CN110916197A - 一种具有护肝功能的牡蛎肽粉及其制备方法和应用 - Google Patents

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Abstract

本发明公开了一种牡蛎肽粉的制备方法，采用定向酶解加超滤富集目标功能肽的工艺，使得获得的牡蛎肽原料在不增加纯化成本的情况下，增加了活性，最大限度的保留了牡蛎肽中的活性成分，提高了后续终端产品的原料品质。

Description

一种具有护肝功能的牡蛎肽粉及其制备方法和应用
技术领域
本发明属于食品加工领域，具体涉及一种护肝功能的牡蛎肽及其制备方法。
背景技术
海洋是地球上资源最丰富的领域，海洋生物在进化过程中产生了许多功能特异的蛋白质，海洋生物在高渗、低温、低氧环境下的进化使得它们拥有与陆地生物不同的基因组、代谢规律和抗逆手段，形成了一系列结构各异，性能独特、具有巨大应用潜力的活性天然产物。
蛋白质是生命的基础，人体吸收蛋白质中有三分之一是以氨基酸的形式吸收，有三分之二是以低聚肽的形式吸收，而低聚肽是蛋白质的预消化产物，是由2-10个氨基酸构成的片段，可不需消化或稍加消化即可吸收，明显提高了蛋白质的吸收利用率。低聚肽的易消化吸收特性和多个方面的生理调节功能，更奠定了其在营养干预的配方食品中的基础性地位,在未来人们摄取蛋白质方式将进入蛋白肽的新时代。
利用现代生物酶解技术已经可以将食物蛋白酶解成易吸收的小分子低聚肽，而且已经实现了产业化。目前的食源性肽类酶解产品基本都是非定向酶解混合物，尽管研究人员进行了一些酶解肽的构效关系方面的研究，也得到了很多例如降压肽等功能肽的序列，但这些工艺停留在研究阶段，在应用环节尚存在瓶颈问题，主要是要得到相应功效结构的低聚肽必须强化分离纯化工艺，这必然增加了大量费用。这类工艺研究适合药物，而对于功能食品来说是成本太高，这个问题成为了肽类功能产品实现确切功效的瓶颈。目前市面许多产品尽管宣称功效，但其实在技术环节没有实现有力的功效保证。
如何在现有非定向性酶解工艺的基础上，定向增加和富集解酒护肝功能小肽的含量，又不增加很多成本是本发明技术方案的重点。
发明内容
一方面，本发明提供了一种具有高乙醇脱氢酶激活率的牡蛎肽粉的制备方法，所述方法包括如下步骤：
1)牡蛎酶解液的制备：将鲜牡蛎肉匀浆，在匀浆液中加入复合蛋白酶和胰蛋白酶，进行酶解，制备酶解液；
优选的，所述复合蛋白酶与牡蛎肉干重的质量比为1.5-2.5％，优选2％；所述胰蛋白酶的用量与牡蛎肉干重的质量比为1000U-5000U：1g，优选2000U：1g；
优选的，所述复合蛋白酶为市售诺维信公司的
Figure BDA0002319640050000021
复合蛋白酶；
优选的，酶解温度为40-50℃，酶解时间为4-5小时；
2)灭酶处理：将步骤1)得到的酶解液对酶进行灭活；优选的，在100℃10min对酶进行灭活；
3)将步骤2)经灭酶处理的酶解液离心去除上层漂浮物及底层沉淀，保留上清液；
4)在上清液中加入酵母菌，发酵除腥；优选的，在30-35℃条件下搅拌均匀，静置2-4h进行发酵除腥；
5)将步骤4)的发酵液进行离心去除沉淀，超滤膜进行超滤澄清；
优选的，所述超滤膜的截留分子量小于10000Da，优选的，为2000Da，更优选的，为1000Da；
6)将超滤液进行喷雾干燥，制备得到低分子牡蛎肽干粉；
优选的，喷雾干燥的进口温度设置在180-190℃，流速为13-16rpm，出口温度为80-90℃。
在优选的实施方式中，牡蛎肽的分子量低于1000Da。
另一方面，本发明还提供了由上述方法制备得到的牡蛎肽粉。
另一方面，本发明还提供了上述牡蛎肽粉在制备具有解酒护肝效果的产品中的应用；优选的，所述产品为功能食品。
在优选的实施方式中，所述功能食品的组分还包括山梨糖醇、酵母抽提物、葛根粉、L-谷氨酰胺、微晶纤维素、MS和SiO2。
在优选的实施方式中，所述功能食品的配方如下：山梨糖醇20-30％、牡蛎肽粉20-30％、酵母抽提物15-20％、葛根粉10-20％、L-谷氨酰胺8-16％、微晶纤维素3-9％、MS(硬脂酸镁)1-2％、SiO2 1-2％。
本发明制备的具有解酒护肝效果的无腥味低分子牡蛎肽粉最大限度的保留了牡蛎肽中的活性成分，采用定向酶解加超滤富集目标功能肽的工艺，使得获得的牡蛎肽原料在不增加纯化成本的情况下，增加了活性，提高了后续终端产品的原料品质。
附图说明
图1.不同酶的选择对于牡蛎肽的ADH激活率的影响；其中，“风味+复合”代表风味蛋白酶和复合蛋白酶的组合，“风味+中性”代表风味蛋白酶和中性蛋白酶的组合，“复合+中性”代表复合蛋白酶和中性蛋白酶的组合，“复合+胰”代表复合蛋白酶和胰蛋白酶的组合。
图2.不同截留分子量超滤获得的牡蛎肽的ADH激活率。
实施方式
下面结合实施例对本发明做进一步的说明，以下所述，仅是对本发明的较佳实施例而已，并非对本发明做其他形式的限制，任何熟悉本专业的技术人员可能利用上述揭示的技术内容加以变更为同等变化的等效实施例。凡是未脱离本发明方案内容，依据本发明的技术实质对以下实施例所做的任何简单修改或等同变化，均落在本发明的保护范围内。
实施例1、牡蛎肽的制备和活性测定
申请人前期的研究中发现，牡蛎匀浆液具有解酒的功能，但效果不是很显著。为了提高牡蛎产品的功效，对牡蛎酶解多肽进行制备，从中筛选具有解酒功能的多肽。
本实施例中，采用如下方法制备牡蛎肽：首先，将去壳牡蛎肉匀浆，在匀浆液中依次加入不同的蛋白酶进行酶解，在40-50℃条件下，经4-5小时酶解，制成酶解液；将上述酶解液，在100℃的条件下处理10min，对酶进行灭活；之后，离心去除上层漂浮物及底层沉淀，保留上清液；在上清液中加入酵母菌，在30-35℃条件下搅拌均匀，静置2-4h进行发酵除腥；然后，将发酵液进行离心去除沉淀，选用不超过10000Da的超滤膜进行超滤澄清；最后，将超滤液进行喷雾干燥，制备得到低分子牡蛎肽干粉。喷雾干燥的进口温度设置在180-190℃，流速为13-16rpm，出口温度为80-90℃。
本发明中，利用乙醇脱氢酶(ADH)的激活率衡量所制备的牡蛎肽的体外醒酒活性，具体操作如下：取一5mL小管，加入1.5mL(pH8.8)焦磷酸钠缓冲液，1.0mL27mmol/L氧化型辅酶I(NAD+)，0.5mL体积分数为11.5％的乙醇溶液，0.1mL试样(0.2mg/mL牡蛎肽样品或超纯水)，混匀后于25℃水浴锅中温浴5min，再向管中加入0.1mL25℃温浴的ADH(0.25U/mL)。混匀后立即用分光光度计测定其吸光度(A340nm)值，每10s读数一次，直至每分钟吸光度的增大值达到稳定为止。取最初线性部分计算每分钟还原型辅酶I(NADH)的生成量，ADH的活力(U)以每分钟生成1μmolNADH时所需的酶量表示。
EADH＝△A×3.2/(W×6.2)
ADH激活率(％)＝﹝(E加肽-E空白)/E空白﹞×100
式中：EADH(U)：ADH酶活；△A：340nm处每分钟吸光度的增加值；3.2(mL)反应液总体积；W(mg/mL)：每毫升酶液中含酶量；6.2：NADH在340nm处的摩尔吸光系数；E加肽(U)：牡蛎肽组ADH酶活；E空白(U)：空白组ADH酶活。
实施例2、高ADH激活率的牡蛎肽的筛选
采用实施例1的方法，利用不同的酶对牡蛎匀浆液进行酶解，对最后得到的牡蛎肽酶解液的ADH激活率进行测定，本实施例中尝试了风味蛋白酶、复合蛋白酶(本实施例中采用了市售的诺维信公司的
Figure BDA0002319640050000041
复合蛋白酶)、中性蛋白酶和胰蛋白酶的不同组合；其中，复合蛋白酶与牡蛎肉干重的质量比例为2％，风味蛋白酶、中性蛋白酶和胰蛋白酶的用量与牡蛎肉干重的比例为2000U/g。
如图1所示，采用复合蛋白酶和胰蛋白酶所得到的牡蛎肽的ADH激活率最高。
采用实施例1的方法，利用复合蛋白酶和胰蛋白酶的组合,复合蛋白酶用量与牡蛎肉干重的质量比例为2％，胰蛋白酶的用量与牡蛎肉干重的比例为2000U/g,进行酶解，并选择不同截留分子量的超滤膜进行超滤，通过超滤截留获得分子量为2kDa、1kDa，超滤膜将牡蛎肽按照分子量分离成MW﹥2kDa、1kDa﹤MW﹤2kDa、MW﹤1kDa的组分，测定并比较不同组分的ADH激活率。如图2所示，MW﹤1kDa的牡蛎肽的ADH激活率最高。
实施例3、含有牡蛎肽功能食品的制备
采用实施例1-2的方法制备牡蛎肽，其中，酶解时选择复合蛋白酶和胰蛋白酶，复合蛋白酶与牡蛎肉干重的质量比例为2％，胰蛋白酶的用量与牡蛎肉干重的比例为2000U/g；超滤膜的截留分子量选择1kDa，得到分子量低于1kDa的牡蛎肽粉。功能食品中，各组分的配比如下：山梨糖醇20-30％、牡蛎肽粉(20-30％)、酵母抽提物15-20％、葛根粉10-20％、L-谷氨酰胺8-16％、微晶纤维素3-9％、MS 1-2％、SiO2 1-2％。
制作工艺如下：
1、配料：(1)粉碎过筛，将主料与辅料以等倍量的比例混合过80目筛，对于不能顺利过筛的原料，用研钵研磨后过筛。(2)称量，应按工艺处方要求，准确无误。(3)粘合剂称量，粘合剂为纯化水。(4)混合，将称量好的原辅料加入混料机内干混10-15分钟，加粘合剂再搅拌10-15分钟。(5)制粒，将软材放出后，用摇摆式制粒机制粒，筛网为18目。(6)焖制平衡，将制好的颗粒收入塑料袋中焖制30min。(7)整粒总混，选择16目药筛，进行整粒，结束后加入MS、SiO2进行总混，混合时间10分钟，干混均匀后，用洁净塑料袋盛放，取样后扎紧塑料袋口。
2、压片：片重要求：0.75克，采用浅凹冲旋转式压片机压片，冲模安装完毕后，可将压片速度调至适当位值进行试压片，调整好填充深度、糖片厚度。待糖片片重、外观均符合要求后，开始正式压片。压片过程中要随时注意片子外观，定期检查平均片重。
3、包薄膜衣：(1)薄膜包衣的配制，按照包衣液配SOP来配制包衣液。包衣液固含量为6％，以增重4-5％计，用85％的乙醇配置，配制好的溶液用100目筛过滤备用。(2)包衣，喷枪雾化调节好后，调节好角度，扇面与片面距离为30cm，扇面与片面平行，锅温控制在40℃左右，锅速为1.5转/min。
4、装瓶包装。
实施例4、含有牡蛎肽功能食品的体外功效验证
采用实施例3制备的牡蛎肽功能食品(以下，简称OP)，小鼠(雄性健康昆明小鼠，体重18-22g，由山东省青岛市实验动物与动物实验中心提供。)给与3天，采用体积分数50％酒精灌胃造成酒精性急性肝损伤模型，测定血清ALT、AST和肝组织ADH、ALDH、SOD、GSH-PX、MDA水平，评价证明其醒酒护肝效果。阳性对照采用昂立多邦胶囊(简称ONLLY)，由市场购买。
1、实验方法：
动物的分组及模型建立：健康雄性昆明小鼠适应性喂养3d，随机分为6组，正常对照组(灌服生理盐水)、模型对照组(灌服生理盐水)、昂立多邦(ONLLY)低剂量组(150mg/kg/d)、昂立多邦(ONLLY)高剂量组(300mg/kg/d)、牡蛎肽功能食品(OP)低剂量组(50mg/kg/d)、牡蛎肽功能食品(OP)高剂量组(100mg/kg/d)，每组10只。各组小鼠根据体重按8ml/10kg预灌服胃受试物3d，于末次给药后禁食不禁水8h，小鼠先灌胃上述剂量受试物，1h后，制剂组合和模型对照组小鼠根据体重按15ml/kg灌胃白酒，正常对照组灌胃同体积生理盐水。观察小鼠活动情况，24h后，摘眼球取血，常规分离血清，备用。快速剥离肝脏，称重，-80℃保存备用。
小鼠生理生化指标的变化：转氨酶主要分布在肝脏和心肌中，是代谢过程中人体必不可少的酶，当肝脏细胞受损伤时，转氨酶被释放到血液中，使血清转氨酶升高。因此，转氨酶在血清中活力高低反应了肝脏受损伤的程度。参照试剂盒方法测定血清ALT和AST活力，结果以卡门氏单位表示。卡门氏单位表示定义：1ml血清1min内所生成的丙酮酸，使NADH氧化成NAD+引起吸光度每下降0.001为一个单位。
乙醇脱氢酶(ADH)和乙醛脱氢酶(ALDH)是机体乙醇代谢关键酶。乙醇经ADH催化氧化成乙醛，乙醛再经过ALDH催化成乙酸，后者以乙酰辅酶A的形式进入三羧酸循环，最后氧化成二氧化碳和水排出体外。取肝均浆上清液，按试剂盒方法进行测定。
酒精摄入过量，生成大量活性氧自由基，诱导肝细胞发生脂质过氧化反应，破坏肝细胞膜及蛋白质结构和功能，最终导致肝细胞损害，氧化应激与脂质过氧化作用是酒精性肝损伤最重要的发病机制。正常人体内存在具有保护性抗氧化反应物质，如超氧化物歧化酶(SOD)，谷胱甘肽(GSH)等抗氧化物质，维持细胞不受损害。因此测定SOD等的含量活性一定程度上能反应氧化应激反应；谷胱甘肽过氧化酶(GSH-PX)是体内广泛存在的一种催化过氧化物分解的酶，可使脂质过氧化物分解成相应的醇类，从而起到保护细胞膜结构和功能完整的作用，在疾病或应激状态下，SOD活性、GSH-Px活性均会迅速下降；丙二醛(MDA)是自由基作用于脂质发生过氧化反应的最终产物之一，通过测定MDA的含量可以反应机体脂质过氧化的程度，是最常用的脂质过氧化指标。肝组织GSH-PX、SOD活性和MDA含量均按照试剂盒方法进行测定。其中GSH-PX酶活力单位定义为：每毫克蛋白质，每分钟扣除非酶反应的作用，使反应体系中GSH浓度降低1μmol.L-1为一个酶活力单位；SOD酶活力单位定义：每毫克组织蛋白在1ml反应液中SOD抑制率达到50％所对应的SOD量为一个SOD活力单位。
2、实验结果
2.1对小鼠血清ALT和AST活力的影响
与正常对照组比较，模型对照组小鼠血清ALT和AST活力分别提高了48.3％(P＜0.05)和65.3％(P＜0.01)。灌胃OP各剂量组均能显著减低小鼠血清ALT和AST的活力，分别较模型对照组小鼠平均降低了32.34％(P＜0.05)和44.71％(P＜0.01)，表明OP能显著减轻肝脏的损伤，其效果与ONLLY相当。结果见表1。
表1.本发明功能食品(OP)对小鼠血清ALT和AST和肝脏ADH和ALDH活性的影响
组别 ALT/U.L<sup>-1</sup> AST/U.L<sup>-1</sup> ADH/U.mg<sup>-1</sup>Pro ALDH/U.mg<sup>-1</sup>Pro
正常对照 28.71±4.02 23.33±4.16 4.38±0.34 2.79±0.21
模型对照 42.59±12.48 38.57±11.99 3.09±0.39 4.84±0.74
ONLLY低剂量 27.14±3.54 23.30±4.86 4.54±1.00 6.25±1.18
ONLLY高剂量 35.66±6.37 25.39±5.05 4.58±0.59 5.98±1.67
OP低剂量 30.28±7.43 23.95±5.43 3.72±0.67 5.67±1.04
OP高剂量 27.35±6.0 18.70±3.02 4.38±0.83 7.03±1.83
2.2对小鼠肝脏ADH和ALDH活性的影响
由表1可见，模型对照组小鼠肝脏ADH活力较正常组显著降低(P＜0.05)。灌胃护肝产品后，各组小鼠肝脏ADH活力较模型对照组均有所提高，ONLLY组和OP组较模型组对照组分别平均提高了47.57％和31.07％，其中ONLLY低、高剂量组和OP高剂量组均达到极显著水平(P＜0.01)。模型对照组ALDH活力较正常对照组显著升高(P＜0.05)，灌胃护肝产品各组ALDH活力均有升高，且OP高剂量组较模型对照组有显著差异(P＜0.05)，说明OP能显著促进小鼠肝脏中乙醇的代谢，且在较高剂量下效果优于ONLLY组。
2.3对小鼠肝脏GSH-PX、SOD活性和MDA含量的影响
如表2所示，模型对照组小鼠肝组织中GSH-PX活性显著下降，MDA含量显著升高。灌胃护肝产品各组小鼠肝脏中GSH-PX、SOD活力均有所提高，与模型对照组比较，ONLLY组GSH-PX、SOD活力平均分别提高了27.70％(P＜0.05)、9.98％，OP剂量组平均分别提高了29.04％(P＜0.05)和18.00％，且OP高剂量组效果明显好于其它各剂量组。表明灌胃OP适量能显著提高急性酒精中毒小鼠肝脏抗氧化酶活力。
模型对照组小鼠肝脏中MDA含量显著提高，是正常对照组的2.81倍(P＜0.01)。灌胃样品组小鼠肝脏中MDA含量较模型对照组均有所下降，其中ONLLY低剂量组MDA含量降低了35.09％(P＜0.05)，OP高剂量组降低了48.62％(P＜0.01)。表明OP可显著降低急性酒精中毒小鼠肝脏的脂质过氧化水平。
表2.本发明功能食品(OP)对小鼠肝脏中GSH-PX、SOD活性和MDA含量的影响
组别 GSH-PX/U.mg<sup>-1</sup>Pro SOD/U.mg<sup>-1</sup>Pro MDA/mmol.g<sup>-1</sup>Pro
正常对照 524.49±61.99 177.69±29.28 1.42±0.20
模型对照 420.49±73.57 191.40±41.41 3.99±1.40
ONLLY低剂量 509.21±53.66 201.64±31.32 2.59±0.72
ONLLY高剂量 564.71±51.25 219.36±24.04 3.17±1.06
OP低剂量 528.80±11.62 217.96±24.59 3.20±0.93
OP高剂量 556.38±59.54 233.73±10.43 2.05±0.36

Claims (9)

1.一种具有高乙醇脱氢酶激活率的牡蛎肽粉的制备方法，其特征在于，所述方法包括如下步骤：
1)牡蛎酶解液的制备：将鲜牡蛎肉匀浆，在匀浆液中加入复合蛋白酶和胰蛋白酶进行酶解，制备酶解液；
2)灭酶处理：将步骤1)得到的酶解液对酶进行灭活；优选的，在100℃10min对酶进行灭活；
3)将步骤2)经灭酶处理的酶解液离心去除上层漂浮物及底层沉淀，保留上清液；
4)在上清液中加入酵母菌，发酵除腥；
5)将步骤4)的发酵液进行离心去除沉淀，超滤膜进行超滤澄清；
6)将超滤液进行喷雾干燥，制备得到无腥味低分子牡蛎肽干粉。
2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述步骤5)中采用的超滤膜的截留分子量小于10000Da；优选的，超滤膜的截留分子量为2000Da，更优选，1000Da。
3.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述步骤1)中酶解温度为40-50℃，酶解时间为4-5小时。
4.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述步骤4)在上清液中加入酵母菌后，在30-35℃条件下搅拌均匀，静置2-4h进行发酵除腥。
5.一种牡蛎肽粉，其特征在于，所述牡蛎肽粉由权利要求1-4任一所述的方法制备得到；优选的，所述牡蛎肽的分子量低于1000Da。
6.权利要求5所述的牡蛎肽粉在制备具有解酒护肝效果的产品中的应用。
7.根据权利要求6所述的应用，其特征在于，所述产品为功能食品。
8.根据权利要求7所述的应用，其特征在于，所述功能食品的组分还包括山梨糖醇、酵母抽提物、葛根粉、L-谷氨酰胺、微晶纤维素、MS和SiO2。
9.根据权利要求8所述的应用，其特征在于，所述功能食品的配方如下：山梨糖醇20-30％、牡蛎肽粉20-30％、酵母抽提物15-20％、葛根粉10-20％、L-谷氨酰胺8-16％、微晶纤维素3-9％、MS 1-2％、SiO2 1-2％。
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