CN110914286A - 自噬抑制剂 - Google Patents

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Abstract

本文提供了可用于抑制自噬相关蛋白8(Atg8)的功能的重组肽。所述重组肽可用于制备成像剂，用于监测细胞或受试者中的自噬和治疗自噬相关疾病例如癌症。

Description

自噬抑制剂
与相关申请的交叉引用
本申请要求2017年11月4日提交的美国临时申请号62/707,656的优先权利益，所述临时申请的内容为所有目的整体通过引用并入本文。
技术领域
本公开总的来说涉及可用作自噬相关蛋白8(Atg8)的抑制剂的重组肽、用于它们的制备的方法和所述重组肽作为自噬的抑制剂和/或自噬的成像剂的用途。
背景技术
自噬在希腊语中意味着“自我吞噬”，是最早在超过半个世纪之前被描述的真核生物中的一种进化保守的途径。自噬负责降解细胞内的蛋白质聚集体、受损的细胞器和侵入性病原体，因此在维持细胞稳态以及对胁迫条件的应答中起着至关重要的作用。自噬是一种涉及多个步骤的高度受调控的过程。首先，被称为吞噬泡或隔离膜的杯状膜成核以启动自噬。所述吞噬泡继续伸长并成熟，成为封闭的双膜自噬体。所述自噬体在晚些时候与溶酶体融合形成自噬溶酶体。被吞没在所述自噬溶酶体内部的物质随后将经历溶酶体降解和再循环。自噬功能失调与各种不同的人类疾病紧密相关，所述疾病包括但不限于癌症、代谢性疾病、免疫障碍和神经退行性疾病(Choi等，2013；Deng等，2017；Galluzzi等，2017b；Jiang和Mizushima，2014；Levine和Kroemer，2008；Levine等，2011；Menzies等，2015；Rubinsztein等，2012)。因此，自噬作为治疗性干预的潜在靶点已引起越来越多的关注。
在过去的两到三十年中，酵母和秀丽隐杆线虫(C.elegans)中的遗传筛查使研究人员能够鉴定和表征自噬机制的一系列关键组分，包括自噬相关(Atg)基因和异位P-颗粒(Epg)基因。在这些基因中，Atg8参与自噬过程的多个步骤，并且被认为是自噬的核心组分。Atg8通过与磷脂酰乙醇胺(PE)脂质缀合而附着到吞噬泡膜。Atg8-PE最有可能通过其膜系留和融合活性来促进吞噬泡扩张和自噬体闭合。Atg8还将Atg1/ULK1复合物募集到吞噬泡以促进自噬体形成。在所述封闭的自噬体中，外膜上的Atg8与Rab效应物PLEKHM1和EPG5相互作用，与晚期胞内体/溶酶体融合。在选择性自噬中，吞噬泡内膜上的Atg8与自噬受体(例如p62和NBR1)相互作用，以召集用于降解的靶。因此，Atg8及其直系同源物(Atg8s)通常被用作自噬指示物，而Atg8功能的消除削弱自噬。酵母仅含有一个Atg8基因，但在高等真核生物如秀丽隐杆线虫(C.elegans)中，存在两个同源基因LGG-1和LGG-2。在脊椎动物中，这两个成员进一步扩展为两个亚家族，即GABARAP亚家族(GABARAPs，包括GABARAP、GABARAPL1和GABARAPL2)和LC3亚家族(LC3s，包括LC3A、LC3B和LC3C)。在秀丽隐杆线虫(C.elegans)中的遗传学研究和哺乳动物细胞中的RNA干扰显示，这两个家族发挥一些非冗余的作用，而且它们对于整个自噬过程来说都是不可或缺的。然而，不同哺乳动物的Atg8同源物享有的高度序列相似性以及对基因敲除或基因下调做出响应的潜在遗传补偿，使每个个体成员的进一步功能研究变得复杂。
Atg8s含有短的N-端二螺旋延长部，后面跟有C-端泛素样结构域。Atg8s中的两个疏水袋可以识别含有ΦXXΨ基序(其中Φ表示芳香族氨基酸Trp/Tyr/Phe，Ψ表示疏水氨基酸Leu/Ile/Val，并且X表示任何氨基酸)、也被称为LC3相互作用区(LIR)或Atg8相互作用基序(AIM)的蛋白质(Birgisdottir等，2013；Noda等，2010)。除了所述两个疏水残基之外，典型的LIR通常含有几个N-端酸性残基Asp/Glu，并以微摩尔至亚微摩尔范围内的解离常数(Kd)结合到Atg8s。最近的两项研究报告了使用不同策略来监测自噬的基于LIR的传感器的开发(Lee等，2017；Stolz等，2017)。然而，与许多已知的天然存在的规范LIR基序一样，这些基于LIR的肽仍以较弱的亲和力结合到Atg8s。由于Atg8s在自噬中的核心作用，因此非常需要开发极为强效和高度选择性的Atg8结合肽，因为此类肽对于大量不同的应用来说将是非常有价值的，例如在活体动物中在时空层面上高效地抑制Atg8介导的选择性自噬，作为生化工具来研究和清楚地阐述不同Atg8成员在自噬中的功能，并通过特异性识别Atg8s的每个成员来监测自噬过程等。鉴于上述，对开发Atg8蛋白的改进的抑制剂存在着需求。
发明内容
本公开涉及重组肽，其可以包含22至27个残基，并且源自于被称为锚蛋白的支架蛋白家族的巨大同工型(270/480kD锚蛋白-G同工型或440kD锚蛋白-B同工型)。所述重组肽可以被构造成以纳摩尔范围内的解离常数(Kd)紧密结合到所有Atg8蛋白或Atg8蛋白亚组，包括但不限于哺乳动物GABARAP、GABARAPL1、GABARAPL2、LC3A、LC3B和LC3C以及秀丽隐杆线虫LGG-1和LGG-2。Ank来源的肽与各个Atg8家族成员包括GABARAP、GABARAPL1、GABARAPL2或LC3B复合物的晶体学研究显示，所述Ank来源的肽含有规范LIR核心(ΦXXΨ基序)和额外的C-端两亲性α-螺旋两者，后者对于所述超强结合来说是关键的。最后，具有超强Atg8结合亲和性的延长LIR的某些实施方式的共有序列基序被确定是：“(D/E)2-3X0-2ΦXXΨXXXEΨρρΨρρρΨ”，其中Φ表示芳香族残基；Ψ表示脂族或芳香族残基；ρ表示极性残基，并且X表示任何残基。
第一方面，本文中提供了一种重组肽，其包含由式I表示的序列：
X1-X2-X3-X4-X5-X6-X7-X8-X9-X10-X11-X12-X13-R1
I
或其可药用盐或两性离子，其中X1、X2和X3独立地是天冬氨酸、谷氨酸或不存在：
X4和X5独立地是任何氨基酸或不存在；
X6是具有包含芳香族或杂芳族部分的侧链的氨基酸；
X7和X8独立地是任何氨基酸；
X9是具有包含无环脂肪族或芳香族部分的侧链的氨基酸；
X10、X11和X12独立地是任何氨基酸；
X13是谷氨酸或精氨酸；并且
R1是包含7至15个氨基酸的两亲性α螺旋，其中
X1、X2和X3中的至少两者选自天冬氨酸和谷氨酸。
在所述第一方面的第一实施方式中，本文中提供了所述第一方面的重组肽，其中X7和X8独立地是具有包含醇、无环脂肪族或羧酸部分的侧链的氨基酸。
在所述第一方面的第二实施方式中，本文中提供了所述第一方面的重组肽，其中X10、X11和X12独立地是具有包含醇、羧酸或酰胺部分的侧链的氨基酸。
在所述第一方面的第三实施方式中，本文中提供了所述第一方面的重组肽，其中R1包含由式II表示的序列：
X14-X15-X16-X17-X18-X19-X20-X21
II
其中X14和X17独立地是具有包含无环脂肪族部分的侧链的氨基酸；
X16是具有包含极性部分的侧链的氨基酸或不存在；
X15和X18-X20独立地是具有包含极性部分的侧链的氨基酸；并且
X21是具有包含无环脂肪族部分的侧链的氨基酸或不存在。
在所述第一方面的第四实施方式中，本文中提供了所述第一方面的第三实施方式的重组肽，其中X14、X17和X21独立地选自由丙氨酸、异亮氨酸和亮氨酸组成的组，并且X15、X16和X18-X20独立地选自精氨酸、天冬氨酸、谷氨酸、谷氨酰胺、赖氨酸和丝氨酸组成的组。
在所述第一方面的第五实施方式中，本文中提供了所述第一方面的重组肽，其中X6是苯丙氨酸、色氨酸或酪氨酸，X7和X8独立地选自由苏氨酸、异亮氨酸、亮氨酸、缬氨酸、谷氨酸和天冬氨酸组成的组，X9是亮氨酸、异亮氨酸、缬氨酸或苯丙氨酸，并且X10、X11和X12独立地选自由天冬氨酸、谷氨酸、谷氨酰胺、丝氨酸和苏氨酸组成的组。
在所述第一方面的第六实施方式中，本文中提供了所述第一方面的第三实施方式的重组肽，其中X14、X17和X21独立地选自由丙氨酸、异亮氨酸和亮氨酸组成的组，并且X15、X16和X18-X20独立地选自由精氨酸、天冬氨酸、谷氨酸、谷氨酰胺、赖氨酸和丝氨酸组成的组。
在所述第一方面的第七实施方式中，本文中提供了所述第一方面的重组肽，其中所述重组肽包含与SEQ ID NO：1、SEQ ID NO：2、SEQ ID NO：3、SEQ ID NO：12、SEQ ID NO：14、SEQ ID NO：20或SEQ ID NO：21具有至少88％序列同源性的肽。
在所述第一方面的第八实施方式中，本文中提供了所述第一方面的重组肽，其中所述重组肽包含具有SEQ ID NO：1、SEQ ID NO：2、SEQ ID NO：3、SEQ ID NO：12、SEQ ID NO：14、SEQ ID NO：14、SEQ ID NO：15、SEQ ID NO：16、SEQ ID NO：20或SEQ ID NO：21的肽。
在所述第一方面的第九实施方式中，本文中提供了所述第一方面的第七实施方式的重组肽，其还包含亲和标签或可检测标记。
在所述第一方面的第十实施方式中，本文中提供了所述第一方面的第九实施方式的重组肽，其中所述可检测标记选自由显色酶类、放射性同位素、发色团、发光化合物、荧光化合物、磁共振成像化合物、超顺磁性粒子和超小超顺磁性粒子组成的组。
第二方面，本文中提供了一种编码所述第一方面的重组肽的多核苷酸。
第三方面，本文中提供了一种在自噬的抑制对其有益的受试者中抑制自噬的方法，所述方法包括向所述受试者施用治疗有效量的所述第一方面的重组肽，由此在所述受试者中抑制自噬活性。
在所述第三方面的第一实施方式中，本文中提供了所述第三方面的方法，其中R1包含由式II表示的序列：
X14-X15-X16-X17-X18-X19-X20-X21
II
其中X14和X17独立地是具有包含无环脂肪族部分的侧链的氨基酸；
X16是具有包含极性部分的侧链的氨基酸或不存在：
X15和X18-X20独立地是具有包含极性部分的侧链的氨基酸；并且
X21是具有包含无环脂肪族部分的侧链的氨基酸或不存在。
在所述第三方面的第二实施方式中，本文中提供了所述第三方面的方法，其中所述重组肽包含与SEQ ID NO：1、SEQ ID NO：2或SEQ ID NO：3、SEQ ID NO：12、SEQ ID NO：14、SEQ ID NO：20或SEQ ID NO：21具有至少88％序列同源性的肽。
在所述第三方面的第三实施方式中，本文中提供了所述第三方面的方法，其中所述重组肽包含具有SEQ ID NO：1、SEQ ID NO：2、SEQ ID NO：3、SEQ ID NO：12、SEQ ID NO：14、SEQ ID NO：14、SEQ ID NO：15、SEQ ID NO：16、SEQ ID NO：20或SEQ ID NO：21的肽。
第四方面，本文中提供了一种抑制细胞中自噬的方法，所述方法包括将所述细胞与所述第一方面的重组肽相接触由此抑制所述细胞中自噬的步骤。
在所述第四方面的第一实施方式中，本文中提供了所述第四方面的方法，其中R1包含由式II表示的序列：
X14-X15-X16-X17-X18-X19-X20-X21
II
其中X14和X17独立地是具有包含无环脂肪族部分的侧链的氨基酸；
X16是具有包含极性部分的侧链的氨基酸或不存在；
X15和X18-X20独立地是具有包含极性部分的侧链的氨基酸；并且
X21是具有包含无环脂肪族部分的侧链的氨基酸或不存在。
在所述第四方面的第二实施方式中，本文中提供了所述第四方面的方法，其中所述重组肽包含与SEQ ID NO：1、SEQ ID NO：2、SEQ ID NO：3、SEQ ID NO：12、SEQ ID NO：14、SEQ ID NO：20或SEQ ID NO：21具有至少88％序列同源性的肽。
在所述第四方面的第三实施方式中，本文中提供了所述第四方面的方法，其中所述重组肽包含具有SEQ ID NO：1、SEQ ID NO：2、SEQ ID NO：3、SEQ ID NO：12、SEQ ID NO：14、SEQ ID NO：14、SEQ ID NO：15、SEQ ID NO：16、SEQ ID NO：20或SEQ ID NO：21的肽。
本文中描述的重组肽包括：来自于天然大鼠480kD AnkG的第1985-2010位残基的AnkG WT(PEDDWTEFSSEEIREARQAAASHAPS；SEQ ID NO：1)；从大鼠480kD AnkG的第1985-2010位残基修饰的AnkG E1991R(PEDDWTRFSSEEIREARQAAASHAPS；SEQ ID NO：2)；和来自于天然人类440kD AnkB的第1588-1614位残基的AnkB WT(VEEEWVIVSDEEIEEARQKAPLEITEY；SEQ IDNO：3)。所述重组肽也可以包括本文中描述的重组肽的修饰的形式，包括契合上述共有序列基序的肽，从来自于其他物种(例如小鼠、大鼠、犬、兔、大鼠、斑马鱼等)的AnkB或AnkG衍生的AnkB和AnkG重组肽，和/或与本文中描述的重组肽序列具有50％、60％、70％、80％、90％、93％、95％、97％、98％、99％或更高序列同源性的重组肽。还设想了与本文中描述的重组肽在结构上相似的肽模拟物或肽类似物，包括但不限于非蛋白质(例如对叠氮基-苯丙氨酸等)或化学修饰的(例如磷酸化、乙酰化、脂化等)氨基酸的替换、非肽连接、二聚或寡聚偶联以及订书肽(staple peptide)。
本公开还提供了用于抑制或监测自噬的双重作用工具。一方面，所述Ank来源的肽可用作强力抑制剂来阻断由Atg8s与含有LIR的蛋白质形成的复合物，从而抑制自噬，正如在细胞系和秀丽隐杆线虫中显示的。本文中描述的抑制性重组肽可用于治疗癌症或其他自噬相关疾病。本文中描述的重组肽也可用于筛选自噬诱导物，其是用于治疗神经退行性疾病例如阿兹海默病、帕金森氏病以及其他自噬相关疾病的潜在的药物先导物。另一方面，本文中描述的重组肽可用作特异性标志物来监测自噬的发生。
附图说明
图1A描绘的图示出了270/480kD AnkG的结构域组织和LIR序列在AnkG中的位置。
图1B描绘了来自于脊椎动物的AnkG LIR的序列比对。
图1C描绘了等温滴定量热法(ITC)结果，示出了AnkG LIR可以以纳摩尔范围的亲和性结合到GABARAPs。C1：GABARAP；C2：GABARAPL1；C3：GABARAPL2。
图1D描绘了ITC结果，示出了AnkG LIR可以以数百至数千nM范围内的亲和力结合到LC3s。D1：LC3A；D2：LC3B；D3：LC3C。
图2A描绘了AnkG LIR/GABARAPL1复合体结构的丝带图。对结合重要的关键残基用棒状模型示出。盐桥和氢键用虚线指示。
图2B描绘了合并的表面(GABARAPL1)和丝带-棒状模型(AnkG LIR)，示出了GABARAPL1的容纳AnkG的LIR核心和C-螺旋的两个疏水袋。
图2C描绘了立体视图，示出了AnkG LIR C-螺旋与GABARAPL1的详细相互作用。
图2D描绘了AnkG LIR/LC3B复合体结构的丝带图。对结合重要的关键残基用棒状模型示出。
图2E是概述了源自于ITC实验的解离常数的表，示出了界面中的重要残基的截短或突变减弱或甚至破坏与GABARAP和/或LC3A的结合。
图3A描绘的图示出了440kD AnkB的结构域组织和延长LIR序列在巨大AnkB中的位置。
图3B描绘了脊椎动物中的AnkB LIR的序列比对。也包括AnkG LIR作为参比。
图3C描绘了ITC结果，显示出AnkB LIR(SEQ ID NO：3)重组肽结合到GABARAPs。注意AnkB LIR(SEQ ID NO：3)和GABARAPs的Kd值由于它们的超强结合而源自于基于竞争的ITC实验。
图3D描绘了ITC结果，显示出AnkB LIR(SEQ ID NO：3)重组肽与LC3s的结合。
图4A描绘了与GABARAP复合的AnkB LIR(SEQ ID NO：3)的立体视图。对结合重要的残基用棒状模型突出。盐桥和氢键用虚线指示。
图4B描绘了与LC3B复合的AnkB LIR(SEQ ID NO：3)的立体视图。对结合重要的残基用棒状模型突出。盐桥和氢键用虚线指示。
图4C概述了源自于ITC的解离常数，显示出界面中的重要残基的突变减弱结合。
图5A描绘了AnkG/GABARAPL1、AnkG/LC3B、AnkB/GABARAP、AnkB/LC3B和FYCO1/LC3A(PDB：5CX3)复合体结构的叠加，显示出Atg8s与延长LIR序列的共同的结合模式，所述延长LIR序列为LIR核心后面跟有以Glu开始的C-螺旋。
图5B示出了含有LIR核心以及两亲性C-螺旋的LIRs的序列比对。也示出了共有序列“(D/E)2-3X0-2ΦXXΨXXXEΨρρΨρρρΨ”，其中Φ表示芳香族残基；Ψ表示脂族残基；ρ表示极性残基；并且X表示任何残基。
图5C描绘了ITC结果，示出了GABARAP结合到带有C-螺旋延长部的FAM134B LIR(SEQ ID NO.21)远远强于不带有所述C-螺旋的肽。
图5D描绘了ITC结果，显示出预测的E462/R67盐桥的电荷反转突变减弱或甚至破坏FAM134B(SEQ ID NO.21)与GABARAP之间的结合。
图6A描绘了在下文的细胞培养物和秀丽隐杆线虫研究中使用的AnkB WT(SEQ IDNO：3)、AnkB W1592R(SEQ ID NO：11)、AnkG WT(SEQ ID NO：1)、AnkG E1991R(SEQ ID NO：2)和AnkG W1989R(SEQ ID NO：13)的氨基酸序列。
图6B概述了AnkB WT(SEQ ID NO：3)、AnkB W1592R(SEQ ID NO：11)、AnkG WT(SEQID NO：1)、AnkG E1991R(SEQ ID NO：2)和AnkG W1989R(SEQ ID NO：13)与不同Atg8家族成员之间的结合的Kd值。
图6C描绘了表达带有mCherry标签的不同AnkB/G肽的COS-7细胞中具有LC3阳性斑点的代表性荧光显微图像。C1：仅仅mCherry；C2：mCherry::AnkB WT(SEQ ID NO：3)；C3：mCherry::AnkBW1592R(SEQ ID NO：11)；C4：mCherry::AnkG WT(SEQ ID NO：1)；C5：mCherry::AnkGE1991R(SEQ ID NO：2)；和C6：mCherry::AnkGW1989R(SEQ ID NO：13)。
图6D描绘了定量表达仅仅mCherry、mCherry::AnkB WT(SEQ ID NO：3)、mCherry::AnkB W1592R(SEQ ID NO：11)、mCherry::AnkG WT(SEQ ID NO：1)、mCherry::AnkG E1991R(SEQ ID NO：2)和mCherry::AnkG W1989R(SEQ ID NO：13)的COS7细胞中LC3阳性斑点的数目的图。数据被表示为平均值±SEM；ns：不显著，p>0.05；*：p≤0.05；**：p≤0.01；***：p≤0.001；****：p≤0.0001。
图6E描绘了表达带有mCherry标签的不同AnkB/G肽的COS-7细胞中具有GABARAP阳性斑点的代表性荧光显微图像。E1：仅仅mCherry；E2：mCherry::AnkB WT(SEQ ID NO：3)；E3：mCherry::AnkB W1592R(SEQ ID NO：11)；E4：mCherry::AnkG WT(SEQ ID NO：1)；E5：mCherry::AnkG E1991R(SEQ ID NO：2)；和E6：mCherry::AnkG W1989R(SEQ ID NO：13)。
图6F描绘了定量表达仅仅mCherry、mCherry::AnkB WT(SEQ ID NO：3)、mCherry::AnkB W1592R(SEQ ID NO：11)、mCherry::AnkG WT(SEQ ID NO：1)、mCherry::AnkG E1991R(SEQ ID NO：2)和mCherry::AnkG W1989R(SEQ ID NO：13)的COS7细胞中GABARAP阳性斑点的数目的图。数据被表示为平均值±SEM；ns：不显著，p>0.05；*：p≤0.05；**：p≤0.01；***：p≤0.001；****：p≤0.0001。
图6G描绘了定量表达仅仅mCherry、mCherry::AnkB WT(SEQ ID NO：3)、mCherry::AnkB W1592R(SEQ ID NO：11)、mCherry::AnkG WT(SEQ ID NO：1)、mCherry::AnkG E1991R(SEQ ID NO：2)和mCherry::AnkG W1989R(SEQ ID NO：13)的COS7细胞中p62阳性斑点的数目的图。数据被表示为平均值±SEM；ns：不显著，p>0.05；*：p≤0.05；**：p≤0.01；***：p≤0.001；****：p≤0.0001。
图7A描绘了代表性荧光显微图像，示出了表达mCherry::AnkB WT(SEQ ID NO：3)的COS7细胞中的p62阳性斑点。比例尺：20μm。
图7B描绘了代表性荧光显微图像，示出了表达mCherry::AnkB W1592R(SEQ IDNO：11)的COS7细胞中的p62阳性斑点。比例尺：20μm。
图7C描绘了代表性荧光显微图像，示出了表达mCherry::AnkG WT(SEQ ID NO：1)的COS7细胞中的p62阳性斑点。比例尺：20μm。
图7D描绘了代表性荧光显微图像，示出了表达mCherry::AnkG E1991R(SEQ IDNO：2)的COS7细胞中的p62阳性斑点。比例尺：20μm。
图7E描绘了代表性荧光显微图像，示出了表达mCherry::AnkG W1989R(SEQ IDNO：13)的COS7细胞中的p62阳性斑点。比例尺：20μm。
图7F描绘了代表性荧光显微图像，示出了表达仅mCherry的COS7细胞中的p62阳性斑点。比例尺：20μm。
图8A描绘了秀丽隐杆线虫(C.elegans)野生型胚胎的微分干涉相差显微术图像(左图)，以及示出了来自于弱表达并分散位于细胞质中的SQST-1::GFP的荧光的荧光显微术照片。比例尺：10μm。
图8B描绘了表达Cherry::AnkB WT(SEQ ID NO：3)重组肽的秀丽隐杆线虫(C.elegans)胚胎的荧光显微图像(左图)，在所述胚胎中积累有大量SQST-1::GFP聚集物(右图)。
图8C描绘了表达Cherry::AnkB W1592R(SEQ ID NO：11)的秀丽隐杆线虫(C.elegans)胚胎的荧光显微图像(左图)，显示出没有SQST-1::GFP聚集物(右图)。
图8D描绘了秀丽隐杆线虫(C.elegans)野生型幼虫的微分干涉相差显微术图像，以及示出了来自于弱表达并分散位于细胞质中的SQST-1::GFP的荧光的荧光显微图像(右图)。比例尺：20μm。
图8E描绘了表达Cherry::AnkB WT(SEQ ID NO：3)重组肽的秀丽隐杆线虫(C.elegans)幼虫的荧光显微图像(左图)，在幼虫和成虫阶段具有大量SQST-1::GFP聚集物(右图)。
图8F描绘了表达Cherry::AnkB W1592R(SEQ ID NO：11)的秀丽隐杆线虫(C.elegans)幼虫的荧光显微图像(左图)，显示出没有SQST-1::GFP聚集物(右图)。
图8G描绘的条形图示出了表达Pnfya-1::ch::AnkB WT(SEQ ID NO：3)(n＝236)和Pnfya-1::ch::AnkB W1592R(SEQ ID NO：11)(n＝207)的秀丽隐杆线虫(C.elegans)胚胎的孵化率。数据被显示为平均值±SD，***p<0.0001。
图8H描绘的条形图示出了表达Pnfya-1::ch::AnkB WT(SEQ ID NO：3)(n＝13)和Pnfya-1::ch::AnkB W1592R(SEQ ID NO：11)(n＝14)的胚胎发育成L1幼虫的时间。数据被显示为平均值±SD，***p<0.0001。
图8I描绘的条形图示出了表达Pnfya-1::ch::AnkB WT(SEQ ID NO：3)(n＝13)和Pnfya-1::ch::AnkB W1592R(SEQ ID NO：11)(n＝14)的L1幼虫发育为年轻成虫的时间。数据被显示为平均值±SD，***p<0.0003。
图9A描绘了秀丽隐杆线虫(C.elegans)野生型胚胎的微分干涉相差显微术图像(左图)，以及示出了来自于弱表达并分散位于下皮中的SQST-1::GFP的荧光的荧光显微图像(右图)。
图9B描绘了表达mCherry::AnkB WT(SEQ ID NO：3)的秀丽隐杆线虫(C.elegans)胚胎的荧光显微图像(左图)，显示出大量SQST-1::GFP聚集物积累在胚胎中的下皮细胞中(右图)。
图9C描绘了表达mCherry::AnkB W1592R(SEQ ID NO：11)的秀丽隐杆线虫(C.elegans)胚胎的荧光显微图像(左图)，显示出没有SQST-1::GFP聚集物(右图)。
图9D描绘了秀丽隐杆线虫(C.elegans)野生型L4幼虫的微分干涉相差显微术图像(左图)，以及示出了来自于弱表达并分散位于下皮中的SQST-1::GFP的荧光的荧光显微图像(右图)。
图9E描绘了表达mCherry::AnkB WT(SEQ ID NO：3)的秀丽隐杆线虫(C.elegans)野生型L4幼虫的荧光显微图像(左图)，显示出下皮中大量SQST-1::GFP聚集物的积累(右图)。
图9F描绘了表达mCherry::AnkB W1592R(SEQ ID NO：11)的秀丽隐杆线虫(C.elegans)野生型L4幼虫的荧光显微图像(左图)，显示出没有SQST-1::GFP聚集物(右图)。
图9G描绘了表达由col-19启动子驱动的mCherry::AnkB WT(SEQ ID NO：3)的秀丽隐杆线虫(C.elegans)L4幼虫的荧光显微图像，所述启动子在从年轻成虫阶段开始的下皮细胞中特异性表达(左图)，显示出在幼虫阶段中没有mCherry::AnkB WT(SEQ ID NO：3)表达并且没有SQST-1::GFP聚集物(右图)。
图9H描绘了秀丽隐杆线虫(C.elegans)野生型成虫的微分干涉相差显微术图像(左图)，以及示出了来自于弱表达并分散位于下皮中的SQST-1::GFP的荧光的荧光显微图像(右图)。
图9I描绘了表达由col-19启动子驱动的mCherry::AnkB WT(SEQ ID NO：3)的成年秀丽隐杆线虫(C.elegans)的荧光显微图像，所述启动子在从年轻成虫阶段开始的下皮细胞中特异性表达(左图)，以及示出了来自于表达并位于下皮中的SQST-1::GFP的荧光的荧光显微图像(右图)。
图9J示出了Pnfya-1::ch::AnkB WT和Pnfya-1::ch::AnkB WR动物的存活曲线。(寿命中值对于表达Pnfya-1::ch::AnkB WT的动物来说为16.32天，对于表达Pnfya-1::ch::AnkB WR的动物来说为19.15天；p＝0.0000)。
图9K示出了Pmyo-3::ch::AnkB WT和Pmyo-3::ch::AnkB WR线虫的存活曲线。(寿命中值：对于Pmyo-3::ch::AnkB WT来说为18.12天，对于Pmyo-3::ch::AnkB WR来说为18.72天；p＝0.3113)。
图10A描绘了秀丽隐杆线虫(C.elegans)野生型胚胎的微分干涉相差显微术图像(左图)，以及示出了来自于弱表达并分散位于下皮中的SQST-1::GFP的荧光的荧光显微图像(右图)。
图10B描绘了表达mCherry::AnkG WT(SEQ ID NO：1)的秀丽隐杆线虫(C.elegans)胚胎的荧光显微图像(左图)，所述表达引起在胚胎阶段积累SQST-1::GFP聚集物(右图)。
图10C描绘了表达mCherry::AnkG E1991R(SEQ ID NO：2)的胚胎的荧光显微图像(左图)，所述表达引起在胚胎阶段积累SQST-1::GFP聚集物(右图)。
图10D描绘了表达Cherry::AnkG W1989R(SEQ ID NO：2)的胚胎的荧光显微图像(左图)，所述表达没有引起在胚胎阶段积累SQST-1::GFP聚集物(右图)。
图10E描绘了秀丽隐杆线虫(C.elegans)野生型L4幼虫的微分干涉相差显微术图像(左图)，以及示出了来自于弱表达并分散位于下皮中的SQST-1::GFP的荧光的荧光显微图像(右图)。
图10F描绘了表达Phyp7::mCherry::AnkG(SEQ ID NO：1)的秀丽隐杆线虫(C.elegans)野生型L4幼虫的荧光显微图像(左图)，显示出大量的SQST-1::GFP聚集物积累在下皮中(右图)。
图10G描绘了表达的Phyp7::mCherry::AnkG E1991R(SEQ ID NO：2)的秀丽隐杆线虫(C.elegans)野生型L4幼虫的荧光显微图像(左图)，显示出大量的SQST-1::GFP聚集物积累在下皮中(右图)。
图10H描绘了表达由col-19启动子驱动的mCherry::AnkB WT(SEQ ID NO：3)的秀丽隐杆线虫(C.elegans)L4幼虫的荧光显微图像，所述启动子在从年轻成虫阶段开始的下皮细胞中特异性表达(左图)，显示出在幼虫阶段没有mCherry::AnkB WT(SEQ ID NO：3)的表达并且没有SQST-1::GFP聚集物(右图)。
图10I描绘了秀丽隐杆线虫(C.elegans)野生型胚胎的微分干涉相差显微术图像(左图)，以及示出了来自于弱表达并分散位于下皮中的SQST-1::GFP的荧光的荧光显微图像(右图)。
图10J描绘了表达由驱动肌肉特异性表达的myo-3启动子驱动的mCherry::AnkBWT(SEQ ID NO：3)的秀丽隐杆线虫(C.elegans)胚胎的荧光显微图像(左图)，以及显示出大量SQST-1::GFP聚集物在肌肉中积累的荧光显微图像(右图)。
图10K描绘了表达由驱动肌肉特异性表达的myo-3启动子驱动的mCherry::AnkBW1592R(SEQ ID NO：11)的秀丽隐杆线虫(C.elegans)胚胎的荧光显微图像(左图)，以及显示出没有SQST-1::GFP的荧光显微图像(右图)。
图10L描绘了秀丽隐杆线虫(C.elegans)野生型L4幼虫的微分干涉相差显微术图像(左图)，以及示出了来自于弱表达并分散位于下皮中的SQST-1::GFP的荧光的荧光显微图像(右图)。
图10M描绘了表达由驱动肌肉特异性表达的myo-3启动子驱动的mCherry::AnkBWT(SEQ ID NO：3)的秀丽隐杆线虫(C.elegans)L4幼虫的荧光显微图像(左图)，以及显示出SQST-1::GFP聚集物在肌肉细胞中积累的荧光显微图像(右图)。
图10N描绘了表达由驱动肌肉特异性表达的myo-3启动子驱动的mCherry::AnkBW1592R(SEQ ID NO：11)的秀丽隐杆线虫(C.elegans)L4幼虫的荧光显微图像(左图)，所述表达在肌肉细胞中不产生SQST-1::GFP聚集物(右图)。
图10O描绘了秀丽隐杆线虫(C.elegans)野生型胚胎的微分干涉相差显微术图像，以及示出了来自于弱表达并分散位于下皮中的SQST-1::GFP的荧光的荧光显微图像(右图)。
图10P描绘了表达由驱动肠特异性表达的vha-6启动子驱动的mCherry::AnkB WT(SEQ ID NO：1)的秀丽隐杆线虫(C.elegans)胚胎的荧光显微图像(左图)，以及示出了SQST-1::GFP聚集物在肠细胞中积累的荧光显微图像(右图)。
图10Q描绘了表达由驱动肠特异性表达的vha-6启动子驱动的mCherry::AnkBW1592R(SEQ ID NO：11)的秀丽隐杆线虫(C.elegans)胚胎的荧光显微图像(左图)，所述表达在肠细胞中不产生SQST-1::GFP聚集物(右图)。
图10R描绘了秀丽隐杆线虫(C.elegans)野生型幼虫的微分干涉相差显微术图像，以及示出了来自于弱表达并分散位于细胞质中的SQST-1::GFP的荧光的荧光显微图像(右图)。
图10S描绘了表达由驱动肠特异性表达的vha-6启动子驱动的mCherry::AnkB WT(SEQ ID NO：1)的秀丽隐杆线虫(C.elegans)幼虫的荧光显微图像(左图)，以及示出了SQST-1::GFP聚集物在肠细胞中积累的荧光显微图像(右图)。
图10T描绘了表达由驱动肠特异性表达的vha-6启动子驱动的mCherry::AnkBW1592R(SEQ ID NO：11)的秀丽隐杆线虫(C.elegans)胚胎的荧光显微图像(左图)，所述表达在肠细胞中不产生SQST-1::GFP聚集物(右图)。
图10U示出了Pvha-6::ch::AnkB WT和Pvha-6::ch::AnkB WR线虫的存活曲线。(寿命中值：对于Pvha-6::ch::AnkB WT来说为18.87天，对于Pvha-6::ch::AnkB WR来说为18.13天；p＝0.7585)。
图10V示出了Py37a1b.5::ch::AnkB WT和Py37a1b.5::ch::AnkB WR线虫的存活曲线。(寿命中值：对于Py37a1b.5::ch::AnkB WT来说为16.64天，对于Py37a1b.5::ch::AnkBWR来说为18.63天；p＝0.0197)。
图10W描绘了表达由驱动肌肉特异性表达的myo-3启动子驱动的mCherry::AnkBWT(SEQ ID NO：3)的秀丽隐杆线虫(C.elegans)L4幼虫的荧光显微图像(左图)(SEQ ID NO：3)，以及显示出少量SQST-1::GFP聚集物在肌肉细胞中积累的荧光显微图像(右图)。AnkBWT肽的表达水平与自噬抑制程度相关。具有Ch::AnkB WT的弱表达水平的动物在肌肉细胞中含有很少SQST-1::GFP聚集物，而在具有Ch::AnkB WT的高表达水平的动物中SQST-1::GFP聚集物的数量更大。
图10X描绘了表达由驱动肌肉特异性表达的myo-3启动子驱动的mCherry::AnkBWT(SEQ ID NO：3)的秀丽隐杆线虫(C.elegans)L4幼虫的荧光显微图像(左图)(SEQ ID NO：3)，以及显示出大量SQST-1::GFP聚集物在肌肉细胞中积累的荧光显微图像(右图)。AnkBWT肽的表达水平与自噬抑制程度相关。具有Ch::AnkB WT的弱表达水平的动物在肌肉细胞中含有很少SQST-1::GFP聚集物，而在具有Ch::AnkB WT的高表达水平的动物中SQST-1::GFP聚集物的数量更大。
图10Y描绘了表达由驱动肌肉特异性表达的myo-3启动子驱动的mCherry::AnkBWT(SEQ ID NO：3)的秀丽隐杆线虫(C.elegans)L4幼虫的荧光显微图像(左图)(SEQ ID NO：3)，以及显示出大量SQST-1::GFP聚集物在肌肉细胞中积累的荧光显微图像(右图)。AnkBWT肽的表达水平与自噬抑制程度相关。具有Ch::AnkB WT的弱表达水平的动物在肌肉细胞中含有很少SQST-1::GFP聚集物，而在具有Ch::AnkB WT的高表达水平的动物中SQST-1::GFP聚集物的数量更大。
图11A描绘了用GFP-RFP-LC3B和可以充当自噬体标志物的Myc-AnkB WT(SEQ IDNO：3)共转染的COS7细胞的荧光显微图像。箭头指示GFP-RFP-LC3B斑点和MycAnkB斑点的共定位；仅仅红色的信号用圆圈注明。
图11B描绘了用GFP-RFP-LC3B和可以充当自噬体标志物的Myc-AnkB W1989R(SEQID NO：13)共转染的COS7细胞的荧光显微图像。箭头指示GFP-RFP-LC3B斑点和MycAnkB斑点的共定位；仅仅红色的信号用圆圈注明。
具体实施方式
270/480kD锚蛋白-G(AnkG)这种富集在轴突初始段和郎飞氏结中的AnkG的神经元特异性同工型，以～10-20nM的Kd结合到GABARAP。AnkG的被鉴定为结合到GABARAP的区域含有LIR基序。AnkG与GABARAP之间结合的超强亲和力促使人们探究基于在AnkG中发现的LIR基序，是否有可能开发出超强的Atg8结合肽作为自噬抑制剂。这项研究发现了含有23-27个氨基酸的序列的重组肽，其对GABARAP和LC3蛋白具有非常高的亲和性。通过修饰所述重组肽的结构，可以制备对GABARAP或LC3具有提高的选择性的重组肽。
定义
本文中使用的术语的定义意在并入每个术语在生物技术领域中公认的当前最新定义。在适当情况下提供了示例。除非在特定情况下另有限制，否则这些定义适用于在整个本说明书中使用的所述术语，无论是单独还是作为较大组的一部分使用。
当在本文中使用时，术语“附连”或“附连的”是指通过键或非键相互作用连接或结合以便将两个或更多个化合物保持在一起，其涵盖直接或间接附连，使得例如其中第一多肽被直接结合到第二多肽或其他分子，以及其中将一个或多个中间化合物(例如接头)例如多肽配置在所述第一多肽与第二多肽或其他分子之间的实施方式。
当在本文中使用时，术语“蛋白质”、“多肽”或“肽”是指由两个或更多个氨基酸单体和/或其类似物构成的有机聚合物。术语“多肽”或“肽”包括任何长度的氨基酸聚合物，包括全长蛋白质和肽及其类似物和片段。三个或更多个氨基酸的多肽也被称为寡肽。当在本文中使用时，术语“氨基酸”、“氨基酸单体”或“氨基酸残基”是指20种天然存在的氨基酸中的任一者，包括具有非天然侧链的合成氨基酸，并包括D和L光学异构体。术语“氨基酸类似物”是指其中一个或多个单独的原子已被不同原子、同位素或不同官能团代替，但在其他方面与其天然氨基酸类似物一致的氨基酸。
术语“氨基酸”是指天然存在和非天然氨基酸，以及以与天然存在的氨基酸相似的方式起作用的氨基酸类似物和氨基酸模拟物。天然编码的氨基酸是20种常见氨基酸(丙氨酸、精氨酸、天冬酰胺、天冬氨酸、半胱氨酸、谷氨酰胺、谷氨酸、甘氨酸、组氨酸、异亮氨酸、亮氨酸、赖氨酸、甲硫氨酸、苯丙氨酸、脯氨酸、丝氨酸、苏氨酸、色氨酸、酪氨酸和缬氨酸)以及吡咯赖氨酸和硒代半胱氨酸。氨基酸类似物是指与天然存在的氨基酸具有相同的基本化学结构，即结合到氢、羧基、氨基和R基团的α碳的化合物，例如高丝氨酸、正亮氨酸、甲硫氨酸亚砜、甲硫氨酸甲基锍。这些类似物具有修饰的R基团(例如正亮氨酸)或修饰的肽骨架，但保留与天然存在的氨基酸相同的基本化学结构。
当在本文中使用时，术语“非天然氨基酸”等是指不是20种常见氨基酸、硒代半胱氨酸或吡咯赖氨酸之一的任何氨基酸、修饰的氨基酸和/或氨基酸类似物。
氨基酸在本文中可以用它们的公知的三字母符号或用IUPAC-IUB生物化学命名委员会推荐的单字母符号来指称。同样地，核苷酸可以用它们的通常接受的单字母密码子来指称。
当在本文中使用时，术语“变体”是指与参比核酸或多肽不同，但保留其基本性质的多核苷酸或核酸。通常，变体总体上与所述参比核酸或多肽密切相似，并且在许多区域中与它们一致。
变体可以例如包括亲代多肽序列的具有至少一个保守氨基酸替换的氨基酸序列。可选地或另外，所述变体可以包括所述亲代多肽序列的具有至少一个非保守氨基酸替换的氨基酸序列。在这种情况下，所述非保守氨基酸替换优选地不干扰或抑制所述功能性变体的生物活性。所述非保守氨基酸替换可能增强所述变体的生物活性，使得所述变体的生物活性与亲代多肽相比提高。
所描述的多肽的氨基酸替换可以是保守氨基酸替换。保守氨基酸替换在本领域中是已知的，并且包括其中具有某些物理和/或化学性质的一个氨基酸被具有相同或相近化学或物理性质的另一个氨基酸代替的氨基酸替换。例如，所述保守氨基酸替换可以是酸性/带负电荷的极性氨基酸被替换为另一个酸性/带负电荷的极性氨基酸(例如Asp或Glu)，具有非极性侧链的氨基酸被替换为另一个带非极性侧链的氨基酸(例如Ala、Gly、Val、Ile、Leu、Met、Phe、Pro、Trp、Cys、Val等)，碱性/带正电荷的极性氨基酸被替换为另一个碱性/带正电荷的极性氨基酸(例如Lys、His、Arg等)，具有极性侧链的不带电荷的氨基酸被替换为另一个有极性侧链的不带电荷的氨基酸(例如Asn、Gln、Ser、Thr、Tyr等)，具有β-支链侧链的氨基酸被替换为另一个具有β-支链侧链的氨基酸(例如Ile、Thr和Val)，具有芳香族侧链的氨基酸被替换为另一个具有芳香族侧链的氨基酸(例如His、Phe、Trp和Tyr)，等等。
当用于指称多肽或多核苷酸序列时，术语“同源性百分率”和“序列同一性百分率”在本文中可互换地用于指称多核苷酸和多肽之间的比较，并且通过在比较窗口内比较两个最适对齐的序列来确定，其中为了两个序列的最适比对，所述多核苷酸或多肽序列在所述比较窗口中的部分与参比序列(其不包含添加或缺失)相比可能包含添加或缺失(即空位)。所述百分率如下计算：确定在两个序列中存在相同的核酸碱基或氨基酸残基的位置的数目以得到匹配位置数，用所述匹配位置数除以所述比较窗口中的位置总数并乘以100，以得到序列同一性的百分率。同源性使用本领域中已知的各种序列比较算法和程序中的任一者来评估。此类算法和程序包括但绝不限于TBLASTN、BLASTP、FASTA、TFASTA和CLUSTALW[Pearson和Lipman,1988,Proc.Natl.Acad.Sci.USA 85(8):2444-2448；Altschul等，1990,J.Mol.Biol.215(3):403-410；Thompson等，1994,Nucleic Acids Res.22(2):4673-4680；Higgins等，1996,Methods Enzymol.266:383-402；Altschul等，1990,J.Mol.Biol.215(3):403-410；Altschul等，1993,Nature Genetics 3:266-272]。在某些实施方式中，蛋白质和核酸序列同源性使用本领域中公知的基本局部比对搜索工具(“BLAST”)来评估(参见例如Karlin和Altschul,1990,Proc.Natl.Acad.Sci.USA 87:2267-2268；Altschul等，1990,J.Mol.Biol.215:403-410；Altschul等，1993,Nature Genetics 3:266-272；Altschul等，1997,Nuc.Acids Res.25:3389-3402)。
当在本文中使用时，术语“治疗”等是指减轻或改善障碍/疾病和/或与其相关的症状。应当理解，尽管没有排除，但治疗障碍或病症并不需要完全消除所述障碍、病症或与其相关症状。在某些实施方式中，治疗包括障碍或病症和/或与其相关的症状的预防。当在本文中使用时，术语“预防”是指抑制或至少延迟障碍、病症或与其相关的症状的发生的任何行动。预防可以包括一级、二级和三级预防水平，其中：a)一级预防避免疾病的发生；b)二级预防活动旨在早期疾病治疗，由此提高干预措施阻止疾病进展和症状出现的机会；c)三级预防通过恢复功能并减少与疾病相关的并发症来减轻已经建立的疾病的负面影响。
当在本文中使用时，术语“受试者”是指任何动物(例如哺乳动物)，包括但不限于人类、非人类灵长动物、犬科动物、猫科动物、牛科动物和啮齿动物。
短语“基本上由……构成”在本文中意在将所述重组肽的范围限定到指定的原料氨基酸，并限定到只包括不实质性影响所保护的发明的基本和新颖特征另外的氨基酸或变化，基本和新颖特征即例如所述重组肽与Atg8蛋白家族成员的结合亲和性。
当在本文中使用时，术语“重组蛋白”、“重组肽”等是指可以使用重组DNA技术制造的任何感兴趣的蛋白质。
重组宿主细胞可以是用于重组蛋白生产的任何宿主细胞，包括但不限于细菌、酵母、昆虫和哺乳动物细胞系。重组宿主细胞可以通过用含有编码感兴趣的重组肽的DNA的表达载体转化宿主细胞来制造。
本文中提供的包含式I和其他序列的重组肽具体排除了包括本文中描述的序列的天然存在的蛋白(例如天然存在的全长AnkB、AnkG和FAM134B)。在某些实施方式中，本文中描述的重组肽排除了包含本文中提供的式I的重组肽和其他序列，并且等于或长于任何天然存在的AnkB、AnkG和FAM134B蛋白的35、30、35、40、45或50个氨基酸的肽序列。在某些实施方式中，本文中描述的重组肽排除了包含式I的重组肽并在所述式I的重组肽的n-端和/或c-端处具有超过5、10、15或20个侧翼氨基酸的肽序列，所述侧翼氨基酸是在天然存在的AnkB、AnkG和FAM134B蛋白中在等同的延长LIR肽序列处的天然的侧翼氨基酸。
所述AnkG LIR基序位于两种巨大AnkG同工型(270/480kD AnkG)共有的巨大***片段的N-端部分处(图1A)。通过测量GABARAP与各种截短的AnkG片段之间的定量结合常数，将AnkG的最小GABARAP结合区定位到含有约26个氨基酸的肽(aa 1985-2010，在本文中也被称为AnkG LIR(SEQ ID NO：1))，其比已知的LIR序列略微长一些(图1B)。令人吃惊的是，所述鉴定到的多肽序列在AnkG中是进化上保守的，并在通过等温滴定量热法(ITC)测定法测量时以～2.6nM的Kd结合到GABARAP(图1B和C1)。应该指出，AnkG LIR(SEQ ID NO：1)与GABARAP之间的结合比几乎所有报道的LIR基序与Atg8s之间的结合强～1000倍，将AnkGLIR定性为超强GABARAP结合物。AnkG LIR(SEQ ID NO：1)也可以超强亲和性(Kd～3.7nM)结合到GABARAPL1，并以略微低一些的亲和性(Kd～40nM，图1C2和1C3)结合到GABARAPL2(也被称为GATE-16)。令人吃惊的是，ITC结果显示，AnkG LIR以数百至数千nM范围内的Kd值结合到LC3s，这与规范LIRs与LC3s之间的结合相当(图1D)，表明AnkG LIR可以在Atg8s的两个亚家族之间做出区分，并且可以选择性地结合到GABARAPs。
为了阐明控制AnkG LIR与GABARAPs之间的超强和选择性结合的分子基础，我们确定了分别与GABARAPL1和LC3B复合的AnkG LIR的晶体结构。所述AnkG LIR/GABARAPL1复合物的晶体被衍射到
Figure BDA0002367793010000201
分辨率，并且结构通过分子置换法来解析。在所述复合物中，AnkG LIR的总共26个残基中的23个(Pro1985-His2007)可以在电子密度图中被清楚地示踪。所述GABARAPL1结合的AnkG LIR由两个部分构成：由含有特征“ΦXXΨ”基序的LIR核心形成的N-端延伸结构，以及含有三转角α-螺旋的C-端延长部(被称为“C-螺旋”，覆盖Glu1996至Ala2003)，其在大多数报道的LIRs中丢失(图2A)。所述LIR核心中的两个芳香族残基Trp1989和Phe1992深深***到两个疏水袋中，并且这种结合与在报道的LIRs与所有Atg8s之间的结合基本上相同(图2B)。正如预期，将Trp1989用Arg替换引起AnkG LIR与GABARAP和与LC3的结合急剧变弱(图2E)。所述C-螺旋与GABARAPL1的α3几乎垂直，并且与来自于GABARAPL1的α3和α4的多个残基广泛相互作用(图2C)。从AnkG LIR移除一半的C-螺旋(即截短aa 2001-2010)，导致它与GABARAP的结合降低到～1/200(图2E中的构建物“1985-2000”)，表明所述C-螺旋为所述超强结合所需。然而，单独的AnkG LIR C-螺旋(aa 1993-2010)与GABARAP没有可检测到的结合(图2E)。因此我们得出结论，规范LIR基序和延长的C-螺旋的协同作用赋予AnkG LIR与GABARAP的超强结合，并且所述独特的C-螺旋可能提供了AnkG LIR与GABARAPs之间的结合特异性。所述在其他LIR/Atg8相互作用中尚未观测到的C-螺旋与GABARAPL1α3/α4之间的结合界面，可以被分为三层。上层包括两个盐桥(Glu1996-Arg67和Glu1999-Lys66)；中间层由Ile1997/Ala2000/Ala2003与Leu63/Phe62之间的疏水相互作用介导；下层由与Asp54形成盐桥并与Gln59形成氢键的Arg2001构成(图2C)。应该指出，许多报道的LIRs通常以Glu残基结束，其对应于AnkG LIR中的Glu1996，并且这个Glu也与GABARAPL1中的Arg67(或其他Atg8成员中的相应Arg)形成盐桥(Cheng等，2016；Olsvik等，2015)。Glu1996或Arg67的电荷反转突变或疏水的Ile1997或Ala2000被Gln的替换总是降低AnkG LIR与GABARAP之间的结合(图2E)。
AnkG LIR/LC3B复合物的结构以
Figure BDA0002367793010000211
的分辨率被确定。所述AnkG LIR/LC3B复合物的总体结构和结合方式大体上与AnkG LIR/GABARAPL1相似(
Figure BDA0002367793010000212
的均方根偏差(RMSD)；图2D)，重要的区别在于LC3结合的AnkG LIR C-螺旋明显更短，仅覆盖Glu1996-Arg2001而不是GABARAPL1复合物中的Glu1996-His2007。这个结构发现解释了AnkG LIR结合到LC3s比结合到GABARAPs的亲和性弱得多的原因(图1)。然而，AnkG LIR的较短的C-螺旋也参与LC3结合并且对LC3结合来说是重要的，因为重要残基的替换或截短所述C-螺旋降低或甚至完全废止了AnkG LIR与LC3的结合(图2E)。有趣的是，我们观察到Glu1991与LC3B的Lys29和His27相互作用，而同一个Glu仅仅与GABARAPL1的Arg28(对应于LC3B的Lys29)发生弱相互作用。我们预计将Glu1991用Arg替换将减弱AnkG LIR与LC3s的结合，但对它与GABARAPs的结合影响有限，因此所述突变的AnkG LIR在与GABARAPs的结合中可能具有超过LC3s的甚至更高的选择性。确实，所述Glu1991Arg AnkG LIR以略微更弱的亲和性结合到GABARAP，但以1/10的低的亲和性结合到LC3A，从而将GABARAP与LC3A之间的选择性提高到～1000倍(图2E)。
AnkG LIR与GABARAP的超强结合促使我们搜索可能存在的其他天然存在的强Atg8结合蛋白。使用AnkG LIR作为模板针对人类蛋白质组进行的BLAST搜索返回了来自于440kD巨大AnkB的相似延长LIR序列作为最佳候选者，并且我们将它称为AnkB LIR(SEQ ID NO：3)(图3A和B)。440kD AnkB和480kD AnkG两者均含有编码几千个氨基酸残基的巨大外显子，尽管所述两个巨大外显子编码序列之间的同源性非常有限。所述440kD AnkB也是一种神经元特异性同工型，并且主要表达在无髓鞘/有髓鞘前的轴突中。AnkB LIR(SEQ ID NO：3)也含有LIR核心“ΦXXΨ”，后面跟有一段与AnkG LIR C-螺旋具有相当有限的同源性的氨基酸残基(图3B)。然而，在整个进化期间，AnkB LIR的序列在440kD AnkB中高度保守(图3B)。我们惊喜地发现AnkB LIR(SEQ ID NO：3)结合到GABARAP的亲和性是AnkG LIR(SEQ ID NO：1)约10倍高(Kd值为～0.27nM相比于2.6nM；图3C相比于图1C)。甚至更加令人吃惊的是，AnkBLIR以超强的亲和性结合到Atg8家族的所有成员，其中Kd值的范围从最强的～0.21nM到最弱的～10.5nM(图3C和D)。
为了理解控制AnkB LIR(SEQ ID NO：3)与Atg8s之间的强相互作用的机制，我们分别以
Figure BDA0002367793010000221
和
Figure BDA0002367793010000222
的分辨率解析了AnkB LIR/GABARAP和AnkB LIR/LC3B复合物的晶体结构(图4A和B)。AnkB LIR(SEQ ID NO：3)与GABARAP和LC3B的结合的总体结构特点高度类似于AnkG与GABARAPL1和LC3B的结合(图2和4)。因此，我们将不再进一步描述所述两种复合物的总体结构，仅仅指出AnkB LIR在LIR核心基序之后也含有明确的C-螺旋延长部。同样正如预期，用Arg替换Trp1592(规范“ΦXXΨ”LIR-基序中的第一个疏水残基)急剧降低AnkBLIR与人类Atg8家族的所有成员的结合(图4C)。因此，AnkB LIR的这个Trp1592Arg突变体充当出色的对照，用于下文中我们在细胞培养物和体内两种背景下进行的自噬抑制的功能研究。
当比较AnkB LIR(SEQ ID NO：3)和AnkG LIR(SEQ ID NO：1)与Atg8成员的结合时，存在几个细微但重要的差异，它们可以解释为什么AnkB LIR与Atg8s的结合总是比AnkGLIR更强。AnkB LIR的“ΦXXΨ”LIR-基序中的两个中间残基也是疏水的(Val1593和Ile1594，对应于AnkG LIR中的Thr1990和Glu1991；图3B)，并且这两个残基与来自于GABARAP或LC3B的许多疏水残基积极相互作用(图4)。在AnkG LIR中，只有Glu1991强烈参与与LC3B的结合(图2A和D)。在AnkB LIR/LC3B复合物中，来自于LC3B的Lys65的侧链与来自于AnkB LIR C-螺旋的两个残基的骨架形成氢键(图4)，为LC3亚家族中的Lys65可以有利地与AnkB LIR但不与AnkG LIR相互作用的原因提供了解释。
从上述结构研究揭示的来自于AnkB和AnkG LIR的强Atg8结合序列的定义性特点是紧接规范LIR-基序之后存在～10个残基的两亲性α-螺旋(C-螺旋)(图5B)。所述C-螺旋起点处的Glu残基与所有Atg8s中α3终点处绝对保守的Arg(GABARAP中的Arg67和LC3A中的Arg70)形成一对盐桥(图5A和图4)。紧接该Glu残基之后的第1-4-8位置处的三个非芳香族疏水残基在所述C-螺旋的同一面上对齐，并与由Atg8s的α3形成的疏水表面相互作用。由于所述疏水相互作用的非特异性本质，所述三个疏水残基相当简并，只要它们的体积不那么大即可，因为Atg8的疏水表面相对平坦(图2B)。我们使用下述两个标准搜索人类蛋白质组中可能存在的其他超强Atg8结合物：规范LIR-基序的存在，其后紧跟始于Glu残基的三转角或更长的两亲性α-螺旋。这种搜索返回了几种潜在候选物。其中，FAM134A/B/C(也被分别称为内质网自噬调控物2/1/3)特别好地契合所述搜索标准(图5B)。已暗示FAM134B及其酵母直系同源物Atg40参与选择性自噬，通过结合到Atg8s促进内质网的降解(被称为ER自噬)(Khaminets等，2015；Mochida等，2015)。我们使用基于ITC的测定法测试了GABARAP与含有或不含C-螺旋延长部的人类FAM134B LIR(SEQ ID NO：21)(对于aa 448-469来说被称为“LIR-L”，对于aa 448-461来说被称为“LIR-S”；预测Glu462是所述C-螺旋的起始残基，等同于AnkG LIR中的Glu1996)的结合。与我们的预测相符，GABARAP以非常高的亲和性结合到FAM134B LIR-L(Kd～25nM；图5C)。预测的C-螺旋的截短导致它与GABARAP的结合急剧降低(Kd下降到704nM；图5C)。此外，FAM134B中的Glu462或GABARAP中的Arg67的电荷反转突变引起所述结合的降低或甚至完全破坏(图5D)，表明FAM134B采取与AnkB/G LIR相似的结合方式。将所有上述数据合在一起，我们推衍出具有超强Atg8结合亲和性的延长LIR的共有序列基序：“(D/E)2-3X0-2ΦXXΨXXXEΨρρΨρρρΨ”，其中Φ表示芳香族残基，Ψ表示脂族残基，ρ表示极性残基，并且X表示任何残基(图5B)。
我们注意到最近鉴定到的来自于FYCO1的LC3结合序列(SEQ ID NO：20)，通过在规范LIR-基序后具有一转角螺旋延长部并在所述螺旋起点处的Leu后跟有Glu而具有部分契合于超强Atg8结合基序的序列特点(Cheng等，2016；Olsvik等，2015)(图5A和B)。FYCO1 LIR的C-螺旋比AnkB/G LIRs更短。因此，FYCO1 LIR与LC3之间的结合明显比AnkB LIR与Atg8的结合更弱。
所述具有超强Atg8结合亲和性的延长LIR的共有序列基序“(D/E)2-3X0-2ΦXXΨXXXEΨρρΨρρρΨ”也可以由包含式I表示的序列的重组肽或其可药用盐或两性离子来表示：
X1-X2-X3-X4-X5-X6-X7-X8-X9-X10-X11-X12-X13-R1
I
其中X1、X2和X3独立地是天冬氨酸、谷氨酸或不存在；X4和X5独立地是任何氨基酸或不存在；X6是具有包含芳香族或杂芳族部分的侧链的氨基酸；X7和X8独立地是任何氨基酸；；X9是具有包含无环脂肪族或芳香族部分的侧链的氨基酸；X10,、X11和X12独立地是任何氨基酸；X13是谷氨酸或精氨酸；并且R1是包含7至15个氨基酸的两亲性α螺旋，其中X1、X2和X3中的至少两者选自天冬氨酸和谷氨酸。
本文中描述的重组肽通常可以对GABARAP和LC3两种蛋白质家族均具有高的结合亲和性，并因此可用作所述两种蛋白质家族的功能的抑制剂。然而，本文中描述的重组肽在GABARAP与LC3之间的选择性可以通过本文中描述的重组肽的适合的结构修饰来修改，以产生能够更加选择性地结合到GABARAP或LC3中的一者超过另一者的重组肽。这种选择性重组肽可用作生物化学探针，用于研究GABARAP或LC3的功能。例如，如图2E和4C中所证实的，AnkB的E1599R修饰(SEQ ID NO：12)、AnkG的E1996R修饰(SEQ ID NO：14)和AnkG的E1991R修饰(SEQ ID NO：2)都导致对GABARAP蛋白的选择性的提高。
在某些实施方式中，当X13是精氨酸时，所述重组肽必须包含与SEQ ID NO：12或SEQID NO：14具有至少84％序列同源性的肽。在某些实施方式中，X13是精氨酸，并且所述重组肽包含与SEQ ID NO：12具有至少88％、至少92％、至少96％或100％序列同源性的肽。在某些实施方式中，X13是精氨酸，并且所述重组肽包含与SEQ ID NO：14具有至少88％、至少92％、至少96％或100％序列同源性的肽。
在某些实施方式中，X13是谷氨酸。
具有包含脂族部分的侧链的氨基酸包括甘氨酸、丙氨酸、亮氨酸、异亮氨酸、缬氨酸和脯氨酸。
具有包含无环脂肪族部分的侧链的氨基酸包括甘氨酸、丙氨酸、亮氨酸、异亮氨酸和缬氨酸。
具有包含芳香族部分的侧链的氨基酸包括苯丙氨酸和酪氨酸。
具有包含杂芳族部分的侧链的氨基酸包括色氨酸和组氨酸。
具有包含极性部分的侧链的氨基酸可以包括不带电荷的氨基酸例如丝氨酸、苏氨酸、半胱氨酸、天冬酰胺、谷氨酰胺和酪氨酸以及带电荷的氨基酸例如精氨酸、谷氨酸、天冬氨酸、赖氨酸和组氨酸两类。
具有包含羧酸部分的侧链的氨基酸可以包括天冬氨酸和谷氨酸。
具有包含酰胺部分的侧链的氨基酸可以包括天冬酰胺和谷氨酰胺。
在某些实施方式中，X1、X2和X3独立地选自天冬氨酸和谷氨酸，并且X4和X5不存在。在某些实施方式中，X1、X2和X3独立地选自天冬氨酸和谷氨酸，X4和X5不存在，并且X13是谷氨酸。
在某些实施方式中，X1、X2和X3分别是谷氨酸、天冬氨酸和天冬氨酸，并且X4和X5不存在。在某些实施方式中，X1、X2和X3分别是谷氨酸、天冬氨酸和天冬氨酸，X4和X5不存在，并且X13是谷氨酸。
在某些实施方式中，X1、X2和X3各自是谷氨酸，并且X4和X5不存在。在某些实施方式中，X1、X2和X3各自是谷氨酸，X4和X5不存在，并且X13是谷氨酸。
在某些实施方式中，X1不存在，X2和X3是天冬氨酸，并且X4和X5不存在。在某些实施方式中，X1不存在，X2和X3是天冬氨酸，X4和X5不存在，并且X13是谷氨酸。
在某些实施方式中，X1不存在，X2和X3是天冬氨酸，并且X4和X5分别是丙氨酸和缬氨酸。在某些实施方式中，X1不存在，X2和X3是天冬氨酸，X4和X5分别是丙氨酸和缬氨酸，并且X13是谷氨酸。
在某些实施方式中，X6是色氨酸或苯丙氨酸。在某些实施方式中，X6是色氨酸或苯丙氨酸，并且X13是谷氨酸。
在某些实施方式中，X7和X8独立地是苏氨酸、缬氨酸、异亮氨酸、亮氨酸、精氨酸或谷氨酸。在某些实施方式中，X7和X8独立地是苏氨酸、缬氨酸、异亮氨酸、亮氨酸、精氨酸或谷氨酸，并且X13是谷氨酸。
在某些实施方式中，X9是苯丙氨酸、缬氨酸、亮氨酸或异亮氨酸。在某些实施方式中，X9是苯丙氨酸、缬氨酸、亮氨酸或异亮氨酸，并且X13是谷氨酸。
在某些实施方式中，X10、X11和X12独立地是谷氨酸、天冬氨酸、谷氨酰胺、丝氨酸或苏氨酸。在某些实施方式中，X10、X11和X12独立地是谷氨酸、天冬氨酸、谷氨酰胺、丝氨酸或苏氨酸，并且X13是谷氨酸。
在某些实施方式中，X1、X2和X3各自是谷氨酸并且X4和X5不存在；X4和X5分别是丙氨酸和缬氨酸，X6是色氨酸，X7和X8独立地是缬氨酸或异亮氨酸，X9是缬氨酸，并且X10、X11和X12独立地是谷氨酸、天冬氨酸或丝氨酸。在某些实施方式中，X1、X2和X3各自是谷氨酸并且X4和X5不存在；X4和X5分别是丙氨酸和缬氨酸，X6是色氨酸，X7和X8独立地是缬氨酸或异亮氨酸，X9是缬氨酸，X10、X11和X12独立地是谷氨酸、天冬氨酸或丝氨酸，并且X13是谷氨酸。
在某些实施方式中，X1、X2和X3各自是谷氨酸并且X4和X5不存在，或X1、X2和X3分别是天冬氨酸、谷氨酸和谷氨酸并且X4和X5不存在，X6是色氨酸，X7和X8独立地是缬氨酸、异亮氨酸或亮氨酸，X9是缬氨酸或亮氨酸，并且X10、X11和X12独立地是谷氨酸、天冬氨酸、谷氨酰胺、苏氨酸或丝氨酸。在某些实施方式中，X1、X2和X3各自是谷氨酸并且X4和X5不存在，或X1、X2和X3分别是天冬氨酸、谷氨酸和谷氨酸并且X4和X5不存在，X6是色氨酸，X7和X8独立地是缬氨酸、异亮氨酸或亮氨酸，X9是缬氨酸或亮氨酸，X10、X11和X12独立地是谷氨酸、天冬氨酸、谷氨酰胺、苏氨酸或丝氨酸，并且X13是谷氨酸。
在某些实施方式中，X1、X2和X3分别是谷氨酸、天冬氨酸和天冬氨酸并且X4和X5不存在，或X1、X2和X3分别是谷氨酸、天冬氨酸和谷氨酸并且X4和X5不存在，X6是色氨酸，X7和X8独立地是缬氨酸、异亮氨酸、苏氨酸或谷氨酸，X9是苯丙氨酸，并且X10、X11和X12独立地是赖氨酸、谷氨酸、天冬酰胺、天冬氨酸、苏氨酸或丝氨酸。在某些实施方式中，X1、X2和X3分别是谷氨酸、天冬氨酸和天冬氨酸并且X4和X5不存在，或X1、X2和X3分别是谷氨酸、天冬氨酸和谷氨酸并且X4和X5不存在，X6是色氨酸，X7和X8独立地是缬氨酸、异亮氨酸、苏氨酸或谷氨酸，X9是苯丙氨酸，X10、X11和X12独立地是赖氨酸、谷氨酸、天冬酰胺、天冬氨酸、苏氨酸或丝氨酸，并且X13是谷氨酸。
在某些实施方式中，X1、X2和X3分别是谷氨酸、天冬氨酸和天冬氨酸并且X4和X5不存在，X6是色氨酸，X7和X8独立地是异亮氨酸、苏氨酸或谷氨酸，X9是苯丙氨酸，并且X10、X11和X12独立地是谷氨酸或丝氨酸。在某些实施方式中，X1、X2和X3分别是谷氨酸、天冬氨酸和天冬氨酸并且X4和X5不存在，X6是色氨酸，X7和X8独立地是异亮氨酸、苏氨酸或谷氨酸，X9是苯丙氨酸，X10、X11和X12独立地是谷氨酸或丝氨酸，并且X13是谷氨酸。
在某些实施方式中，X1、X2和X3分别是谷氨酸、天冬氨酸和天冬氨酸并且X4和X5不存在，X6是色氨酸，X7和X8分别是苏氨酸和精氨酸，X9是苯丙氨酸，并且X10、X11和X12独立地是谷氨酸或丝氨酸。在某些实施方式中，X1、X2和X3分别是谷氨酸、天冬氨酸和天冬氨酸并且X4和X5不存在，X6是色氨酸，X7和X8分别是苏氨酸和精氨酸，X9是苯丙氨酸，X10、X11和X12独立地是谷氨酸或丝氨酸，并且X13是谷氨酸。
螺旋在本领域中是公知的，具有形成α螺旋的倾向性的氨基酸也是如此。例如，已知氨基酸甲硫氨酸、丙氨酸、亮氨酸、谷氨酸和/或赖氨酸当被包括在肽中时具有形成α螺旋结构的高倾向性。已知具有形成α螺旋的倾向性的其他氨基酸包括苯丙氨酸、甘氨酸、色氨酸、异亮氨酸和缬氨酸。
R1可以是两亲性α螺旋。在两亲性α螺旋中，所述螺旋的一个面主要包含亲水性氨基酸，所述螺旋的另一个面主要包含疏水性氨基酸。两亲性α螺旋的氨基酸序列通常可以每3至4个残基在亲水和疏水性残基之间交替，因为所述α螺旋每3.6个氨基酸形成一个转角。
在某些实施方式中，R1是3、4、5、6、7、8、9或10转角的两亲性α螺旋。在某些实施方式中，所述两亲性α螺旋包含7至36、7至34、7至32、7至30、7至28、7至26、7至24、7至22、7至20、7至18、7至15、7至13、7至11个或7个氨基酸。在某些实施方式中，所述两亲性α螺旋包含7、8、9、10、11、12、13、14或15个氨基酸。
在某些实施方式中，R1包含两亲性α螺旋，其包含由式II表示的序列：
X14-X15-X16-X17-X18-X19-X20-X21
II
其中X14和X17独立地是具有包含无环脂肪族部分的侧链的氨基酸，X16是具有包含极性部分的侧链的氨基酸或不存在，X15和X18-X20独立地是具有包含极性部分的侧链的氨基酸，并且X21是具有包含无环脂肪族部分的侧链的氨基酸或不存在。
在某些实施方式中，X14和X17独立地是丙氨酸、亮氨酸、异亮氨酸或缬氨酸。在某些实施方式中，X14是异亮氨酸或亮氨酸。在某些实施方式中，X17是丙氨酸或异亮氨酸。
在某些实施方式中，X15和X18-X20独立地是天冬氨酸、精氨酸、谷氨酸、谷氨酰胺、赖氨酸、丝氨酸或半胱氨酸。
在某些实施方式中，X21是丙氨酸、亮氨酸或甘氨酸。
在某些实施方式中，X14和X17独立地是丙氨酸、亮氨酸、异亮氨酸或缬氨酸；X15和X18-X20独立地是天冬氨酸、精氨酸、谷氨酸、谷氨酰胺、赖氨酸、丝氨酸或半胱氨酸，并且X21是丙氨酸、亮氨酸或甘氨酸。
在某些实施方式中，R1包含与SEQ ID NO：17、SEQ ID NO：18或SEQ ID NO：19具有至少75％、至少87％或100％序列同源性的肽。
在某些实施方式中，所述重组肽包含在来自于任何生物的AnkB或AnkG蛋白中发现的延长LIR基序，包括但不限于非人类灵长动物、人类(例如AnkB：SEQ ID NO：3和AnkG：SEQID NO：4)、小鼠(例如AnkB：SEQ ID NO：8)、大鼠(例如AnkG：SEQ ID NO：1)、犬科动物、鸡(例如AnkB：SEQ ID NO：9和AnkG：SEQ NO:5)、兔、大鼠(例如AnkG：SEQ ID NO：1)、斑马鱼(例如AnkB：SEQ ID NO：10和AnkG：SEQ ID NO：7)、蛙(例如AnkG：SEQ ID NO：6)等。
在其他实施方式中，所述重组肽是包含本文中所描述的多肽序列的任何非天然存在的蛋白质。这些肽可以源自于与AnkB和AnkG无关的蛋白质。例如，FAM134B(SEQ ID NO：21)对ATG8家族成员表现出强结合亲和性。
在某些实施方式中，所述包含由式I表示的序列的重组肽包括与SEQ ID NO：1、SEQID NO：2、SEQ ID NO：3、SEQ ID NO：4、SEQ ID NO：5、SEQ ID NO：6、SEQ ID NO：7、SEQ IDNO：8、SEQ ID NO：9、SEQ ID NO：10、SEQ ID NO：12、SEQ ID NO：14、SEQ ID NO：20或SEQ IDNO：21具有至少88％、至少92％、至少97％或100％序列同源性的肽。
在某些实施方式中，所述包含由式I表示的序列的重组肽包括与SEQ ID NO：1、SEQID NO：2、SEQ ID NO：3、SEQ ID NO：4、SEQ ID NO：5、SEQ ID NO：6、SEQ ID NO：7、SEQ IDNO：8、SEQ ID NO：9、SEQ ID NO：10、SEQ ID NO：20或SEQ ID NO：21具有至少88％、至少92％、至少97％或100％序列同源性的肽。
在某些实施方式中，所述包含由式I表示的序列的重组肽包括与SEQ ID NO：1、SEQID NO：2或SEQ ID NO：3具有至少88％、至少92％、至少97％或100％序列同源性的肽。
在某些实施方式中，所述式I的重组肽基本上由本文中描述的肽序列中的任一者构成。
本文中描述的重组肽表现出与GABARAP、GABARAPL1、GABARAPL2、LC3A、LC3B和LC3C的强烈结合。本文中描述的重组肽可以以纳摩尔和亚纳摩尔范围内的Kd结合到GABARAP和LC3家族蛋白。在某些实施方式中，本文中描述的重组肽可以以0.1nM至200nM、0.1nM至150nM、0.1nM至100nM、0.1nM至80nM、0.1nM至60nM、0.1nM至40nM、0.1nM至30nM、0.1nM至25nM、0.1nM至20nM、0.1nM至15nM、0.1nM至10nM或0.1nM至1nM的Kd结合到GABARAP家族成员。在某些实施方式中，本文中描述的重组肽可以以1nM至100nM、1nM至75nM、1nM至50nM、1nM至25nM、1nM至20nM或1nM至15nM的Kd结合到LC3家族成员。任选地，这些值可以通过本文中描述并在下文实施例中描述的测定法来确定。
在某些实施方式中，本文中描述的重组肽对一种或多种GABARAP蛋白表现出比对至少一种LC3蛋白强多达2、3、5、10、100、500或1,000倍的Kd。
本文中描述的重组肽的抑制效果可以发生在无细胞体系中、细胞或组织培养物中和/或患者中的细胞和/或组织中。因此，在某些实施方式中，提供了一种在细胞中抑制自噬的方法，所述方法包括将所述细胞与本文中描述的重组肽相接触，由此在所述细胞中抑制或至少部分抑制自噬的步骤。
本文中描述的重组肽，通过用适合的可检测标签适合地修饰所述重组肽，可用于成像自噬过程。所述重组肽也可以用亲和标签修饰，所述亲和标签使所述重组肽能够用于牵出实验，以分离参与自噬过程的结合靶(例如Atg8蛋白)。因此，在某些实施方式中，本文中描述的重组肽还包含亲和标签和/或可检测标记。所述亲和标签或可检测标记可以通过肽键直接共价附连到所述重组肽的n-端或c-端，或通过接头共价附连。在可选实施方式中，亲和标签或可检测标记可以被共价附连到适当官能化的侧链，例如赖氨酸、半胱氨酸、谷氨酸、天冬氨酸、酪氨酸、丝氨酸或苏氨酸侧链。在某些实施方式中，所述可检测标记通过(Gly-Ser)n、(Gly-Gly-Gly-Ser)n(SEQ ID NO：22)、(Gly-Gly-Ser-Gly)n(SEQ ID NO：23)、(Gly-Gly-Gly-Gly-Ser)n(SEQ ID NO：24)、(Gly-Gly-Ser)n、(Gly-Ser)n或Glyn接头间接地共价附连到所述重组肽的n-端，其中n是1-10。在某些实施方式中，所述可检测标记通过(Gly-Ser)n、(Gly-Gly-Gly-Ser)n(SEQ ID NO：22)、(Gly-Gly-Ser-Gly)n(SEQ ID NO：23)、(Gly-Gly-Gly-Gly-Ser)n(SEQ ID NO：24)、(Gly-Gly-Ser)n、(Gly-Ser)n或Glyn接头间接地附连到所述重组肽的n-端，其中n是1-4。在某些实施方式中，所述可检测标记通过SGLRSGS(SEQ ID NO：25)或YSDLDGS(SEQ ID NO：26)间接地附连到所述重组肽的n-端。在某些实施方式中，所述重组肽还包含通过SGLRSGS(SEQ ID NO：25)接头共价附连在n-端的mCherry可检测标记。在某些实施方式中，所述重组肽该包含通过YSDLDGS(SEQ ID NO：26)接头共价附连在n-端的绿色荧光蛋白可检测标记。
当在本文中使用时，术语“亲和标签”是指可以被附连到一个或多个多肽以提供用于例如所述一个或多个多肽的纯化或检测的多肽段。原则上，可以获得抗体或其他特异性结合试剂的任何肽或蛋白质可用作亲和标签。亲和标签包括但不限于：聚组氨酸，蛋白质，谷胱甘肽S转移酶，Glu-Glu亲和标签，物质P，链亲和素结合肽，或其他抗原性表位例如血凝素(HA)多肽。总的来说，参见Ford等，Protein Expression and Purification 2:95-107,1991。
可检测标记可以包括显色酶类、放射性同位素、发色团、发光化合物、荧光化合物、磁共振成像化合物、超顺磁性粒子和超小超顺磁性粒子。在某些实施方式中，所述可检测标记是荧光蛋白例如绿色荧光蛋白或mCherry。
适合的可检测标记包括可以通过光谱、光化学、生物化学、免疫化学、电学、光学或化学手段检测的任何组合物。适合的可检测标记包括但不限于磁珠(例如DynabeadsTM)、荧光染料(例如荧光素、德克萨斯红、罗丹明、绿色荧光蛋白、红色荧光蛋白、黄色荧光蛋白等)、放射性标记物(例如3H、125I、35S、14C或32P)、酶(例如辣根过氧化物酶、碱性磷酸酶、萤光素酶和在酶联免疫吸附测定法(ELISA)中常用的其他酶)和比色法标记物例如胶体金或彩色玻璃或塑料(例如聚苯乙烯、聚丙烯、乳胶等)珠。
还提供了编码本文中所描述的重组肽的多核苷酸。在某些实施方式中，所述多核苷酸编码重组肽::荧光蛋白偶联物。所述多核苷酸可以被包括在质粒表达载体中。编码所述重组肽的质粒表达载体的表达可以以组织特异性或发育阶段特异性方式驱动，或者使用适合的启动子通过化学调控或物理调控来诱导。本领域中已知的任何启动子可用于驱动编码本文中描述的重组肽的质粒的表达。这些启动子包括但不限于nfya-1、col-19、myo-3、vha-6、hyp7、y37A1B.5CMV、CAG、SV40等。
本公开还提供了一种药物组合物，其包含本文中描述的重组肽中的任一者和至少一种可药用赋形剂。
本文中描述的重组肽及其可药用盐可以单独地或按照标准的制药实践与可药用载体或稀释剂组合在药物组合物中施用到受试者。所述化合物可以口服或肠胃外、优选地肠胃外施用。肠胃外施用包括静脉内、肌肉内、腹膜内、皮下和局部，并且优选方法是静脉内施用。
因此，本公开提供了可药用组合物，其包含与一种或多种可药用载体(添加剂)和/或稀释剂配制在一起的治疗有效量的一种或多种本文中描述的重组肽。本公开的药物组合物可以被具体配制成用于以固体或液体形式施用，包括适应于下述施用的形式：(1)肠胃外施用，例如通过皮下、肌肉内、静脉内硬膜外注射，作为例如无菌溶液或悬液或持续释放剂型；和(2)口服施用，例如药水(水性或非水性溶液或悬液)，片剂例如定向用于颊、舌下和***吸收的片剂，大丸剂，粉剂，颗粒剂，用于施用到舌的糊剂。本发明的化合物的优选施用方法是肠胃外施用(静脉内)。
正如本文中阐述的，本文中描述的重组肽的某些实施方式可以含有碱性官能团例如氨基，并因此能够与可药用酸形成可药用盐。就此而言，术语“可药用盐”是指本公开的化合物的相对无毒的无机和有机酸加成盐。这些盐可以在施用介质或剂型制造过程中原位制备，或通过分开地将采取游离碱形式的纯化的本发明的化合物与适合的有机或无机酸反应，并在随后的纯化过程中分离由此形成的盐来制备。代表性的盐包括氢溴酸盐、盐酸盐、硫酸盐、硫酸氢盐、硝酸盐、乙酸盐、戊酸盐、油酸盐、棕榈酸盐、硬脂酸盐、月桂酸盐、苯甲酸盐、乳酸盐、磷酸盐、甲苯磺酸盐、柠檬酸盐、马来酸盐、富马酸盐、琥珀酸盐、酒石酸盐、萘酸盐、甲磺酸盐、葡庚糖酸盐、乳糖酸盐和月桂基磺酸盐等。
本公开的重组肽的可药用盐包括所述化合物的常规的无毒性盐或季铵盐，例如来自于无毒性有机或无机酸的常规的无毒性盐或季铵盐。例如，这些常规无毒性盐包括源自于无机酸例如盐酸、氢溴酸、硫酸、氨磺酸、磷酸、硝酸等的盐，以及从有机酸例如乙酸、丙酸、琥珀酸、乙醇酸、硬脂酸、乳酸、苹果酸、酒石酸、柠檬酸、抗坏血酸、棕榈酸、马来酸、羟基马来酸、苯乙酸、谷氨酸、苯甲酸、水杨酸、磺胺酸、2-乙酰氧基苯甲酸、富马酸、甲苯磺酸、甲磺酸、乙二磺酸、草酸、2-羟乙磺酸等制备的盐。
在其他情况下，本文中描述的重组肽可以含有一个或多个酸性官能团，并因此能够与可药用碱形成可药用盐。在这些情况下，术语“可药用盐”是指本发明的化合物的相对无毒性的无机和有机碱加成盐。这些盐同样可以在施用介质或剂型制造过程中原位制备，或通过分别地将采取游离酸形式的纯化的化合物与适合的碱例如可药用金属阳离子的氢氧化物、碳酸盐或碳酸氢盐反应、与氨或与可药用有机伯胺、仲胺或叔胺进行反应来制备。代表性的碱或碱土金属盐包括锂、钠、钾、钙、镁和铝盐等。用于形成碱加成盐的代表性有机胺包括乙胺、二乙胺、乙二胺、乙醇胺、二乙醇胺、哌嗪等。
润湿剂、乳化剂和润滑剂例如月桂基硫酸钠和硬脂酸镁，以及着色剂、脱模剂、包衣剂、甜味剂、调味剂和香味剂、防腐剂、增溶剂、缓冲剂和抗氧化剂，也可存在于所述组合物中。
制备这些剂型或重组肽的方法包括将本文描述的重组肽与所述载体和任选的一种或多种辅助成分相组合的步骤。一般来说，所述剂型通过将本发明的化合物与液体载体均匀密切地进行组合(液体剂型)、与液体载体相组合然后冻干(使用无菌水等进行重构的粉末剂型)或与细分固体载体或两者相组合，然后如有必要，塑形或包装所述产品。
本公开的适合于肠胃外施用的药物组合物包含一种或多种本文中描述的重组肽与一种或多种可药用无菌等渗水性或非水性溶液、分散系、悬液或乳液或无菌粉末的组合，所述无菌粉末可以在即将使用前重构成无菌可注射溶液或分散系，所述药物组合物可以含有糖、醇类、抗氧化剂、缓冲剂、抑菌剂、螯合剂、赋予所述剂型与目标受体的血液等渗的溶质、或悬浮剂或增稠剂。在实例中，将所述活性成分与所述可药用载体在溶液中混合在一起，然后冻干以产生干粉。所述干粉被包装成单位剂型，然后通过向所述粉剂添加无菌溶液例如水或生理盐水来重构，以用于肠胃外施用。
可以在本公开的药物组合物中使用的适合的水性和非水性载体的实例包括水、乙醇、多元醇(例如甘油、丙二醇、聚乙二醇等)及其适合的混合物、植物油例如橄榄油、以及可注射的有机酯例如油酸乙酯。例如，通过使用包衣材料例如卵磷脂，在分散系的情况下通过维持所需的粒径，以及通过使用表面活性剂，可以维持适当的流动性。
这些组合物还可包含辅助剂例如防腐剂、湿润剂、乳化剂和分散剂。通过包含各种不同的抗细菌和抗真菌剂例如对羟基苯甲酸酯、氯丁醇，苯酚山梨酸等，可以确保防止微生物对本发明的重组肽的作用。还可能希望在所述组合物中包括等渗剂例如糖、氯化钠等。另外，通过包含延迟吸收的试剂如单硬脂酸铝和明胶，可以引起可注射药物形式的延长吸收。
当在本文中使用时，短语“肠胃外施用”意味着肠和局部施用之外的施用方式，通常通过注射来进行，并且包括但不限于静脉内、肌肉内、动脉内、鞘内、囊内、眶内、心内、真皮内、腹膜内、经气管、皮下、表皮下、关节内、被膜下、蛛网膜下、脊柱内和胸骨内注射和输注。
当在本文中使用时，短语“***性施用”和“外周施用”意味着化合物、药物或其他材料的直接施用到中枢神经***中之外的施用，使其进入所述患者的***并因此经历代谢和其他类似过程，例如皮下施用。
本文中描述的重组肽是Atg8的强力抑制剂，并因此可用于治疗自噬的抑制在其中具有治疗效果的疾病或病症。因此，在某些实施方式中，本文中提供了一种在自噬的抑制对其有益的受试者中抑制自噬的方法，所述方法包括向所述受试者施用治疗有效量的本文中描述的重组肽，由此在所述受试者中抑制自噬活性。这类自噬的抑制在其中有益的疾病或病症包括但不限于癌症(例如乳腺、卵巢和***癌)、代谢疾病(例如动脉粥样硬化和糖尿病)、免疫障碍(例如乳糜泻病、多发性硬化症)和神经退行性疾病(例如阿兹海默病、帕金森氏病)。
已提出自噬的抑制是一种通过促进放疗敏化和化疗敏化的新的抗癌疗法。因此，本文中描述的重组肽可用于使肿瘤对癌症药物和/或放疗敏感。因此，本文中描述的重组肽可以与一种或多种癌症药物共同施用，以治疗患有癌症的受试者。
所描述的重组肽和癌症药物可以同时(例如同时、基本上同时或在同一治疗方案内)或顺序施用，这具体取决于所述癌症的本质、患者的状况以及将要与本文描述的重组肽联合施用(即在单一治疗方案内)的癌症药物的实际选择。
如果本文中描述的重组肽和所述癌症药物不同时或基本上同时施用，则本文中描述的重组肽和所述癌症药物的最佳施用次序对于不同类型的癌症来说可能不同。因此，在某些情况下，可以首先施用本文中描述的重组肽，然后施用所述癌症药物；在其他情况下，可以首先施用所述癌症药物，然后施用本文中描述的重组肽。这种交替施用可以在单个治疗方案中重复地进行。在评估所述待治疗的疾病和患者的状况之后，治疗方案中的施用顺序以及每种治疗剂的重复施用次数的确定完全在专业医师的知识范围之内。
实施例
Ank衍生肽可以在异源细胞中强力抑制自噬
我们使用确立已久的培养COS7细胞，通过在所述细胞中过表达AnkB/G LIR肽来评估自噬抑制。我们对代表含有LC3或GABARAP的自噬结构的内源LC3或GABARAP阳性斑点的数目进行定量，作为用于定量自噬抑制的读出数据(Klionsky等，2016；Mizushima等，2010)。在营养剥夺后，可以在过表达仅mCherry的细胞中观察到LC3或GABARAP阳性斑点的明显积累，表明自噬被饥饿诱导(图6C6和E6)。mCherry-AnkB WT的过表达将LC3和GABARAP斑点降低到背景水平(即当细胞不被饥饿时LC3和GABARAP斑点的水平，数据未示出)。相反，mCherry-AnkB WR肽的表达对LC3或GABARAP斑点数目没有影响(即具有与表达mCherry载体对照时相同的斑点数目；图6C-F)。上述结果表明AnkB WT肽可以通过靶向所有Atg8家族成员而起到强力自噬抑制剂的作用。
与我们的生物化学数据完全一致，AnkG WT肽强力抑制GABARAP斑点形成，但当在COS7细胞中过表达时仅仅较小地减少LC3阳性斑点。令人满意的是，AnkG ER肽对LC3斑点数目减少基本上没有影响，但强力抑制GABARAP斑点形成(图6C-F)，表明AnkG ER肽事实上可以起到GABARAP介导的自噬的特异性抑制剂的作用。作为阴性和特异性对照，当细胞过表达mCherry-AnkG WR肽时，我们没有看到LC3或GABARAP斑点数目的任何可注意到的变化(图6C-F)。
我们进一步对p62这种研究最充分的选择性自噬底物之一的水平进行定量，以监测在饥饿条件下表达各种不同AnkB/G LIR肽的COS7细胞中的自噬流(Klionsky等，2016；Mizushima等，2010)。在诱导自噬后，p62通过它的LIR基序介导的与Atg8s的相互作用和随后并入到自噬体中而形成聚集物(Bjorkoy等，2005；Pankiv等，2007)。如果自噬流正常，只形成相对低且稳定水平的p62聚集物(即p62阳性自噬体通过与溶酶体融合被稳定地清理(Bjorkoy等，2005))，并且当细胞表达mCherry载体对照时情况正是如此(图7F)。AnkB WT肽的过表达急剧增加p62阳性斑点(图7和6G)，推测是由于所有Atg8介导的自噬过程的强力抑制。有趣的是，尽管所述AnkG WT肽在COS7细胞中也明显增加p62阳性斑点，但p62斑点增加的数目显著低于由AnkB WT肽所引起的p62斑点增加的数目(图6G)，表明一部分LC3亚家族介导的自噬不被AnkG WT肽阻断。正如我们预期的，当与mCherry载体对照相比时，AnkB WR或AnkG WR肽均不能够诱导p62阳性斑点增加(图7和6G)。令人满意的是，与表达mCherry或AnkB/G WR的细胞相比，在表达AnkG ER肽的细胞中p62阳性斑点没有统计学显著的增加(图7和6G)。这与以前基于siRNA的研究相一致，所述研究显示LC3但不是GABARAP的下调在COS7细胞中引起p62积累(Maruyama等，2014)。合在一起，上述基于细胞的测定法加强了我们较早时从生物化学和结构研究得出的结论，即AnkB WT肽可以通过靶向Atg8家族的所有成员而起到强力自噬抑制剂的作用，并且AnkG WT或ER肽可以选择性靶向GABARAPs而不影响LC3s。
Ank衍生肽的表达在秀丽隐杆线虫(C.elegans)中减弱自噬
秀丽隐杆线虫(C.elegans)为研究自噬，特别是为调查Atg8的不同成员在自噬中的作用提供了理想的平台，因为线虫含有GABARAP和LC3两个亚家族的Atg8s，并且足够简单地，每个亚家族仅有一个基因(线虫lgg-1和lgg-2分别是哺乳动物的GABARAP和LC3的直系同源物)。较早时也已显示，lgg-1和lgg-2在自噬中非冗余地起作用(Wu等，2015)。在线虫中进行自噬测定之前，我们使用与我们为图1和3所描述的相同的方法测量了各种不同的AnkB/G LIR肽与纯化的LGG-1和LGG-2的结合。与我们在与哺乳动物Atg8s的结合中发现的情况类似，AnkB WT肽非常强地结合到LGG-1和LGG-2两者，并且WR突变肽消除了所述结合(图6B；下方的两行)。AnkG WT肽强烈结合到LGG-1，但对LGG-2具有约1/130的弱亲和性。AnkG ER肽保持与LGG-1的强结合，并对LGG-2表现出～1/1,000的弱结合(图6B；下方的两行)。
接下来我们确定了AnkB WT肽是否在秀丽隐杆线虫(C.elegans)中阻断自噬。自噬为各种不同的蛋白质底物包括在发育期间秀丽隐杆线虫(C.elegans)的p62同源物SQST-1的降解所需(Tian等，2010)。在野生型动物中，SQST-1::GFP被弱表达并分散位于细胞质中，而在自噬突变体中大量SQST-1聚集物积累(Tian等，2010)。将与Cherry报告物融合的AnkBWT肽(Cherry::AnkBWT)或Cherry::AnkB WR在从胚胎期到成年期遍在表达的nfya-1启动子的控制之下进行表达。将表达质粒注入到带有整合的SQST-1::GFP报告物(bpIs151)的动物中，获得转基因株系并进行分析。我们发现表达Cherry::AnkB WT的动物从胚胎期至成年期在多种组织中积累大量SQST-1::GFP聚集物(图8A、B、D和E)。相反，在表达Cherry::AnkB WR的动物中不形成SQST-1::GFP聚集物(图8C、F)。
在发育期间或在成年秀丽隐杆线虫(C.elegans)中发生的各种不同生理过程中，自噬发挥关键作用(Zhang等，2015)。更少的自噬突变体发育成幼虫。表达Pnfya-1::Cherry::AnkB WT的动物显示出孵化率的显著降低。60.8％的表达AnkB WT肽的胚胎孵化，与此相比96.9％的表达AnkB WR的胚胎孵化(图8G)。自噬突变体也生长缓慢。与表达AnkBWR突变肽的胚胎相比，表达Cherry::AnkB WT的胚胎花费多大约两小时的时间发育成L1幼虫和另外6个小时的时间发育成年轻成虫(图8H和I)。因此，在秀丽隐杆线虫(C.elegans)发育期间AnkB WT肽阻断自噬。
同样地，我们还在秀丽隐杆线虫(C.elegans)中测试了AnkG肽的阻断效果。在hyp7启动子的控制之下，表达Cherry::AnkG WT或ER肽而不是Cherry::AnkG WR肽的表皮引起从胚胎期到成年期SQST-1::GFP聚集物的积累(图10A-H)。这个观察与哺乳动物异源细胞中的观察略有不同。这可以通过所述两个家族在不同生物体中的不同作用来解释。在哺乳动物中，p62降解依赖于LC3而不是GABARAP(Maruyama等，2014)，因此阻断GABARAP结合对p62降解具有极小影响。然而，在秀丽隐杆线虫(C.elegans)中，LGG-1在LGG-2上游起作用(Manil-Segalen等，2014；Wu等，2015)，因此阻断它们中的任一者将导致SQST-1降解的缺陷。
C.通过Ank衍生肽的表达组织和时间特异性地减弱自噬
尽管从遗传筛选分离到一大批自噬突变体(Tian等，2010)，但以空间时间方式抑制自噬活性的测定法仍未获得。我们调查了AnkB肽是否可以以组织和时间特异性方式阻断自噬。将AnkB肽在组织特异性启动子的控制下进行表达，所述启动子包括用于体壁肌肉细胞的myo-3、用于下皮细胞的y37A1B.5和用于肠细胞的vha-6启动子。将所述表达构建物注入到带有相应的组织特异性SQST-1::GFP表达整合株系的动物中。我们发现在表达AnkB WT肽的动物中，从胚胎期到成年期在不同组织中积累大量SQST-1::GFP聚集物，而表达WR肽的动物不显示出积累(图9A-F，图10I-T)。也在具有不同AnkB WT表达水平的动物中比较了SQST-1::GFP聚集物的积累。具有AnkB WT肽的弱表达水平的动物含有较少的SQST-1::GFP聚集物，并且SQST-1::GFP聚集物的水平随着AnkB WT肽表达的提高而提高(图10W-Y)。
我们还检查了AnkB肽是否可以以时间控制的方式削弱自噬。AnkB WT的表达由col-19的启动子驱动，所述启动子从年轻成虫期开始在下皮细胞中表达。我们发现表达这种肽的动物表现出SQST-1::GFP聚集物的成年特异性积累的表型，而从胚胎期到L4幼虫期没有发现聚集物(图9G-I)。
已知自噬调节成年线虫的衰老过程。我们发现表达Pnfya-1::Cherry::AnkB WT的线虫与表Cherry::AnkB WR达的动物相比寿命急剧缩短(图9J)。与表达Cherry::AnkB WR的动物相比，在肌肉细胞和肠细胞中表达Cherry::AnkB WT不显著减少寿命(图9K，图10U)。由AnkB引起的自噬缺陷比在自噬突变体中更弱。通过表达Cherry::AnkB WT在下皮细胞中减损自噬活性略微减少平均寿命(图10V)。这些结果表明在不同组织中自噬的减弱对线虫中的衰老具有差异贡献。合在一起，这些结果表明AnkB肽可以在秀丽隐杆线虫(C.elegans)中以空间和时间特异性方式抑制自噬活性。
接下来，我们试图探索Ank衍生肽作为自噬体标志物的潜在应用。将COS7细胞用GFP-RFP-LC3B和带有Myc标签的AnkB WT或AnkB WR肽共转染。在这种设计中，自噬体上的LC3B将表现出绿色和红色荧光两种信号，而溶酶体上的LC3B将仅显示出红色荧光，因为GFP在酸性环境中被淬灭。由于正如我们前面证实的，细胞中表达的大量AnkB WT肽可以有效地抑制自噬，因此我们仅仅聚焦于具有Myc-AnkB的低表达水平的COS7细胞。在具有AnkB WT表达的细胞中，观察到显著数量的黄色(与红色信号合并的绿色信号)和仅仅红色的斑点，表明在这种少量AnkB WT肽存在下自噬流保持正常(图11A)。LC3B主要集中在自噬体上，因为绝大多数斑点具有绿色和红色两种颜色(图11A)。Myc-AnkB WT肽完美地与这些双色斑点共定位，但不与仅仅红色的斑点共定位(图11A)。作为阴性对照，AnkB WR肽散布在细胞中(图11B)。上述观察表明低水平的AnkB WT可以充当自噬体上LC3B的高效且特异的标志物。
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序列表
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<151> 2017-11-14
<160> 26
<170> PatentIn version 3.5
<210> 1
<211> 26
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 实验室中制备的大鼠重组肽AnkG
<400> 1
Pro Glu Asp Asp Trp Thr Glu Phe Ser Ser Glu Glu Ile Arg Glu Ala
1 5 10 15
Arg Gln Ala Ala Ala Ser His Ala Pro Ser
20 25
<210> 2
<211> 26
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 实验室中制备的大鼠重组肽AnkG E1991R
<400> 2
Pro Glu Asp Asp Trp Thr Arg Phe Ser Ser Glu Glu Ile Arg Glu Ala
1 5 10 15
Arg Gln Ala Ala Ala Ser His Ala Pro Ser
20 25
<210> 3
<211> 27
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 实验室中制备的人重组肽AnkB
<400> 3
Val Glu Glu Glu Trp Val Ile Val Ser Asp Glu Glu Ile Glu Glu Ala
1 5 10 15
Arg Gln Lys Ala Pro Leu Glu Ile Thr Glu Tyr
20 25
<210> 4
<211> 27
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 实验室中制备的人重组肽AnkG
<400> 4
Pro Glu Asp Asp Trp Ile Glu Phe Ser Ser Glu Glu Ile Arg Glu Ala
1 5 10 15
Arg Gln Gln Ala Ala Ala Ser Gln Ser Pro Ser
20 25
<210> 5
<211> 27
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 实验室中制备的鸡重组肽AnkG
<400> 5
Ser Glu Asp Asp Trp Val Glu Phe Ser Thr Glu Glu Ile Asp Glu Ala
1 5 10 15
Arg Gln Gln Ala Leu Thr Ser Pro Pro Met Ser
20 25
<210> 6
<211> 25
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 实验室制备的热带非洲爪蟾重组肽AnkG
<400> 6
Pro Glu Asp Glu Trp Val Glu Phe Ser Asn Glu Glu Leu Glu Glu Ala
1 5 10 15
Arg Gln Leu Ala Asn Thr His Ala Pro
20 25
<210> 7
<211> 26
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 实验室制备的斑马鱼源重组肽AnkG
<400> 7
Ser Glu Asp Glu Trp Glu Glu Phe Ser Lys Asp Glu Ile Glu Glu Ala
1 5 10 15
Arg His Ser Ala Leu Arg Ser Leu Pro Thr
20 25
<210> 8
<211> 27
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 实验室制备的小鼠重组肽AnkB
<400> 8
Leu Glu Glu Glu Trp Val Ile Val Ser Asp Glu Glu Ile Gln Glu Ala
1 5 10 15
Lys Gln His Ala Pro Val Glu Ile Asp Glu His
20 25
<210> 9
<211> 27
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 实验室中制备的鸡重组肽AnkB
<400> 9
Val Glu Glu Glu Trp Val Ile Val Ser Asp Glu Glu Ile Glu Glu Ala
1 5 10 15
Arg Arg Asn Ala Pro Val Glu Val Thr Glu Pro
20 25
<210> 10
<211> 27
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 实验室中制备的斑马鱼重组肽AnkB
<400> 10
Lys Asp Glu Glu Trp Val Leu Leu Thr Glu Ser Glu Ile Glu Glu Ala
1 5 10 15
Lys Met Met Ala Ala Phe Glu Ser Gln Glu Ala
20 25
<210> 11
<211> 27
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 实验室中制备的人重组肽AnkB W1592R
<400> 11
Val Glu Glu Glu Arg Val Ile Val Ser Asp Glu Glu Ile Glu Glu Ala
1 5 10 15
Arg Gln Lys Ala Pro Leu Glu Ile Thr Glu Tyr
20 25
<210> 12
<211> 27
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 实验室中制备的人重组肽AnkB E1599R
<400> 12
Val Glu Glu Glu Trp Val Ile Val Ser Asp Glu Arg Ile Glu Glu Ala
1 5 10 15
Arg Gln Lys Ala Pro Leu Glu Ile Thr Glu Tyr
20 25
<210> 13
<211> 26
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 实验室中制备的大鼠重组肽AnkG W1989R
<400> 13
Pro Glu Asp Asp Arg Thr Glu Phe Ser Ser Glu Glu Ile Arg Glu Ala
1 5 10 15
Arg Gln Ala Ala Ala Ser His Ala Pro Ser
20 25
<210> 14
<211> 26
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 实验室中制备的大鼠重组肽AnkG E1996R
<400> 14
Pro Glu Asp Asp Trp Thr Glu Phe Ser Ser Glu Arg Ile Arg Glu Ala
1 5 10 15
Arg Gln Ala Ala Ala Ser His Ala Pro Ser
20 25
<210> 15
<211> 26
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 实验室中制备的大鼠重组肽AnkG I1997Q
<400> 15
Pro Glu Asp Asp Trp Thr Glu Phe Ser Ser Glu Glu Gln Arg Glu Ala
1 5 10 15
Arg Gln Ala Ala Ala Ser His Ala Pro Ser
20 25
<210> 16
<211> 26
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 实验室中制备的大鼠重组肽AnkG A2000Q
<400> 16
Pro Glu Asp Asp Trp Thr Glu Phe Ser Ser Glu Glu Ile Arg Glu Gln
1 5 10 15
Arg Gln Ala Ala Ala Ser His Ala Pro Ser
20 25
<210> 17
<211> 7
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 实验室中制备的大鼠重组AnkG α螺旋
<400> 17
Ile Arg Glu Ala Arg Gln Ala
1 5
<210> 18
<211> 8
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 实验室中制备的人重组AnkB α螺旋
<400> 18
Ile Glu Glu Ala Arg Gln Lys Ala
1 5
<210> 19
<211> 8
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 实验室中制备的人重组AnkGα螺旋
<400> 19
Ile Arg Glu Ala Arg Gln Gln Ala
1 5
<210> 20
<211> 26
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 实验室中制备的人重组FYCO1序列
<400> 20
Asp Asp Ala Val Phe Asp Ile Ile Thr Asp Glu Glu Leu Cys Gln Ile
1 5 10 15
Gln Glu Ser Gly Ser Ser Leu Pro Glu Thr
20 25
<210> 21
<211> 26
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 实验室中制备的人重组FAM134B序列
<400> 21
Glu Gly Asp Asp Phe Glu Leu Leu Asp Gln Ser Glu Leu Asp Gln Ile
1 5 10 15
Glu Ser Glu Leu Gly Leu Thr Gln Asp Gln
20 25
<210> 22
<211> 4
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 实验室中制备的(GGGS)n肽接头
<400> 22
Gly Gly Gly Ser
1
<210> 23
<211> 4
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 实验室中制备的(GGSG)n肽接头
<400> 23
Gly Gly Ser Gly
1
<210> 24
<211> 5
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 实验室中制备的(GGGGS)n肽接头
<400> 24
Gly Gly Gly Gly Ser
1 5
<210> 25
<211> 7
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 实验室中制备的SGLRSGS肽接头
<400> 25
Ser Gly Leu Arg Ser Gly Ser
1 5
<210> 26
<211> 7
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 实验室中制备的YSDLDGS肽接头
<400> 26
Tyr Ser Asp Leu Asp Gly Ser
1 5

Claims (20)

1.包含由式I表示的序列的重组肽：
X1-X2-X3-X4-X5-X6-X7-X8-X9-X10-X11-X12-X13-R1
I
或其可药用盐或两性离子，其中X1、X2和X3独立地是天冬氨酸、谷氨酸或不存在；
X4和X5独立地是任何氨基酸或不存在；
X6是具有包含芳香族或杂芳族部分的侧链的氨基酸；
X7和X8独立地是任何氨基酸；
X9是具有包含无环脂肪族或芳香族部分的侧链的氨基酸；
X10、X11和X12独立地是任何氨基酸；
X13是谷氨酸或精氨酸；并且
R1是包含7至15个氨基酸的两亲性α螺旋，其中
X1、X2和X3中的至少两者选自天冬氨酸和谷氨酸。
2.如权利要求1所述的重组肽，其中X7和X8独立地是具有包含醇、无环脂肪族或羧酸部分的侧链的氨基酸。
3.如权利要求1所述的重组肽，其中X10、X11和X12独立地是具有包含醇、羧酸或酰胺部分的侧链的氨基酸。
4.如权利要求1所述的重组肽，其中R1包含由式II表示的序列：
X14-X15-X16-X17-X18-X19-X20-X21
II
其中X14和X17独立地是具有包含无环脂肪族部分的侧链的氨基酸；
X16是具有包含极性部分的侧链的氨基酸或不存在；
X15和X18-X20独立地是具有包含极性部分的侧链的氨基酸；并且
X21是具有包含无环脂肪族部分的侧链的氨基酸或不存在。
5.如权利要求4所述的重组肽，其中X14、X17和X21独立地选自由丙氨酸、异亮氨酸和亮氨酸组成的组；并且X15、X16和X18-X20独立地选自由精氨酸、天冬氨酸、谷氨酸、谷氨酰胺、赖氨酸和丝氨酸所组成的组。
6.如权利要求1所述的重组肽，其中X6是苯丙氨酸、色氨酸或酪氨酸；X7和X8独立地选自由苏氨酸、异亮氨酸、亮氨酸、缬氨酸、谷氨酸和天冬氨酸组成的组；X9是亮氨酸、异亮氨酸、缬氨酸或苯丙氨酸；并且X10、X11和X12独立地选自由天冬氨酸、谷氨酸、谷氨酰胺、丝氨酸和苏氨酸组成的组。
7.如权利要求6所述的重组肽，其中X14、X17和X21独立地选自由丙氨酸、异亮氨酸和亮氨酸组成的组；并且X15、X16和X18-X20独立地选自由精氨酸、天冬氨酸、谷氨酸、谷氨酰胺、赖氨酸和丝氨酸组成的组。
8.如权利要求1所述的重组肽，其中所述重组肽包括与SEQ ID NO：1、SEQ ID NO：2、SEQID NO：3、SEQ ID NO：12、SEQ ID NO：14、SEQ ID NO：20或SEQ ID NO：21具有至少88％序列同源性的肽。
9.如权利要求1所述的重组肽，其中所述重组肽包括具有SEQ ID NO：1、SEQ ID NO：2、SEQ ID NO：3、SEQ ID NO：12、SEQ ID NO：14、SEQ ID NO：14、SEQ ID NO：15、SEQ ID NO：16、SEQ ID NO：20或SEQ ID NO：21的肽。
10.如权利要求8所述的重组肽，其进一步包含亲和标签或可检测标记。
11.如权利要求10所述的重组肽，其中所述可检测标记选自由显色酶、放射性同位素、发色团、发光化合物、荧光化合物、磁共振成像化合物、超顺磁性粒子和超小超顺磁性粒子组成的组。
12.一种多核苷酸，其编码如权利要求1所述的重组肽。
13.一种在自噬抑制对其有益的受试者中抑制自噬的方法，所述方法包括向所述受试者施用治疗有效量的如权利要求1所述的重组肽，由此在所述受试者中抑制自噬活性。
14.如权利要求13的方法，其中R1包含由式II表示的序列：
X14-X15-X16-X17-X18-X19-X20-X21
II
其中X14和X17独立地是具有包含无环脂肪族部分的侧链的氨基酸；
X16是具有包含极性部分的侧链的氨基酸或不存在：
X15和X18-X20独立地是具有包含极性部分的侧链的氨基酸；并且
X21是具有包含无环脂肪族部分的侧链的氨基酸或不存在。
15.如权利要求13所述的方法，其中所述重组肽包括与SEQ ID NO：1、SEQ ID NO：2或SEQ ID NO：3、SEQ ID NO：12、SEQ ID NO：14、SEQ ID NO：20或SEQ ID NO：21具有至少88％序列同源性的肽。
16.如权利要求13所述的方法，其中所述重组肽包括具有SEQ ID NO：1、SEQ ID NO：2、SEQ ID NO：3、SEQ ID NO：12、SEQ ID NO：14、SEQ ID NO：14、SEQ ID NO：15、SEQ ID NO：16、SEQ ID NO：20或SEQ ID NO：21的肽。
17.一种在细胞中抑制自噬的方法，所述方法包括将所述细胞与如权利要求1所述的重组肽相接触由此在所述细胞中抑制自噬的步骤。
18.如权利要求17所述的方法，其中R1包含由式II表示的序列：
X14-X15-X16-X17-X18-X19-X20-X21
II
其中X14和X17独立地是具有包含无环脂肪族部分的侧链的氨基酸；
X16是具有包含极性部分的侧链的氨基酸或不存在；
X15和X18-X20独立地是具有包含极性部分的侧链的氨基酸；并且
X21是具有包含无环脂肪族部分的侧链的氨基酸或不存在。
19.如权利要求17所述的方法，其中所述重组肽包括与SEQ ID NO：1、SEQ ID NO：2、SEQID NO：3、SEQ ID NO：12、SEQ ID NO：14、SEQ ID NO：20或SEQ ID NO：21具有至少88％序列同源性的肽。
20.如权利要求17所述的方法，其中所述重组肽包括具有SEQ ID NO：1、SEQ ID NO：2、SEQ ID NO：3、SEQ ID NO：12、SEQ ID NO：14、SEQ ID NO：14、SEQ ID NO：15、SEQ ID NO：16、SEQ ID NO：20或SEQ ID NO：21的肽。
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