CN110914430B - 抗bril抗体以及使用了该抗体的bril融合蛋白质的稳定化方法 - Google Patents

Abstract

本发明的目的在于提供通过使目标蛋白质稳定化，使得目前为止无法进行结构解析或难以进行结构解析的目标蛋白质能够有效地结构解析的方法。本发明提供与BRIL或BRIL融合蛋白质特异性结合的抗BRIL抗体及其抗原结合片段、编码该抗体及其抗原结合片段的核酸、包含该核酸的载体、包含该载体的抗体生产细胞、该抗体的制造方法和该抗体在蛋白质结构解析中的使用方法。

Description

抗BRIL抗体以及使用了该抗体的BRIL融合蛋白质的稳定化 方法

技术领域

本发明涉及使用抗BRIL抗体使BRIL融合蛋白质稳定化的方法、使用抗BRIL抗体的BRIL融合蛋白质的结晶化方法、结晶制造方法和制作方法、使用抗BRIL抗体解析BRIL融合蛋白质的晶体结构的方法、抗BRIL抗体、编码该抗体的核酸、包含该核酸的载体、导入了该载体的转化细胞以及抗BRIL抗体的制造方法。

背景技术

发挥生命所必须的作用的蛋白质与多种疾病相关，特别是GPCR(G Protein－Coupled Receptor，G蛋白偶联受体)发挥着信号传递的重要功能，成为超过30％的医药品的靶标蛋白质。在现在的药物发现中，以靶标蛋白质的立体结构为基础，通过计算机模拟进行候补化合物的筛选、新化合物的设计，因此靶标蛋白质的结构解析的重要性高。

作为GPCR的结构解析进行X射线晶体结构解析，在20世纪90年代得知了细菌视紫红质的X射线晶体结构(非专利文献1)，在2000年作为哺乳类的GPCR首次对牛的视紫红质进行了结构解析(非专利文献2)。之后，在2007年作为人的GPCR首次对β₂－肾上腺素受体进行了结构解析(非专利文献3)。

目前为止，在结构确定了的GPCR中，以野生型的状态成功进行结构解析的GPCR能够大量制备，其他的GPCR无法以能够纯化的水平在组织中表达，即使在培养细胞使其强制表达的情况下，从稳定性和表达量的观点出发，也存在难以大量制备到以野生型状态能够结晶化的水平的问题。

GPCR共通由7条跨膜螺旋和第8位的两亲性螺旋构成。螺旋被6个环(loop)连接，N末端与3个环存在于细胞外，C末端和3个环存在于细胞内。GPCR的跨膜部分为将细胞外的激动剂结合传递到细胞内的部分，因此，本质上柔韧性高，在纯化时成为使GPCR不稳定的原因。另外，GPCR以细胞外环区域为中心的配体结合部位的结构具有很大的多样性，因此在不同的受体家族中，在家族中，并不容易预测立体结构的预测。

关于GPCR的结构解析，为了改善稳定性、表达量和结晶性等，目前为止进行了各种研究，进行了约40种人GPCR的结构解析。例如，存在使用将参与GPCR与G蛋白质的相互作用的GPCR的细胞内第3环替换称为T4 Lysozyme(以下，称为T4L)的方法(非专利文献3、专利文献1)或替换成Cytochrome b562RIL的方法(非专利文献4、专利文献1)成功进行结构解析的报告例。

另外，报告有通过在GPCR的氨基酸序列中导入变异，使GPCR的结构稳定化为任意的三维结构的方法(非专利文献5)。该方法在能够利用变异的导入部位使结构固定为激动剂结合型或拮抗剂结合型的方面有效。

形成特异性识别GPCR的抗体与GPCR的复合体的方法(非专利文献6)为对特定的GPCR特异性的抗体片段将特定的GPCR稳定化的方法。另外，在结晶化时，通过抗体片段与GPCR结合，参与晶格中的分子间接触的膜外亲水性表面被扩张，由此具有促进结晶生成的效果。

现有技术文献

专利文献

专利文献1：美国专利申请公开第2012/0288913号说明书

非专利文献

非专利文献1：Pebay-Peyroula E et al.Science,1997；277:1676-81

非专利文献2：Palczewski K et al.Science,2000；289(5480):739-45

非专利文献3：Rosenbaum et al.Science 2007；318:1266-73

非专利文献4：Chun et al.Structure 2012；20:967-976

非专利文献5：Serrano et al.Proc.Natl.Acad.Sci.USA,2008；105:877-882

非专利文献6：Hino et al.Nature,2012；482:237-240

发明内容

发明要解决的问题

如上所述，药物发现中靶标蛋白质的结构解析的重要性高，关于稳定性等上存在问题的GPCR的结构解析，目前为止进行了各种研究。然而，非专利文献5中记载的方法由于以腺苷A2a受体时有效的变异导入部位为基础，规定其他的GPCR的变异导入部位，因此难以说通用性高。进而变异导入部位的组合的探索和结构解析需要大量的劳力和时间。另外，非专利文献6中记载的方法需要对各个GPCR分别制备特异性的抗体片段。

本发明鉴于上述实际情况，其目的在于提供通过将目标蛋白质稳定化，使得目前为止不可能进行结构解析或难以进行结构解析的目标蛋白质能够进行有效的结构解析的方法。另外，其目的在于提供在目标蛋白质的结构解析中有效且有效使蛋白质稳定化的通用的抗体或其抗原结合片段。

解决问题的方法

本发明人发明在使目标膜蛋白质稳定化时，以BRIL为标签蛋白质，制备与该膜蛋白质融合得到的BRIL融合蛋白质，使用与BRIL结合的抗体或其抗原结合片段，能够使该BRIL融合蛋白质稳定化，从而完成了本发明。

即，本发明涉及以下的＜1＞～＜27＞。

＜1＞一种使BRIL融合蛋白质稳定化方法，其中使用与BRIL结合的抗体或其抗原结合片段，使目标蛋白质与BRIL融合使

＜2＞BRIL融合蛋白质稳定化。

＜2＞根据＜1＞所述的方法，其中，BRIL融合蛋白质为目标蛋白质的2个相邻的螺旋结构通过BRIL被融合得到的蛋白质。

＜3＞根据＜1＞或＜2＞所述的方法，其中，目标蛋白质为膜表达蛋白质。

＜4＞根据＜3＞所述的方法，其中，膜表达蛋白质为选自G蛋白偶联受体(GPCR)、离子通道和转运子中的任何一种。

＜5＞根据＜1＞～＜4＞中任一项所述的方法，其特征在于，通过使与BRIL结合的抗体或其抗原结合片段与BRIL融合蛋白质的BRIL结合，而使BRIL融合蛋白质稳定化。

＜6＞根据＜1＞～＜5＞中任一项所述的方法，其中，与BRIL结合的抗体或其抗原结合片段为选自以下的(1)～(3)中的任意一种的抗体或其抗原结合片段：

(1)与BRIL的第3螺旋结构和第4螺旋结构的至少任意一者结合的抗体或其抗原结合片段；

(2)与BRIL的第3螺旋结构到第4螺旋结构的至少一部分结合的抗体或其抗原结合片段；以及

(3)与BRIL的选自从N末端起第67位的Ile(I)、第71位的Gln(Q)、第74位的Asp(D)、第77位的Lys(K)、第78位的Leu(L)、第83位的Lys(K)、第85位的Lys(K)、第86位的Glu(E)、第88位的Gln(Q)、第89位的Ala(A)、第90位的Ala(A)、第92位的Glu(E)、第93位的Gln(Q)、第96位的Thr(T)、第97位的Thr(T)、第99位的Asn(N)和第100位的Ala(A)的氨基酸残基中的至少1个氨基酸残基结合的抗体或其抗原结合片段。

＜7＞根据＜1＞～＜6＞中任一项所述的方法，其中，与BRIL结合的抗体或其抗原结合片段为选自以下的(i)～(iii)中的任意一种。

(i)与抗体的H链可变区(VH)的互补决定区(CDR)1～3分别包含序列编号1～3所示的氨基酸序列，且抗体的L链可变区(VL)的CDR1～3分别包含序列编号4～6所示的氨基酸序列的抗体竞争性结合的抗体或其抗原结合片段；

(ii)与抗体的VH的CDR1～3分别包含序列编号1～3所示的氨基酸序列，且抗体的VL的CDR1～3分别包含序列编号4～6所示的氨基酸序列的抗体所结合的表位结合的抗体或其抗原结合片段；以及

(iii)与和抗体的VH的CDR1～3分别包含序列编号1～3所示的氨基酸序列，且抗体的VL的CDR1～3分别包含序列编号4～6所示的氨基酸序列的抗体所结合的表位相同的表位结合的抗体或其抗原结合片段。

＜8＞根据＜1＞～＜7＞中任一项所述的方法，其中，关于与BRIL结合的抗体或其抗原结合片段，抗体的VH的CDR1～3分别包含显示与序列编号1～3所示的氨基酸序列90％以上的相同性的氨基酸序列，且抗体的VL的CDR1～3分别包含显示与序列编号4～6所示的氨基酸序列90％以上的相同性的氨基酸序列。

＜9＞一种抗BRIL抗体或其抗原结合片段，其为选自以下的(1)～(3)中的任意一种：

(1)与BRIL的第3螺旋结构和第4螺旋结构的至少任意一者结合的抗体或其抗原结合片段；

(2)与BRIL的第3螺旋结构至第4螺旋结构的至少一部分结合的抗体或其抗原结合片段；以及

(3)与BRIL的选自从N末端起第67位的Ile(I)、第71位的Gln(Q)、第74位的Asp(D)、第77位的Lys(K)、第78位的Leu(L)、第83位的Lys(K)、第85位的Lys(K)、第86位的Glu(E)、第88位的Gln(Q)、第89位的Ala(A)、第90位的Ala(A)、第92位的Glu(E)、第93位的Gln(Q)、第96位的Thr(T)、第97位的Thr(T)、第99位的Asn(N)和第100位的Ala(A)的氨基酸残基中的至少1个氨基酸残基结合的抗体或其抗原结合片段。

＜10＞根据＜9＞所述的抗BRIL抗体或其抗原结合片段，其为选自以下的(i)～(iii)中的任意一种：

(i)与抗体的VH的CDR1～3分别包含序列编号1～3所示的氨基酸序列，且抗体的L链可变区(VL)的CDR1～3分别包含序列编号4～6所示的氨基酸序列的抗体竞争性结合的抗体或其抗原结合片段；

(ii)与抗体的VH的CDR1～3分别包含序列编号1～3所示的氨基酸序列，且抗体的VL的CDR1～3分别包含序列编号4～6所示的氨基酸序列的抗体所结合的表位结合的抗体或其抗原结合片段；以及

(iii)与和抗体的VH的CDR1～3分别包含序列编号1～3所示的氨基酸序列、且抗体的VL的CDR1～3分别包含序列编号4～6所示的氨基酸序列的抗体所结合的表位相同的表位结合的抗体或其抗原结合片段。

＜11＞根据＜9＞或＜10＞所述的抗BRIL抗体或其抗原结合片段，其中，关于与BRIL结合的抗体或其抗原结合片段，抗体的VH的CDR1～3分别包含显示与序列编号1～3所示的氨基酸序列90％以上的相同性的氨基酸序列，且抗体的VL的CDR1～3分别包含显示与序列编号4～6所示的氨基酸序列90％以上的相同性的氨基酸序列。

＜12＞一种BRIL融合蛋白质的结晶促进方法或结晶制造方法，该BRIL融合蛋白质是使目标蛋白质与BRIL融合得到的，其中，使用与BRIL结合的抗体或其抗原结合片段。

＜13＞根据＜12＞所述的结晶促进方法或结晶制造方法，其中，BRIL融合蛋白质为目标蛋白质的2个相邻的螺旋结构被BRIL融合后的BRIL融合蛋白质。

＜14＞根据＜12＞或＜13＞所述的结晶促进方法或结晶制造方法，其中，目标蛋白质为膜表达蛋白质。

＜15＞根据＜14＞所述的结晶促进方法或结晶制造方法，其中，膜表达蛋白质为选自GPCR、离子通道和转运子中的任意1种。

＜16＞根据＜12＞～＜15＞中任一种所述的结晶促进方法或结晶制造方法，其特征在于，通过使与BRIL结合的抗体或其抗原结合片段结合于BRIL融合蛋白质的BRIL，使BRIL融合蛋白质稳定化。

＜17＞根据＜12＞～＜16＞中任一种所述的结晶促进方法或结晶制造方法，其中，与BRIL结合的抗体或其抗原结合片段为选自以下的(1)～(3)中的任意一种：

(1)与BRIL的第3螺旋结构和第4螺旋结构中的至少任意一者结合的抗体或其抗原结合片段；

(2)与BRIL的第3螺旋结构至第4螺旋结构的至少一部分结合的抗体或其抗原结合片段；和

(3)与BRIL的选自从N末端起第67位的Ile(I)、第71位的Gln(Q)、第74位的Asp(D)、第77位的Lys(K)、第78位的Leu(L)、第83位的Lys(K)、第85位的Lys(K)、第86位的Glu(E)、第88位的Gln(Q)、第89位的Ala(A)、第90位的Ala(A)、第92位的Glu(E)、第93位的Gln(Q)、第96位的Thr(T)、第97位的Thr(T)、第99位的Asn(N)和第100位的Ala(A)的氨基酸残基中的至少1个氨基酸残基结合的抗体或其抗原结合片段。

＜18＞根据＜12＞～＜17＞中任一种所述的结晶促进方法或结晶制造方法，其中，与BRIL结合的抗体或其抗原结合片段为选自以下的(i)～(iii)中的任意一种：

(i)与抗体的VH的CDR1～3分别包含序列编号1～3所示的氨基酸序列，且抗体的L链可变区(VL)的CDR1～3分别包含序列编号4～6所示的氨基酸序列的抗体竞争性结合的抗体或其抗原结合片段；

(ii)与抗体的VH的CDR1～3分别包含序列编号1～3所示的氨基酸序列，且抗体的VL的CDR1～3分别包含序列编号4～6所示的氨基酸序列的抗体所结合的表位结合的抗体或其抗原结合片段；以及

(iii)与和抗体的VH的CDR1～3分别包含序列编号1～3所示的氨基酸序列，且抗体的VL的CDR1～3分别包含序列编号4～6所示的氨基酸序列的抗体所结合的表位相同的表位结合的抗体或其抗原结合片段。

＜19＞根据＜12＞～＜18＞中任一种所述的结晶促进方法或结晶制造方法，其中，关于与BRIL结合的抗体或其抗原结合片段，抗体的VH的CDR1～3分别包含显示与序列编号1～3所示的氨基酸序列90％以上的相同性的氨基酸序列，且抗体的VL的CDR1～3分别包含显示与序列编号4～6所示的氨基酸序列90％以上的相同性的氨基酸序列。

＜20＞一种BRIL融合蛋白质的立体结构解析方法，其中，该BRIL融合蛋白质是使目标蛋白质与BRIL融合得到的，其中，使用与BRIL结合的抗体或其抗原结合片段。

＜21＞根据＜20＞所述的立体结构解析方法，其中，BRIL融合蛋白质为目标蛋白质的2个相邻的螺旋结构被BRIL融合后的BRIL融合蛋白质。

＜22＞根据＜20＞或＜21＞所述的立体结构解析方法，其中，目标蛋白质为膜表达蛋白质。

＜23＞根据＜22＞所述的立体结构解析方法，其中，膜表达蛋白质为选自GPCR、离子通道和转运子中的任意一种。

＜24＞根据＜20＞～＜23＞中任一项所述的立体结构解析方法，其特征在于，通过使与BRIL结合的抗体或其抗原结合片段结合于BRIL融合蛋白质的BRIL，使BRIL融合蛋白质稳定化。

＜25＞根据＜20＞～＜24＞中任一项所述的立体结构解析方法，其中，与BRIL结合的抗体或其抗原结合片段为选自以下的(1)～(3)中的任意一种：

(1)与BRIL的第3螺旋结构和第4螺旋结构中的至少任意一者结合的抗体或其抗原结合片段；

(2)与BRIL的第3螺旋结构至第4螺旋结构的至少一部分结合的抗体或其抗原结合片段；和

(3)与BRIL的选自从N末端起第67位的Ile(I)、第71位的Gln(Q)、第74位的Asp(D)、第77位的Lys(K)、第78位的Leu(L)、第83位的Lys(K)、第85位的Lys(K)、第86位的Glu(E)、第88位的Gln(Q)、第89位的Ala(A)、第90位的Ala(A)、第92位的Glu(E)、第93位的Gln(Q)、第96位的Thr(T)、第97位的Thr(T)、第99位的Asn(N)和第100位的Ala(A)的氨基酸残基中的至少1个氨基酸残基结合的抗体或其抗原结合片段。

＜26＞根据＜20＞～＜25＞中任一项所述的立体结构解析方法，其中，与BRIL结合的抗体或其抗原结合片段为选自以下的(i)～(iii)中的任意一种：

(i)与抗体的H链可变区(VH)的互补决定区(CDR)1～3分别包含序列编号1～3，且抗体的L链可变区(VL)的CDR1～3分别包含序列编号4～6所示的氨基酸序列的抗体竞争性结合的抗体或其抗原结合片段；

(ii)与抗体的VH的CDR1～3分别包含序列编号1～3所示的氨基酸序列，且抗体的VL的CDR1～3分别包含序列编号4～6所示的氨基酸序列的抗体所结合的表位结合的抗体或其抗原结合片段；以及

(iii)与和抗体的VH的CDR1～3分别包含序列编号1～3所示的氨基酸序列，且抗体的VL的CDR1～3分别包含序列编号4～6所示的氨基酸序列的抗体所结合的表位相同的表位结合的抗体或其抗原结合片段。

＜27＞根据＜20＞～＜26＞中任一项所述的立体结构解析方法，其中，关于与BRIL结合的抗体或其抗原结合片段，抗体的VH的CDR1～3分别包含显示与序列编号1～3所示的氨基酸序列90％以上的相同性的氨基酸序列，且抗体的VL的CDR1～3分别包含显示与序列编号4～6所示的氨基酸序列90％以上的相同性的氨基酸序列。

发明的效果

根据本发明，能够提供能够将目前为止不能结构解析或难以结构解析的目标蛋白质有效地进行结构解析的方法。另外，还能够提供在目标蛋白质的结构解析中有效且有效地使蛋白质稳定化的方法。另外根据本发明，能够提供对该蛋白质稳定化有用的抗体、编码该抗体的核酸、包含该核酸的载体、包含该载体的抗体生产细胞、该抗体的制造方法以及该抗体在蛋白质结构解析中的使用方法。

附图说明

图1是表示hChemR23－BRIL融合蛋白质的利用Fluorescence Size ExclusionChromatography(FSEC，荧光尺寸排除色谱法)的柱形图的结果的图。图1的横轴表示蛋白质的洗脱时间(分钟)，纵轴表示比荧光强度(RFU)。

图2是表示hChemR23－BRIL/apo/SRP2070Fab复合体结晶的X射线衍射像的图。

图3是表示hChemR23－BRIL/apo/SRP2070Fab复合体的结构解析的结果的图。

图4是表示5HT_1B－BRIL/Ergotamine/SRP2070Fab复合体的结构解析的结果的图。

图5是用电子显微镜拍摄hChemR23－BRIL/apo/SRP2070Fab的复合体得到的图。箭头(实线)所示的部分为SRP2070Fab，箭头(虚线)所示的部分为GPCR部分。

图6是用电子显微镜拍摄5HT_1B－BRIL/Ergotamine/SRP2070Fab复合体得到的图。箭头(实线)所示的部分为SRP2070Fab，箭头(虚线)所示的部分为GPCR部分。

发明的具体实施方式

本发明涉及使用与BRIL结合的抗体(以下，也简称为抗BRIL抗体。)或其抗原结合片段使BRIL融合蛋白质稳定化的方法(以下，也简称为本发明的稳定化方法。)。在本发明的稳定化方法中，在进行目标蛋白质的结构解析时，预先制作目标蛋白质与BRIL融合得到的BRIL融合蛋白质，使与BRIL融合蛋白质的BRIL部分结合的抗体或其抗原结合片段与BRIL融合蛋白质共存，使其结合，由此能够使BRIL融合蛋白质稳定化。

另外，本发明还包括通过使BRIL融合蛋白质稳定地存在的BRIL融合蛋白质的纯化方法、制造方法、结晶化方法、结晶化的促进方法、结晶制造方法和立体结构解析方法等。

作为本发明的稳定化方法中使用的抗BRIL抗体或其抗原结合片段，也可以使用后述的抗BRIL抗体或其抗原结合片段的任何一种。作为本发明的BRIL融合蛋白质的纯化方法，可以列举使抗BRIL抗体或其抗原结合片段在柱或珠子上固相化，使其与BRIL融合蛋白质结合，由此将BRIL融合蛋白质有效且特异性地纯化的方法。

根据本发明的稳定化方法，能够使BRIL融合蛋白质在溶液内稳定地存在，因此，本发明的稳定化方法也能够用于目标蛋白质的负染色电子显微镜解析或冷冻电子显微镜解析。此时，抗BRIL抗体或其抗原结合片段也能够作为以可溶性状态对目标BRIL融合蛋白质赋予方向性的标记物操作，因此能够用于目标蛋白质的电子显微镜解析像的解析。

即，如果在溶液中使本发明的抗BRIL抗体或其抗原结合片段与BRIL融合蛋白质结合，则能够将与目标BRIL融合蛋白质的BRIL部分结合的抗体或其抗原结合片段作为识别三维结构中的BRIL部分、目标蛋白质部分的标记物进行识别，因此对目标蛋白质的结构解析有用。

另外，根据本发明的稳定化方法，通过在结晶的生成过程中，使抗BRIL抗体或其抗原结合片段与BRIL融合蛋白质的BRIL部分结合，能够有规则地排列BRIL融合蛋白质，能够有效促进目标蛋白质的结晶化。本发明的稳定化方法作为有效地促进目前为止无法或难以结晶化的目标蛋白质的结晶化的方法也有用。

根据本发明的结晶制造方法，将BRIL融合蛋白质与抗BRIL抗体或其抗原结合片段以适当的摩尔比混合后，与聚乙二醇(PEG)、盐、有机溶剂和缓冲剂混合，能够制造目标BRIL融合蛋白质和抗BRIL抗体或其抗原结合片段的共结晶。

作为本发明的结晶制造方法，可以列举包括表达/纯化BRIL融合蛋白质的工序、使BRIL融合蛋白质与抗BRIL抗体或其抗原结合片段反应的工序、以及使BRIL融合蛋白质与抗BRIL抗体或其抗原结合片段共结晶化的工序的结晶的制造方法。

作为本发明的立体结构解析方法，可以列举包括表达/纯化BRIL融合蛋白质的工序、使BRIL融合蛋白质与抗BRIL抗体或其抗原结合片段反应的工序、使BRIL融合蛋白质与抗BRIL抗体或其抗原结合片段共结晶化的工序、以及包含得到X射线衍射数据的工序的晶体结构解析方法的立体结构解析方法、以及表达/纯化BRIL融合蛋白质的工序、使BRIL融合蛋白质与抗BRIL抗体或其抗原结合片段反应的工序、以及利用电子显微镜的结构解析的立体结构解析方法等。

另外，本发明涉及与BRIL融合蛋白质结合的抗BRIL抗体或其抗原结合片段。本发明的抗BRIL抗体或其抗原结合片段能够通过使与BRIL融合蛋白质的BRIL部分结合，而使BRIL融合蛋白质稳定化。

在本发明中，BRIL是指在apocytochrome(脱辅基细胞色素)b562的氨基酸序列中导入了M7W、H102I和R106L的氨基酸残基取代的热耐性apocytochrome b562突变蛋白质(也称为cytochrome b562RI)[Chu et al,J.Mol.Biol.(2002)323,253-262](Protein DataBank ID：PDB 1M6T)。

在本发明中，氨基酸残基取代以原始的氨基酸残基、氨基酸残基的位置、以及取代后的氨基酸残基的顺序表示。

另外，在本发明中BRIL包含由与序列编号9的氨基酸序列依次具有优选90％以上、91％以上、92％以上、93％以上、94％以上的相同性的蛋白质、更优选具有95％以上、96％以上、97％以上、98％以上、99％以上的相同性的氨基酸序列构成的且构成由cytochromeb562的氨基酸序列形成的立体结构的蛋白质。

在本发明中，BRIL融合蛋白质只要为在目标蛋白质上融合有BRIL的蛋白质，则可以包含任意的BRIL融合蛋白质。BRIL融合蛋白质优选以BRIL构成目标蛋白质的螺旋结构的至少一部分的方式与目标蛋白质融合，更优选以BRIL构成目标蛋白质的结构中的环结构的至少一部分的方式与目标蛋白质融合。

作为与目标蛋白质融合的BRIL，只要抗BRIL抗体或其抗原结合片段与BRIL融合蛋白质中的BRIL部分结合，则可以为其片段。作为BRIL片段，可以根据目标蛋白质的种类等适当调整。

作为BRIL融合蛋白质，具体可以列举例如以构成目标蛋白质的细胞外环结构、细胞内环结构、小胞膜外环结构或小胞内环结构的至少一部分的方式融合的BRIL融合蛋白质。

在本发明中作为BRIL融合蛋白质更具体地可以列举例如将在目标蛋白质的结构中存在的2个螺旋结构之间存在的环结构的全部或一部分用BRIL蛋白质或该片段取代或融合后的BRIL融合蛋白质。

在目标蛋白质的结构中存在的上述2个螺旋结构既可以在蛋白质的一级序列上相邻也可以不相邻，优选在三维立体结构上相邻，更优选构成目标蛋白质的2个螺旋结构在一级序列上相邻也在三维立体结构上相邻。

构成上述2个相邻的螺旋结构的第1螺旋结构和第2螺旋结构中，优选第1螺旋结构的C末端侧的氨基酸残基与第2螺旋结构的N末端侧或C末端侧的氨基酸残基的距离近，更优选该距离以以下顺序为

作为目标蛋白质的结构中的环结构，可以列举例如形成贯通各细胞膜、细胞小器官的小胞膜等的膜结构的螺旋结构的正下方的结构。能够使该环结构的一部分取代或融合BRIL蛋白质和该片段，来表达、纯化BRIL融合蛋白质。

具体而言，例如在GPCR的细胞内环融合BRIL的情况下，根据已经报道的GPCR晶体结构解析结果，在GPCR的从N末端起第5位的跨膜螺旋中保守的脯氨酸数第16～24位的氨基酸区域、和第6位的跨膜螺旋中保守的脯氨酸起第－24～－28位的氨基酸区域重叠的部分融合BRIL，由此能够制作稳定的GPCR－BRIL融合蛋白质(Eugene Chun et al.Structure,2012；20:967-976)。

另外，例如在转运子的细胞内环融合BRIL的情况下，在构成转运子蛋白质的跨膜结构域的螺旋结构中，测量相邻的2个螺旋结构的各自的C末端部分与N末端部分的距离，在距离左右的部分，融合BRIL或该片段，由此能够制作BRIL融合蛋白质。

作为本发明中使用的目标蛋白质，只要能够取代或融合BRIL或该片段，则可以为任何蛋白质，优选列举膜表达蛋白质(也称为膜蛋白质)等。作为膜蛋白质，可以列举受体、离子通道、转运子、酶和结构蛋白质等，更优选列举受体、离子通道和转运子。

作为受体，可以列举例如GPCR等。

作为离子通道，可以列举例如CatSper1、CatSper2、CatSper3、CatSper4、TPC1、TPC2、CNGA1、CNGA2、CNGA3、CNGA4、CNGB1、CNGB3、HCN1、HCN2、HCN3、HCN4、KCa1.1、KCa2.1、KCa2.2、KCa2.3、KCa3.1、KNa1.1、KNa1.2、KCa5.1、Kir1.1、Kir2.1、Kir2.2、Kir2.3、Kir2.4、Kir3.1、Kir3.2、Kir3.3、Kir3.4、Kir4.1、Kir4.2、Kir5.1、Kir6.1、Kir6.2、Kir7.1、K2P1.1、K2P2.1、K2P3.1、K2P4.1、K2P5.1、K2P6.1、K2P7.1、K2P9.1、K2P10.1、K2P12.1、K2P13.1、K2P15.1、K2P16.1、K2P17.1、K2P18.1、Kv1.1、Kv1.2、Kv1.3、Kv1.4、Kv1.5、Kv1.6、Kv1.7、Kv1.8、Kv2.1、Kv2.2、Kv3.1、Kv3.2、Kv3.4、Kv4.1、Kv4.2、Kv4.3、Kv5.1、Kv6.1、Kv6.2、Kv6.3、Kv6.4、Kv7.1、Kv7.2、Kv7.3、Kv7.4、Kv7.5、Kv8.1、Kv8.2、Kv9.1、Kv9.2、Kv9.3、Kv10.1、Kv10.2、Kv11.1、Kv11.2、Kv11.3、Kv12.1、Kv12.2、Kv12.3、RyR1、RyR2、RyR3、TRPA1、TRPC1、TRPC2、TRPC3、TRPC4、TRPC5、TRPC6、TRPC7、TRPM1、TRPM2、TRPM3、TRPM4、TRPM5、TRPM6、TRPM7、TRPM8、TRPML1、TRPML2、TRPML3、TRPP1、TRPP2、TRPP3、TRPV1、TRPV2、TRPV3、TRPV4、TRPV5、TRPV6、Cav1.1、Cav1.2、Cav1.3、Cav1.4、Cav2.1、Cav2.2、Cav2.3、Cav3.1、Cav3.2、Cav3.3、Hv1、Nav1.1、Nav1.2、Nav1.3、Nav1.4、Nav1.5、Nav1.56、Nav1.7、Nav1.8、Nav1.9、5－HT3AB、5－HT3A、5－HT3B、5－HT3C、5－HT3D、5－HT3E、ASIC1、ASIC2、ASIC3、ENaCαβγ、ENaCα、ENaCβ、ENaCδ、ENaCγ、GABAA受体α1亚基、GABAA受体α2亚基、GABAA受体α3亚基、GABAA受体α4亚基、GABAA受体α5亚基、GABAA受体α6亚基、GABAA受体β1亚基、GABAA受体β2亚基、GABAA受体β3亚基、GABAA受体γ1亚基、GABAA受体γ2亚基、GABAA受体γ3亚基、GABAA受体δ亚基、GABAA受体ε亚基、GABAA受体θ亚基、GABAA受体π亚基、GABAA受体ρ1亚基、GABAA受体ρ2亚基、GABAA受体ρ3亚基、甘氨酸受体α1亚基、甘氨酸受体α2亚基、甘氨酸受体α3亚基、甘氨酸受体α4亚基、甘氨酸受体β亚基、GluA1、GluA2、GluA3、GluA4、GluD1、GluD2、GluK1、GluK2、GluK3、GluK4、GluK5、GluN1、GluN2A、GluN2B、GluN2C、GluN2D、GluN3A、GluN3B、IP3R1、IP3R2、IP3R3、烟碱乙酰胆碱受体α1亚基、烟碱乙酰胆碱受体α2亚基、烟碱乙酰胆碱受体α3亚基、烟碱乙酰胆碱受体α4亚基、烟碱乙酰胆碱受体α5亚基、烟碱乙酰胆碱受体α6亚基、烟碱乙酰胆碱受体α7亚基、烟碱乙酰胆碱受体α8亚基、烟碱乙酰胆碱受体α9亚基、烟碱乙酰胆碱受体α10亚基、烟碱乙酰胆碱受体β1亚基、烟碱乙酰胆碱受体β2亚基、烟碱乙酰胆碱受体β3亚基、烟碱乙酰胆碱受体β4亚基、烟碱乙酰胆碱受体γ亚基、烟碱乙酰胆碱受体δ亚基、烟碱乙酰胆碱受体ε亚基、P2X1、P2X2、P2X3、P2X4、P2X5、P2X6、P2X7、ZAC、AQP0、AQP1、AQP2、AQP3、AQP4、AQP5、AQP6、AQP7、AQP8、AQP9、AQP10、ClC－1、ClC－2、ClC－3、ClC－4、ClC－5、ClC－6、ClC－7、ClC－Ka、ClC－Kb、CFTR、CaCC、Maxi Cl－、VRAC、Cx23、Cx25、Cx26、Cx30、Cx30.2、Cx30.3、Cx31、Cx31.1、Cx31.9、Cx32、Cx36、Cx37、Cx40、Cx40.1、Cx43、Cx45、Cx46、Cx47、Cx50、Cx59、Cx62、Px1、Px2、Px3、Navi2.1等。

作为GPCR，可以列举例如5－HT1A、5－HT1B、5－HT1D、5－ht1e、5－HT1F、5－HT2A、5－HT2B、5－HT2C、5－HT4、5－HT5a、5－HT6、5－HT7、M1、M2、M3、M4、M5、A1、A2A、A2B、A3、α1A－肾上腺素能受体、α1B－肾上腺素能受体、α1D－肾上腺素能受体、α2A－肾上腺素能受体、α2B－肾上腺素能受体、α2C－肾上腺素能受体、β1－肾上腺素能受体、β2－肾上腺素能受体、β3－肾上腺素能受体、C3a、C5a、C5L2、AT1、AT2、APJ、GPBA、BB1、BB2、BB3、B1、B2、CB1、CB2、CCR1、CCR2、CCR3、CCR4、CCR5、CCR6、CCR7、CCR8、CCR9、CCR10、CXCR1、CXCR2、CXCR3、CXCR4、CXCR5、CXCR6、CXCR7、CX3CR1、XCR1、CCK1、CCK2、D1、D2、D3、D4、D5、ETA、ETB、GPER、FPR1、FPR2/ALX、FPR3、FFA1、FFA2、FFA3、GPR42、GAL1、GAL2、GAL3、生长激素释放肽、FSH、LH、TSH、GnRH、GnRH2、H1、H2、H3、H4、HCA1、HCA2、HCA3、吻素、BLT1、BLT2、CysLT1、CysLT2、OXE、FPR2/ALX、LPA1、LPA2、LPA3、LPA4、LPA5、S1P1、S1P2、S1P3、S1P4、S1P5、MCH1、MCH2、MC1、MC2、MC3、MC4、MC5、MT1、MT2、胃动素、NMU1、NMU2、NPFF1、NPFF2、NPS、NPBW1、NPBW2、Y1、Y2、Y4、Y5、NTS1、NTS2、δ、κ、μ、NOP、OX1、OX2、P2Y1、P2Y2、P2Y4、P2Y6、P2Y11、P2Y12、P2Y13、P2Y14、QRFP、PAF、PKR1、PKR2、PRRP、DP1、DP2、EP1、EP2、EP3、EP4、FP、IP1、TP、PAR1、PAR2、PAR3、PAR4、RXFP1、RXFP2、RXFP3、RXFP4、sst1、sst2、sst3、sst4、sst5、NK1、NK2、NK3、TRH1、TA1、UT、V1A、V1B、V2、OT、CCRL2、CMKLR1、GPR1、GPR3、GPR4、GPR6、GPR12、GPR15、GPR17、GPR18、GPR19、GPR20、GPR21、GPR22、GPR25、GPR26、GPR27、GPR31、GPR32、GPR33、GPR34、GPR35、GPR37、GPR37L1、GPR39、GPR42、GPR45、GPR50、GPR52、GPR55、GPR61、GPR62、GPR63、GPR65、GPR68、GPR75、GPR78、GPR79、GPR82、GPR83、GPR84、GPR85、GPR87、GPR88、GPR101、GPR119、GPR120、GPR132、GPR135、GPR139、GPR141、GPR142、GPR146、GPR148、GPR149、GPR150、GPR151、GPR152、GPR153、GPR160、GPR161、GPR162、GPR171、GPR173、GPR174、GPR176、GPR182、GPR183、LGR4、LGR5、LGR6、LPAR6、MAS1、MAS1L、MRGPRD、MRGPRE、MRGPRF、MRGPRG、MRGPRX1、MRGPRX2、MRGPRX3、MRGPRX4、OPN3、OPN5、OXGR1、P2RY8、P2RY10、SUCNR1、TAAR2、TAAR3、TAAR4、TAAR5、TAAR6、TAAR8、TAAR9、CCPB2、CCRL1、FY、CT、降钙素受体样受体、CRF1、CRF2、GHRH、GIP、GLP－1、GLP－2、胰高血糖素、分泌素、PTH1、PTH2、PAC1、VPAC1、VPAC2、BAI1、BAI2、BAI3、CD97、CELSR1、CELSR2、CELSR3、ELTD1、EMR1、EMR2、EMR3、EMR4P、GPR56、GPR64、GPR97、GPR98、GPR110、GPR111、GPR112、GPR113、GPR114、GPR115、GPR116、GPR123、GPR124、GPR125、GPR126、GPR128、GPR133、GPR143、GPR144、GPR157、LPHN1、LPHN2、LPHN3、CaS、GPRC6、GABAB1、GABAB2、mGlu1、mGlu2、mGlu3、mGlu4、mGlu5、mGlu6、mGlu7、mGlu8、GPR156、GPR158、GPR179、GPRC5A、GPRC5B、GPRC5C、GPRC5D、卷曲受体、FZD1、FZD2、FZD3、FZD4、FZD5、FZD6、FZD7、FZD8、FZD9、FZD10、SMO等。

作为转运子，可以列举例如ABC1、ABC2、ABC3、ABCR、ABCA5、ABCA6、ABCA7、ABCA8、ABCA9、ABCA10、ABCA12、ABCA13、ABCB1、ABCB2、ABCB3、ABCB4、ABCB5、ABCB6、ABCB7、ABCB8、ABCB9、ABCB10、ABCB11、ABCC1、ABCC2、ABCC3、ABCC4、ABCC5、ABCC6、ABCC7、ABCC8、ABCC9、ABCC10、ABCC11、ABCC12、ABCD1、ABCD2、ABCD3、ABCG1、ABCG2、ABCG4、ABCG5、ABCG8、F型ATP酶α亚基、F型ATP酶β亚基、F型ATP酶γ亚基、F型ATP酶δ亚基、F型ATP酶ε亚基、F型ATP酶A亚基、F型ATP酶B亚基、F型ATP酶C亚基、F型ATP酶D亚基、F型ATP酶E亚基、F型ATP酶F2亚基、F型ATP酶F6亚基、F型ATP酶G2亚基、F型ATP酶8亚基、V型ATP酶V1马达A亚基、V型ATP酶V1马达B1亚基、V型ATP酶V1马达B2亚基、V型ATP酶V1马达C1亚基、V型ATP酶V1马达D亚基、V型ATP酶V1马达E1亚基、V型ATP酶V1马达E2亚基、V型ATP酶V1马达F亚基、V型ATP酶V1马达G1亚基、V型ATP酶V1马达G2亚基、V型ATP酶V1马达G3亚基、V型ATP酶V1马达H亚基、V型ATP酶V0马达a1亚基、V型ATP酶V0马达a2亚基、V型ATP酶V0马达a3亚基、V型ATP酶V0马达a4亚基、V型ATP酶V0马达b亚基、V型ATP酶V0马达c亚基、V型ATP酶V0马达d1亚基、V型ATP酶V0马达d2亚基、V型ATP酶V0马达e1亚基、V型ATP酶V0马达e2亚基、钠/钾离子转运ATP酶亚基α－1、钠/钾离子转运ATP酶亚基α－2、钠/钾离子转运ATP酶亚基α－3、钠/钾离子转运ATP酶亚基α－4、钠/钾离子转运ATP酶亚基β－1、钠/钾离子转运ATP酶亚基β－2、钠/钾离子转运ATP酶亚基β－3、钠/钾离子转运ATP酶亚基γ、SERCA1、SERCA2、SERCA3、PMCA1、PMCA2、PMCA3、PMCA4、SPCA1、SPCA2、ATP4A、ATP12A、ATP4B、ATP7A、ATP7B、ATP8A1、ATP8A2、ATP8B1、ATP8B2、ATP8B3、ATP8B4、ATP9A、ATP9B、ATP10A、ATP10B、ATP10D、ATP11A、ATP11B、ATP11C、突触小泡糖蛋白2A、EAAT1、EAAT12、EAAT3、EAAT4、EAAT5、ASCT1、ASCT2、GLUT1、GLUT2、GLUT3、GLUT4、GLUT5、GLUT6、GLUT7、GLUT8、GLUT9、GLUT10、GLUT11、GLUT12、HMIT、rBAT、4F2hc、CAT1、CAT2、CAT3、CAT4、可能的阳离子氨基酸转运蛋白、LAT1、LAT2、y+LAT1、y+LAT2、b0、+AT、Asc－1、xCT、AGT1、AE1、AE2、AE3、AE4、NBCe1、NBCe2、NBCn1、NBCn2、NDCBE、BTR1、SGLT1、SGLT2、SGLT3、SGLT4、SGLT5、CHT、NIS、SMVT、SMCT1、SMCT2、SMIT1、SMIT2、NET、DAT、GAT1、GAT2、GAT3、BGT1、TauT、CT1、GlyT1、GlyT2、ATB0、PROT、B0AT1、B0AT2、B0AT3、NTT4、NTT5、SIT1、NCX1、NCX2、NCX3、NHE1、NHE2、NHE3、NHE4、NHE5、NHE6、NHE7、NHE8、NHE9、NHA1、NHA2、Sperm－NHE、NHE11、NTCP、ASBT、P3、P4、P5、SOAT、P7、NRAMP1、DMT1、NKCC2、NKCC1、NCC、KCC1、KCC2、KCC3、KCC4、CCC9、CCC6、NaS1、NaS2、NaC1、NaC2、NaC3、UT－A、UT－B、PepT1、PepT2、PHT1、PHT2、MCT1、VMCT2、MCT3、MCT4、MCT5、MCT6、MCT7、MCT8、MCT9、MCT11、MCT12、MCT13、MCT14、TAT1、NPT1、NPT3、NPT4、钠/磷酸盐共转运蛋白同系物、AST、VGLUT1、VGLUT2、VGLUT3、VNUT、VMAT1、VMAT2、VAChT、溶质载体家族18成员B1、FOLT、ThTr1、ThTr2、PiT1、PiT2、OCT1、OCT2、OCT3、OCTN1、OCTN2、CT2、OAT1、OAT2、OAT3、OAT4、OAT5、有机阴离子转运蛋白4、URAT1、ORCTL3、ORCTL4、FLIPT1、BOIT、ORCTL2、OAT6、SLC22A23、SLC22A24、UST6、溶质载体家族22成员31。

另外，作为转运子，可以列举例如SVCT1、SVCT2、SVCT3、SNBT1、NKCX1、NKCX2、NKCX3、NKCX4、NKCX5、NKCX6、CIC、DIC、OGC、ODC、SLC25A34、SLC25A35、溶质载体家族25成员47、溶质载体家族25成员48、AGC1、AGC2、GC1、GC2、ORC1、ORC2、CAC、ORNT3、SLC25A38、CGI－69、MCFP、SLC25A44、SLC25A45、PHC、ANT1、ANT2、ANT3、ANT4、GDC、PMP34、DNC、SAMC1、SLC25A42、APC1、APC2、APC3、MFTC、PNC1、PNC2、SCaMC－3L、SLC25A43、UCP1、UCP2、UCP3、UCP4、UCP5、KMCP1、线粒体载体1、线粒体载体2、溶质载体家族25成员51、溶质载体家族25成员52、溶质载体家族25成员53、线粒体铁蛋1、线粒体铁蛋白2、SLC25A46、精脒/精胺N1-乙酰基转移酶1(Sat－1)、DTDST、DRA、潘蛋白(Pendrin)、PAT－1、SLC26A7、SLC26A9、压力素(Prestin)、Tat1、SLC26A10、KBAT、FATP1、FATP2、FATP3、FATP4、FATP5、FATP6、CNT1、CNT2、CNT3、ENT1、ENT2、ENT3、PMAT、ZnT1、ZnT2、ZnT3、ZnT4、ZnT5、ZnT6、ZnT7、ZnT8、ZnT9、ZnT10、CTR1、CTR2、VIAAT、ACATN1、NaPi－IIa、NaPi－IIb、NaPi－IIc、CMP－唾液酸转运蛋白、UDP－半乳糖转运蛋白、UDP－N－乙酰氨基葡萄糖转运蛋白、MGC2541、FLJ11130、UGTREL1、PAPS转运蛋白1、PAPS转运蛋白2、YEA、GDP－岩藻糖转运蛋白、OVCOV1、UDP－葡萄糖醛酸/UDP－N－乙酰半乳糖胺转运蛋白、HFRC1、FRCL1、溶质载体家族35成员E1、溶质载体家族35成员E2、溶质载体家族35成员E2B、溶质载体家族35成员E3、溶质载体家族35成员E4、溶质载体家族35成员F1、溶质载体家族35成员F2、溶质载体家族35成员F3、溶质载体家族35成员F4、溶质载体家族35成员F5、溶质载体家族35成员F6、溶质载体家族35成员G1、溶质载体家族35成员G2、溶质载体家族35成员G3、溶质载体家族35成员G4、溶质载体家族35成员G5、溶质载体家族35成员G6、PAT1、PAT2、PAT3、PAT4、SPX1、SPX2、SPX3、SPX4、SNAT1、SNAT2、SNAT3、SNAT4、SNAT5、SNAT6、SNAT7、推测的钠偶联中性氨基酸转运蛋白8、推测的钠偶联中性氨基酸转运蛋白9、PP1744、AVT2、ZIP1、ZIP2、ZIP3、ZIP4、ZIP5、ZIP6、ZIP7、ZIP8、ZIP9、ZIP10、ZIP11、ZIP12、ZIP13、ZIP14、IREG1、MgtE、溶质载体家族41成员2、溶质载体家族41成员3、RhAG、RhBG、RhCG、LAT3、LAT4、EEG1、CTL1、CTL2、CTL3、CTL4、CTL5、质子相关糖转运蛋白A、膜相关转运蛋白、溶质载体家族45成员3、溶质载体家族45成员4、PCFT、TSCOT、SLC46A3、MATE1、MATE2－K、HRG1、FLVCR1、FLVCR2、MFSD7、DIRC2、RAG1AP1、OSTα、OSTβ、RFVT1、RFVT2、RFVT3、OATP1A2、OATP1B1、OATP1B3、OATP1C1、OATP2A1、OATP2B1、OATP3A1、OATP4A1、OATP4C1、OATP5A1、OATP6A1等。

在制作BRIL融合蛋白质时，目标蛋白质中的BRIL的***位置、BRIL融合蛋白质的N末端与C末端的氨基酸序列的长度等能够适当调整以通过对BRIL融合蛋白质进行实施例中后述的FSEC等的筛选，得到所希望的单分散性和稳定性等。

作为本发明的抗体或其抗原结合片段，可以列举与BRIL特异性结合的抗体(抗BRIL抗体)或其抗原结合片段。

抗体分子由被称为重链(Heavy chain，以下记作H链)和轻链(Light chain，以下记作L链)的多肽构成。另外，H链从N末端侧起由H链可变区(也记作VH)、H链恒定区(也记作CH)构成，L链从N末端侧起由L链可变区(也记作VL)、L链恒定区(也记作CL)的各区域构成。

CH在每个亚类中，分别已知有α、δ、ε、γ和μ链。CH从N末端侧起还由CH1结构域、铰链区、CH2结构域、CH3结构域的各结构域构成。结构域是指构成抗体分子的各多肽的功能性结构单位。另外，CH2结构域与CH3结构域一起称为Fc区域或简称为Fc。CL已知有C_λ链和C_κ链。

本发明中的CH1结构域、铰链区、CH2结构域、CH3结构域和Fc区域根据EU指数[Kabat et al.,Sequences of Proteins of Immunological Interest,US Dept.Healthand Human Services(1991)]，以从N末端起的氨基酸残基的编号来规定。具体而言，CH1规定为EU指数第118～215位的氨基酸序列，铰链规定为EU指数第216～230位的氨基酸序列，CH2规定为EU指数第231～340位的氨基酸序列，CH3规定为EU指数第341～447位的氨基酸序列。

作为本发明的抗体，还包括特别是基因工程学制作的重组小鼠抗体、重组大鼠抗体、重组兔抗体、小鼠型嵌合抗体、大鼠型嵌合抗体、人型嵌合抗体(以下，也仅简记作嵌合抗体)、人源化抗体[也被称为人源互补决定区(Complementarity Determining Region；CDR)移植抗体]和人抗体等的基因重组抗体。

嵌合抗体是指例如由人以外的动物(非人类动物)的抗体的VH和VL与人抗体的CH和CL构成的抗体。另外，还包含不同种类动物间的VH/VL和CH/CL重组得到的嵌合抗体。作为非人类动物，例如小鼠、大鼠、仓鼠、兔等只要能够制作杂交瘤，则可以使用任何来源。

杂交瘤是指使对非人类动物免疫抗原所取得的B细胞与源自小鼠等的骨髓瘤细胞进行细胞融合而得到的、产生具有所希望的抗原特异性的单克隆抗体的细胞。因此，构成杂交瘤所产生的抗体的可变区由非人类动物抗体的氨基酸序列构成。

人型嵌合抗体能够通过生产单克隆抗体的源自非人类动物细胞的杂交瘤，取得编码该单克隆抗体的VH和VL的cDNA，分别***到具有编码人抗体的CH和CL的DNA的动物细胞用表达载体中，构建人嵌合抗体表达载体，导入动物细胞，使其表达并制造。

人源化抗体是指将非人类动物抗体的VH和VL的CDR的氨基酸序列移植到与人抗体的VH和VL对应的CDR上的抗体。VH和VL的CDR以外的区域被称为骨架区(以下记作FR)。

人源化抗体能够通过构建编码由非人类动物抗体的VH的CDR的氨基酸序列和任意的人抗体的VH的FR的氨基酸序列构成的VH的氨基酸序列的cDNA和编码由非人类动物抗体的VL的CDR的氨基酸序列和任意的人抗体的VL的FR的氨基酸序列构成的VL的氨基酸序列的cDNA，分别***到具有编码人抗体的CH和CL的DNA的动物细胞用表达载体中，构建人源化抗体表达载体，并导入动物细胞，来表达并制造。

人抗体原本是指在人体内天然存在的抗体，但也包括由于最近的基因工程学、细胞工程、发育工程的技术进步所制作的人抗体噬菌体库和由人抗体产生转基因动物得到的抗体等。

人抗体能够通过对保有人免疫球蛋白基因的小鼠(Tomizuka K.et.al.,ProcNatl Acad Sci U S A.97,722-7,2000)免疫所希望的抗原来取得。另外，通过使用由源自人的B细胞扩增抗体基因得到的噬菌体展示文库，选择具有所希望的结合活性的人抗体，能够不进行免疫而取得人抗体(Winter G.et.al.,Annu Rev Immunol.12:433-55.1994)。此外，通过使用EB病毒使人B细胞永生，制作生产具有所希望的结合活性的人抗体的细胞，能够取得人抗体(Rosen A.et.al.,Nature 267,52-54.1977)。

存在于人体内的抗体例如能够通过使从人末梢血分离的淋巴细胞感染EB病毒等而永生后，克隆，能够得到产生该抗体的淋巴细胞，能够由培养淋巴细胞得到的培养物中纯化该抗体。

人抗体噬菌体库是通过将由人B细胞制备的抗体基因***噬菌体基因使Fab、scFv等的抗体片段在表面表达的噬菌体的文库。通过该文库，能够回收表达以对将抗原固定化的底物的结合活性为指标而具有所希望的抗原结合活性的抗体片段的噬菌体。该抗体片段进一步通过基因工程学的方法，也能够变成由2条完全的H链和2条完全的L链构成的人抗体分子。

人抗体产生转基因动物是指将人抗体基因重组入宿主动物的染色体内的动物。具体而言，能够在小鼠ES细胞导入人抗体基因，将该ES细胞移植到其他小鼠的初期胚后，使其发育，制作人抗体产生转基因动物。由人抗体产生转基因动物制作人抗体的方法能够利用通常的人以外的哺乳动物所进行的杂交瘤制作方法取得人抗体产生杂交瘤进行培养，由此在培养物中产生并积累人抗体。

作为本发明的抗体的VH和VL的氨基酸序列，可以是将人抗体的VH和VL的氨基酸序列、非人类动物抗体的VH和VL的氨基酸序列、或者非人类动物抗体的CDR移植到任意的人抗体的骨架得到的人源化抗体的VH和VL的氨基酸序列的任意一种。

作为本发明的抗体中的CL的氨基酸序列，可以是人抗体的氨基酸序列或非人类动物抗体的氨基酸序列的任意一种，优选为人抗体的氨基酸序列的C_κ或C_λ。

作为本发明的抗体的CH，可以是属于免疫球蛋白的任何CH，优选使用属于IgG类的亚类、γ1(IgG1)、γ2(IgG2)、γ3(IgG3)、γ4(IgG4)的任意一种。

作为本发明的抗体，Fc与抗体片段结合而成的Fc融合蛋白质、Fc与天然存在的配体或受体结合而成的Fc融合蛋白质(也称为免疫粘附素)、使得多个Fc区融合而成的Fc融合蛋白质等也包含在本发明。另外，为了使抗体稳定化以及控制血中半衰期，改变了氨基酸残基的Fc区等也能够用于本发明的抗体。

本发明的抗体或其抗原结合片段还包括包含翻译后修饰后所有的氨基酸残基的抗体。作为翻译后修饰，可以列举例如H链的C末端的赖氨酸残基的缺失[赖氨酸剪切(lysine clipping)]以及多肽的N末端的谷氨酰胺残基改变成焦谷氨酰胺(pyroGlu)等[Beck et al,Analytical Chemistry,85,715-736(2013)]。

在本发明中作为抗原结合片段(或者也称为抗体片段)，可以列举Fab、Fab’、F(ab’)₂、scFv、双抗体、dsFv、包含多个CDR的肽等。

Fab是将IgG抗体用蛋白质分解酶木瓜蛋白酶处理得到的片段中，(H链的第224位的氨基酸残基被切断)、H链的N末端侧约一半与L链全体由二硫键(S－S键)结合得到的分子量约5万的具有抗原结合活性的抗原结合片段。

F(ab’)₂是将IgG用蛋白质分解酶胃蛋白酶处理得到的片段中，(H链的第234位的氨基酸残基被切断)、比Fab经由铰链区的S－S键结合的片段稍大、分子量约10万的具有抗原结合活性的抗原结合片段。

Fab’是将上述F(ab’)₂的铰链区的S－S键切断得到的分子量约5万的具有抗原结合活性的抗原结合片段。

scFv是将1条VH和1条VL使用由4个Gly和1个Ser残基构成的接头(G4S)连接任意个数得到的接头肽等适当的肽接头(P)连结而成的VH－P－VL或VL－P－VH多肽且具有抗原结合活性的抗原结合片段。

双抗体(Diabody)是抗原结合特异性相同或不同的scFv形成二聚体得到的抗原结合片段、且具有对相同抗原的2价抗原结合活性或对不同抗原的特异性抗原结合活性的抗原结合片段。

dsFv是将VH和VL中的各自1个氨基酸残基取代为半胱氨酸残基后的多肽经由该半胱氨酸残基间的S－S键结合而成的片段。

包含CDR的肽包含VH或VL的CDR的至少1个区域以上而构成。多个包含CDR的肽能够将CDR彼此直接或经由适当的肽接头而结合。

构建编码本发明的改变抗体的VH和VL的CDR的DNA，将该DNA***原核生物用表达载体或真核生物用表达载体，将该表达载体导入原核生物或真核生物，由此使其表达进行制造。另外，包含CDR的肽能够通过Fmoc法或tBoc法等的化学合成法制造。

作为本发明的抗BRIL抗体或其抗原结合片段，具体可以列举选自以下的(a)～(о)中的任意一种。

(a)与BRIL的螺旋结构结合的抗体或其抗原结合片段、

(b)与BRIL的第1～4螺旋结构的任意1个结合的抗体或其抗原结合片段、

(c)与BRIL的第3螺旋结构和第4螺旋结构的至少任意一者结合的抗体或其抗原结合片段、

(d)与BRIL的第3螺旋结构至第4螺旋结构的至少一部分结合的抗体或其抗原结合片段、

(e)与BRIL的第3螺旋结构和第4螺旋结构结合的抗体或其抗原结合片段、

(f)与BRIL的选自从N末端起第67位的Ile(I)、第71位的Gln(Q)、第74位的Asp(D)、第77位的Lys(K)、第78位的Leu(L)、第83位的Lys(K)、第85位的Lys(K)、第86位的Glu(E)、第88位的Gln(Q)、第89位的Ala(A)、第90位的Ala(A)、第92位的Glu(E)、第93位的Gln(Q)、第96位的Thr(T)、第97位的Thr(T)、第99位的Asn(N)和第100位的Ala(A)的氨基酸残基中的至少1个氨基酸残基结合的抗体或其抗原结合片段、

(g)与BRIL的选自从N末端起第74位的Asp(D)、第92位的Glu(E)、第96位的Thr(T)、第97位的Thr(T)和第99位的Asn(N)的氨基酸残基中的至少1个氨基酸残基结合的抗体或其抗原结合片段、

(h)与BRIL的从N末端起第74位的Asp(D)结合的抗体或其抗原结合片段、

(i)与BRIL的选自从N末端起第92位的Glu(E)、第96位的Thr(T)、第97位的Thr(T)和第99位的Asn(N)的氨基酸残基中的至少1个氨基酸残基结合的抗体或其抗原结合片段、

(j)与BRIL的从N末端起第92位的Glu(E)结合的抗体或其抗原结合片段、

(k)与BRIL的从N末端起第96位的Thr(T)结合的抗体或其抗原结合片段、

(l)与BRIL的从N末端起第97位的Thr(T)结合的抗体或其抗原结合片段、

(m)与BRIL的从N末端起第99位的Asn(N)结合的抗体或其抗原结合片段、

(n)与BRIL的从N末端起第96位的Thr(T)、第97位的Thr(T)和第99位的Asn(N)的氨基酸残基结合的抗体或其抗原结合片段、

(o)与BRIL的第92位的Glu(E)、第96位的Thr(T)、第97位的Thr(T)和第99位的Asn(N)的氨基酸残基结合的抗体或其抗原结合片段。

在本发明中作为构成BRIL的螺旋结构的氨基酸序列，序列编号9所示的氨基酸序列中，作为构成第1螺旋结构的氨基酸序列可以列举从N末端起第4位的M至第19位的K的氨基酸序列，作为构成第2螺旋结构的氨基酸序列可以列举从N末端起第23位的A至42位的K的氨基酸序列，作为构成可以列举第3螺旋结构的氨基酸序列从N末端起59位的K至81位的E的氨基酸序列，以及作为构成第4螺旋结构的氨基酸序列可以列举从N末端起第84位的V至第105位的Y的氨基酸序列。

另外，作为本发明的抗体或该抗体片段更具体而言，可以列举选自以下的(i)～(vii)中的任意一种。

(i)与抗体的VH的CDR1～3分别包含序列编号1～3所示的氨基酸序列、且抗体的VL的CDR1～3分别包含序列编号4～6所示的氨基酸序列的抗体竞争性结合的抗体或其抗原结合片段、

(ii)与抗体的VH的CDR1～3分别包含序列编号1～3所示的氨基酸序列、且抗体的VL的CDR1～3分别包含序列编号4～6所示的氨基酸序列的抗体所结合的表位结合的抗体或其抗原结合片段、

(iii)与和抗体的VH的CDR1～3分别包含序列编号1～3所示的氨基酸序列、且抗体的VL的CDR1～3分别包含序列编号4～6所示的氨基酸序列的抗体所结合的表位相同的表位结合的抗体或其抗原结合片段、

(iv)抗体的VH的CDR1～3分别包含与序列编号1～3所示的氨基酸序列以以下顺序显示90％以上、91％以上、92％以上、93％以上、94％以上、更优选95％以上、96％以上、97％以上、98％以上、99％以上的相同性的氨基酸序列，且抗体的VL的CDR1～3分别包含与序列编号4～6所示的氨基酸序列优选以以下顺序显示90％以上、91％以上、92％以上、93％以上、94％以上、更优选95％以上、96％以上、97％以上、98％以上、99％以上的相同性的氨基酸序列的抗体及其抗原结合片段、

(v)抗体的VH的CDR1～3分别包含序列编号1～3所示的氨基酸序列、且抗体的VL的CDR1～3分别包含序列编号4～6所示的氨基酸序列的抗体或其抗原结合片段、

(vi)抗体的VH包含与序列编号7所示的氨基酸序列优选以以下的顺序显示90％以上、91％以上、92％以上、93％以上、94％以上、更优选95％以上、96％以上、97％以上、98％以上、99％以上的相同性的氨基酸序列，且抗体的VL包含与序列编号8所示的氨基酸序列优选以以下的顺序显示90％以上、91％以上、92％以上、93％以上、94％以上、更优选95％以上、96％以上、97％以上、98％以上、99％以上的相同性的氨基酸序列的抗体或其抗原结合片段、

(vii)抗体的VH包含序列编号7所示的氨基酸序列、且抗体的VL包含序列编号8所示的氨基酸序列的抗体或其抗原结合片段。

本发明的抗体中还包括在本发明的抗体或其抗原结合片段上融合了荧光物质、放射性同位元素等结构分析所需要的分子后的衍生物。另外，本发明的抗体或其抗原结合片段能够用于BRIL融合蛋白质的检测或测定。例如作为免疫学的检测或测定，为使用实施了标记的抗原或抗体或者其抗原结合片段，检测或测定抗体或其抗原结合片段量或抗原量的方法。

作为免疫学的检测或测定方法，可以列举放射性物质标记免疫抗体法(RIA)、酶免疫测定法(EIA或ELISA)、荧光免疫测定法(FIA)、发光免疫测定法(luminescentimmunoassay)、免疫印迹法或物理化学的方法等。

根据上述方法，不仅能够进行BRIL融合蛋白质的检测或测定，而且在BRIL融合蛋白质的利用电子显微镜的结构解析以及利用X射线的晶体结构解析中，还能够将融合于目标蛋白质的BRIL部分用抗BRIL抗体标记化，或确定三维下的分子的方向性。

以下，具体说明本发明的抗BRIL抗体的制造方法、以及使用抗BRIL抗体的BRIL融合蛋白质的稳定化方法、BRIL融合蛋白质的晶体结构解析方法等。

1.抗体的制造方法

(1)抗原的制备

在作为抗原的BRIL蛋白质或目标蛋白质上融合BRIL得到的BRIL融合蛋白质能够通过将包含编码蛋白质的全长或其一部分长度的cDNA的表达载体导入大肠杆菌、酵母、昆虫细胞或动物细胞等来获得。

另外，也能够通过Fmoc法或tBoc法等的化学合成法制备具有BRIL的部分序列的合成肽，用于抗原。BRIL或BRIL融合蛋白质也可以在C末端或N末端添加FLAG或His等公知的标签。

本发明中使用的BRIL或BRIL融合蛋白质能够通过使用Molecular Cloning,ALaboratory Manual,Second Edition,Cold Spring Harbor Laboratory Press(1989)或Current Protocols In Molecular Biology,John Wiley&Sons(1987-1997)等中记载的方法等，例如通过以下的方法，将编码该BRIL或BRIL融合蛋白质的DNA在宿主细胞中表达来制造。

首先，将包含编码BRIL或BRIL融合蛋白质的部分的全长cDNA***适当的表达载体的启动子的下游，由此制作重组载体。将所得到的该重组载体导入适合该表达载体的宿主细胞，由此能够得到生产多肽的转化体。

作为表达载体，只要能够在使用的宿主细胞中自我复制或重组到染色体中，且在能够转录编码多肽的DNA的位置含有适当的启动子的载体，则可以任意使用。

作为宿主细胞，只要是大肠杆菌等的属于埃希氏菌属等的微生物、PichiaPastoris酵母、Sf9等的昆虫细胞、或CHO细胞等的动物细胞等能够表达目标基因的细胞则可以任意使用。

在使用大肠杆菌等的原核生物作为宿主细胞的情况下，重组载体优选为能够在原核生物中自我复制，同时包含启动子、核糖体结合序列、包含编码BRIL或BRIL融合蛋白质的部分的DNA以及转录终止序列的载体。另外，该重组载体中也不一定需要转录终止序列，但优选在结构基因的正下方配置转录终止序列。进一步，在该重组载体中也可以包含控制启动子的基因。作为该重组载体，优选使用将作为核糖体结合序列的Shine-Dalgarno序列(也称为SD序列)与起始密码子之间调节为适当距离(例如6～18碱基)的质粒。

另外，作为编码该BRIL或BRIL融合蛋白质的DNA的碱基序列，能够以成为对宿主内的表达最适合的密码子的方式取代碱基，由此能够提高目标BRIL或BRIL融合蛋白质的生产率。

作为表达载体，只要能够在使用的宿主细胞中发挥功能则可以任意使用，可以列举例如：pBTrp2、pBTac1、pBTac2(以上、Roche Diagnostics公司制)、pKK233－2(Pharmacia公司制)、pSE280(Invitrogen公司制)、pGEMEX－1(Promega公司制)、pQE－8(Qiagen公司制)、pKYP10(日本特开昭58－110600号公报)、pKYP200[Agricultural BiologicalChemistry,48,669(1984)]、pLSA1[Agric.Biol.Chem.,53,277(1989)]、pGEL1[Proc.Natl.Acad.Sci.USA,82,4306(1985)]、pBluescript II SK(－)(Stratagene公司制)、pTrs30[由大肠杆菌JM109/pTrS30(FERM BP－5407)制备]、pTrs32[由大肠杆菌JM109/pTrS32(FERM BP－5408)制备]、pGHA2[由大肠杆菌IGHA2(FERM BP－400)制备、日本特开昭60－221091号公报]、pGKA2[由大肠杆菌IGKA2(FERM BP－6798)制备、日本特开昭60－221091号公报]、pTerm2(US4686191、US4939094、US5160735)、pSupex、pUB110、pTP5、pC194、pEG400[J.Bacteriol.,172,2392(1990)]、pGEX(Pharmacia公司制)、pET***(Novagen公司制)、pME18SFL3、或pFastBac1(Invitrogen公司制)等。

作为宿主细胞，可以列举例如大肠杆菌XL1－Blue、大肠杆菌XL2－Blue、大肠杆菌DH1、大肠杆菌MC1000、大肠杆菌KY3276、大肠杆菌W1485、大肠杆菌JM109、大肠杆菌HB101、大肠杆菌No.49、大肠杆菌W3110、大肠杆菌NY49或大肠杆菌DH5α等。

作为向宿主细胞导入重组载体的方法，只要是向使用的宿主细胞导入DNA的方法则能够使用任意的方法，可以列举例如使用钙离子的方法[Proc.Natl.Acad.Sci.USA,69,2110(1972)、Gene,17,107(1982)、Molecular&General Genetics,168,111(1979)]。

在使用动物细胞作为宿主的情况下，作为表达载体，只要为能够在动物细胞中发挥功能，则能够任意使用，可以列举例如pcDNAI、pCDM8(Funakoshi公司制)、pAGE107[日本特开平3－22979号公报；Cytotechnology,3,133(1990)]、pAS3-3(日本特开平2－227075号公报)、pCDM8[Nature,329,840(1987)]、pcDNAI/Amp(Invitrogen公司制)、pcDNA3.1(Invitrogen公司制)、pREP4(Invitrogen公司制)、pAGE103[J.Biochemistry,101,1307(1987)]、pAGE210、pME18SFL3、pKANTEX93(国际公开第97/10354号)、N5KG1val(美国专利第6，001，358号说明书)、INPEP4(Biogen－IDEC公司制)和转座子载体(国际公开第2010/143698号)等。

作为宿主细胞，可以列举人白血病细胞Namalwa细胞、猴细胞COS细胞、中国仓鼠卵巢细胞CHO细胞[Journal of Experimental Medicine,108,945(1958)；Proc.Natl.Acad.Sci.USA,60,1275(1968)；Genetics,55,513(1968)；Chromosoma,41,129(1973)；Methods in Cell Science,18,115(1996)；Radiation Research,148,260(1997)；Proc.Natl.Acad.Sci.USA,77,4216(1980)；Proc.Natl.Acad.Sci.,60,1275(1968)；Cell,6,121(1975)；Molecular Cell Genetics,Appendix I,II(pp.883-900)]、二氢叶酸还原酶基因(以下记作dhfr)缺失了的CHO细胞(CHO/DG44细胞)[Proc.Natl.Acad.Sci.USA,77,4216(1980)]、CHO－K1(ATCC CCL－61)、DUkXB11(ATCC CCL－9096)、Pro－5(ATCC CCL－1781)、CHO－S(Life Technologies、Cat#11619)、Pro－3、大鼠骨髓瘤细胞YB2/3HL.P2.G11.16Ag.20(或也称为YB2/0)、小鼠骨髓瘤细胞NSO、小鼠骨髓瘤细胞SP2/0－Ag14、叙利亚仓鼠细胞BHK或HBT5637(日本特开昭63－000299号公报)等。

作为重组载体的导入方法，只要是能够在动物细胞导入DNA的方法就可以任意使用，可以列举例如电穿孔法[Cytotechnology,3,133(1990)]、磷酸钙法(日本特开平2－227075号公报)、或脂质转染法[Proc.Natl.Acad.Sci.USA,84,7413(1987)]等。

将具有如上得到的导入了编码BRIL或BRIL融合蛋白质的DNA的重组载体的微生物、酵母、昆虫细胞或动物细胞等的来源的转化体在培养基中培养，在培养液中生成并积累该BRIL或BRIL融合蛋白质，从该培养液中收集，由此能够制造BRIL或BRIL融合蛋白质。将该转化体在培养基中培养的方法能够按照宿主的培养中使用的通常的方法进行。

作为编码BRIL或BRIL融合蛋白质的基因的表达方法，除了直接表达以外，还能够使用分泌生产或融合蛋白质表达等的方法[Molecular Cloning,A Laboratory Manual,Second Edition,Cold Spring Harbor Laboratory Press(1989)]。作为BRIL或BRIL融合蛋白质的生产方法，有在宿主细胞内生产的方法、在宿主细胞外分泌的方法、或在宿主细胞的外膜上生产的方法，通过改变使用的宿主细胞、生产的BRIL或BRIL融合蛋白质的结构，能够选择适当的方法。

(2)动物的免疫和融合用抗体产生细胞的制备

对3～20周龄的小鼠、免疫不全小鼠(MRL/MpJJms slc－lpr/lpr)、大鼠或仓鼠等的动物免疫(1)中得到的抗原，采集该动物的脾、***、末梢血中的抗体产生细胞。

免疫通过在动物的皮下或静脉内或腹腔内例如与弗氏完全佐剂、氢氧化铝凝胶与百日咳菌疫苗、或蛋白脂质体等的适当的佐剂一起投予抗原来进行。在抗原为部分肽的情况下，制作与BSA(牛血清白蛋白)、或KLH(Keyhole Limpet hemocyanin)等的载体蛋白质的缀合物，将其作为免疫原使用。

抗原的投予在第1次投予之后，每隔1～2周进行5～10次。各投予后第3～7天通过眼底静脉丛采血，使用酶免疫测定法[Antibodies－A Laboratory Manual,Cold SpringHarbor Laboratory(1988)]等测定其血清的抗体效价。将对免疫中使用的抗原，其血清显示足够的抗体效价的动物作为融合用抗体产生细胞的供给源。

在抗原的最终投予后第3～7天，从免疫了的动物摘出脾脏等包含抗体产生细胞的组织，采集抗体产生细胞。在使用脾脏细胞的情况下，将脾脏粉碎，分散后，离心，进而除去红细胞，取得融合用抗体产生细胞。

(3)骨髓瘤细胞的制备

作为骨髓瘤细胞，使用从小鼠得到的株化细胞，可以使用例如8－氮鸟嘌呤耐性小鼠(BALB/c由来)骨髓瘤细胞株P3－X63Ag8－U1(P3－U1)[Current Topics inMicrobiology and Immunology,18,1(1978)]、P3－NS1/1－Ag41(NS－1)[EuropeanJ.Immunology,6,511(1976)]、SP2/0－Ag14(SP－2)[Nature,276,269(1978)]、P3－X63－Ag8653(653)[J.Immunology,123,1548(1979)]、或P3－X63－Ag8(X63)[Nature,256,495(1975)]等。

该骨髓瘤细胞用正常培养基[添加了谷氨酰胺、2－巯基乙醇、庆大霉素、FBS和8－氮鸟嘌呤的RPMI1640培养基]传代，在细胞融合的第3～4天前用正常培养基传代，确保融合当日2×10 ⁷个以上的细胞数。

(4)细胞融合和单克隆抗体产生杂交瘤的制备

将(2)中得到的融合用抗体产生细胞和(3)中得到的骨髓瘤细胞用MinimumEssential Medium(MEM)培养基或PBS(磷酸氢二钠1.83g、磷酸二氢钾0.21g、食盐7.65g、蒸留水1升、pH7.2)充分清洗，以细胞数成为融合用抗体产生细胞：骨髓瘤细胞＝5～10：1的方式混合，离心后，除去上清。

将沉淀的细胞群充分分散后，在37℃一边搅拌一边添加聚乙二醇－1000(PEG－1000)、MEM培养基和二甲亚砜的混合液。进而每1～2分钟添加MEM培养基1～2mL数次后，加入MEM培养基，使总量为50mL。离心后，除去上清。将沉淀的细胞群缓慢分散后，对融合用抗体产生细胞中在HAT培养基[添加了次黄嘌呤、胸腺嘧啶核苷和氨基蝶呤的正常培养基]中缓慢悬浮细胞。

将该悬浊液在5％CO ₂培养箱中在37℃培养7～14天。培养后，取出培养上清的一部分，通过后述的结合试验等杂交瘤的选择方法，与包含BRIL或BRIL融合蛋白质的抗原反应，选择与不与不含BRIL或BRIL融合蛋白质的抗原反应的细胞群。然后，通过极限稀释法进行克隆，选择稳定并确认到强的抗体效价的细胞作为单克隆抗体产生杂交瘤。

(5)纯化单克隆抗体的制备

对进行了姥鲛烷(Pristane)处理[在腹腔内投予2，6，10，14－四甲基十六烷(Pristane)0.5mL，饲养2周]的8～10周龄的小鼠或裸小鼠，在腹腔内注射(4)中得到的单克隆抗体产生杂交瘤。以10～21天，杂交瘤发生腹水癌化。从该小鼠采集腹水，离心并将固体成分除去后，用40～50％硫酸铵进行盐析，进行利用辛酸沉淀法、DEAE－琼脂糖柱、蛋白质A－柱或凝胶过滤柱的纯化，收集IgG或IgM组分，作为纯化单克隆抗体。

另外，将(4)中得到的单克隆抗体产生杂交瘤用添加了10％FBS的RPMI1640培养基等培养后，通过离心将上清去除，悬浮在Hybridoma SFM培养基中，培养3～7天。将所得到的细胞悬浮液离心，利用所得到的上清，进行利用蛋白质A－柱或蛋白质G－柱的纯化，收集IgG组分，也能够得到纯化单克隆抗体。此外，也能够在Hybridoma SFM培养基中添加5％Daigo GF21。

抗体的亚类的确定通过使用亚类分型试剂盒利用酶免疫测定法进行。蛋白质量的定量通过Lowry法或280nm时的吸光度计算。

(6)单克隆抗体的选择

单克隆抗体的选择如以下所示，通过使用binding ELISA、脂质体ELISA和流式细胞仪，测定抗体与BRIL或BRIL融合蛋白质表达细胞的的结合性等来进行。BRIL或BRIL融合蛋白质表达细胞只要为在细胞表面上表达BRIL或BRIL融合蛋白质即可可以为任意细胞，可以列举例如Sf9细胞、Pichia Pastoris细胞、人细胞株和(1)中得到的BRIL融合蛋白质强制表达细胞株等。

将BRIL融合蛋白质、该脂质体或BRIL融合蛋白质表达细胞注入96孔板等的板后，注入作为第1抗体的血清、杂交瘤的培养上清或纯化单克隆抗体等的被测物质，使其反应。

将反应后的细胞用包含1～10％牛血清白蛋白(BSA)的PBS(以下记作BSA－PBS)等充分清洗后，注入作为第2抗体的用荧光试剂等标记过的抗免疫球蛋白抗体使其反应。用BSA－PBS等充分清洗后，使用流式细胞仪测定标记化抗体的荧光量，由此选择对BRIL融合蛋白质、BRIL融合蛋白脂质体、或BRIL融合蛋白质表达细胞进行特异性反应的单克隆抗体。

另外，与本发明的抗体竞争性地结合BRIL融合蛋白质、BRIL融合蛋白脂质体或BRIL融合蛋白质表达细胞的抗体，能够通过在使用上述的binding ELISA、脂质体ELISA或流式细胞仪的测定体系中添加被测抗体使其反应而取得。

即，在添加被测抗体时，筛选抑制本发明的抗体与BRIL融合蛋白质、BRIL融合蛋白脂质体或BRIL融合蛋白质表达细胞的结合的抗体，由此，能够取得关于与BRIL或BRIL融合蛋白质的氨基酸序列，或者BRIL或BRIL融合蛋白质的立体结构的结合，能够与本发明的抗体竞争性与BRIL结合的单克隆抗体。

另外，与包含本发明的BRIL或BRIL融合蛋白质结合的单克隆抗体所结合的表位的表位结合的抗体能够通过用公知的方法鉴定上述的筛选方法所取得的抗体的表位，制作包含鉴定的表位的合成肽或模拟表位的立体结构的合成肽等，进行免疫，由此取得。

此外，与和结合于本发明的BRIL或BRIL融合蛋白质的单克隆抗体所结合的表位相同的表位结合的抗体能够通过鉴定由上述的筛选方法取得的抗体的表位，制作鉴定的表位的部分合成肽或模拟表位的立体结构的合成肽等，进行免疫，而取得。

2.基因重组抗体的制作

作为基因重组抗体的制作例，以下表示人型嵌合抗体的制作方法。基因重组的小鼠抗体、大鼠抗体和兔抗体等也能够用同样的方法制作。

(1)基因重组抗体表达用载体的构建

基因重组抗体表达用载体为导入了编码小鼠、大鼠或人等各种抗体的CH和CL的DNA的动物细胞用表达载体，能够通过在动物细胞用表达载体中分别克隆编码所希望种类的抗体的CH和CL的DNA的来构建。

抗体的C区域能够使用任意的小鼠、大鼠、兔、人等任意抗体的CH和CL。例如使用人抗体的γ1亚类的CH和κ类的CL等。编码人抗体的CH和CL的DNA使用cDNA，但也能够使用包含外显子和内含子的染色体DNA。

动物细胞用表达载体只要是能够重组表达编码人抗体的C区域的基因的载体则可以任意使用。例如使用pAGE107[Cytotechnol.,3,133(1990)]、pAGE103[J.Biochem.,101,1307(1987)]、pHSG274[Gene,27,223(1984)]、pKCR[Proc.Natl.Acad.Sci.USA,78,1527(1981)]、pSG1bd2－4[Cytotechnol.,4,173(1990)]或pSE1UK1Sed1－3[Cytotechnol.,13,79(1993)]等。

动物细胞用表达载体中启动子和增强子中使用SV40的早期启动子[J.Biochem.,101,1307(1987)]、莫洛尼(氏)小鼠白血病病毒LTR[Biochem.Biophys.Res.Commun.,149,960(1987)]或免疫球蛋白H链的启动子[Cell,41,479(1985)]和增强子[Cell,33,717(1983)]等。

从基因重组抗体表达载体的构建的容易度、向动物细胞导入的容易度、动物细胞内的抗体H链和L链的表达量的平衡均衡等的观点出发，基因重组抗体表达用载体使用抗体H链和L链存在于同一载体上的类型(串联型)的基因重组抗体表达用载体[J.Immunol.Methods，167，271(1994)]，但也能够使用抗体H链和L链存在于不同的载体上的类型。串联型的基因重组抗体表达用载体使用pKANTEX93(国际公开第97/10354号)、pEE18[Hybridoma,17,559(1998)]等。

(2)编码源自人或人以外的动物的抗体的V区域的cDNA的取得和氨基酸序列的解析

例如，编码非人抗体的VH和VL的cDNA的取得和氨基酸序列的解析能够如下进行。

由产生非人抗体的杂交瘤细胞提取mRNA，合成cDNA。将合成的cDNA克隆到噬菌体或质粒等的载体上制作cDNA文库。通过该文库，例如使用编码小鼠抗体的C区部分或V区部分的DNA作为探针，分别分离具有编码VH或VL的cDNA的重组噬菌体或重组质粒。分别确定重组噬菌体或重组质粒上的作为目标的小鼠抗体的VH或VL的全碱基序列，由碱基序列分别推测VH或VL的全氨基酸序列。

制作产生非人抗体的杂交瘤细胞的人以外的动物使用小鼠、大鼠、仓鼠或兔等，但只要能够制作杂交瘤细胞，则也能够使用任何动物。

将所选择的cDNA用适当的内切酶等切断后，克隆到pBluescript SK(－)(Stratagene公司制)等的质粒上，通过通常使用的碱基序列分析方法等确定该cDNA的碱基序列。碱基序列分析方法例如进行双脱氧法[Proc.Natl.Acad.Sci.USA,74,5463(1977)]等反应后，使用ABI PRISM3700(PE Biosystems公司制)或A.L.F.DNA测序仪(Pharmacia公司制)等的碱基序列自动分析装置等。

由所确定的碱基序列分别推测VH和VL的全氨基酸序列，通过与已知的抗体的VH和VL的全氨基酸序列[Sequences of Proteins of Immunological Interest,USDept.Health and Human Services(1991)]进行比较，分别确认取得的cDNA是否编码包含分泌信号序列的抗体的VH和VL的完整的氨基酸序列。

关于包含分泌信号序列的抗体的VH和VL的完整的氨基酸序列，通过与已知的抗体的VH和VL的全氨基酸序列[Sequences of Proteins of Immunological Interest,USDept.Health and Human Services(1991)]进行比较，能够推测分泌信号序列的长度和N末端氨基酸序列，进而能够得知它们所属的亚组。另外，关于VH和VL的各CDR的氨基酸序列，也能够通过与已知的抗体的VH和VL的氨基酸序列[Sequences of Proteins ofImmunological Interest,US Dept.Health and Human Services(1991)]进行比较来找出。

(3)基因重组抗体表达载体的构建

在编码(1)中得到的基因重组抗体表达用载体的非人或人抗体的CH或CL的各个基因的上游，分别克隆分别编码非人或人抗体的VH或VL的cDNA，由此能够构建小鼠、大鼠、兔或人型嵌合抗体等的基因重组抗体表达载体。

为了将编码非人或人抗体的VH或VL的cDNA的3’末端侧与非人或人抗体的CH或CL的5’末端侧连结，制作以连结部分的碱基序列编码适当氨基酸且成为适当的内切酶识别序列的方式设计的VH和VL的cDNA。

将所制作的VH和VL的cDNA分别克隆到(1)所得到的基因重组抗体表达用载体的编码非人或人抗体的CH或CL的各个基因的上游，以使它们以适当的形式表达，构建小鼠、大鼠、兔或人型嵌合抗体等的基因重组抗体表达载体。

所构建的基因重组抗体表达载体能够通过导入到上述的适当的宿主细胞使其表达，来制作基因重组抗体。

3.与BRIL或BRIL融合蛋白质结合的抗体的用途

本发明的抗体利用与BRIL或BRIL融合蛋白质特异性结合的性质，可以在免疫学的方法、目标蛋白质的稳定化方法、结晶制造方法、晶体结构分析方法、电子显微镜结构分析等的用途中使用。免疫学的方法是指使用实施了标记的抗原或抗体，检测或测定抗体量或抗原量的方法。可以列举例如放射性物质标记免疫抗体法、酶免疫测定法、荧光免疫测定法、发光免疫测定法、免疫印迹法或物理化学的方法等。

另外，在结晶制造方法、电子显微镜结构分析、晶体结构分析等的结构分析中，能够通过使用非标记抗体将BRIL融合蛋白质稳定化来使用。另外，在本结构分析中，通过抗BRIL抗体本身与BRIL或BRIL融合蛋白质特异性结合，能够作为复合体中的标记物识别，因此有用。

放射性物质标记免疫抗体法例如使抗原或表达抗原的细胞等与本发明的抗体或该抗体片段反应，进而使实施了放射线标记的抗免疫球蛋白抗体或该抗体片段反应后，用闪烁计数器等来测定。

酶免疫测定法例如使抗原或表达抗原的细胞等与本发明的抗体或该抗体片段反应，进而与用酶等实施了标记的抗免疫球蛋白抗体或结合片段反应后，添加底物用吸光光度计测定反应液的吸光度。作为酶免疫测定法中使用的标记体，能够使用公知[酶免疫测定法、医学書院(1987)]的酶标记。作为标记酶使用碱性磷酸酶标记、过氧化物酶标记、荧光素酶标记、或生物素标记等。

荧光免疫测定法用文献[Monoclonal Antibodies-Principles and practice,Third edition,Academic Press(1996)、单克隆抗体实验手册、KODANSHA SCIENTIFICLTD.(1987)]等中记载的方法测定。作为荧光免疫测定法中使用的标记体，能够使用公知[荧光抗体法、Soft-science公司(1983)]的荧光标记。例如使用FITC或RITC等。发光免疫测定法用文献[生物发光和化学发光临床检查42、广川书店(1998)]等中记载的方法测定。作为发光免疫测定法中使用的标记体，可以列举公知的发光体标记，使用吖啶酯、洛粉碱(LOPHINE)等。

另外，也能够通过使荧光标记的抗体与细胞反应，用流式细胞仪分析的荧光抗体染色法[Monoclonal Antibodies-Principles and practice,Third edition,AcademicPress(1996)、单克隆抗体实验手册、KODANSHA SCIENTIFIC LTD.(1987)]进行检测。另外，荧光抗体染色法中，使用FMAT8100HTS***(Applied Biosystems公司制)等的情况下，能够不分离所形成的抗体－抗原复合体与参与抗体－抗原复合体的形成的游离的抗体或抗原，来测定抗原量或抗体量。

作为使用本发明的抗BRIL抗体的使BRIL融合蛋白质稳定化的方法、结晶制造方法、晶体结构分析方法，例如能够制备与BRIL特异性结合的抗体或该抗体片段，使其与BRIL融合蛋白质以适当的摩尔比反应后，使用液相色谱，纯化包含BRIL融合蛋白质和抗BRIL抗体的复合体的峰进行结晶化，通过抗BRIL抗体与BRIL融合蛋白质结合，能够得到稳定化后的BRIL融合蛋白质/抗BRIL抗体的共结晶。

所得到的BRIL融合蛋白质被稳定地结晶化，能够用于X射线晶体结构分析。

另外，作为使用本发明的抗BRIL抗体使BRIL融合蛋白质在溶液中稳定化的方法，例如在负染色电子显微镜解析、或冷冻电子显微镜解析等的结构解析中，在作为试样的BRIL融合蛋白质中添加抗BRIL抗体进行电子显微镜解析，由此使溶液中的BRIL融合蛋白质稳定化且作为结构复合体的标记物利用，能够赋予三维的分子的方向性。作为抗BRIL抗体不论是上述的标签化的抗体，还是非标签化的抗体都可以使用。负染色电子显微镜解析和冷冻电子显微镜解析均为进行液相中的目标蛋白质的结构解析的方法，能够使用染色电子显微镜进行结构解析的样品同样在冷冻电子显微镜中也能够用于结构解析。

以下，利用实施例具体说明本发明，但本发明不限于下述实施例。

实施例

[实施例1]BRIL融合人ChemR23蛋白质的制作

根据已经报告的GPCR晶体结构分析结果，可知通过在GPCR的从第5个跨膜螺旋上保守的脯氨酸起第16～24位的氨基酸区域与从第6个跨膜螺旋上保守的脯氨酸起第－24～－28位的氨基酸区域重叠的部分融合BRIL，GPCR的结构稳定性提高，结晶化概率提高(Eugene Chun et al.Structure,2012；20:967-976)。因此，在本实施例中也在人ChemR23(以下，也简称为hChemR23。)的第5～6个跨膜螺旋之间的环部分***BRIL，构建人ChemR23－BRIL融合蛋白质。

具体而言，在制作了在hChemR23的氨基酸序列(序列编号10)中，从N末端起第247位的亮氨酸与第248位的谷氨酰胺之间***了BRIL的变异体、在第248位的谷氨酰胺与第249位的精氨酸之间***了BRIL的变异体、在第249位的精氨酸与第250位的天冬酰胺之间***了BRIL的变异体、在第250位的天冬酰胺与第251位的精氨酸之间***了BRIL的变异体、在第251位的精氨酸与第252位的亮氨酸之间***了BRIL的变异体、在第252位的亮氨酸与第253位的丙氨酸之间***了BRIL的变异体、在第253位的丙氨酸与第254位的赖氨酸之间***了BRIL的变异体、在第254位的赖氨酸与第255位的苏氨酸之间***了BRIL的变异体、削除第248位的谷氨酰胺至第254位的赖氨酸且在第247位的亮氨酸与第255位的苏氨酸之间***了BRIL的变异体、削除第248位的谷氨酰胺至第253位的丙氨酸且在第247位的亮氨酸与第254位的赖氨酸之间***了BRIL的变异体、削除第248位的谷氨酰胺至第252位的亮氨酸且在第247位的亮氨酸与第253位的丙氨酸之间***了BRIL的变异体、削除第248位的谷氨酰胺至第251位的精氨酸且在第247位的亮氨酸与第252位的亮氨酸之间***了BRIL的变异体、削除第248位的谷氨酰胺至第250位的天冬酰胺且在第247位的亮氨酸与第251位的精氨酸之间***了BRIL的变异体、削除第248位的谷氨酰胺至第249位的精氨酸且在第247位的亮氨酸与第250位的天冬酰胺之间***了BRIL的变异体、削除第248位的谷氨酰胺且在第247位的亮氨酸与第249位的精氨酸之间***了BRIL的变异体、削除第249位的精氨酸至第254位的赖氨酸且在第248位的谷氨酰胺与第255位的苏氨酸之间***了BRIL的变异体、削除第249位的精氨酸至第253位的丙氨酸且在第248位的谷氨酰胺与第254位的赖氨酸之间***了BRIL的变异体、削除第249位的精氨酸至第252位的亮氨酸且在第248位的谷氨酰胺与第253位的丙氨酸之间***了BRIL的变异体、削除第249位的精氨酸至第251位的精氨酸且在248位的谷氨酰胺与252位的亮氨酸之间***了BRIL的变异体、削除第249位的精氨酸至第250位的天冬酰胺且在第248位的谷氨酰胺与第251位的精氨酸之间***了BRIL的变异体、削除第249位的精氨酸且在248位的谷氨酰胺与第250位的天冬酰胺之间***了BRIL的变异体、削除第250位的天冬酰胺至第254位的赖氨酸且在第249位的精氨酸与第255位的苏氨酸之间***了BRIL的变异体、削除第250位的天冬酰胺至第253位的丙氨酸且在第249位的精氨酸与第254位的赖氨酸之间***了BRIL的变异体、削除第250位的天冬酰胺至第252位的亮氨酸且在第249位的精氨酸与253位的丙氨酸之间***了BRIL的变异体、削除第250位的天冬酰胺至第251位的精氨酸且在第249位的精氨酸与第252位的亮氨酸之间***了BRIL的变异体、削除第250位的天冬酰胺且在第249位的精氨酸与第251位的精氨酸之间***了BRIL的变异体、削除第251位的精氨酸至第254位的赖氨酸且在第250位的天冬酰胺与第255位的苏氨酸之间***了BRIL的变异体、削除第251位的精氨酸至第253位的丙氨酸且在第250位的天冬酰胺与第254位的赖氨酸之间***了BRIL的变异体、削除第251位的精氨酸至第252位的亮氨酸且在第250位的天冬酰胺与第253位的丙氨酸之间***了BRIL的变异体、削除第251位的精氨酸且在第250位的天冬酰胺与第252位的亮氨酸之间***了BRIL的变异体、削除第252位的亮氨酸至第254位的赖氨酸且在第251位的精氨酸与第255位的苏氨酸之间***了BRIL的变异体、削除第252位的亮氨酸至第253位的丙氨酸且在第251位的精氨酸与第254位的赖氨酸之间***了BRIL的变异体、削除第252位的亮氨酸且在第251位的精氨酸与第253位的丙氨酸之间***了BRIL的变异体、削除第253位的丙氨酸至第254位的赖氨酸且在第252位的亮氨酸与第255位的苏氨酸之间***了BRIL的变异体、削除第253位的丙氨酸且在第252位的亮氨酸与第254位的赖氨酸之间***了BRIL的变异体、以及削除第254位的赖氨酸且在第253位的丙氨酸与第255位的苏氨酸之间***了BRIL的变异体的合计32种BRIL融合蛋白质。

使用酿酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)中将片段化载体(在p426GAL1***了TEV protease识别序列、GFP和His₈标签序列的载体)和基因片段用同源重组反应连结的体系(Nat.Protoc.2008；784-98)，使其表达在人ChemR23的C末端融合了绿色荧光蛋白(GFP)和His₈标签序列的BRIL融合蛋白质。

将表达的hChemR23－BRIL融合蛋白质供于荧光尺寸排阻色谱(Fluorescent SizeExclusion Chromatography；FSEC)，实施FSEC筛选。将与凝集体峰相比，所希望的主峰更高、单分散性高的样品判断为作为单一的BRIL融合蛋白质表达的试样，选择为BRIL***到最适合的***位置的BRIL融合蛋白质。

进而制作改变BRIL融合蛋白质的N末端和C末端的氨基酸序列的长度的hChemR23－BRIL融合蛋白质，通过FSEC筛选确定最适合的N末端和C末端的氨基酸序列的长度，取得稳定的hChemR23－BRIL融合蛋白质。图1表示hChemR23－BRIL融合蛋白质的利用FSEC的柱形图。

FSEC筛选的结果，选择hChemR23的第1～31位的氨基酸和第343～373位的氨基酸残基缺失，削除第252位的亮氨酸，而且在hChemR23的第251位的精氨酸与第253位的丙氨酸之间连结有BRIL的BRIL融合蛋白质(序列编号11)。

[实施例2]hChemR23－BRIL融合蛋白质的制备

对于选出的变异体，用以下的步骤构建杆状病毒表达体系。首先，将编码序列编号10所示的hChemR23的氨基酸序列中，在编码第32位至第342位的氨基酸序列的cDNA序列(削除第252位的亮氨酸且***BRIL)的C末端上添加了组氨酸标签的氨基酸序列且将第192位的谷氨酰胺取代为谷氨酰胺酸的序列构成的cDNA重组到改变型的pFastBac1(Invitrogen公司制)，构建Sf9细胞表达用载体(pFastBac1－hChemR23－BRIL)。

按照Bac to Bac Baculovirus Expression System(Invitrogen公司制)的手册，将构建的pFastBac1－hChemR23－BRIL载体转化到DH10Bac感受态细胞，取得hChemR23－BRIL表达用的杆粒(Bacmid)。将该杆粒转染到Sf9细胞，制作重组杆状病毒。按照手册，使制作得到的杆状病毒转染到Sf9细胞，由此制备在细胞膜表达hChemR23－BRIL的Sf9细胞。

从在细胞膜表达ChemR23－BRIL的Sf9细胞中，用以下的方法制备细胞膜组分。将Sf9细胞冻结融解，用低渗缓冲液[10mmol/L HEPES pH7.5、20mmol/L KCl、10mM MgCl₂、protein inhibitor cocktail tablet Complete(商标)EDTA free]悬浮后，移到超离心用管中，在4℃进行45,000rpm、30分钟超离心。

将沉淀用高渗缓冲液[10mmol/L HEPES pH7.5、10mmol/LmgCl ₂、20mmol/L KCl、1M NaCl、protein inhibitor cocktail tablet Complete(商标)EDTA free]悬浮，用Dounce型匀浆器(Nippon Genetics株式会社)进行悬浮，再次以45,000rpm进行30分钟超离心。将沉淀用高渗缓冲液悬浮，用Dounce型匀浆器悬浮，再次以45,000rpm进行30分钟超离心。

将沉淀悬浮于包含40％甘油的高渗缓冲液，作为Sf9细胞膜组分以－80℃冷冻保存。将包含hChemR23－BRIL的Sf9细胞膜在冰上解冻后，将膜组分用溶解缓冲液[50mmol/LHEPES pH7.5、500mmol/L NaCl、10％甘油、2％正十二烷基(注册商标)－D－麦芽糖苷(DDM)、0.03％胆固醇半琥珀酸酯(CHS)、protein inhibitor cocktail tablet Complete(商标)EDTA free(Roche公司制)]悬浮后，以4℃用旋转器(rotator)缓慢混合2小时左右，由此将膜溶解。

溶解后，以45,000rpm进行40分钟超离心，将上清回收。在其中加入用清洗缓冲液(50mmol/L HEPES pH7.5、500mmol/L NaCl、10％甘油、2％DDM、0.03％CHS、20mmol/L咪唑)平衡化后的TALON金属亲和树脂(Clontech公司制)10mL，在4℃用批式法使蛋白质吸附2小时。

将树脂填充在空柱中，用清洗缓冲液进行5CV(柱体积)清洗后，用盐浓度提高到800mmol/L的清洗缓冲液进行5CV清洗后，用洗脱缓冲液(50mmol/L HEPES pH7.5、500mmol/L NaCl、10％甘油、2％DDM、0.03％CHS、500mmol/L咪唑)进行3CV洗脱。

将洗脱后的样品用超滤浓缩到10mL，使用PD－10柱置换为清洗缓冲液w/o咪唑(50mmol/L HEPES pH7.5、500mmol/L NaCl、10％甘油、2％DDM、0.03％CHS)，加入需要量的Tabacco Etch Virus Protease(TEV，烟草蚀刻病毒蛋白酶)蛋白酶，在4℃静置过夜。

第二天，确认用TEV蛋白酶的切断后，加入用清洗缓冲液w/o咪唑平衡化后的NiSepharose 6Fast Flow(GE Healthcare Japan公司制)6mL，在4℃用批式法使蛋白质吸附2小时。在柱中装入树脂，回收通过液，使用Amicon Ultra(100kDa截止大小、MerckMillipore公司制)浓缩到1mL左右后，通过BCA测试(Smith,P.K.et al.Anal.Biochem.,1985:150；76-85)和UV₂₈₀测定，算出蛋白质浓度，以后的浓缩通过监测UV₂₈₀，来计算浓度。最终浓缩到30mg/mL左右，作为纯化hChemR23－BRIL样品。

[实施例3]免疫和抗体产生杂交瘤的亚克隆

为了作为抗原使用，制备将纯化hChemR23－BRIL用以下的方法再构成为脂质体的样品。

在L－α－磷脂酰胆碱(EggPC)溶液(10mg/mL EggPC、0.8w/v％胆酸钠、0.5mg/mL脂质A的PBS)中，将纯化后的hChemR23－BRIL以相对于脂质10mg而蛋白质1mg的比例混合。加入与液量基本等量的Bio－Beads SM－2(Bio－Rad Laboratories制)缓慢颠倒混合，由此将表面活性剂除去后，进行超声波匀浆，由此制备免疫用hChemR23－BRIL蛋白脂质体。

就ELISA用的脂质体抗原而言，在包含EggPC的生物素－PE溶液(10mg/mL EggPC、25μg/mL生物素PE(Avanti Polar Lipids)、0.8w/v％胆酸钠in PBS)中，以相对于EggPC10mg而蛋白质1mg的比例混合，以与免疫用脂质体抗原的制备同样的方法，制备ELISA用hChemR23－BRIL蛋白脂质体。

免疫中使用5周龄的雌性免疫不全小鼠(MRL/MpJJms slc－lpr/lpr、日本SLC株式会社)。在初次免疫中，将上述的免疫用hChemR23－BRIL蛋白脂质体用PBS缓冲液稀释后的稀释液作为抗原液，通过腹腔注射对小鼠免疫。

在第2次以后的追加免疫中，将用PBS缓冲液稀释的脂质体抗原和等量的ImjectAlum(Thermo Fisher Scientific)混合得到的液体作为抗原液。实施初次免疫(100μg/小鼠)，在初次免疫7天后实施1次追加免疫(50μg/小鼠)，在初次免疫第21天后实施第2次追加免疫(50μg/小鼠)。

使用在第2次免疫后第7天分别采集的血液通过离心操作制备血清样品，用脂质体ELISA法进行抗体效价的测定。在第3次免疫后第7天进行全采血、脾脏摘出。采集的全血通过离心操作制备血清样品。从摘出的脾脏提取脾脏细胞，通过PEG法使其与小鼠骨髓瘤细胞(P3/NS1/1－Ag4－1、独立行政法人医药基盤研究所JCRB细胞库)融合。

用在500mL的RPMI1640(Nacalai Tesque公司制)中添加了HAT Media Supplement(50x)Hybri－Max(SIGMA－ALDRICH公司制)1瓶得到的培养基悬浮杂交瘤，在96孔中各注入300μL，在37℃、5％CO ₂的条件下静置1周。

HAT筛选后第7天将各孔的培养上清中的抗hChemR23－BRIL抗体利用脂质体ELISA法进行1次筛选。将确认了抗体的产生的孔悬浮并移到24孔在37℃静置培养。这里使用的脂质体ELISA法使用的是将hChemR23－BRIL包埋生物素化脂质体经由链霉亲和素固定在96孔板中进行的方法(日本特愿2009－110994)。

具体而言，将hChemR23－BRIL包埋生物素化脂质体用PBS稀释成1－10μg/mL，分注如96孔的链霉亲和素板后，在室温静置1.5小时，由此将hChemR23－BRIL包埋生物素化脂质体固相化。除去固相抗原溶液，在每一个孔中加入包含1％BSA的PBS(以下记作BSA－PBS)200μL，在室温静置2小时。

将BSA－PBS除去，作为一次抗体将杂交瘤培养上清在每孔中加入50μL，在室温静置2小时左右。除去杂交瘤培养上清，用洗板机实施清洗。作为二次抗体将抗小鼠IgG-HRP缀合物用0.5－1％的BSA－PBS稀释，每孔加入50μL，在室温静置1.5小时左右。除去二次抗体液，用洗板机清洗。然后，以450nm的吸光度检测HRP反应底物四甲基联苯胺(TMB)的产物。

在24孔扩大培养后第2天进行2次筛选。用脂质体ELISA法检测各孔的培养上清中的抗hChemR23－BRIL抗体。确认对hChemR23－BRIL、hCCR10－BRIL(第1～39位的氨基酸和第316～362位的氨基酸缺失且第236位～第243位的氨基酸削除后与BRIL连结而成的变异体)(序列编号12)、空脂质体和改性hChemR23－BRIL的结合性，选出产生向hChemR23－BRIL的结合性高而与其他样品的结合性低的抗体的细胞。将确认了产生抗体的孔悬浊，移到24个孔中在37℃静置培养。

此外，使hCCR10－BRIL在Pichia pastoris(毕赤巴斯德酵母)的细胞膜上表达，培养后，将菌体冻结融解，在其中添加所需量的Zymolyase(注册商标)100T(Nacalai Tesque公司制)，在30℃以100rpm左右的低速度振荡1小时，由此进行细胞壁的消化反应。然后，进行超声波破碎，以7,000rpm高速离心20分钟，回收上清。

将回收的上清进一步以45,000rpm进行40分钟超离心，将沉淀用高盐缓冲液(10mmol/L HEPES pH7.5、10mmol/LmgCl ₂、20mmol/L KCl、1M NaCl)悬浮，用Dounce型匀浆器悬浮，再次以45,000rpm进行30分钟超离心。将沉淀用Membrane buf.(50mmol/L HEPESpH7.5、120mmol/L NaCl、20％甘油)悬浮后，添加适当的配体使其成为100μmol/L，将其作为膜组分，纯化与实施例2中记载的方法同样地实施。

将2次筛选中选出的培养细胞上清中的抗hChemR23－BRIL抗体用与实施例1同样的FSEC法实施3次筛选。将使hChemR23－BRIL表达了的Pichia pastoris细胞膜和表达了hCCR10－BRIL的Pichia pastoris细胞膜分别用1％DDM可溶化，进行超离心，并使用上清。

选出产生虽然对hChemR23－BRIL和hCCR10－BRIL的两者观察到了结合，但相比于hCCR10－BRIL，明显对于hChemR23－BRIL的结合强的抗体的杂交瘤，作为杂交瘤SRP2070。确认杂交瘤SRP2070生产的抗BRIL小鼠单克隆抗体SRP2070的亚类，结果为小鼠IgG2a类。

[实施例4]纯化抗体的制备

将取得的抗BRIL抗体产生杂交瘤SRP2070用10cm培养皿进行扩大培养，将每1个培养皿的细胞对1只裸小鼠(BALB/cSlc－nu/nu、日本SLC株式会社)进行腹腔内给药。小鼠在杂交瘤的腹腔内给药的7天前将500μL的弗氏不完全佐剂(Freund’s IncompleteAdjuvant)(FIA、DIFCO公司制)进行腹腔内给药。细胞接种后采集腹水。腹水通过离心，将细胞和残渣除去。然后，用填充脱脂棉的针筒过滤，进而将残渣过滤。

制备将390g的硫酸铵溶解于1L的PBS缓冲液的饱和硫酸铵溶液，将腹水和饱和硫酸铵溶液以体积比为1比2混合，在4℃搅拌1小时以上。然后，用一晚透析置换为PBS缓冲液。

单克隆抗体纯化使用AKTA pure色谱***(GE Healthcare Japan公司制)，用HiTrap protein G(GE Healthcare Japan公司制)进行。洗脱用1mol/L甘氨酸盐酸缓冲液进行，在洗脱用管中预先添加洗脱量的10分之一的1mol/L Tris－HCl，由此与洗脱的同时进行洗脱液的中和。

取得的纯化单克隆抗体用PBS缓冲液置换后，用在NHS－activated Sepharose 4Fast Flow(GE Healthcare Japan公司制)上固定了木瓜蛋白酶(Nacalai Tesque公司制)的树脂进行处理，由此进行Fab片段化。然后，供于Protein A Sepharose 4 Fast Flow(GEHealthcare Japan公司制)，将通过液回收，由此制备Fab片段。将所得到的Fab片段样品作为结构解析用Fab抗体SRP2070Fab。

[实施例5]抗BRIL抗体SRP2070抗体的序列解析

从由构建的SRP2070产生杂交瘤提取的mRNA制作cDNA，进行抗体的重链和轻链的氨基酸序列以及编码其的基因序列的解析。

其结果得知，SRP2070抗体的VH区域由序列编号7所示的氨基酸序列构成，SRP2070抗体的VH区域的CDR1～3由序列编号1～3所示的氨基酸序列构成。得知编码序列编号7所示的氨基酸序列的基因由序列编号13表示。得知包含信号序列的氨基酸序列由序列编号15表示，编码其的基因由序列编号17表示。

[化学式1]

序列编号7：

/>

SS(下划线为CDR部分)

序列编号1：

序列编号2：

序列编号3：

另外得知，SRP2070抗体的VL区域由序列编号8所示的氨基酸序列构成，VL区域的CDR1～3由序列编号4～6所示的氨基酸序列构成。得知编码序列编号8所示的氨基酸序列的基因由序列编号14表示。得知包含信号序列的氨基酸序列由序列编号16表示，编码其的基因由序列编号18表示。

[化学式2]

序列编号8：

(下划线为CDR部分)

序列编号4：

序列编号5：

序列编号6：

[实施例6]hChemR23－BRIL/apo/SRP2070Fab复合体的制备和结构解析

在以实施例2所记载的方法制备的hChemR23－BRIL样品中以摩尔比计约1.2倍量的SRP2070Fab，在4℃静置1小时。样品的纯化通过组合AKTA Pure色谱***(GE HealthcareJapan公司制)和Superdex 200 Increase10/300 GL(GE Healthcare Japan公司制)来实施。

分离精制hChemR23－BRIL/apo/SRP2070Fab复合体的峰，浓缩至约50mg/mL，作为结晶化用样品。

所得到的结晶化样品通过LCP(Lipidic cubic phase)法[Martin Caffrey etal.,NATURE PROTOCOLS 2009；4(5):706-31]实施共结晶。具体而言，将hChemR23－BRIL/apo/SRP2070Fab复合体结晶化用样品、1－油酰基－rac－甘油和胆固醇以40％、54％、6％的比率在针筒内混合，由此制作LCP。

结晶化使用LCP结晶化用玻璃夹层板，对LCP 50nL注入结晶化溶液800 nL并用玻璃盖板密封。

以作为沉淀剂的20－50v/v％聚乙二醇300、20－50v/v％聚乙二醇400、20－50v/v％聚乙二醇单甲醚500或20－50v/v％聚乙二醇二甲醚550；作为缓冲液的100mM MES－NaOH pH6－6.5、100mM Hepes－NaOH pH7－7.5或100mM Tris－HCl pH8－8.5；作为有机溶剂的添加剂的0.5－2v/v％甲基－2，4－戊二醇、0.5－2v/v％2，5－己二醇、0.5－2v/v％1，2，3－己三醇或0.5－2v/v％异丙醇；作为盐的50－400mM乙酸铵、氯化铵、磷酸二氢铵、氟化铵、甲酸铵、柠檬酸二铵、磷酸氢二铵、硝酸铵、硫酸铵、酒石酸氢铵、水合醋酸钙、二水合氯化钙、二水合乙酸锂、氯化锂、四水合柠檬酸锂、硝酸锂、一水合硫酸锂、四水合乙酸镁、六水合氯化镁、无水甲酸镁、六水合硝酸镁、水合硫酸镁、六水合二氯化镍(II)、乙酸钾、氯化钾、一水合柠檬酸钾、磷酸二氢钾、氟化钾、甲酸钾、磷酸一氢钾、硝酸钾、四水合酒石酸钾钠、硫酸钾、硫氰酸钾、三水合乙酸钠、氯化钠、无水柠檬酸钠、磷酸二氢钠、甲酸钠、无水磷酸一氢钠、丙二酸钠pH 7.0、硝酸钠、十水合硫酸钠、无水酒石酸二钠、硫氰酸钠、琥珀酸pH 7.0、无水乙酸锌、十水合硫酸锌的组合，实施结晶化。

上述条件中，以作为沉淀剂的36－47v/v％聚乙二醇300或32－43.5v/v％聚乙二醇单甲醚500；作为缓冲液的100mM MES－NaOH pH6－6.5、有机溶剂的添加剂的0.5－2v/v％甲基－2，4－戊二醇或0.5－2v/v％2，5－己二醇；作为盐的125－190mM琥珀酸二钠、75－150mM柠檬酸三钠的组合，生成hChemR23－BRIL/apo/SRP2070Fab的结晶。

此外，在抗体非存在下进行了hChemR23－BRIL融合蛋白质的结晶化，但在任何条件下都没能取得结晶，无法实施hChemR23的结构解析。另一方面，在抗BRIL抗体存在下，生成了结晶(表1)。

由LCP法取得的结晶用液氮冻结，在高辉度光科学研究中心SPring－8Beam lineBL32XU中，进行X射线衍射实验。结合来自合计81个结晶的部分数据，得到了衍射功率4.0的结晶，以及分辨率4.5埃的完整数据，实施hChemR23－BRIL/apo/SRP2070Fab的复合体的结构解析的结果，得到了图3所示的蛋白质立体结构。图2表示X射线衍射像的结果，图3表示结构解析的结果。另外，表1表示利用抗BRIL抗体的BRIL融合蛋白质的结晶纯化和结构解析的结果。

[表1]

抗BRIL抗体的BRIL融合蛋白质的结晶纯化和结构解析

由以上的结果可知，在抗BRIL抗体非存在下无法取得的BRIL融合蛋白质的结晶在抗BRIL抗体存在下才能够结晶化，并能够将目标蛋白质进行结构解析。

[实施例7]5HT _1B－BRIL和SRP2070Fab的复合体制备和结构解析

5HT _1B－BRIL用与已经报道的(Wang et al.,Science 2013；340:610-614)相同的构建方法制备。低分子配体的麦角胺在将表达5HT _1B－BRIL融合蛋白质的Sf9细胞膜可溶化时以100μM添加，并且在以后的各纯化阶段的缓冲液中添加100μM进行纯化，由此稳定地纯化5HT _1B－BRIL融合蛋白质。将用与实施例6同样的方法制备得到的包含5HT _1B－BRIL/SRP2070Fab的凝胶过滤组分浓缩至约30mg/mL，与实施例6记载的方法同样地以LCP法进行结晶化。

其结果，在从结晶化起1周以内，生成了能够在衍射数据取得中利用的结晶(表1)。与实施例6同样地在高辉度光科学研究中心SPring－8Beam line BL32XU中进行X射线衍射实验，得到了分辨率3埃的完整数据，实施了5HT _1B－BRIL/Ergotamine/SRP2070Fab的复合体的结构解析。将结果表示于图4和表1。

由以上的结果可知，与实施例6同样地在抗BRIL抗体存在下能够得到良好的结晶，因此结晶化中抗BRIL抗体不会抑制BRIL融合蛋白质的结晶化，反而通过使抗BRIL抗体共存，能够简便地发现结晶化条件，且能够有效地进行结晶化。因此可知，本发明的抗BRIL抗体能够使融合了BRIL的目标蛋白质稳定地结晶化，在BRIL融合蛋白质的结构解析中是非常有用的工具。

[实施例8]BRIL/SRP2070Fab的制备和结晶化

将在BRIL蛋白质的氨基酸序列的N末端添加了TEV蛋白酶识别氨基酸的变异体基因利用内切酶位点BamHI和HindIII***pET28a载体(Novagen公司制)，作为His标签融合体表达。表达样品通过Ni Sepharose 6Fast Flow(GE Healthcare Japan公司制)纯化，然后用TEV蛋白酶将His标签切断。

再次、供于Ni Sepharose 6Fast Flow，将回收的通过液用阴离子交换柱纯化。对其样品，添加摩尔比约1.2倍量的SRP2070Fab，在4℃静置1小时后，进行凝胶过滤，分离纯化BRIL/SRP2070Fab复合体的峰，浓缩至15mg/mL，使用该样品，用蒸汽扩散法实施结晶化。

具体而言，将100nL的BRIL/SRP2070Fab复合体蛋白质溶液和100nL的结晶化溶液混合，作为结晶化内液，与50μL的结晶化溶液(结晶化外液)一起密封，在4℃静置，由此在一周内取得结晶。

作为结晶化溶液，例如由18w/v％聚乙二醇8000、180mmol/L氟化铵、50mmol/LCHES pH9.5生成结晶。取得结晶用液氮冻结，实施X射线衍射实验，结果得到分辨率2.0埃的完整数据，成功进行了BRIL/SRP2070Fab的复合体结构解析。

SRP2070Fab与BRIL的结合方式与实施例6的hChemR23－BRIL融合蛋白质和实施例7的5HT1B－BRIL融合蛋白质的结合方式相同。通过所得到的BRIL和SRP2070Fab的复合体结构解析结果，确定SRP2070Fab的表位和互补位。

确认BRIL与抗BRIL抗体SRP2070的复合体结构，得知抗BRIL抗体SRP2070识别并结合BRIL的第3螺旋结构至第4螺旋结构。

另外，为了解析详细的表位，选择抗BRIL抗体SRP2070的CDR和以内相互作用的BRIL蛋白质内的氨基酸残基，结果得知本发明的抗BRIL抗体SRP2070与BRIL蛋白质的立体结构中的第3螺旋结构至第4螺旋结构中存在的氨基酸残基结合，识别BRIL氨基酸序列的N末端起第67位的Ile(I)、第71位的Gln(Q)、第74位的Asp(D)、第77位的Lys(K)、第78位的Leu(L)、第83位的Lys(K)、第85位的Lys(K)、第86位的Glu(E)、第88位的Gln(Q)、第89位的Ala(A)、第90位的Ala(A)、第92位的Glu(E)、第93位的Gln(Q)、第96位的Thr(T)、第97位的Thr(T)、第99位的Asn(N)和第100位的Ala(A)的氨基酸残基。

此外可知，上述表位中第74位的Asp(D)、第92位的Glu(E)、第93位的Gln(Q)、第96位的Thr(T)、第97位的Thr(T)和第99位的Asn(N)与抗体形成氢键，因此是构成抗BRIL抗体SRP2070的表位的氨基酸残基中最重要的氨基酸残基。

[实施例9]hChemR23－BRIL/apo/SRP2070Fab的负染色电子显微镜解析

用实施例1中记载的方法制备hChemR23－BRIL融合蛋白质。然后，用实施例6记载的方法制备hChemR23－BRIL/apo/SRP2070Fab的复合体，作为负染色电子显微镜的样品，调至约2mg/mL的浓度。将该样品稀释至100倍，在4℃以18000转速离心15分钟。将2.5μL的上清样品上样至样品载网上，在室温静置1分钟，使样品渗透至载网上。

然后，从载网去除样品液，用水清洗3次。将2.5μL的负染色用的试剂NanoW(Methylamine Tungstate，from Nanoprobes)加到样品载网上，在室温静置1分钟，将蛋白质颗粒染色。擦去剩余的染色试剂，在撮影前使样品载网干燥。使TF20电子显微镜在室温以200kV工作，在100,000倍的倍率(像素大小/pixel)、焦点距离1.8～2.5μm的条件下拍摄电子显微镜照片。

实施二维图像的分类，将取得5种代表性平均像的结果表示于图5。如图5所示，箭头(实线)所示的部分为SRP2070Fab，箭头(虚线)所示的部分为GPCR部分，能够识别SRP2070Fab的取向。由以上的结果可知，通过对BRIL融合蛋白质使用本发明的抗BRIL抗体，能够识别液相中三维结构中的GPCR蛋白质部分、BRIL部分，其结果能够鉴定BRIL融合蛋白质分子的方向性。

[实施例10]5HT _1B－BRIL/Ergotamine/SRP2070Fab的负染色电子显微镜解析

用实施例7记载的方法制备5HT _1B－BRIL/麦角胺/SRP2070Fab。作为变更之处，将最终的缓冲液组成中的表面活性剂DDM和CHS的浓度设为0.025％。作为负染色电子显微镜用样品，调至约0.75mg/mL的浓度。将该样品稀释至50倍，在4℃以18,000转速离心15分钟。将2.5μL的上清样品上样至样品载网上，在室温静置10秒钟，使样品渗透至载网上。

然后，从载网去除样品液，用水清洗3次。将2.5μL的负染色用的试剂Nano－W(Methylamine Tungstate，from Nanoprobes)加到样品载网上，在室温静置1分钟，将蛋白质颗粒染色。擦去剩余的染色试剂，在撮影前使样品载网干燥。使TF20电子显微镜在室温以200kV工作，以80,000倍的倍率(像素大小/pixel)、焦点距离1.8～2.5μm的条件下拍摄电子显微镜照片。

实施二维图像的分类，将取得10种代表性平均像的结果表示于图6。如图6所示，箭头(实线)所示的部分为SRP2070Fab，箭头(虚线)所示的部分为GPCR部分，能够识别SRP2070Fab的取向。由以上的结果可知，不仅是之前实施例的ChemR23－BRIL融合蛋白质，而且其他BRIL融合蛋白质也同样，通过使用本发明的抗BRIL抗体，都能够识别液相中三维结构中的GPCR蛋白质部分、BRIL部分，其结果能够鉴定BRIL融合蛋白质分子的方向性。

参照特定的方式详细说明了本发明，但在不脱离本发明的精神和范围内能够进行各种变更和修正，对于本领域技术人员来说是不言而喻的。此外，本申请基于在2017年7月13日申请的日本专利申请(日本特愿2017－137269)，将其整体通过引用援用。另外，这里所引用的所有参照作为整体引入。

序列编号9－人工序列的说明：BRIL蛋白质的氨基酸序列

序列编号10－人工序列的说明：人ChemR23的氨基酸序列

序列编号11－人工序列的说明：人ChemR23－BRIL融合蛋白质的氨基酸序列

序列编号12－人工序列的说明：人CCR10－BRIL融合蛋白质的氨基酸序列。

序列表

<110> 协和麒麟株式会社

<120> 抗BRIL抗体以及使用了该抗体的BRIL融合蛋白质的稳定化方法

<130> W525092

<150> JP2017-137269

<151> 2017-07-13

<160> 18

<170> PatentIn version 3.3

<210> 1

<211> 5

<212> PRT

<213> 小家鼠（Mus musculus）

<400> 1

Asp Phe Tyr Ile Asn

1 5

<210> 2

<211> 17

<212> PRT

<213> 小家鼠（Mus musculus）

<400> 2

Trp Ile Phe Pro Gly Ser Gly Asn Thr His Tyr Asn Glu Lys Phe Lys

1 5 10 15

Gly

<210> 3

<211> 10

<212> PRT

<213> 小家鼠（Mus musculus）

<400> 3

Pro Val Ser Tyr Tyr Tyr Asp Phe Asp Tyr

1 5 10

<210> 4

<211> 11

<212> PRT

<213> 小家鼠（Mus musculus）

<400> 4

Arg Ala Ser Gln Ser Val Ser Asn Tyr Leu His

1 5 10

<210> 5

<211> 7

<212> PRT

<213> 小家鼠（Mus musculus）

<400> 5

Tyr Ala Ser Gln Ser Ile Ser

1 5

<210> 6

<211> 9

<212> PRT

<213> 小家鼠（Mus musculus）

<400> 6

Gln Gln Ser Asn Ser Trp Pro Leu Thr

1 5

<210> 7

<211> 119

<212> PRT

<213> 小家鼠（Mus musculus）

<400> 7

Gln Ile Gln Leu Gln Gln Ser Gly Pro Glu Leu Val Lys Pro Gly Ala

1 5 10 15

Ser Val Lys Ile Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Thr Asp Phe

20 25 30

Tyr Ile Asn Trp Met Lys Gln Arg Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Ile

35 40 45

Gly Trp Ile Phe Pro Gly Ser Gly Asn Thr His Tyr Asn Glu Lys Phe

50 55 60

Lys Gly Lys Ala Thr Leu Ile Val Asp Thr Ser Ser Ser Thr Ala Phe

65 70 75 80

Met Gln Leu Asn Ser Leu Thr Ser Glu Asp Ser Ala Val Tyr Phe Cys

85 90 95

Thr Arg Pro Val Ser Tyr Tyr Tyr Asp Phe Asp Tyr Trp Gly Gln Gly

100 105 110

Thr Thr Leu Thr Val Ser Ser

115

<210> 8

<211> 107

<212> PRT

<213> 小家鼠（Mus musculus）

<400> 8

Asp Ile Val Leu Thr Gln Ser Pro Ala Thr Leu Ser Val Thr Pro Gly

1 5 10 15

Asp Arg Val Ser Leu Ser Cys Arg Ala Ser Gln Ser Val Ser Asn Tyr

20 25 30

Leu His Trp Tyr Gln Gln Lys Ser His Glu Ser Pro Arg Leu Leu Ile

35 40 45

Lys Tyr Ala Ser Gln Ser Ile Ser Gly Ile Pro Ser Arg Phe Ser Gly

50 55 60

Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Ser Ile Asn Ser Val Glu Thr

65 70 75 80

Glu Asp Phe Gly Met Tyr Phe Cys Gln Gln Ser Asn Ser Trp Pro Leu

85 90 95

Thr Phe Gly Ala Gly Thr Lys Leu Glu Leu Arg

100 105

<210> 9

<211> 106

<212> PRT

<213> 人工（Artificial）

<220>

<223> Description of the artificial sequence: amino acid sequence of

BRIL

<400> 9

Ala Asp Leu Glu Asp Asn Trp Glu Thr Leu Asn Asp Asn Leu Lys Val

1 5 10 15

Ile Glu Lys Ala Asp Asn Ala Ala Gln Val Lys Asp Ala Leu Thr Lys

20 25 30

Met Arg Ala Ala Ala Leu Asp Ala Gln Lys Ala Thr Pro Pro Lys Leu

35 40 45

Glu Asp Lys Ser Pro Asp Ser Pro Glu Met Lys Asp Phe Arg His Gly

50 55 60

Phe Asp Ile Leu Val Gly Gln Ile Asp Asp Ala Leu Lys Leu Ala Asn

65 70 75 80

Glu Gly Lys Val Lys Glu Ala Gln Ala Ala Ala Glu Gln Leu Lys Thr

85 90 95

Thr Arg Asn Ala Tyr Ile Gln Lys Tyr Leu

100 105

<210> 10

<211> 373

<212> PRT

<213> 人（Homo sapiens）

<400> 10

Met Arg Met Glu Asp Glu Asp Tyr Asn Thr Ser Ile Ser Tyr Gly Asp

1 5 10 15

Glu Tyr Pro Asp Tyr Leu Asp Ser Ile Val Val Leu Glu Asp Leu Ser

20 25 30

Pro Leu Glu Ala Arg Val Thr Arg Ile Phe Leu Val Val Val Tyr Ser

35 40 45

Ile Val Cys Phe Leu Gly Ile Leu Gly Asn Gly Leu Val Ile Ile Ile

50 55 60

Ala Thr Phe Lys Met Lys Lys Thr Val Asn Met Val Trp Phe Leu Asn

65 70 75 80

Leu Ala Val Ala Asp Phe Leu Phe Asn Val Phe Leu Pro Ile His Ile

85 90 95

Thr Tyr Ala Ala Met Asp Tyr His Trp Val Phe Gly Thr Ala Met Cys

100 105 110

Lys Ile Ser Asn Phe Leu Leu Ile His Asn Met Phe Thr Ser Val Phe

115 120 125

Leu Leu Thr Ile Ile Ser Ser Asp Arg Cys Ile Ser Val Leu Leu Pro

130 135 140

Val Trp Ser Gln Asn His Arg Ser Val Arg Leu Ala Tyr Met Ala Cys

145 150 155 160

Met Val Ile Trp Val Leu Ala Phe Phe Leu Ser Ser Pro Ser Leu Val

165 170 175

Phe Arg Asp Thr Ala Asn Leu His Gly Lys Ile Ser Cys Phe Asn Asn

180 185 190

Phe Ser Leu Ser Thr Pro Gly Ser Ser Ser Trp Pro Thr His Ser Gln

195 200 205

Met Asp Pro Val Gly Tyr Ser Arg His Met Val Val Thr Val Thr Arg

210 215 220

Phe Leu Cys Gly Phe Leu Val Pro Val Leu Ile Ile Thr Ala Cys Tyr

225 230 235 240

Leu Thr Ile Val Cys Lys Leu Gln Arg Asn Arg Leu Ala Lys Thr Lys

245 250 255

Lys Pro Phe Lys Ile Ile Val Thr Ile Ile Ile Thr Phe Phe Leu Cys

260 265 270

Trp Cys Pro Tyr His Thr Leu Asn Leu Leu Glu Leu His His Thr Ala

275 280 285

Met Pro Gly Ser Val Phe Ser Leu Gly Leu Pro Leu Ala Thr Ala Leu

290 295 300

Ala Ile Ala Asn Ser Cys Met Asn Pro Ile Leu Tyr Val Phe Met Gly

305 310 315 320

Gln Asp Phe Lys Lys Phe Lys Val Ala Leu Phe Ser Arg Leu Val Asn

325 330 335

Ala Leu Ser Glu Asp Thr Gly His Ser Ser Tyr Pro Ser His Arg Ser

340 345 350

Phe Thr Lys Met Ser Ser Met Asn Glu Arg Thr Ser Met Asn Glu Arg

355 360 365

Glu Thr Gly Met Leu

370

<210> 11

<211> 416

<212> PRT

<213> 人工（Artificial）

<220>

<223> Description of the artificial sequence: hChemR23-BRIL fusion

protein

<400> 11

Ser Pro Leu Glu Ala Arg Val Thr Arg Ile Phe Leu Val Val Val Tyr

1 5 10 15

Ser Ile Val Cys Phe Leu Gly Ile Leu Gly Asn Gly Leu Val Ile Ile

20 25 30

Ile Ala Thr Phe Lys Met Lys Lys Thr Val Asn Met Val Trp Phe Leu

35 40 45

Asn Leu Ala Val Ala Asp Phe Leu Phe Asn Val Phe Leu Pro Ile His

50 55 60

Ile Thr Tyr Ala Ala Met Asp Tyr His Trp Val Phe Gly Thr Ala Met

65 70 75 80

Cys Lys Ile Ser Asn Phe Leu Leu Ile His Asn Met Phe Thr Ser Val

85 90 95

Phe Leu Leu Thr Ile Ile Ser Ser Asp Arg Cys Ile Ser Val Leu Leu

100 105 110

Pro Val Trp Ser Gln Asn His Arg Ser Val Arg Leu Ala Tyr Met Ala

115 120 125

Cys Met Val Ile Trp Val Leu Ala Phe Phe Leu Ser Ser Pro Ser Leu

130 135 140

Val Phe Arg Asp Thr Ala Asn Leu His Gly Lys Ile Ser Cys Phe Asn

145 150 155 160

Asn Phe Ser Leu Ser Thr Pro Gly Ser Ser Ser Trp Pro Thr His Ser

165 170 175

Gln Met Asp Pro Val Gly Tyr Ser Arg His Met Val Val Thr Val Thr

180 185 190

Arg Phe Leu Cys Gly Phe Leu Val Pro Val Leu Ile Ile Thr Ala Cys

195 200 205

Tyr Leu Thr Ile Val Cys Lys Leu Gln Arg Asn Arg Ala Asp Leu Glu

210 215 220

Asp Asn Trp Glu Thr Leu Asn Asp Asn Leu Lys Val Ile Glu Lys Ala

225 230 235 240

Asp Asn Ala Ala Gln Val Lys Asp Ala Leu Thr Lys Met Arg Ala Ala

245 250 255

Ala Leu Asp Ala Gln Lys Ala Thr Pro Pro Lys Leu Glu Asp Lys Ser

260 265 270

Pro Asp Ser Pro Glu Met Lys Asp Phe Arg His Gly Phe Asp Ile Leu

275 280 285

Val Gly Gln Ile Asp Asp Ala Leu Lys Leu Ala Asn Glu Gly Lys Val

290 295 300

Lys Glu Ala Gln Ala Ala Ala Glu Gln Leu Lys Thr Thr Arg Asn Ala

305 310 315 320

Tyr Ile Gln Lys Tyr Leu Ala Lys Thr Lys Lys Pro Phe Lys Ile Ile

325 330 335

Val Thr Ile Ile Ile Thr Phe Phe Leu Cys Trp Cys Pro Tyr His Thr

340 345 350

Leu Asn Leu Leu Glu Leu His His Thr Ala Met Pro Gly Ser Val Phe

355 360 365

Ser Leu Gly Leu Pro Leu Ala Thr Ala Leu Ala Ile Ala Asn Ser Cys

370 375 380

Met Asn Pro Ile Leu Tyr Val Phe Met Gly Gln Asp Phe Lys Lys Phe

385 390 395 400

Lys Val Ala Leu Phe Ser Arg Leu Val Asn Ala Leu Ser Glu Asp Thr

405 410 415

<210> 12

<211> 376

<212> PRT

<213> 人工（Artificial）

<220>

<223> Description of the artificial sequence: hCCR10-BRIL fusion

protein

<400> 12

Ser Arg Ala Phe Gln Pro Ser Val Ser Leu Thr Val Ala Ala Leu Gly

1 5 10 15

Leu Ala Gly Asn Gly Leu Val Leu Ala Thr His Leu Ala Ala Arg Arg

20 25 30

Ala Ala Arg Ser Pro Thr Ser Ala His Leu Leu Gln Leu Ala Leu Ala

35 40 45

Asp Leu Leu Leu Ala Leu Thr Leu Pro Phe Ala Ala Ala Gly Ala Leu

50 55 60

Gln Gly Trp Ser Leu Gly Ser Ala Thr Cys Arg Thr Ile Ser Gly Leu

65 70 75 80

Tyr Ser Ala Ser Phe His Ala Gly Phe Leu Phe Leu Ala Cys Ile Ser

85 90 95

Ala Asp Arg Tyr Val Ala Ile Ala Arg Ala Leu Pro Ala Gly Pro Arg

100 105 110

Pro Ser Thr Pro Gly Arg Ala His Leu Val Ser Val Ile Val Trp Leu

115 120 125

Leu Ser Leu Leu Leu Ala Leu Pro Ala Leu Leu Phe Ser Gln Asp Gly

130 135 140

Gln Arg Glu Gly Gln Arg Arg Cys Arg Leu Ile Phe Pro Glu Gly Leu

145 150 155 160

Thr Gln Thr Val Lys Gly Ala Ser Ala Val Ala Gln Val Ala Leu Gly

165 170 175

Phe Ala Leu Pro Leu Gly Val Met Val Ala Cys Tyr Ala Leu Leu Gly

180 185 190

Arg Thr Leu Leu Ala Ala Asp Leu Glu Asp Asn Trp Glu Thr Leu Asn

195 200 205

Asp Asn Leu Lys Val Ile Glu Lys Ala Asp Asn Ala Ala Gln Val Lys

210 215 220

Asp Ala Leu Thr Lys Met Arg Ala Ala Ala Leu Asp Ala Gln Lys Ala

225 230 235 240

Thr Pro Pro Lys Leu Glu Asp Lys Ser Pro Asp Ser Pro Glu Met Lys

245 250 255

Asp Phe Arg His Gly Phe Asp Ile Leu Val Gly Gln Ile Asp Asp Ala

260 265 270

Leu Lys Leu Ala Asn Glu Gly Lys Val Lys Glu Ala Gln Ala Ala Ala

275 280 285

Glu Gln Leu Lys Thr Thr Arg Asn Ala Tyr Ile Gln Lys Tyr Leu Arg

290 295 300

Arg Ala Leu Arg Val Val Val Ala Leu Val Ala Ala Phe Val Val Leu

305 310 315 320

Gln Leu Pro Tyr Ser Leu Ala Leu Leu Leu Asp Thr Ala Asp Leu Leu

325 330 335

Ala Ala Arg Glu Arg Ser Cys Pro Ala Ser Lys Arg Lys Asp Val Ala

340 345 350

Leu Leu Val Thr Ser Gly Leu Ala Leu Ala Arg Cys Gly Leu Asn Pro

355 360 365

Val Leu Tyr Ala Phe Leu Gly Leu

370 375

<210> 13

<211> 357

<212> DNA

<213> 小家鼠（Mus musculus）

<400> 13

cagatccagc tgcagcagtc tggacctgag ctggtgaagc ctggggcttc agtgaagata 60

tcctgcaagg cttctggcta caccttcact gacttctata taaactggat gaagcagagg 120

cctggacagg gacttgagtg gattggatgg atttttcctg gaagcggtaa tactcactac 180

aatgagaagt tcaagggcaa ggccacattg attgtagaca catcctccag cacagccttc 240

atgcagctca acagcctgac ctctgaggac tctgcggtct atttctgtac aagaccggtc 300

tcttattact acgattttga ctactggggc caaggcacca ctctcacagt ctcctca 357

<210> 14

<211> 321

<212> DNA

<213> 小家鼠（Mus musculus）

<400> 14

gatattgtgc taactcagtc tccagccacc ctgtctgtga ctccaggaga tagagtcagt 60

ctttcctgca gggccagcca aagtgttagc aactacctac actggtatca acaaaaatca 120

catgagtctc caaggcttct catcaagtat gcttcccagt ccatctctgg gatcccctcc 180

aggttcagtg gcagtggatc agggacagat ttcactctca gtatcaacag tgtggagact 240

gaagattttg gaatgtattt ctgtcaacag agtaacagct ggccgctcac gttcggtgct 300

gggaccaagc tggagctgag a 321

<210> 15

<211> 138

<212> PRT

<213> 小家鼠（Mus musculus）

<400> 15

Met Gly Trp Ser Trp Ile Phe Leu Phe Leu Leu Ser Gly Thr Ala Gly

1 5 10 15

Val His Cys Gln Ile Gln Leu Gln Gln Ser Gly Pro Glu Leu Val Lys

20 25 30

Pro Gly Ala Ser Val Lys Ile Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe

35 40 45

Thr Asp Phe Tyr Ile Asn Trp Met Lys Gln Arg Pro Gly Gln Gly Leu

50 55 60

Glu Trp Ile Gly Trp Ile Phe Pro Gly Ser Gly Asn Thr His Tyr Asn

65 70 75 80

Glu Lys Phe Lys Gly Lys Ala Thr Leu Ile Val Asp Thr Ser Ser Ser

85 90 95

Thr Ala Phe Met Gln Leu Asn Ser Leu Thr Ser Glu Asp Ser Ala Val

100 105 110

Tyr Phe Cys Thr Arg Pro Val Ser Tyr Tyr Tyr Asp Phe Asp Tyr Trp

115 120 125

Gly Gln Gly Thr Thr Leu Thr Val Ser Ser

130 135

<210> 16

<211> 127

<212> PRT

<213> 小家鼠（Mus musculus）

<400> 16

Met Val Phe Thr Pro Gln Ile Leu Gly Leu Met Leu Phe Trp Ile Ser

1 5 10 15

Ala Ser Arg Gly Asp Ile Val Leu Thr Gln Ser Pro Ala Thr Leu Ser

20 25 30

Val Thr Pro Gly Asp Arg Val Ser Leu Ser Cys Arg Ala Ser Gln Ser

35 40 45

Val Ser Asn Tyr Leu His Trp Tyr Gln Gln Lys Ser His Glu Ser Pro

50 55 60

Arg Leu Leu Ile Lys Tyr Ala Ser Gln Ser Ile Ser Gly Ile Pro Ser

65 70 75 80

Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Ser Ile Asn

85 90 95

Ser Val Glu Thr Glu Asp Phe Gly Met Tyr Phe Cys Gln Gln Ser Asn

100 105 110

Ser Trp Pro Leu Thr Phe Gly Ala Gly Thr Lys Leu Glu Leu Arg

115 120 125

<210> 17

<211> 414

<212> DNA

<213> 小家鼠（Mus musculus）

<400> 17

atgggatgga gctggatctt tcttttcctc ctgtcaggaa ctgcaggtgt ccattgccag 60

atccagctgc agcagtctgg acctgagctg gtgaagcctg gggcttcagt gaagatatcc 120

tgcaaggctt ctggctacac cttcactgac ttctatataa actggatgaa gcagaggcct 180

ggacagggac ttgagtggat tggatggatt tttcctggaa gcggtaatac tcactacaat 240

gagaagttca agggcaaggc cacattgatt gtagacacat cctccagcac agccttcatg 300

cagctcaaca gcctgacctc tgaggactct gcggtctatt tctgtacaag accggtctct 360

tattactacg attttgacta ctggggccaa ggcaccactc tcacagtctc ctca 414

<210> 18

<211> 381

<212> DNA

<213> 小家鼠（Mus musculus）

<400> 18

atggttttca cacctcagat tcttggactt atgcttttct ggatttcagc ctccagaggt 60

gatattgtgc taactcagtc tccagccacc ctgtctgtga ctccaggaga tagagtcagt 120

ctttcctgca gggccagcca aagtgttagc aactacctac actggtatca acaaaaatca 180

catgagtctc caaggcttct catcaagtat gcttcccagt ccatctctgg gatcccctcc 240

aggttcagtg gcagtggatc agggacagat ttcactctca gtatcaacag tgtggagact 300

gaagattttg gaatgtattt ctgtcaacag agtaacagct ggccgctcac gttcggtgct 360

gggaccaagc tggagctgag a 381

Claims (5)

1.一种使BRIL融合蛋白质稳定化的方法，其中，所述BRIL融合蛋白质是使BRIL与目标蛋白质融合而成的，该方法使用与BRIL结合的抗原结合片段，通过使与BRIL结合的抗原结合片段与BRIL融合蛋白质的BRIL结合，使BRIL融合蛋白质稳定化；

其中，与BRIL结合的抗原结合片段的VH的CDR1～3分别包含序列编号1～3所示的氨基酸序列，且该抗原结合片段的VL的CDR1～3分别包含序列编号4～6所示的氨基酸序列；其中所述抗原结合片段是Fab。

2.根据权利要求1所述的方法，其中，BRIL融合蛋白质为目标蛋白质的2个相邻的螺旋结构通过BRIL融合而成的蛋白质。

3.根据权利要求1或2所述的方法，其中，目标蛋白质为膜表达蛋白质。

4.根据权利要求3所述的方法，其中，膜表达蛋白质为选自G蛋白偶联受体(GPCR)、离子通道和转运子中的任意一种。

5.一种抗BRIL抗原结合片段，

其中，所述抗原结合片段的VH的CDR1～3分别包含序列编号1～3所示的氨基酸序列，且所述抗原结合片段的VL的CDR1～3分别包含序列编号4～6所示的氨基酸序列；其中所述抗原结合片段是Fab。