CN110910960A - 一种鲍曼不动杆菌分子血清型快速分析方法 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种鲍曼不动杆菌分子血清型快速分析方法。该方法在建立了鲍曼不动杆菌分子血清型数据库***的基础上，用户只需作简单的参数设置并上传鲍曼不动杆菌的基因组序列，***将在极短的时间内反馈该菌株的分子血清型O基因座（OCL）、K基因座（KL）或其它新的分子血清型。该方法适用于跟踪鲍曼不动杆菌种群中的K基因座、O基因座，以及新的分子血清型的出现和演变。同时，该方法将基于鲍曼不动杆菌全基因组信息，针对K基因座和O基因座的控制措施以及蛋白质结合疫苗的开发，特别是涉及鲍曼不动杆菌中新的O基因座类型上升的控制具有非常重要的作用。

Description

一种鲍曼不动杆菌分子血清型快速分析方法

技术领域

本发明涉及分子血清型分型和鉴定领域，主要应用于鲍曼不动杆的O基因座(OCL)、K基因座(KL)或其它新的分子血清型的分型分析。

背景技术

鲍曼不动杆菌(学名：Acinetobacter baumannii，俗称：AB菌)，又称鲍氏不动杆菌，属于革兰氏阴性菌，是一种严格需氧、非乳糖发酵的条件致病菌，不具鞭毛，移动性不高，但生命力极强，可广泛地存在于大自然中。

AB菌已经成为医院感染的主要来源，尤其是重症监护室。它通常会引起菌血症，肺炎，脑膜炎，腹膜炎，心内膜炎，以及泌尿道和皮肤感染。因为抗生素的滥用，导致鲍曼不动杆菌产生抗药性，变成多重抗药性鲍曼不动杆菌(MDR)。

资料表明，AB菌约占中国临床分离的不动杆菌的70％以上。AB菌对第三代和***头孢菌素的耐药率已达63.0％～89.9％。对四种氨基糖苷类(阿米卡星、庆大酶素、奈替米星、妥布霉素)和环丙沙星的耐药率菌达96.3％。我国目前的绝大多数菌株对亚胺培南、美罗培南、头孢派酮/舒巴坦和多黏菌素B保持敏感，但在呼吸道感染的治疗中效果较差。

在许多革兰氏阴性细菌中，荚膜多糖(CPS)和脂多糖(LPS)是主要的毒力因子，它们在病原体的整体适应性和毒力中起关键作用。在AB菌中也发现了两个多糖合成基因簇，第一个是用于荚膜多糖(CPS)合成和输出的K基因座，第二个是合成脂寡糖(LOS)的外囊(OC)成分的O基因座，它位于基因ilvE和aspS之间。在某些细菌中，糖基结构会被O抗原扩展以形成脂多糖(LPS)。但是，AB菌仅包含LOS。CPS对于规避宿主免疫防御至关重要，有助于抵抗抗菌化合物并促进病原体在不同环境中的存活。

CPS以及CPS生物合成的途径已被认为是抗菌策略的理想靶标，而由于其又暴露于AB菌的表面的特殊性，也非常适合开发针对鲍曼不动杆菌的疫苗。然而，多糖基因的差异表达将导致CPS结构的快速改变从而阻止抗体的识别。在AB菌中检测到荚膜成分的变化，表明胞外多糖的高表型变异。有趣的是，研究已经确定了位于AB菌的多糖基因中存在噬菌体序列，这暗示着菌株之间的水平基因转移和此类基因的扩展可能发生，从而导致了细菌菌株的毒性发生。无论是由差异表达介导还是由噬菌体介导导致这种荚膜成分的改变，都将对靶向荚膜的疫苗和噬菌体治疗产生重要影响，并会限制针对特定CPS结构的疫苗的使用。由于LPS和CPS的组成对于替代疗法的开发很重要，因此了解其结构变化的细节至关重要。为此，需要确定K基因座类型，以确定在疫苗开发过程中应使用针对哪种K基因座类型或CPS组合。此外，确定新的O和K基因座类型有助于更清晰的了解细胞表面的LOS和CPS结构对AB菌的毒力程度的影响。

近年来，高通量基因组测序技术取得了快速的发展，它具有以下优势：(i)高灵敏性，即可以发现含量极低的基因片段；(ii)高覆盖性，测序的随机性性很好，可以均匀覆盖所测的细菌基因组；(3)不断提升的检测通量和下降的检测成本。大量的科研团队利用高通量基因组测序技术开展对病原微生物的研究，推动了感染的生物学、流行病学和耐药机制的研究。以AB菌为例，截止时间到2019年5月，在NCBI公共数据中已有3519个公开基因组数据。但随着AB菌基因组数据快速增长的同时，目前却没有一个针对AB菌的K和O基因座的信息库，也没有一个可以对AB菌的K和O基因座或新型分子血清型进行分析、预测的工具。

发明内容

为了克服现有技术等不足，本发明提供一种鲍曼不动杆菌分子血清型快速分析方法，建立了针对AB菌的LOS和CPS基因座的信息库，可以对AB菌的LOS和CPS基因座或新型分子血清型进行分析、预测。

一种鲍曼不动杆菌分子血清型快速分析方法，步骤如下：

1)BauTYPE数据库构建

从公共数据库中下载鲍曼不动杆菌的基因组数据，并将基因组数据进行质控和过滤，提取鲍曼不动杆菌分子血清型基因座：O基因座(OCL)和K基因座(KL)；

2)分子血清型分析判别

上传待分析的鲍曼不动杆菌的基因组序列，与所述的BauTYPE数据库进行比对分型；

首先，利用BLASTN程序将组装好的基因组序列与鲍曼不动杆菌分子血清型数据库进行比对，寻找每个参考基因座的匹配片段；

其次，基于比对覆盖率和一致性，获得最佳匹配基因座并得到对应的查询基因组的比对片段序列信息；

然后，使用tBLASTn搜索所有基因座的蛋白基因，得到匹配基因并将其分为最佳匹配基因座基因和非最佳匹配基因座基因；

最后，根据最佳匹配基因座的比对片段信息进行可视化展示，包括基因座类型、覆盖范围、一致性和匹配的基因。

所述的质控和过滤包括去冗余处理及二次鉴定，排除公共数据库中存在的错标、污染的基因组数据。

3)新候选分子血清型的判别：

在步骤2)分子血清型分析判别后，出现在一条序列上且丢失或者增加一个或多个基因的，确定为新型血清型，进一步对不一致的片段进行其他基因座基因、NT和NR数据库的比对和注释。

所述的步骤1)提取鲍曼不动杆菌分子血清型基因座方法如下：利用CLC GenomicsWorkbench 12.0，从所下载的鲍曼不动杆菌菌株的基因组数据中获取O基因座和K基因座，并存入BauTYPE数据库。

本发明的有益效果：

目前，基于血清学的分型方法主要是根据细菌外膜蛋白抗原、脂多糖抗原的不同从而将细菌分成不同血清型的，通过对细菌进行血清学分型可对不同地区及不同医院所检出的不同菌株进行比较。缺点是分型率只能达到90％左右，有时不易获得有关分型血清，有部分菌株用现有分型血清不能作出分型鉴别。本发明通过建立AB菌的荚膜多糖(CPS)合成的K基因座和脂寡糖(LOS)合成的O基因座的DNA序列信息数据库，并将其与基于血清学的分型方法的血清型分型对应起来，从而更好地了解AB菌的表面多糖合成基因在DNA序列水平上的多样性并能够建立起一套基于DNA序列的分子血清分型技术和策略。该方法学的建立以及数据在未来不断的积累，不仅对于追溯感染源和感染途径，说明细菌的流行病学特征和有效控制感染的发生有重要指导意义，还能为针对AB菌开发高效的疫苗具有指导意义。

附图说明

图1是本发明的流程图；

图2是鲍曼不动杆菌分子血清型分析主界面；

图3是C071菌株匹配上O基因座类型、覆盖范围、一致性和匹配的基因；

图4是C071菌株匹配上K基因座类型、覆盖范围、一致性和匹配的基因。

具体实施方式

下面结合附图和实施例对本发明进行进一步描述，但本发明的保护范围并不仅限于此。

实施例1

如图1所示，本发明的流程如下：

1)获取鲍曼不动杆菌菌株的基因组序列数据；

2)利用CLC Genomics Workbench 12.0，从基因组序列数据中提取O基因座和K基因座的序列信息，并将其保存在Fasta格式，建立BauTYPE数据库；

3)将经过组装的未知分子血清型的鲍曼不动杆菌的基因组序列(C071)，通过自编的Python程序ABtypingTools进行比对分型。

ABtypingTools进行比对分型步骤如下：首先，利用BLASTN程序将组装好的基因组序列与BauTYPE数据库进行比对(e值设置为：1e-5)，寻找每个参考基因座的匹配片段。其次，基于比对覆盖率和一致性，我们获得最佳匹配基因座并得到对应的查询基因组的比对片段序列信息。根据匹配阈值，将结果分为三类：完全匹配(覆盖度＝100％，一致性＝100％)、高匹配(覆盖度>＝99，一致性>＝95)和低匹配(覆盖度<99％或一致性<95％)。然后，使用tBLASTn搜索所有基因座的蛋白基因(e值设置为：1e-5)，得到匹配基因并将其分为最佳匹配基因座基因和非最佳匹配基因座基因。最后，根据最佳匹配基因座的比对片段信息进行可视化展示。

步骤3)ABtypingTools的参数设置如下：ABtypingTools具有两个必需参数和六个可选参数。它需要两个输入文件：组装完成的基因组序列fasta文件和参考基因座数据库名称前缀。其他六个可选参数为：--outdir OUTDIR(输出文件所在目录)；--tempdir TEMPDIR(临时文件存放的文件夹)；--min_locus_cov(匹配序列的最小覆盖率，默认值：95.0％)；--min_locus_id(匹配序列的最小一致性，默认值：90.0％)；--min_gene_cov(匹配基因的最小覆盖率，默认值：99.0)；和--min_gene_id(匹配基因的最小一致性，默认值：99.0)。每次运行大约需要3分钟。

用户可选择他们想要检测的血清型(图2)。提交查询后，运行Python程序(ABtypingTools)。检测到的结果分为三类：完全匹配(覆盖度＝100％，一致性＝100％)、高匹配(覆盖度>＝99，一致性>＝95)和低匹配(覆盖度<99％或一致性<95％)。处理后的数据结果将显示在包括O或K基因座类型、覆盖范围、一致性和匹配的基因(图3和图4)。如图3和图4所示，用户使用的菌株C071，在O基因座比对取得了OCL1的“完美”评分。但是，对于K基因座，KL4的匹配比率(77.8％)和同一性(98.53％)有限。

4)新分子血清型鉴定。在此，如果在基因座区域内丢失或者增加一个或多个基因的，则可能暗示该AB菌株的基因组中存在新的基因座类型。在这种情况下，需要进一步的分析以确认新的基因座类型。

实施例2

如图1所示，流程如下：

1)获取鲍曼不动杆菌菌株的基因组序列数据；

2)从基因组序列中提取O基因座和K基因座的序列信息，并将其保存在Fasta格式，建立BauTYPE数据库；

3)将经过组装的101个已知分子血清型的鲍曼不动杆菌的基因组序列(86个K基因座和15个O基因座)，通过自编的程序ABtypingTools进行比对分型。

用户可选择他们想要检测的血清型(图2)。提交查询后，运行Python程序(ABtypingTools)。检测到的结果分为三类：完全匹配(覆盖度＝100％，一致性＝100％)、高匹配(覆盖度>＝99，一致性>＝95)和低匹配(覆盖度<99％或一致性<95％)。K基因座和O基因座与BauTYPE果有很好的一致性(86/86，100％)和(15/15，100％)(表1)。

表1使用之前报告的血清型对BauTYPE的结果进行验证

下一步从GeneBank(截止2019年5月的3516)下载了所有可用的基因组组装，然后使用BauTYPE对它们进行分型。对于O基因座类型，3516个基因组的最终分型结果如下：140个基因型与完全匹配，2870个基因型与高匹配，506个基因型与低匹配。对于K基因座类型，根据BauTYPE算法，我们得到了1009个被分析为“完美”，1698个被分析为“高”，808个被分析为“低”的结果。

4)新分子血清型鉴定。在此，如果在基因座区域内丢失或者增加一个或多个基因的，则可能暗示该AB菌株的基因组中存在新的基因座类型。在3516个AB基因组中，检测到45个新的O基因座类型(表2)，未发现新的K基因座类型。其中，67个样本属于KL9_-new1型，其中wzy基因被未知的1703bp片段所取代。37个样品属于KL2_-new2型，其中pet1基因被删除。约96％(3377/3516)AB基因组通过短读测序平台测序。由短读测序数据组装而成的contig容易被***元素破坏，不会进入新类型的分析流程。进一步的新的类型鉴定需要鲍曼杆菌更完整的基因组序列。

表2新鉴定的K基因座类型

Claims (4)

1.一种鲍曼不动杆菌分子血清型快速分析方法，其特征在于，步骤如下：

1）BauTYPE数据库构建

从公共数据库中下载鲍曼不动杆菌的基因组数据，并将基因组数据进行质控和过滤，

提取鲍曼不动杆菌分子血清型基因座： O基因座（OCL）和K基因座（KL）；

2）分子血清型分析判别

上传待分析的鲍曼不动杆菌的基因组序列，与所述的BauTYPE数据库进行比对分型；

首先，利用BLASTN程序将组装好的基因组序列与鲍曼不动杆菌分子血清型数据库进行比对，寻找每个参考基因座的匹配片段；

其次，基于比对覆盖率和一致性，获得最佳匹配基因座并得到对应的查询基因组的比对片段序列信息；

然后，使用tBLASTn搜索所有基因座的蛋白基因，得到匹配基因并将其分为最佳匹配基因座基因和非最佳匹配基因座基因；

最后，根据最佳匹配基因座的比对片段信息进行可视化展示，包括基因座类型、覆盖范围、一致性和匹配的基因。

2.根据权利要求1所述的一种鲍曼不动杆菌分子血清型快速分析方法，其特征在于，

所述的质控和过滤包括去冗余处理及二次鉴定，排除公共数据库中存在的错标、污染的基因组数据。

3.根据权利要求1所述的一种鲍曼不动杆菌分子血清型快速分析方法，其特征在于，3）新候选分子血清型的判别：

在步骤2）分子血清型分析判别后，出现在一条序列上且丢失或者增加一个或多个基因的，确定为新型血清型，进一步对不一致的片段进行其他基因座基因、NT和NR数据库的比对和注释。

4.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述的步骤1）提取鲍曼不动杆菌分子血清型基因座方法如下：利用CLC Genomics Workbench 12.0，从所下载的鲍曼不动杆菌菌株的基因组数据中获取O基因座和K基因座，并存入BauTYPE数据库。

Images