CN110904256A - 同时检测沙门氏菌、多杀性巴氏杆菌、金黄色葡萄球菌和副鸡禽杆菌的引物组及应用 - Google Patents

同时检测沙门氏菌、多杀性巴氏杆菌、金黄色葡萄球菌和副鸡禽杆菌的引物组及应用 Download PDF

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Abstract

本发明提供了一种同时检测沙门氏菌、多杀性巴氏杆菌、金黄色葡萄球菌和副鸡禽杆菌的引物组、试剂盒及应用，涉及多重PCR技术领域。本发明所述引物组的核苷酸序列如SEQ ID NO：1～8所示。本发明还提供了包括所述引物组的试剂盒以及检测方法，可特异性同时检测沙门氏菌、多杀性巴氏杆菌、金黄色葡萄球菌和副鸡禽杆菌，特异性良好，且SE、PM、SA最低检出量均为5×10‑3ng/μL，APG最低检出量为5×10‑2ng/μL，敏感性良好。

Description

同时检测沙门氏菌、多杀性巴氏杆菌、金黄色葡萄球菌和副鸡 禽杆菌的引物组及应用
技术领域
本发明属于多重PCR技术领域，具体涉及同时检测沙门氏菌、多杀性巴氏杆菌、金黄色葡萄球菌和副鸡禽杆菌的引物组及应用。
背景技术
沙门氏菌(SE，Salmonella)是引起急性胃肠炎的主要病原菌之一，具有广泛的宿主，存在于家禽、家畜、鼠类等多种动物的肠道，主要是通过污染的食物和水源摄入。本菌广泛分布于自然界，引起人类和动物的许多临床和亚临床感染症状，因此具有重要的公共卫生意义，是目前世界各国分离率最高的菌型之一。种蛋污染导致高死胚率，幼禽易感，常出现水样腹泻迅速死亡，与其他菌并发感染可引起败血症致使幼雏。该菌在外界环境中抵抗力较强，常温下可迅速繁殖、耐低温、干燥、不耐热，55℃、1小时，60℃、25分钟即可灭活；对酸敏感，pH<2的酸性环境，99％被杀灭，对紫外线和各种化学消毒剂均敏感。
金黄色葡萄球菌((SA，Staphylococcus aureus)，也称“金葡菌”，鸡和火鸡感染比较普遍，由于增重减缓、产蛋下降和屠宰加工淘汰造成一定的经济损失。临诊表现为急性败血症状、关节炎、雏鸡脐炎、皮肤(包括翼尖)坏死和骨膜炎。雏鸡感染后多为急性败血病的症状和病理变化，中雏为急性或慢性，成年鸡多为慢性。雏鸡和中雏死亡率较高，是养鸡业中危害严重的疾病之一。金黄色葡萄球菌除了作为家禽主要致病菌外，约有50％的典型或非典型金黄色葡萄球菌，产生肠毒素，在加工工程中污染家禽胴体，导致人机体出现与家禽相关的食物中毒。
副鸡禽杆菌(APG，Avibacterium paragallinarum)可引起鸡急性呼吸道疾病，称为传染性鼻炎(IC)。该病最明显的症状是包括鼻道内鼻窦的上呼吸道有浆液性或黏液性鼻分泌物流出并伴有难闻气味等鼻炎症状。IC造成最大损失是育成鸡生长不良和产蛋鸡产蛋率明显下降(10％-40％)。干燥后在鼻孔周围凝固成黄色结痂，影响呼吸，继而出现面部和结膜水肿、消瘦、下痢。目前控制鸡传染性鼻炎的主要方法是采用全菌灭活疫苗配合抗生素治疗或预防的综合措施。
多杀性巴氏杆菌(PM，Pasteurella multocida)引起的禽出血性败血症，主要侵害家禽和野禽的接触性疾病。18世纪后半叶，欧洲爆发该病，学者首次提出将其命名为禽霍乱(FC)。该病自然潜伏期一般2-9天，急性型症状包括：发热、厌食、羽毛粗乱、口鼻流出黏液性分泌物、腹泻和呼吸加快。常呈败血性症状，发病率和死亡率很高，但也常出现慢性或良性经过表现为局部感染。该病的流行季节主要为夏末、秋季和冬季。
沙门氏菌、金黄色葡萄球菌、副鸡禽杆菌和多杀巴氏杆菌感染禽只多出现腹泻、败血症和突然大量死亡的症状，为四种病的确诊带来极大的困难，目前对这四种病原的单重和双PCR方法均已有报道，但同时检测这四种病原的诊断方法还未见报道。
发明内容
有鉴于此，本发明的目的在于提供一种同时检测沙门氏菌、金黄色葡萄球菌、副鸡禽杆菌和多杀巴氏杆菌的引物组及其应用，能够通过一次PCR诊断四种病原菌，大大减少临床诊断的时间，对于饲养场实际生产、防治具有重要意义。
为了实现上述发明目的，本发明提供以下技术方案：
本发明提供了一种同时检测沙门氏菌、多杀性巴氏杆菌、金黄色葡萄球菌和副鸡禽杆菌的引物组，所述引物组中包括引物SE-F、SE-R、PM-F、PM-R、APG-F、APG-R、SA-F和SA-R，所述SE-F的核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示；所述SE-R的核苷酸序列如SEQ ID NO.2所示；所述PM-F的核苷酸序列如SEQ ID NO.3所示；所述PM-R的核苷酸序列如SEQ ID NO.4所示；所述APG-F的核苷酸序列如SEQ ID NO.5所示；所述APG-R的核苷酸序列如SEQ ID NO.6所示；所述SA-F的核苷酸序列如SEQ ID NO.7所示；所述SA-R的核苷酸序列如SEQ ID NO.8所示。
本发明还提供了一种同时检测沙门氏菌、多杀性巴氏杆菌、金黄色葡萄球菌和副鸡禽杆菌的试剂盒，包括所述引物组。
本发明还提供了一种同时检测沙门氏菌、多杀性巴氏杆菌、金黄色葡萄球菌和副鸡禽杆菌的方法，以所述引物组或所述试剂盒中的引物组为引物，以待测样本的基因组DNA为模板DNA进行四重PCR扩增，当PCR扩增条带中同时出现698bp、169bp、485bp和279bp四个特异性片段，则待测样本中同时含有沙门氏菌、多杀性巴氏杆菌、金黄色葡萄球菌和副鸡禽杆菌。
优选的，所述四重PCR扩增的体系以25μL计，包括：引物SE-F和SE-R各0.65μL，PM-F和PM-R各0.5μL，APG-F和APG-R各0.25μL，SA-F和SA-R各0.25μL，Mix 12.625μL，H206.625μL，模板DNA2.45μL。
优选的，所述引物组中各引物的工作浓度：SE-F和SE-R的浓度独立为10μM/L，PM-F和PM-R的浓度独立为10μM/L，APG-F和APG-R的浓度独立为10μM/L，SA-F和APG-R的浓度独立为10μM/L。
优选的，所述四重PCR扩增的程序包括：95℃预变性5min；95℃变性30s，55℃退火30s，72℃延伸1min，30个循环；72℃延伸10min。
相比于现有技术，本发明具有以下有益效果：本发明提供了一种同时检测沙门氏菌、多杀性巴氏杆菌、金黄色葡萄球菌和副鸡禽杆菌的引物组、试剂盒，采用本发明提供的四重PCR扩增条件，分别以双蒸水、PM+SE+APG+SA混合DNA，枯草芽孢杆菌DNA、白色葡萄球菌DNA，变形杆菌DNA、绿脓杆菌DNA为、大肠杆菌DNA、滑液囊支原体DNA、鸡毒支原体DNA模板，进行PCR扩增。结果显示，PCR能够同时扩增出约698bp、169bp、485bp和279bp四个特异性片段，枯草芽孢杆菌、白色葡萄球菌，变形杆菌、绿脓杆菌为、大肠杆菌、滑液囊支原体、鸡毒支原体和阴性对照均未扩增出目的片段，表明本实验建立的四重PCR方法具有良好的特异性；同时利用梯度稀释实验进行PM、SE、APG和SA的四重PCR，结果显示随着模板DNA浓度的逐渐减少，扩增产物的亮度逐渐降低，PM、SE和SA的最低检出量均为5×10-3ng/μL，APG最低检出量为5×10-2ng/μL，敏感性良好。
附图说明
图1为实施例1中沙门氏菌、金黄色葡萄球菌、副鸡禽杆菌、多杀性巴氏多重PCR检测特异性验证结果图；
图2为实施例2中沙门氏菌、金黄色葡萄球菌、副鸡禽杆菌、多杀性巴氏杆菌多重PCR检测敏感性验证结果。
具体实施方式
本发明提供了一种同时检测沙门氏菌、多杀性巴氏杆菌、金黄色葡萄球菌和副鸡禽杆菌的引物组，所述引物组的信息如表1所示：
表1引物组信息
Figure BDA0002326225400000041
在本发明中，所述引物组中的各引物分别根据Genbank公布的SE invA基因序列、PM KMT1基因序列、APG hagA基因序列和SAU nuc基因序列，利用PrimerPlex 2多重PCR引物设计软件设计4对引物。本发明中所述引物组由生工生物工程(上海)股份有限公司合成。
本发明还提供了一种同时检测沙门氏菌、多杀性巴氏杆菌、金黄色葡萄球菌和副鸡禽杆菌的试剂盒，包括所述引物组。
本发明还提供了一种同时检测沙门氏菌、多杀性巴氏杆菌、金黄色葡萄球菌和副鸡禽杆菌的方法，以所述引物组或所述试剂盒中的引物组为引物，以待测样本的基因组DNA为模板DNA进行四重PCR扩增，当PCR扩增条带中同时出现698bp、169bp、485bp和279bp四个特异性片段，则待测样本中同时含有沙门氏菌、多杀性巴氏杆菌、金黄色葡萄球菌和副鸡禽杆菌。
本发明所述四重PCR扩增的体系以25μL计，优选包括：引物SE-F和SE-R各0.65μL，PM-F和PM-R各0.5μL，APG-F和APG-R各0.25μL，SA-F和SA-R各0.25μL，Mix 12.625μL，H206.625μL模板DNA 2.45μL。本发明所述体系中，所述Mix优选购自宝生物工程(大连)有限公司；各菌的基因组DNA为全基因组DNA，DNA提取方法按照TIANamp Bacteria DNA Kit细菌基因组DNA提取试剂盒说明书进行，试剂盒购自天根生化科技(北京)有限公司。基因组DNA的初始浓度为5×101ng/μL，在本发明所述试方法中，所述引物组中各引物的工作浓度优选为：SE-F和SE-R的浓度独立为10μM/L，PM-F和PM-R的浓度独立为10μM/L，APG-F和APG-R的浓度独立为10μM/L，SA-F和APG-R的浓度独立为10μM/L。
本发明所述四重PCR扩增的程序优选包括：95℃预变性5min；95℃变性30s，55℃退火30s，72℃延伸1min，30个循环；72℃延伸10min。
下面结合实施例对本发明提供的同时检测沙门氏菌、多杀性巴氏杆菌、金黄色葡萄球菌和副鸡禽杆菌的引物组及其应用进行详细的说明，但是不能把它们理解为对本发明保护范围的限定。
实施例1
分别以双蒸水、PM、SE、APG、SA混合DNA，枯草芽孢杆菌DNA、白色葡萄球菌DNA，变形杆菌DNA、绿脓杆菌DNA、大肠杆菌DNA、滑液囊支原体DNA、鸡毒支原体DNA为模板，利用表1所述的引物组，构建25μL体系，进行PCR扩增：95℃预变性5min；95℃变性30s，55℃退火30s，72℃延伸1min，30个循环；72℃延伸10min。
各组体系分别为：
A：SE-F/R各0.65μL，PM-F/R各0.5μL，APG-F/R各0.25μL，SA-F/R各0.25μL，Mix12.5μL，H209.2μL；
B：SE-F/R各0.65μL，PM-F/R各0.5μL，APG-F/R各0.25μL，SA-F/R各0.25μL，Mix12.625μL，H206.625μL，DNA SE0.5μL，PM、APG，SA各0.65μL；
C：SE-F/R各0.65μL，PM-F/R各0.5μL，APG-F/R各0.25μL，SA-F/R各0.25μL，Mix12.5μL，H208.55μL，DNA PM0.65μL；
D：SE-F/R各0.65μL，PM-F/R各0.5μL，APG-F/R各0.25μL，SA-F/R各0.25μL，Mix12.5μL，H208.7μL，SE DNA 0.5μL；
E：SE-F/R各0.65μL，PM-F/R各0.5μL，APG-F/R各0.25μL，SA-F/R各0.25μL，Mix12.5μL，H208.55μL，APG DNA 0.65μL；
F：SE-F/R各0.65μL，PM-F/R各0.5μL，APG-F/R各0.25μL，SA-F/R各0.25μL，Mix12.5μL，H208.55μL，SA DNA 0.65μL；
G：SE-F/R各0.65μL，PM-F/R各0.5μL，APG-F/R各0.25μL，SA-F/R各0.25μL，Mix12.5μL，H208.7μL，枯草芽孢杆菌DNA0.5μL；
H：SE-F/R各0.65μL，PM-F/R各0.5μL，APG-F/R各0.25μL，SA-F/R各0.25μL，Mix12.5μL，H208.7μL，白色葡萄球菌DNA0.5μL；
I：SE-F/R各0.65μL，PM-F/R各0.5μL，APG-F/R各0.25μL，SA-F/R各0.25μL，Mix12.5μL，H208.7μL，变形杆菌DNA0.5μL；
J：SE-F/R各0.65μL，PM-F/R各0.5μL，APG-F/R各0.25μL，SA-F/R各0.25μL，Mix12.5μL，H208.7μL，绿脓杆菌DNA0.5μL；
K：SE-F/R各0.65μL，PM-F/R各0.5μL，APG-F/R各0.25μL，SA-F/R各0.25μL，Mix12.5μL，H208.7μL，大肠杆菌DNA0.5μL；
L：SE-F/R各0.65μL，PM-F/R各0.5μL，APG-F/R各0.25μL，SA-F/R各0.25μL，Mix12.5μL，H208.7μL，滑液囊支原体DNA0.5μL；
M：SE-F/R各0.65μL，PM-F/R各0.5μL，APG-F/R各0.25μL，SA-F/R各0.25μL，Mix12.5μL，H208.7μL，鸡毒支原体DNA0.5μL。
经上述组合经过PCR后得到的扩增产物用2％琼脂糖凝胶电泳检测，结果如图1所示：PCR能够同时扩增出约698bp、169bp、485bp和279bp四个特异性片段，枯草芽孢杆菌、白色葡萄球菌，变形杆菌、绿脓杆菌、大肠杆菌、滑液囊支原体、鸡毒支原体和阴性对照均未扩增出目的片段，表明本实验建立的四重PCR方法具有良好的特异性。
实施例2
分别调整PM，SE，APG，SA初始浓度为5×101ng/μL，分别取100μL PM、SE、APG、SA等体积混合后进行10倍梯度稀释(100～10-7)，后每个稀释度SE取0.5μL，PM、SA和APG取0.65μL混合作为模板，按照上述四重PCR条件进行扩增，检测其对PM、SE、APG、SA的最低检出量，评价其敏感性。
结果如图2所示，其中M：DL2000 Marker，1：阴性对照、2：5×101、3：5×100、4：5×10-1、5：5×10-2、6：5×10-3、7：5×10-4、8：5×10-5、9：5×10-6、10：5×10-7ng/μL，随着浓度的逐渐减少，扩增产物的亮度逐渐降低，泳道6中已无APG扩增条带，说明APG最低检出量为5×10-2ng/μL，泳道7中已无扩增条带，说明PM、SE和SA的最低检出量均为5×10-3ng/μL，敏感性良好。
以上所述仅是本发明的优选实施方式，应当指出，对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明原理的前提下，还可以做出若干改进和润饰，这些改进和润饰也应视为本发明的保护范围。
序列表
<110> 内蒙古自治区农牧业科学院
内蒙古农业大学
<120> 同时检测沙门氏菌、多杀性巴氏杆菌、金黄色葡萄球菌和副鸡禽杆菌的引物组及应用
<160> 8
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 22
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 1
gtcctccgct ctgtctactt at 22
<210> 2
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 2
actgactgct accttgctga t 21
<210> 3
<211> 22
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 3
gtgttgagtc aatctgcttc ct 22
<210> 4
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 4
gctctgtcgt taatggcttc a 21
<210> 5
<211> 22
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 5
cctaatcaga cgcacgaaca ta 22
<210> 6
<211> 22
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 6
atcacttctt gagcaacacc tt 22
<210> 7
<211> 22
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 7
gcgattgatg gtgatacggt ta 22
<210> 8
<211> 19
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 8
agccaagcct tgacgaact 19

Claims (6)

1.一种同时检测沙门氏菌、多杀性巴氏杆菌、金黄色葡萄球菌和副鸡禽杆菌的引物组，其特征在于，所述引物组中包括引物SE-F、SE-R、PM-F、PM-R、APG-F、APG-R、SA-F和SA-R，所述SE-F的核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示；所述SE-R的核苷酸序列如SEQ ID NO.2所示；所述PM-F的核苷酸序列如SEQ ID NO.3所示；所述PM-R的核苷酸序列如SEQ ID NO.4所示；所述APG-F的核苷酸序列如SEQ ID NO.5所示；所述APG-R的核苷酸序列如SEQ ID NO.6所示；所述SA-F的核苷酸序列如SEQ ID NO.7所示；所述SA-R的核苷酸序列如SEQ ID NO.8所示。
2.一种同时检测沙门氏菌、多杀性巴氏杆菌、金黄色葡萄球菌和副鸡禽杆菌的试剂盒，其特征在于，包括权利要求1所述引物组。
3.一种同时检测沙门氏菌、多杀性巴氏杆菌、金黄色葡萄球菌和副鸡禽杆菌的方法，其特征在于，以权利要求1所述引物组或权利要求2所述试剂盒中的引物组为引物，以待测样本的基因组DNA为模板DNA进行四重PCR扩增，当PCR扩增条带中同时出现698bp、169bp、485bp和279bp四个特异性片段，则待测样本中同时含有沙门氏菌、多杀性巴氏杆菌、金黄色葡萄球菌和副鸡禽杆菌。
4.根据权利要求3所述方法，其特征在于，所述四重PCR扩增的体系以25μL计，包括：引物SE-F和SE-R各0.65μL，PM-F和PM-R各0.5μL，APG-F和APG-R各0.25μL，SA-F和SA-R各0.25μL，Mix 12.625μL，H206.625μL，模板DNA2.45μL。
5.根据权利要求3所述方法，其特征在于，所述引物组中各引物的工作浓度：SE-F和SE-R的浓度独立为10μM/L，PM-F和PM-R的浓度独立为10μM/L，APG-F和APG-R的浓度独立为10μM/L，SA-F和APG-R的浓度独立为10μM/L。
6.根据权利要求3所述方法，其特征在于，所述四重PCR扩增的程序包括：95℃预变性5min；95℃变性30s，55℃退火30s，72℃延伸1min，30个循环；72℃延伸10min。
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