联免疫吸附测定 (ELISA)、Western印迹、免疫组织化学分析、放射免疫测定(RIA)、 质谱、微阵列和显微术。检测ANXA2核酸序列的方法包括但不限于聚合 酶链反应(PCR)、逆转录酶-PCR(RT-PCR)、原位PCR、定量PCR (q-PCR)、原位杂交、Southern印迹、Northern印迹、序列分析、微阵 列分析、报告基因的检测或其他DNA/RNA杂交平台。
本文中公开的方法通常包括将测试样品中ANXA2的水平与ANXA2 的对照水平相比以确定对象发生先兆子痫的风险是否提高。在一些实施方 案中，“ANXA2的对照水平”来自于有过成功妊娠并且无先兆子痫病史的 对象。在这样的一些情况下，当ANXA2的对照水平来自于有过成功妊娠 并且无先兆子痫病史的对象时，测试样品中ANXA2的水平低于对照水平 指示对象患有先兆子痫或发生先兆子痫的风险提高。在一些实施方案中， 已知对照水平可预测发生PE，并且在这样的一些情况下，测试样品中对 应于对照水平的ANXA2水平表明对象患有先兆子痫或发生先兆子痫的 风险提高。因此，与其确定测试水平是否在统计上低于对照水平，不如可 确定测试水平是否处于已知预测发生PE的范围内。对照水平可以是固定 的数字，例如，以ANXA2单位/ml子宫内膜流体计。对照水平可以是一 个范围。对照水平可以是在对照样品中测量的比较水平，所述水平与测试 水平的测定同时测量。对照水平可表示成平均值与标准偏差。本发明不旨 在受限于通过其确定测试样品在统计上低于或对应于对照的特定方法。
在一些实施方案中，在整个***的任何阶段测量ANXA2水平。 在一些实施方案中，在***的黄体期期间测量ANXA2水平。在一些 实施方案中，在***的黄体中期(第18-24天)期间测量ANXA2水 平。在一些实施方案中，正常对象(即，有过成功妊娠并且无先兆子痫病 史的对象)在***的黄体中期(第18-24天)期间测量的ANXA2的 平均对照子宫内膜流体水平为32μg/ml(平均值±4)，而有倾向患PE的 对象在黄体中期的ANXA2水平与该对照水平相比显著降低。在一些实施 方案中，有倾向患PE的对象中的ANXA2水平低于该平均对照ANXA2 水平2、3、4或5个标准偏差。在一些实施方案中，有倾向患PE的对象 在黄体中期的ANXA2水平小于5μg/ml、小于10μg/ml、小于15μg/ml、 小于20μg/ml或小于25μg/ml。
在一些实施方案中，测试样品中ANXA2的水平相对于对照样品降低 指示对象患有PE或发生先兆子痫的风险提高。“表达降低”意指测试样品 中ANXA2的表达与对照样品中相比统计上显著降低。例如，当测试样品 中ANXA2的表达水平比对照样品中的低至少1％、至少5％、至少10％、 至少25％、至少50％、至少100％、至少250％、至少500％或至少1000％时，可检测到显著降低。类似地，当测试样品中ANXA2的表达水平比对 照样品的低至少2倍、至少3倍、至少4倍、至少5倍、至少6倍、至少 7倍、至少8倍、至少9倍、至少10倍、至少20倍、至少30倍、至少 40倍、至少50倍、至少100倍或更多时，可检测到显著降低。可通过使 用合适的统计检验来鉴定显著性差异。统计学显著性检验在本领域中是公 知的并且在Petruccelli，Chen和Nandram的1999年重印版的Applied Statistics for Engineers andScientists中例示。
在一些实施方案中，总结分析结果(即，对象是否患有PE或有倾向 患PE)和有关该分析的任何其他信息的报告可任选地作为分析的一部分 生成(其在本文中可互换地称为“提供”报告、“产生”报告或“生成”报告)。 例如，可确定血压和/或尿中蛋白质含量的测量值并且这些可以包含在报 告中。报告的实例可以包括但不限于纸质报告(例如测试结果的计算机生 成的打印输出)或等效格式和存储在计算机可读介质(例如CD、计算机 硬盘驱动器或计算机网络服务器等)上的报告。报告(特别是存储在计算 机可读介质上的那些)可以是数据库(例如患者记录数据库，其可以是具 有限制获取报告的安全特性的“安全数据库”，例如，仅允许患者和患者的 医疗从业者查看报告)的一部分。作为生成有形报告的补充或替代，还可 使报告显示在计算机屏幕(或另一电子器件或仪器的显示器)上。
还可将报告传输、传递或报告(在本文中这些术语可互换使用)给例 如被测试的个体、医疗从业者(例如，医生、护士、临床检验从业者、遗 传咨询师等)、医疗机构、临床实验室和/或意图查看或持有报告的任何其 他方。“传输”或“传递”报告的行为可基于报告的形式通过本领域中已知的 任何方法来进行，并且包括口头传输和非口头传输。此外，“传输”或“传 递”报告可包括递送报告(“推”)和/或撤回(“拉”)报告。例如，非口头 报告可通过如下这样的方式传输/传递：在各方之间物理地传送(例如对 于纸质形式的报告)；例如通过从一方物理地递送到另一方；或者通过以 电子方式或以信号形式(例如，经由电子邮件或通过互联网、通过传真、 和/或通过本领域中已知的任何有线或无线通信方法)传输；例如通过从 存储在计算机网络服务器上的数据库检索等。
在一些实施方案中，本文中描述的方法包括用有效量的已知提高 ANXA2水平的药剂治疗鉴定为患有先兆子痫或有倾向发生先兆子痫的对 象以预防或减轻先兆子痫。已知提高ANXA2水平的药剂包括但不限于糖 胺聚糖。糖胺聚糖的实例包括但不限于低分子量肝素、硫酸乙酰肝素、经 化学修饰的肝素或硫酸乙酰肝素、低分子量硫酸皮肤素及其混合物。用于 治疗先兆子痫的糖胺聚糖的另外的实例描述于EP1016410中，其通过引 用并入本文。
本文中使用的术语“治疗”意指降低或减轻对象发生PE的风险。对象 发生PE的风险降低可表现为与治疗前获得的ANXA2水平相比或者与对 照正常ANXA2水平(即，先前有过成功妊娠并且无PE病史的对象的ANXA2水平)相比，ANXA2水平提高。在一些实施方案中，术语“治疗” 意指以可检出的量或程度减轻或缓解PE。本文中使用的术语“治疗”指完 整治疗和局部治疗二者。例如，治疗PE可表现为尿中蛋白质水平降低和 /或与治疗前获得的血压水平相比或者与对照正常血压水平相比，血压水 平降低。
糖胺聚糖的“有效量”是指足以引起期望的生物应答(即，治疗先兆子 痫)的量。如本领域普通技术人员所理解的，糖胺聚糖的有效量可根据例 如这样的因素而变化：期望的生物学终点、化合物的药物代谢动力学、被 治疗的病症、施用方式以及对象的年龄和健康状况。有效量包括但不限于 减缓、减轻、抑制、缓解或逆转与PE有关的一种或更多种症状所必需的 量。在PE的治疗中，这样的量可指与治疗前获得的血压水平相比或者与 对照正常血压水平相比足以降低血压水平的量。在一些实施方案中，有效 量可指足以引起尿中蛋白质水平降低的量。在一些实施方案中，有效量可 指足以降低对象发生PE的风险的量。这样量可指与治疗前获得的ANXA2 水平相比或与对照正常ANXA2水平(即，有过成功妊娠并且无先兆子痫 病史的对象的ANXA2水平)相比足以提高/提升ANXA2水平的量。在一 些实施方案中，所述量足以重建被治疗对象中ANXA2的对照正常水平。
化合物的有效量可在约0.001mg/kg至约1000mg/kg的范围内变化， 施用一个或更多个剂量，持续一天或数天(取决于施用方式)。在某些实 施方案中，有效量在约0.001mg/kg至约1000mg/kg，约0.01mg/kg至约 750mg/kg，约0.1mg/kg至约500mg/kg，约1.0mg/kg至约250mg/kg， 以及约10.0mg/kg至约150mg/kg的范围内变化。在一些实施方案中，有 效量为1000IU、2000IU、3000IU、40000IU、5000IU、6000IU或7000 IU糖胺聚糖。在一些实施方案中，有效量为5000IU糖胺聚糖(例如， 低分子量肝素)。糖胺聚糖可经由任何合适的施用途径施用。例如，糖胺 聚糖可通过皮下、静脉内、腹膜内或肌内途径施用。
在一些实施方案中，本文中描述的方法包括在用糖胺聚糖治疗之前和 之后测量从对象获得的测试样品中膜联蛋白A2(ANXA2)的水平。相对 于治疗前的水平，预期有效治疗在治疗后可提高ANXA2的水平。因此， 有效治疗由治疗后ANXA2的水平提高指示。
通过以下实施例进一步举例说明本发明，所述实施例决不应解释为进 一步的限制。本申请全文中引用的所有参考文献(包括参考文献、授权的 专利、公开的专利申请和正审查的专利申请)的全部内容均通过引用明确 并入本文。
实施例
实施例1：通过ANXA2缺乏介导的子宫内膜蜕膜化抗性揭示先兆子痫的 母系原因
材料和方法
组织收集、hESC分离、以及培养
于2011年8月8日获得CEIC Ethics Committee of Hospital La Fe， ValenciaSpain的IRB批准(代码2011/0383)并且每位患者在组织收集 之前签署了知情同意书。从在其上次妊娠(发生在1年至5年间)期间患 有sPE的女性获得重度先兆子痫(sPE)子宫内膜活检(n＝13)。从年龄 为18-32岁的正常妊娠女性(n＝13)中收集非先兆子痫(非PE)子宫内膜活检。所有患者有规律的***，没有潜在的子宫内膜病理状况，并 且在活检收集之前3个月内没有接受激素治疗。两组的平均年龄和平均 BMI相似。
在无菌条件下使用pipelle(Genetics，Belgium)获得子宫内膜活检。 对样品进行处理，并如先前所述(41)通过温和胶原酶消化分离基质隔室。 使用由含有10％经活性炭吸附(charcoal stripped)的胎牛血清(fetal bovine serum，FBS)和0.1％抗生素的Dulbecco改良Eagle培养基 (DMEM)/F12(Sigma，Madrid，Spain)构成的培养基培养人子宫内膜 基质细胞(hESC)培养物。将用于不同测定的hESC在板中培养至融合， 2天或4天。
体外蜕膜化方案
用含有2％FBS、0.1％抗生素的DMEM/F12和如下两个不同的蜕膜 化方案使融合的hESC单层蜕膜：i)在9天期间孕酮(P4)(1μM)和β- ***(E2)(30nM)，每3天更换培养基；ii)在3天期间8-溴-cAMP (cAMP，Sigma)(0.5mM)和醋酸甲羟孕酮(MPA，Sigma)(1μM)。 对照hESC并行培养而不含蜕膜反应的诱导物。
通过用ELISA分析条件培养基中PRL(Abnova)和IGFBP-1 (Raybiotech)蛋白水平在生物化学上证实以及通过F-肌动蛋白染色在形 态上证实特征性蜕膜表型。将hESC在塑料板中培养至30％-40％融合。 为了使表位掩蔽的影响最小化，将细胞用低浓度固定剂(2％-3％多聚甲 醛)固定并用5％BSA封闭。将细胞于室温下在黑暗中用来自鬼笔鹅膏(Amanita Phalloides)的针对F-肌动蛋白的0.1μg/mL鬼笔环肽-四甲基 罗丹明B异硫氰酸酯(Phalloidin-tetramethylrhodamine B isothiocyanate) 缀合物(Sigma Aldrich，USA)孵育30分钟。用配备有100×1.45数值孔 径物镜和Yokogawa转盘式共聚焦单元(PerkinElmer)的Nikon显微镜 获得荧光共聚焦图像。对于每种免疫荧光标记，至少使用三个不同的组织 制备物。
细胞内和细胞外ANXA2蛋白质测定
使hESC细胞在裂解缓冲液(50mM Tris-HCl pH 8.0、150mM NaCl、 1％IGEPAL CA360、0.5％Na-DOC、0.1％SDS和0.5M EDTA)中裂 解。通过电泳在10％SDS-PAGE凝胶上分离蛋白质提取物(25μg/泳道)， 将其转移到聚偏二氟乙烯膜(Hybond-P(疏水性聚偏二氟乙烯膜)) (Amersham Biosciences，NJ，USA)上并在包含5％乳和0.1％Tween 的PBS缓冲盐水中封闭。将膜在4℃下用1/2500兔多克隆抗人膜联蛋白 II(Abcam，Cambridge，UK)和1/2000小鼠单克隆抗人β-肌动蛋白(Santa Cruz，CA，USA)孵育过夜，并用来自Santa Cruz(CA，USA)的辣根 过氧化物酶缀合的山羊抗兔和山羊抗小鼠IgG-HRP二抗显示。使用增强 化学发光ECL Plus试剂(Amersham Biosciences，CT，USA)检测抗体 -抗原复合物。
通过ELISA(R&D Systems，MN，USA)分析蛋白质提取物(2μg/ 孔)和条件培养基。固定化捕获抗体特异性结合膜联蛋白A2。在洗去未 结合的物质后，使用标准的链霉亲和素-HRP形式，使用膜联蛋白A2特 异性的生物素化检测抗体来检测结合的膜联蛋白A2。每个条件重复进行 三次并对将吸光度值外推至标准曲线以建立人膜联蛋白A2浓度 (pg/mL)。
ANXA2免疫组织化学
将***固定和石蜡包埋的子宫内膜活检切片并安装到涂有 Vectabond(Vector Laboratories，Burlingame，CA，USA)的载玻片上。 脱蜡和再水化后，将切片用PBS润洗3次，持续5分钟。使用LSAB过 氧化物酶试剂盒(Dako，Carpinteria，CA，USA)在子宫内膜切片上进 行免疫组织化学。用PBS中的5％BSA封闭非特异性结合。将切片于室 温下用在含有3％BSA的PBS中稀释的1∶100兔多克隆抗人膜联蛋白II (Abcam，Cambridge，UK)孵育1小时。在不存在抗体的情况下，阴 性对照用包含3％BSA的PBS孵育。二抗包含在LSAB过氧化物酶试剂 盒(Dako)中，其对兔来源一抗有效。用3,30-二氨基联苯胺(DAB)色 原进行染色持续30秒至1分钟的时间。在用苏木精复染色10秒并用蒸馏 水洗涤后，将载玻片用entellan(Merck，Darmstadt，Germany)封固。 ANXA2 siRNA
为了使ANXA2沉默，使用ANXA2特异性的siRNA寡核苷酸(CGGCCUGAGCGUCCAGAAATT，SEQ ID NO：1)和阴性对照RNA双链体，其均用 3’-AlexaFluor488(Qiagen CA，USA)修饰。将hESC用ANXA2siRNA (100nM)或siRNA阴性对照(100nM)转染。所有转染实验使用 Lipofectamine 2000(Invitrogen)和DMEM/F12培养基进行。将细胞在 处理下于37℃下孵育6小时，然后用不含siRNA的新鲜培养基更新培养 基。
F-肌动蛋白/G-肌动蛋白体内测定
使用G-肌动蛋白/F-肌动蛋白体内测定试剂盒(Cytoskeleton，CO， USA)确定经受ANXA2抑制随后经受蜕膜诱导物(AMPc和MPA)的 ESC细胞中游离单体肌动蛋白(G-肌动蛋白)与丝状肌动蛋白(F-肌动 蛋白)的含量。在37℃下使未蜕膜对照、对照野生型、ANXA2siRNA和 蜕膜ESC细胞在F-肌动蛋白稳定缓冲液中匀化。然后用低速离心机(2000 rpm)从细胞裂解物中清除出未破损的细胞。然后将清除的裂解物以 100000×g离心以分离可溶的G-肌动蛋白与不溶的F-肌动蛋白。然后将级 分按比例上样到聚丙烯酰胺凝胶上，通过SDS-PAGE电泳分离并转移至 硝酸纤维素膜上以用1/500抗肌动蛋白抗体(Cytoskeleton，CO，USA) 进行探测。Western印迹的光密度定量确定细胞溶质中存在的G-肌动蛋 白相对于并入细胞骨架的F-肌动蛋白的比例(用总肌动蛋白归一化)。
创伤闭合测定
将hESC细胞接种到盖玻片上，生长至融合并蜕膜，随后用ANXA2 siRNA处理(6小时)。96小时后，用无菌移液管尖端刮划每个盖玻片， 用PBS洗涤并置于新鲜培养基中。即刻和在24小时之后通过相差显微镜 术测量创伤宽度。将创伤闭合计算为初始创伤宽度的闭合面积的百分比。 所示数据代表取自3次独立实验的10次测量的平均值±SEM。
滋养层扩散测定
依照美国国立卫生研究院的实验动物护理和使用指南(U.S.NationalInstitutes of Health guidelines for the Care and Use of Laboratory Animals)，所使用的方案得到瓦伦西亚大学医学院动物护理和使用委员会 (Animal Care and UseCommittee of the Valencia University School of Medicine)的批准。B6C3F1小鼠品系购自Charles River Laboratories (Barcelona，Spain)。使6-8周龄雌性小鼠超数***(superovulated)并 与种畜雄性成对安置过夜。在妊娠的第2天，从输卵管中取出胚胎并在CCM-30培养基(Vitrolife，Lubeck，Germany)中培养3天。研究中仅 包含具有正常形态的扩张胚泡(n＝425个小鼠胚胎)。
将孵化的胚胎在融合的蜕膜hESC单层上共培养充当对照、对照 siRNA或ANXA2siRNA。48小时后，对胚泡附着的滋养层扩散面积进行 评价。将共培养物用低浓度固定剂(2％-3％多聚甲醛)固定并用5％BSA 封闭，在室温下用在3％BSA中稀释的包含1/50小鼠抗波形蛋白(Sigma Aldrich，USA)和1/100兔抗E钙黏蛋白(Abcam，Cambridge，UK) 的一抗孵育2小时。将细胞于室温下在黑暗中用1/1000抗波形蛋白的 TRICT抗小鼠二抗(Invitrogen，Barcelona，spain)和1/1000抗E钙黏 蛋白的Alexa Fluor488抗兔二抗(Invitrogen，Barcelona，Spain)孵育1 小时。在每个实验中每种条件下对10-15个小鼠胚泡进行评估。将生长面 积(以像素表示)表示为取自3次独立实验的一式三份组的测量值的平均 值±SEM。
侵袭测定
使用由滋养层得到的细胞系JEG-3来评价滋养层通过蜕膜hESC侵 袭的能力(参考Hannan 2010)。用胶原Transwell侵袭试剂盒(Chemicon Int.Billerica，MA)进行侵袭测定。培养作为对照、对照siRNA或ANXA2 siRNA的5×105个蜕膜hESC以在24小时期间融合成8mm孔径的 transwell***物。在***物的上方，使106个JEG-3细胞重悬于hESC 培养基中并允许JEG-3细胞侵袭48小时。使用标准酶标仪(microplate reader)通过OD测量侵袭(图4C)。
纤溶研究
通过ELISA试剂盒(Cell Biolabs，CA，USA)按照制造商指示评估 条件培养基中的纤溶酶原水平。通过减去包含培养基但不含hESC的孔的 背景来计算一式两份孔中的平均吸光度(Δ450nm)。
通过荧光测定试剂盒(Anaspec，CA，USA)测量条件培养基中的纤 溶酶活性。其基于蛋白酶切割纤溶酶底物产生在496nm/520nm(激发/ 发射)处检测具有亮绿色荧光的罗丹明110荧光团。将50微升的条件培 养基在室温下预孵育10分钟并向每个孔中添加50uL纤溶酶底物。立即 开始测量获得荧光信号的运动读数并且每5分钟记录数据，持续60分钟， 总计记录13次。每个条件评估两次。使用Rh110荧光参考标准将荧光转 换成浓度值。
MMP2和MMP9水平
通过商业ELISA分析(RayBiotech，GA，USA)评估MMP2和MMP9 前体形式和活性蛋白形式。这些测定使用包被到96孔板上的对人MMP-2 和MMP-9特异性的抗体。将标准品和样品一式两份吸移到孔中并使样品 中存在的MMP-2和MMP-9通过固定化抗体结合到所述孔中。添加生物 素化的抗人MMP-2和MMP-9和HRP缀合的链霉亲和素。添加TMB底 物溶液并将450nm处的吸光度外推至标准曲线。
定量PCR
使用Trizol LS试剂(Invitrogen，Barcelona，Spain)按照制造商的 说明书从hESC培养物中提取总RNA。首先，使用Advantage RT-for-PCR 试剂盒(Clontech CA，USA)根据制造商的说明书将1μg总RNA逆转 录成cDNA。在Light Cycler 480***(Roche)中使用SYBR Green(Roche) 进行定量实时PCR。使用GAPDH作为内对照，将转录物通过相应的标 准曲线量化。每个实验用一式三份的各样品进行3次。使用以下引物：
ANXA2(Fw：TGTGCAAGCTCAGCTTGGA，SEQ ID NO：2，
Rv AGGTGTCTTCAATAGGCCCAA，SEQ ID NO：3)和GAPDH
(Fw GAAGGTGAAGGTCGGAGTC，SEQ ID NO：4，Rv GAAGATGGTGATGGGATTTC，SEQ IDNO：5)。
肝素剂量响应
在50μg/mL和100μg/mL肝素(Sigma，Madrid)的存在下，将hESC 在单层上培养15分钟、30分钟和60分钟以精心进行剂量-响应实验。收 集来自hESC细胞的条件培养基以分析纤溶酶原水平、纤溶酶活性和金属 蛋白酶产生。
统计分析
每个实验使用至少3种不同的子宫内膜活检并且测量一式三份地进 行。表示为平均值±SEM，n表示实验次数。使用t检验用SPSS软件分析 数据以分析组之间的总体差异。P≤0.05的p值被认为是显著的。(＊p≤0.05， ＊＊p≤0.01，＊＊＊p≤0.001)
结果
在其先前妊娠中患有sPE的患者中的体外蜕膜化抗性
与具有正常妊娠史的对照患者(非PE)(n＝13)相比，对来自在其 先前妊娠中患有重度PE(sPE)的女性(n＝13)的hESC的体外蜕膜化 进行评估。在sPE组中，从患有包括如下不同形式的女性中分离出hESC： 并发的HELLP综合征、子痫或先前两次连续的结束于子痫的发生sPE的 HELLP综合征。sPE患者和非PE患者的BMI和年龄相当，但患sPE的 女性具有更高的收缩压/舒张压、蛋白尿、GOT、GPT和更低的血小板计 数和纤维蛋白原水平。用cAMP(0.5μM)+MPA(1μM)持续5天作为 蜕膜刺激或者用激素诱导物P4(1μM)+E2(30nM)持续9天蜕膜的 hESC表现出类似的结果。因此，本研究使用cAMP+MPA方案。有趣的 是，PRL和IGFBP-1分泌证明，与获得自非PE的对应物相比，在获得 自sPE的hESC中体外蜕膜化受损(分别为图1A和1B)。在体外蜕膜化 期间研究hESC中的F-肌动蛋白重组(reorganization)，并且在非PE中 显示出成纤维细胞表型向扩大的圆形细胞形态的转变，而在来自sPE患 者的蜕膜hESC中不存在向蜕膜表型的转变(图1C)。
sPE中ANXA2的下调和失调的hESC表达
与非PE患者相比，对来自在其先前妊娠中患有sPE的女性的全部子 宫内膜样品中ANXA2蛋白丰度进行分析(图2A)。光密度分析示出，与 非PE患者(n＝6)相比，在来自sPE(n＝6)的子宫内膜中ANXA2丰度 显著降低(图2A)。检查了子宫内膜ANXA2定位。与非PE相比，在sPE 中在基质隔室处观察到较低的染色(图2B)。接着，使来自sPE患者与非 PE患者的hESC分离、蜕膜并通过western印迹评估ANXA2蛋白(图 2C)。光密度分析证明，与非PE患者相比，在sPE女性中，ANXA2在 基础条件下显著降低并且在蜕膜hESC中失调(图2C)。为了进一步量化 该分子，使用ELISA分析这两种条件下在蜕膜化期间的细胞内ANXA2 形式和分泌的ANXA2形式。该分析证实，与对照相比，在蜕膜化刺激物 的存在下，来自sPE女性的hESC经历显著降低和细胞内和细胞外 ANXA2二者中的失调(图2D)。此外，分泌形式反映细胞内ANXA2， 这证实了ANXA2作为生物标志物的用途可用于在PE患者中预测蜕膜化 抗性。
体外蜕膜化期间hESC中ANXA2的调节和功能性
先前的研究示出，在感受性获得(receptivity acquisition)与胚胎着 床的初始步骤期间，ANXA2在人子宫内膜中在整个***中受到调节。 接着对hESC体外蜕膜化期间ANXA2的调节进行研究。通过western印 迹评估的细胞内ANXA2(图3A)和光密度分析证实，相对于未蜕膜hESC， 在使用这两种方案的蜕膜hESC中细胞内ANXA2上调(图3A)。通过ELISA比较hESC细胞内动态测量其上清液中分泌的ANXA2(图3B)。 这些结果表明，在体外蜕膜化期间hESC中的细胞内ANXA2和细胞外 ANXA2上调。
接着，在体外蜕膜化期间通过使用siRNA方法抑制ANXA2分子来 评估hESC中ANXA2的功能性。在hESC转染后24小时，与未蜕膜和 蜕膜这两种条件下的对照组和对照siRNA组相比，在siRNA组中观察到 ANXA2 mRNA(图3C)和蛋白质(图3D)显著降低。为了证实其功能相关性，以蜕膜生物标志物(例如PRL和IGFBP-1)的分泌以及蜕膜刺 激开始后72小时的形态学表型变化评价ANXA2抑制的影响。不同于对 照，siRNA蜕膜的hESC中不存在PRL和IGFBP-1(图3E和3F)。此 外，罗丹明鬼笔环肽染色证实，在蜕膜化过程期间，ANXA2干扰终止F- 肌动蛋白结构的特征表型修饰从而使F-肌动蛋白丝的纵向取向未改变(图 3G)。还使用细胞溶质中存在的游离单体G-肌动蛋白相对于并入细胞骨 架的F-肌动蛋白的比例研究肌动蛋白细胞骨架在ANXA2抑制后的蜕膜 化期间的重组(图3H)。在蜕膜表型和未蜕膜表型的对照和对照siRNA hESC细胞中平均G-肌动蛋白/F-肌动蛋白比例为约1∶1，而ANXA2抑制 的hESC细胞显示与F-肌动蛋白相比单体G-肌动蛋白的含量显著提高(在 未蜕膜ANXA2 siRNA处理的细胞中比例为3∶1，而在蜕膜ANXA2 siRNA 处理的细胞中比例为4∶1)(图3H)。这些数据证明，ANXA2抑制通过肌 动蛋白丝解聚和G-肌动蛋白单体分数显著提高来诱导蜕膜化抗性，这证 明在蜕膜化过程期间ANXA2在F-肌动蛋白纤维重组中的功能作用。
ANXA2抑制降低hESC运动性、滋养层扩散和侵袭
为了进一步理解由ANXA2抑制诱导的蜕膜化抗性对滋养层扩散和 侵袭的旁分泌作用，进行创伤闭合测定以分析ANXA2在hESC运动性中 的影响。使hESC蜕膜化，随后用ANXA2 siRNA转染6小时，然后用划 痕破坏细胞单层，并在24小时期间通过视频显微术追踪ANXA2抑制在 迁移方面的作用(图4A)。与对照和对照siRNA细胞相比，在ANXA2 siRNA抑制的细胞中创伤闭合的百分比显著降低(图4A)。
接着使用异源体外共培养模型研究ANXA2抑制对滋养层扩散的影 响，在所述模型中将小鼠胚胎置于融合的蜕膜hESC单层之上，随后进行 ANXA2 siRNA抑制。E钙黏蛋白和波形蛋白的免疫染色分别鉴定小鼠滋 养层和hESC。将滋养层扩散的总面积评价为像素数，并且与对照和对照 siRNA hESC细胞相比在ANXA2siRNA hESC细胞中观察到显著降低(图4B)。
还使用胶原侵袭室测定分析JEG-3人滋养层细胞系对ANXA2抑制 的hESC细胞的侵袭性。蜕膜hESC为ANXA2 siRNA抑制的并且培养在 胶原层上的***物中。然后，将JEG-3细胞悬液置于***物的上方。对 侵袭通过经处理的hESC单层和胶原屏障的能力进行检查。JEG-3细胞侵 入ANXA2抑制的细胞的百分比与对照hESC相比显著降低(图4C)。
由于ANXA2抑制的不足的纤溶活性也存在于来自sPE的hESC中
纤溶***通过纤维蛋白沉积和有倾向患内皮功能障碍与PE的发病机 制有关。与来自PE女性的hESC相比，对hESC ANXA2抑制对纤溶活 性的功能作用进行研究。出于该目的，对来自蜕膜对照、ANXA2 siRNA 和来自PE的hESC的条件培养基中的纤溶酶原水平和纤溶酶活性进行分 析。与对照siRNA hESC和对照蜕膜hESC相比，在ANXA2 siRNA和来 自sPE的hESC中纤溶酶原水平和纤溶酶活性显著降低(纤溶酶原水平： 分别为229.1±23.1pg/mL和191.5±36.7pg/mL与305.1±23.2pg/mL和 397.1±45.1pg/mL；纤溶酶活性：分别为12.7±3.6mM和4.2±0.75mM与 27.5±10.2mM和23.1±4.1mM)(图5A和5B)。因此，当ANXA2在蜕膜 hESC中受到抑制并且在来自SPE患者的hESC中在更大程度上受到抑制 时，纤溶***有缺陷。
有趣的是，纤溶酶原/纤溶酶***通过产生降解ECM组分(例如纤 维蛋白和胶原)的MMP2和MMP9蛋白调节滋养层侵袭。通过ELISA 分析ANXA2抑制的hESC和sPE蜕膜hESC的条件培养基中的MMP2 和MMP9蛋白分泌。当ANXA2受到抑制时以及在sPE患者中，MMP2 和MMP9分泌水平显著降低(图5C和5D)。
肝素治疗有利于ANXA2降低的hESC中缺陷纤溶***的活化
肝素通过组织纤溶酶原激活物(tPA)作用于纤溶途径，并且也已被 描述为肝素与ANXA2结合的直接效应。在测量对对照siRNA hESC、 ANXA2 siRNA抑制的hESC、非PE和PE蜕膜hESC的纤溶酶原丰度和 纤溶酶活性的剂量响应和时间依赖性实验中分析肝素对纤溶的影响。100 ug/mL肝素在所有研究条件下(包括在ANXA2抑制的hESC和sPE蜕膜 hESC中)显著提高条件培养基中纤溶酶原和纤溶酶的分泌(图5E)。另 外，还评价了肝素对纤溶酶的影响，结果表明，在相同剂量下显著提高对 ANXA2 siRNA和来自sPE的hESC的纤溶酶活性(图5F)。通过ELISA 测量对照、ANXA2 siRNA和来自sPE患者的hESC的条件培养基中分泌 的细胞外ANXA2水平。结果证实，肝素处理诱导分泌到培养基中的 ANXA2蛋白的显著提高(图5G)。
最后，体外测试在所有条件下肝素对MMP2和MMP9金属蛋白酶之 产生的功能作用(图5H)。用肝素处理诱导金属蛋白酶显著提高，所述金 属蛋白酶是促进滋养层侵袭通过子宫内膜基质细胞的关键要素。因此，通 过siRNA诱导或sPE患者中自然存在的肝素对ANXA2缺陷蜕膜hESC 的直接和/或间接作用至少部分地纠正相关纤溶缺陷。
基于这些数据，提出了作为PE的母系原因的模型，所述模型整合了 存在于sPE中的至少部分地由ANXA2缺陷介导的hESC蜕膜化抗性与浅 滋养层侵袭和纤溶变化(图7)。发现，sPE中ANXA2缺乏的hESC或通 过siRNA诱导的hESC未适当地蜕膜，原因是肌动蛋白丝解聚和G-肌动 蛋白单体分数显著提高阻碍其典型形态学转变。主要的下游结果包括对酶 原纤溶酶原的直接影响，导致纤溶酶生成降低，从而由于纤溶***的缺陷 产生前凝血(protrombotic)旁分泌作用。类似地，ANXA2活化缺陷通 过抑制降解ECM组分(例如纤维蛋白和胶原)的MMP2和MMP9导致 浅的滋养层侵袭。添加通过ANXA2起作用的肝素能够克服所指出的下游 效应。
讨论
尽管正深入研究作为PE的可能原因的缺陷CTB分化，但这项研究 集中在涉及该产科并发症起源的子宫内膜的母体旁分泌因子。流行病学研 究显示，母系家族中先前的PE与女性亲属患PE的风险提高24％-163％ 相关。然而，父系家族中的PE发作不影响给定患者患PE的风险。因此， PE的遗传易感性显然与母系相关。
通过调节CTB侵入子宫壁的蜕膜的蜕膜化转变靶向hESC。与非PE 对应物相比，获得自sPE的hESC中的蜕膜化抗性鉴定促进了本研究。
膜联蛋白A2(ANXA2)是钙调节的磷脂结合蛋白，其在人子宫内膜 的分泌中期和分泌后期显著上调。这种蛋白质是通过调节F-肌动蛋白网 由子宫内膜上皮细胞获得接受表型的关键。ANXA2是在hESC上存在并 发挥作用的纤溶受体。其充当纤溶酶原及其激活物tPA的细胞表面共受 体，可显著增强细胞表面纤溶酶生成。由于PE中的纤溶途径改变，机制 分析集中在ANXA2上，原因是该分子的高滴度与抗磷脂综合征 (antiphospholipidsyndrome，APS)(已知有倾向发生PE的病症)中的 血栓形成事件相关。此外，患有PE的胎盘中的ANXA2自身抗体已被认 为是胎盘凝血酶形成的可能原因。
首先，与非PE患者相比，在其先前妊娠中患有sPE的患者中，子宫 内膜基质隔室中的ANXA2降低。接着，分析证实，与对照相比，在蜕膜 化刺激物的存在下，来自sPE女性的hESC经历细胞内ANXA2和细胞外 ANXA2的显著降低和失调。另一个出人意料的发现是，在体外蜕膜化期 间hESC中的细胞内ANXA2和细胞外ANXA2上调并且其功能抑制通过 肌动蛋白丝解聚和G-肌动蛋白单体分数提高诱导蜕膜化抗性。通过 ANXA2抑制诱导的蜕膜化抗性的自分泌和旁分泌作用的进一步调查研究 显示对hESC运动性和滋养层扩散降低及侵袭的直接影响，这些是该病理 状况的标志。
纤溶是这样的有序过程：通过其通过重构和降解纤维蛋白血栓的组织 纤溶酶原激活物(tPA)和尿激酶纤溶酶原激活物(uPA)的作用将纤溶 酶原转化为纤溶酶。来自PE的胎盘中的常见组织病理学发现是出现不同 程度的血栓形成和纤维蛋白沉积。纤溶功能缺陷是血栓形成提高的已知风 险因素。在PE中存在纤溶改变，这表明在该疾病的发生中纤溶异常是原 因或结果。ANXA2对酶原纤溶酶原和相同的外源性纤溶途径具有直接影 响，因此，当ANXA2受到抑制时，蜕膜hESC中的纤溶***中存在缺陷， 并且在来自sPE患者的具有蜕膜化抗性的hESC中在更大程度上存在缺 陷。纤溶酶原/纤溶酶***的改变通过抑制降解ECM组分(例如纤维蛋白 和胶原)的MMP2和MMP9损害滋养层侵袭。还证明，剂量为100ug/mL的肝素在体外在所有被研究的条件下提高分泌的ANXA2蛋白质、纤溶酶 原、纤溶酶、MMP2和MMP9产生。因此，本研究为理解PE中肝素治 疗所报道的有益效果确立了基础。
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除本文示出和描述的那些以外，根据前述说明书，本发明的多种修改 对本领域技术人员而言将是显而易见的并且落入所附权利要求书的范围 之内。本发明的优势和目的不必包含于本发明的每个实施方案中。
以下内容对应于母案申请中的原始权利要求书，现作为说明书的一部 分并入此处：
1.用于治疗先兆子痫的方法，所述方法包括：
通过测量从对象获得的测试样品中膜联蛋白A2(ANXA2)的水平来 确定所述对象发生先兆子痫的风险是否提高，
将所述测试样品中ANXA2的水平与ANXA2的对照水平进行比较以 确定所述对象发生先兆子痫的风险是否提高；以及
向确定发生先兆子痫风险提高的对象施用有效量的糖胺聚糖。
2.项1所述的方法，其中所述对象无先兆子痫病史。
3.项1至2中任一项所述的方法，其中所述样品选自：子宫内膜组 织、子宫内膜基质细胞和子宫内膜流体的样品。
4.项1至3中任一项所述的方法，其中ANXA2的所述对照水平来 自于有过成功妊娠并且无先兆子痫病史的对象。
5.项1至4中任一项所述的方法，其中所述糖胺聚糖选自：低分子 量肝素、硫酸乙酰肝素、经化学修饰的肝素或硫酸乙酰肝素、低分子量硫 酸皮肤素及其混合物。
6.项1至5中任一项所述的方法，其中ANXA2的水平使用选自 ELISA、Western印迹和免疫组织化学染色的免疫测定来确定。
7.项1至6中任一项所述的方法，其中所述对象已知怀孕。
8.项1至6中任一项所述的方法，其中所述对象试图怀孕。
9.用于诊断先兆子痫或帮助诊断先兆子痫的方法，所述方法包括：
测量从对象获得的测试样品中膜联蛋白A2(ANXA2)的水平；以及
将所述测试样品中ANXA2的水平与ANXA2的对照水平进行比较以 确定所述对象发生先兆子痫的风险是否提高。
10.项9所述的方法，其中所述对象无先兆子痫病史。
11.项9至10中任一项所述的方法，其中所述样品选自：子宫内膜 组织、子宫内膜基质细胞和子宫内膜流体的样品。
12.项9至11中任一项所述的方法，其中所述对照样品获自有过成 功妊娠并且无先兆子痫病史的对象。
13.项9至12中任一项所述的方法，其中ANXA2的水平使用选自 ELISA、Western印迹和免疫组织化学染色的免疫测定来确定。
14.项9至13中任一项所述的方法，其中所述对象已知怀孕。
15.项9至13中任一项所述的方法，其中所述对象试图怀孕。
16.用于治疗先兆子痫的方法，所述方法包括：
获得目前未患先兆子痫的对象的子宫内膜流体样品，其中所述对象怀 孕或者其中所述对象计划怀孕；
进行测定以确定所述子宫内膜流体样品中ANXA2的水平；
将所述子宫内膜流体样品中ANXA2的水平与ANXA2的对照水平进 行比较以确定所述对象发生先兆子痫的风险是否提高；以及
如果确定所述对象发生先兆子痫的风险提高，则向所述对象施用有效 量的糖胺聚糖。
17.项16所述的方法，其中所述对象无先兆子痫病史。
18.项16至17中任一项所述的方法，其中ANXA2的所述对照水平 来自于有过成功妊娠并且无先兆子痫病史的对象。
19.项16至18中任一项所述的方法，其中所述糖胺聚糖选自：低分 子量肝素、硫酸乙酰肝素、经化学修饰的肝素或硫酸乙酰肝素、低分子量 硫酸皮肤素及其混合物。
20.项16至19中任一项所述的方法，其中ANXA2的水平使用选自 ELISA、Western印迹和免疫组织化学染色的免疫测定来确定。
21.用于治疗先兆子痫的方法，所述方法包括：
鉴定与ANXA2的对照水平相比具有低ANXA2水平、计划怀孕并且 无先兆子痫病史的对象；以及
向所述对象施用足以提高所述对象中ANXA2水平之量的糖胺聚糖。
22.项21所述的方法，其中ANXA2的所述对照水平来自于有过成 功妊娠并且无先兆子痫病史的对象。
23.项21至22中任一项所述的方法，其中所述糖胺聚糖选自：低分 子量肝素、硫酸乙酰肝素、经化学修饰的肝素或硫酸乙酰肝素、低分子量 硫酸皮肤素及其混合物。
24.项21至23中任一项所述的方法，其中ANXA2的水平使用选自 ELISA、Western印迹和免疫组织化学染色的免疫测定来确定。
25.用于评估糖胺聚糖治疗对先兆子痫之效力的方法，所述方法包 括：
用有效量的糖胺聚糖来治疗患有先兆子痫或发生先兆子痫风险提高 的对象；
在用糖胺聚糖治疗之前和之后测量从所述对象获得的测试样品中膜 联蛋白A2(ANXA2)的水平，其中治疗后的ANXA2水平相对于治疗前 水平提高指示所述糖胺聚糖治疗是有效的。
26.项25所述的方法，其中所述糖胺聚糖选自：低分子量肝素、硫 酸乙酰肝素、经化学修饰的肝素或硫酸乙酰肝素、低分子量硫酸皮肤素及 其混合物。
27.项25至26中任一项所述的方法，其中ANXA2的水平使用选自 ELISA、Western印迹和免疫组织化学染色的免疫测定来确定。
序列表
<110> 艾基诺米公司
<120> 先兆子痫的早期检测
<130> I0439.70004WO00
<150> US 61/968,728
<151> 2014-03-21
<150> US 61/969,520
<151> 2014-03-24
<160> 5
<170> PatentIn version 3.5
<210> 1
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成的多肽
<400> 1
cggccugagc guccagaaat t 21
<210> 2
<211> 19
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成的多肽
<400> 2
tgtgcaagct cagcttgga 19
<210> 3
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成的多肽
<400> 3
aggtgtcttc aataggccca a 21
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<211> 19
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成的多肽
<400> 4
gaaggtgaag gtcggagtc 19
<210> 5
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成的多肽
<400> 5
gaagatggtg atgggatttc 20

Claims (10)

1.用于治疗先兆子痫的方法，所述方法包括：
通过测量从对象获得的测试样品中膜联蛋白A2(ANXA2)的水平来确定所述对象发生先兆子痫的风险是否提高，
将所述测试样品中ANXA2的水平与ANXA2的对照水平进行比较以确定所述对象发生先兆子痫的风险是否提高；以及
向确定发生先兆子痫风险提高的对象施用有效量的糖胺聚糖。
2.权利要求1所述的方法，其中所述对象无先兆子痫病史。
3.权利要求1至2中任一项所述的方法，其中所述样品选自：子宫内膜组织、子宫内膜基质细胞和子宫内膜流体的样品。
4.权利要求1至3中任一项所述的方法，其中ANXA2的所述对照水平来自于有过成功妊娠并且无先兆子痫病史的对象。
5.权利要求1至4中任一项所述的方法，其中所述糖胺聚糖选自：低分子量肝素、硫酸乙酰肝素、经化学修饰的肝素或硫酸乙酰肝素、低分子量硫酸皮肤素及其混合物。
6.权利要求1至5中任一项所述的方法，其中ANXA2的水平使用选自ELISA、Western印迹和免疫组织化学染色的免疫测定来确定。
7.权利要求1至6中任一项所述的方法，其中所述对象已知怀孕。
8.权利要求1至6中任一项所述的方法，其中所述对象试图怀孕。
9.用于诊断先兆子痫或帮助诊断先兆子痫的方法，所述方法包括：
测量从对象获得的测试样品中膜联蛋白A2(ANXA2)的水平；以及
将所述测试样品中ANXA2的水平与ANXA2的对照水平进行比较以确定所述对象发生先兆子痫的风险是否提高。
10.权利要求9所述的方法，其中所述对象无先兆子痫病史。
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