CN110894221A - 草莓成熟相关转录因子基因FaNAC2及其应用 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种草莓成熟相关转录因子基因FaNAC2及其应用。本发明克隆得到一个新基因FaNAC2，并首次发现草莓FaNAC2基因能负调控草莓果实成熟，并且与脱落酸信号途径关键基因表达相关。抑制FaNAC2在草莓果实中的表达，能加速果实成熟的进程。因此，通过合理利用该基因可以调节草莓晚熟品种的果实上市时间，为草莓生产服务。本发明为利用基因工程技术调控果实成熟进程提供了理论依据与技术手段，因此在调控草莓晚熟品种果实上市时间具有重大的应用价值。

Description

草莓成熟相关转录因子基因FaNAC2及其应用

技术领域

本发明涉及生物基因工程技术领域，具体涉及一种草莓成熟相关转录因子基因FaNAC2及其应用。

背景技术

作为城市高端水果，草莓近年来已经成为设施农业的重要栽培作物，其营养丰富，口味鲜美，深受大众喜爱。然而，在草莓实际生产中存在的主要问题就是栽培草莓的优良品种过于单一，供应季短。应用遗传工程改良作物品种是未来的研究方向之一，挖掘重要品质调控基因是各国竞相角逐的前沿领域。因此，如何应用遗传工程改良草莓品种是未来生产中亟待解决的问题。

果实成熟是一个复杂的生理生化过程，伴随果实成熟果实内部发生着剧烈的变化。果实成熟的过程受植物激素和转录因子共同调控。在跃变型果实(如苹果、番茄、香蕉)中，植物乙烯是诱导果实成熟的关键因子。对于非跃变型果实(如草莓、葡萄、橘子)，脱落酸在果实成熟中起重要作用。脱落酸能促进果实内部糖类代谢和积累，外源脱落酸试剂喷施草莓果实，果实能提前成熟。近年来，研究发现在乙烯、脱落酸等植物激素信号途径的上游存在的某些重要的转录因子，也能直接或间接调控果实成熟相关基因的表达，调控果实成熟。例如转录因子CNR、RIN和NOR是目前在番茄果实成熟中发现的最重要的成熟相关转录因子。RIN转录因子缺失突变的番茄果实不能正常成熟，应用RIN位点培育的耐贮番茄品种显著提高了番茄果实的货架寿命。然而，对于非跃变型果实的成熟相关转录因子的发掘，目前研究还存在很多不足。

发明内容

本发明的目的是提供一种草莓成熟相关转录因子基因FaNAC2及其应用。

第一方面，本发明首先保护FaNAC2蛋白或其编码基因在调控草莓果实成熟中的应用；所述FaNAC2蛋白是如下(A1)或(A2)或(A3)或(A4)的蛋白质：

(A1)氨基酸序列为序列表的序列2的蛋白质；

(A2)将序列2所示的氨基酸序列经过一个或几个氨基酸残基的取代和/或缺失和/或添加且具有相同功能的蛋白质；

(A3)与(A1)-(A2)中任一所限定的氨基酸序列具有99％以上、95％以上、90％以上、85％以上或者80％以上同一性且具有相同功能的蛋白质；

(A4)在(A1)-(A3)中任一所限定的蛋白质的N端和/或C端连接蛋白标签后得到的融合蛋白。

所述FaNAC2蛋白来源于八倍体红颜草莓。

上述FaNAC2蛋白可人工合成，也可先合成其编码基因，再进行生物表达得到。

上述FaNAC2蛋白中，蛋白标签(protein-tag)是指利用DNA体外重组技术，与目的蛋白一起融合表达的一种多肽或者蛋白，以便于目的蛋白的表达、检测、示踪和/或纯化。所述蛋白标签可为Flag标签、His标签、MBP标签、HA标签、myc标签、GST标签和/或SUMO标签等。

上述FaNAC2蛋白中，同一性是指氨基酸序列的同一性。可使用国际互联网上的同源性检索站点测定氨基酸序列的同一性，如NCBI主页网站的BLAST网页。例如，可在高级BLAST2.1中，通过使用blastp作为程序，将Expect值设置为10，将所有Filter设置为OFF，使用BLOSUM62作为Matrix，将Gap existence cost，Per residue gap cost和Lambda ratio分别设置为11，1和0.85(缺省值)并进行检索一对氨基酸序列的同一性进行计算，然后即可获得同一性的值(％)。

上述应用具体可体现为：所述FaNAC2蛋白或其编码基因在草莓中的活性和/或表达量越低，草莓成熟度越高或成熟速度越快。

本发明还保护FaNAC2蛋白或其编码基因的应用，为如下(C1)-(C5)中的至少一种：

(C1)调控草莓果实中糖含量；

(C2)调控草莓果实中有机酸含量；

(C3)调控草莓果实中花青苷含量；

(C4)调控草莓果实成熟相关基因的表达；

(C5)调控ABA信号途径关键基因的表达。

所述FaNAC2蛋白如前文所述。

所述应用具体可体现为：所述FaNAC2蛋白或其编码基因在草莓中的活性和/或表达量越低，草莓果实中糖含量越高；所述FaNAC2蛋白或其编码基因在草莓中的活性和/或表达量越低，草莓果实中有机酸含量越低；所述FaNAC2蛋白或其编码基因在草莓中的活性和/或表达量越低，草莓果实中花青苷含量越高。

所述糖含量具体可为蔗糖含量。

所述草莓果实成熟相关基因包括花青苷代谢相关酶基因(FaCHS、FaUFGT、FaDFR)、芳香形成关键酶基因(FaQR、FaOMT)、软化关键酶基因(FaPE、FaPL、FaPG)和蔗糖合成相关酶基因(FaSS、FaSPS1、FaSUT1)。

所述ABA信号途径关键基因包括FaABI1、FaABI4、FaPYR1、FaABI5、FaSnRK2E、FaABI3、FaNCED1和FaABAR。

第二方面，本发明保护一种促进草莓果实成熟的方法，包括如下步骤：抑制目的草莓果实中FaNAC2蛋白的活性和/或表达量。

本发明还保护一种促进草莓果实成熟的方法，包括如下步骤：抑制目的草莓果实中FaNAC2蛋白的编码基因表达。

所述FaNAC2蛋白如前文所述。

所述FaNAC2蛋白的编码基因为如下(B1)-(B3)任一所示：

(B1)序列表中序列1所示的DNA分子；

(B2)编码序列是序列表中序列1所示的DNA分子；

(B3)在严格条件下与B1)或B2)限定的DNA分子杂交，且编码相同功能蛋白质的DNA分子。

上述严格条件可为50℃，在7％十二烷基硫酸钠(SDS)、0.5M Na₃PO₄和1mM EDTA的混合溶液中杂交，在50℃，2×SSC，0.1％SDS中漂洗；还可为：50℃，在7％SDS、0.5M Na₃PO₄和1mM EDTA的混合溶液中杂交，在50℃，1×SSC，0.1％SDS中漂洗；还可为：50℃，在7％SDS、0.5M Na₃PO₄和1mM EDTA的混合溶液中杂交，在50℃，0.5×SSC，0.1％SDS中漂洗；还可为：50℃，在7％SDS、0.5M Na₃PO₄和1mM EDTA的混合溶液中杂交，在50℃，0.1×SSC，0.1％SDS中漂洗；还可为：50℃，在7％SDS、0.5M Na₃PO₄和1mM EDTA的混合溶液中杂交，在65℃，0.1×SSC，0.1％SDS中漂洗；也可为：在6×SSC，0.5％SDS的溶液中，在65℃下杂交，然后用2×SSC，0.1％SDS和1×SSC，0.1％SDS各洗膜一次。

所述“抑制目的草莓果实中FaNAC2蛋白的编码基因的表达”是通过向目的草莓中导入干扰载体实现的；所述干扰载体包括特异DNA分子；所述特异DNA分子包括区段甲和区段乙；所述区段甲和所述区段乙为反向互补序列；所述区段甲的序列如序列表中序列1自5’端第615位至960位所示。

所述干扰载体具体可为向pK7GWIWG2D(II)载体的正向attB1和attB2之间***了序列1自5’端第615位至960位所示的DNA分子，并且向pK7GWIWG2D(II)载体的反向attB1和attB2之间***了序列1自5’端第615位至960位的反向互补序列得到的干扰载体。

在上述方法中，将所述干扰载体导入所述目的草莓，具体可为：通过使用Ti质粒、Ri质粒、植物病毒载体、直接DNA转化、显微注射、电导、农杆菌介导等常规生物学方法转化草莓细胞或组织，并将转化的草莓组织培育成植株。

本发明还保护上述干扰载体。

第三方面，本发明保护FaNAC2蛋白或其编码基因，或，以上任一所述的方法，或，所述干扰载体在草莓育种中的应用。

所述育种的目的是为了选育成熟度高或成熟速度快的草莓。

以上各方面中，所述草莓具体为八倍体草莓，更具体为红颜草莓。

本发明克隆得到一个新基因FaNAC2，并首次发现草莓FaNAC2基因能负调控草莓果实成熟，并且与脱落酸信号途径关键基因表达相关。抑制FaNAC2在草莓果实中的表达，能加速果实成熟的进程。因此，通过合理利用该基因可以调节草莓晚熟品种的果实上市时间，为草莓生产服务。本发明为利用基因工程技术调控果实成熟进程提供了理论依据与技术手段，因此在调控草莓晚熟品种果实上市时间具有重大的应用价值。

附图说明

图1为FaNAC2的RT-PCR扩增电泳图。

图2为FaNAC2的转录活性分析结果图。

图3为FaNAC2-RNAi图谱及FaNAC2-RNAi果实特征。

图4为FaNAC2-RNAi果实的品质变化和成熟相关基因的表达。

图5为FaNAC2调控果实成熟的可能机制分析。

具体实施方式

以下的实施例便于更好地理解本发明，但并不限定本发明。下述实施例中的实验方法，如无特殊说明，均为常规方法。下述实施例中所用的试验材料，如无特殊说明，均为自常规生化试剂商店购买得到的。以下实施例中的定量试验，均设置三次重复实验，结果取平均值。

草莓红颜：小汤山特菜大观园。

pEAQ-BD载体：参考文献：Feng B,Han Y,Xiao Y,et al.The Banana Fruit DofTranscription Factor MaDof23 Acts as a Repressor and Interacts with MaERF9 inRegulating Ripening-related Genes[J].JOURNAL OF EXPERIMENTAL BOTANY,2016,8.；公众可以从中国科学院植物研究所获得。

pEAQ-BD-VP16载体：参考文献：Feng B,HanY,Xiao Y,et al.The Banana FruitDof Transcription Factor MaDof23 Acts as a Repressor and Interacts withMaERF9 in Regulating Ripening-related Genes[J].JOURNAL OF EXPERIMENTALBOTANY,2016,8.；公众可以从中国科学院植物研究所获得。

双荧光报告基因载体(pGreen II 0800-LUC)：参考文献：Feng B,HanY,Xiao Y,etal.The Banana Fruit Dof Transcription Factor MaDof23 Acts as a Repressor andInteracts with MaERF9 in Regulating Ripening-related Genes[J].JOURNAL OFEXPERIMENTAL BOTANY,2016,8.；公众可以从中国科学院植物研究所获得。

农杆菌GV3101：北京庄盟国际生物基因科技有限公司。

pK7GWIWG2D(II)载体：参考文献：Feng B,Han Y,Xiao Y,et al.The BananaFruit Dof Transcription Factor MaDof23 Acts as a Repressor and Interacts withMaERF9 in Regulating Ripening-related Genes[J].JOURNAL OF EXPERIMENTALBOTANY,2016,8.；公众可以从中国科学院植物研究所获得。

烟草：参考文献：Feng B,Han Y,Xiao Y,et al.The Banana FruitDofTranscription Factor MaDof23 Acts as a Repressor and Interacts with MaERF9in Regulating Ripening-related Genes[J].JOURNAL OF EXPERIMENTAL BOTANY,2016,8.；公众可以从中国科学院植物研究所获得。

实施例1、草莓成熟相关转录因子基因FaNAC2的获得

提取八倍体草莓红颜果实的总RNA，并反转录为cDNA。经过大量序列分析与功能验证，从cDNA中发现了一个草莓成熟相关转录因子基因FaNAC2，如序列表的序列1所示，其编码的蛋白质如序列表的序列2所示。

实施例2、草莓FaNAC2转录因子的转录活性分析

一、重组表达载体的构建

1、pMD19T-FaNAC2重组表达载体的构建

(1)提取八倍体草莓红颜果实的总RNA，并反转录为cDNA，以所述cDNA为模板，采用引物FaNAC2-F和引物FaNAC2-R组成的引物对利用高保真酶(I-5 TM2x High-FidelityMaster Mix，擎科生物)进行PCR扩增，得到PCR扩增产物。

FaNAC2-F:5’-ATGGAGAGCACCGACTCG-3’；

FaNAC2-R:5’-CTAAGAATACCAATTCCCCGGAAG-3’。

PCR反应体系为：cDNA模板100ng，正反向各引物(10μM)2μL，I-5 TM2x High-Fidelity Master Mix 25μL，水补齐至50μL。

PCR反应程序设置为：98℃2min；98℃10s，56℃15s，72℃15s，共35个循环；72℃终延伸5min。

将扩增产物在1％的琼脂糖凝胶上电泳检测。结果发现在1000bp处有一条目的条带，如附图1所示。

(2)将步骤(1)得到的扩增产物进行回收并纯化后与载体pMD19T(TaKaRa，大连)按照TA克隆的原理进行连接，构建pMD19T-FaNAC2重组质粒(已经测序验证，pMD19T-FaNAC2重组质粒含有序列1所示的DNA分子)。

2、pEAQ-BD-FaNAC2重组表达载体的构建

(1)以步骤1得到的pMD19T-FaNAC2重组质粒为模板，采用引物FaNAC2-BD-F和引物FaNAC2-BD-R组成的引物对进行PCR扩增，得到PCR扩增产物。

FaNAC2-BD-F:5’-TTGACTGTATCGCCGACCGGTATGGAGAGCACCGACTCG-3’；

FaNAC2-BD-R:5’-TGAAACCAGAGTTAAAGGCCTCTAAGAATACCAATTCCCCGGAAG-3’。

(2)将步骤(1)得到的PCR扩增产物纯化后，利用同源重组酶(In-Fusion HDCloning，TaKaRa，大连)按照同源重组克隆原理连接于pEAQ-BD载体，形成pEAQ-BD-FaNAC2重组表达载体(已经测序验证，pEAQ-BD-FaNAC2重组表达载体含有序列1所示的DNA分子)。

3、pEAQ-BD-VP16-FaNAC2重组表达载体

(1)以步骤1得到的pMD19T-FaNAC2重组质粒为模板，采用引物VP16-FaNAC2-BD-F和引物FaNAC2-BD-R组成的引物对进行PCR扩增，得到PCR扩增产物。

VP16-FaNAC2-BD-F:5’-TTGACGAGTACGGTGGGACCGGTATGGAGAGCACCGACTCG-3’；

VP16-FaNAC2-BD-R:5’-AATGAAACCAGAGTTAAAGGCCTCTAAGAATACCAATTCCCCGGAAG-3’。

(2)将步骤(1)得到的PCR扩增产物纯化后，利用同源重组酶(In-Fusion HDCloning，TaKaRa，大连)按照同源重组克隆原理连接于pEAQ-BD-VP16载体，形成pEAQ-BD-VP16-FaNAC2重组表达载体(已经测序验证，pEAQ-BD-VP16-FaNAC2重组表达载体含有序列1所示的DNA分子)。

pEAQ-BD-VP16-FaNAC2载体中含有VP16转录激活因子，能高效激活下游报告基因表达，通常用作转录活性分析试验的正对照蛋白；将转录因子与VP16蛋白融合表达后，通过VP16激活能力的变化可以判断转录因子的激活或抑制活性。

二、草莓FaNAC2转录因子的转录活性分析

采用烟草瞬时转化和双荧光检测实验方法检测FaNAC2转录因子的转录活性。

双荧光报告基因载体(pGreen II 0800-LUC)含有萤火虫荧光素酶(LUC)和海肾荧光素酶(REN)两套荧光素报告基因。将含待检测转录因子的植物表达载体与双荧光报告基因载体共同瞬时转化烟草叶片，烟草荧光的强度可以反映转录因子对下游靶基因的转录/和抑制活性。

实验分为如下四组：

实验组1：pEAQ-BD-FaNAC2重组载体与pGreen II 0800-LUC载体共表达；

实验组2：pEAQ-BD-VP16-FaNAC2重组载体与pGreenII 0800-LUC载体共表达；

阳性对照组：pEAQ-BD-VP16载体与pGreen II 0800-LUC载体共表达；

阴性对照组：pEAQ-BD空载体与pGreen II 0800-LUC载体共表达。

实验中使用的载体示意图见图2A。

具体实验方法如下(以实验组1为例说明，其余各组方法相同，仅进行载体的替换)：

1、将pEAQ-BD-FaNAC2重组载体与pGreen II 0800-LUC载体分别利用冻融法转化农杆菌GV3101，经过LB固体培养基(含50mg/L卡那霉素、50mg/L利福平、50mg/L链霉素)筛选培养后，挑取阳性菌落至LB液体培养基(含50mg/L卡那霉素、50mg/L利福平、50mg/L链霉素)培养至菌液浓度达到OD₆₀₀＝1时，用室温5000g离心10min收集细菌，并用等体积转化液(含10mM MES缓冲液pH5.6、10mM氯化镁、200μM乙酰丁香酮)将菌体洗涤和重悬。

2、完成步骤1后，将两种重组菌菌液按照1:8(pEAQ-BD-FaNAC2:pGreen II0800-LUC)的体积比例混合，并用1ml微量注射器从两周大的烟草叶片的背面注射叶片，注射结束后培养两天。

3、完成步骤3后，剪取烟草叶片，利用Dual-Luciferase ReporterAssay System试剂盒(Promega)在Tanon化学发光仪(天能科技，上海)上观察荧光。具体方法为，在烟草叶片背面均匀涂抹发光底物试剂(30μL Luciferin母液+1μL 10％Triton X 100+1000μLddH₂O)，避光孵育3-6min，使用化学发光仪暗室发光进行荧光检测。

上述四个实验组结果如图2B所示。结果显示，FaNAC2对下游LUC报告基因有抑制作用，而且FaNAC2与VP16融合后降低了VP16蛋白的激活作用，说明FaNAC2是转录负调控因子。

实施例3、FaNAC2在调控草莓果实成熟过程中的应用

一、FaNAC2干扰表达载体的构建

(1)以步骤1得到的pMD19T-FaNAC2重组质粒为模板，采用引物FaNAC2-RNAi-F和引物FaNAC2-RNAi-R组成的引物对进行PCR扩增，得到PCR扩增产物。

FaNAC2-RNAi-F:5’-GTCGTTTCCCCTGTC-3’；

FaNAC2-RNAi-R:5’-CAGCATTGGCTGCTGGT-3’。

(2)将步骤(1)得到的扩增产物回收并纯化后连入PCR8/GW/TOPO TACLONE克隆载体(Invitrogen)。再利用LR重组酶(LR Clonase II Ezyme mix，Invitrogen)通过GATEWAY克隆的方法连入pK7GWIWG2D(II)载体，得到pK7G-FaNAC2干扰载体。对pK7G-FaNAC2干扰载体描述如下：向pK7GWIWG2D(II)载体的正向attB1和attB2之间***了序列1自5’端第615位至960位所示的DNA分子，并且向pK7GWIWG2D(II)载体的反向attB1和attB2之间***了序列1自5’端第615位至960位的反向互补序列(已经测序验证，示意图见图3A)。

二、重组农杆菌的制备和草莓果实瞬时转化

1、将步骤一得到的pK7G-FaNAC2干扰载体转化农杆菌GV3101，挑取阳性克隆接种至20mL LB培养基中(含50mg/L卡那霉素、50mg/L利福平和50mg/L链霉素)，28℃、200rpm(转/分钟)摇菌至OD₆₀₀＝0.6，以5000g离心10min收集菌液。用20mL转化液(10mM MgCl2，10mM MES，PH＝5.6，200μM乙酰丁香酮)悬浮菌体，在室温条件下，以5000g离心10min收集菌液；再20mL用转化液重新悬浮菌体，将农杆菌菌液在室温静置2h以上。

2、将步骤1得到的农杆菌菌液通过注射法侵染红颜草莓果实。具体方法为：利用1ml无菌微量注射器，在草莓绿果期于果实中轴处注射，直至果实呈现水渍状。注射后果实放置在室温，相对湿度70-90％，每天观察。

参照上述方法将pK7GWIWG2D(II)载体(空载体对照)转化草莓果实，每天观察。

注射完成5天后，取果实，提取总RNA并反转录为cDNA。以所述cDNA为模板，利用荧光定量试剂(SYBR Premix Ex TaqTM，TaKaRa)在荧光定量PCR仪上(STEPONE PLUS，ABI，美国)检测FaNAC2基因的表达变化。

用于检测FaNAC2基因的qRT-PCR引物为FaNAC2-qRT-PCR-F(5’-CGGAGCACGGCCTAATAGAG-3’)和FaNAC2-qRT-PCR-R(5’CCAACTTTCCGAGTACCCCC-3’)。

内参为FaACTIN基因，其引物为FaACTIN-qRT-PCR-F(5’-GCCAACCGTGAGAAGATG-3’)和FaACTIN-qRT-PCR-R(5’-TCCAGAGTCAAGAACA-3’)。

反应体系为：模板2μL，SYBR Mix 10μL，正反向引物各0.8μL，Rox 0.8μL，灭菌双蒸水补齐至20μL。反应程序为：98℃10min；95℃15S，60℃30S，40个循环；72℃5min；95℃1min，融解曲线分析为***默认设置。

每种果实检测30个。

结果如图3B所示。结果显示，相比于转入空载体的草莓果实，转入pK7G-FaNAC2载体的草莓果实注射后的着色明显加速。同时，在注射pK7G-FaNAC2载体后的果实中，FaNAC2基因表达量显著低于对照果实。野生型红颜草莓果实表型及FaNAC2基因表达量与转入空载体的草莓果实无显著差异。

上述结果说明瞬时RNAi干扰实验成功抑制了FaNAC2基因的表达，FaNAC2基因对于草莓果实成熟具负调控作用。

三、FaNAC2-RNAi果实品质检测

草莓果实的风味品质是由糖和有机酸含量决定的，通常糖酸比值越高口感越好。

花青素的含量决定了草莓果实的色泽品质。

待测果实：步骤二得到的FaNAC2-RNAi果实、转入空载体的对照草莓果实和野生型红颜草莓果实(每种检测5-6个果实)。

1、蔗糖含量检测

称取0.1-0.2g待测果实，利用植物蔗糖含量检测试剂盒(索来宝生物，中国)对草莓果实的蔗糖含量进行测定和计算。

2、有机酸含量检测

称取1g待测果实，加入6ml蒸馏水匀浆，将匀浆液在75^-80℃水浴中加热30min，立即冷却，再定容至10ml。13000rpm离心10min，弃除沉淀，加入酚酞50μl，用0.1mol/L氢氧化钠标准溶液滴定至刚到浅红色为止。酸的含量计算公式为：

X％＝M×V×K×5/W×100；

公式中：X-总酸度百分含量；V-滴定时消耗NaOH亳升数；M-NaOH溶液的摩尔浓度；W-样品重量；K-换算为适当酸度系数(柠檬酸为-0.070)。

3、花青素含量检测

将待测果实用液氮速冻后磨成粉末，称取0.1g粉末，加入10ml花色素提取液(1％HCl甲醇)混匀，在4℃浸提24h。14000rpm离心15min弃除沉淀，用比色法对上清中花色素苷进行定量。紫外分光光度计波长设定为530nm和600nm，花色素提取液为空白对照，花青素含量计算公式为：

ΔA＝A530-A600公式A

C＝10×ΔA×n×V/W公式B

公式中：C-果实中花青素的含量(U/gFW)；n为稀释倍数；V-样品提取液总体积(mL)；W-样品鲜重(g)。

结果如图4A所示。结果显示，FaNAC2-RNAi果实的糖和花青苷显著高于转空载体对照果实，而有机酸的含量显著低于对照果实，野生型果实与转空载体对照果实的检测结果无显著性差异。

上述结果说明抑制FaNAC2表达，果实加速成熟，果实品质提前形成。

四、FaNAC2-RNAi果实成熟相关基因检测

待测果实：步骤二得到的FaNAC2-RNAi果实、转入空载体的对照草莓果实和野生型红颜草莓果实(每种检测5-6个果实)。

采用实时荧光定量RT-PCR的检测方法，对待测果实的品质形成关键基因进行了检测，包括花青苷代谢相关酶基因(FaCHS、FaUFGT、FaDFR)芳香形成关键酶基因(FaQR、FaOMT)、软化关键酶基因(FaPE、FaPL、FaPG)，蔗糖合成相关酶基因(FaSS、FaSPS1、FaSUT1)等。所用引物如下所示：

FaCHS-qRT-PCR-F：5’-CATACCCCGACTACTACTTTCGT-3’

FaCHS-qRT-PCR-R：5’-CGCACATACTGGGATTCTCTT-3’

FaUFGT-qRT-PCR-F：5’-TAGAGGATGTGTGGAAGATTGGT-3’

FaUFGT-qRT-PCR-R：5’-CTGTTGTGCGAGTTGTTTTAGTG-3’

FaDFR-qRT-PCR-F：5’-ACCCTGAGAACGAAGTGATAAAG-3’

FaDFR-qRT-PCR-R：5’-TAAACACCACCCTCCGAACT-3’

FaQR-qRT-PCR-F：5’-CACTGACTCTCCCCTACCTACAAT-3’

FaQR-qRT-PCR-R：5’-ATACACTTCATCCCCCACCTTA-3’

FaOMT-qRT-PCR-F：5’-CACCAAGGGAGTTGTCCAT-3’

FaOMT-qRT-PCR-R：5’-GTTGAAAGCATCACAGCAGAC-3’

FaPE-qRT-PCR-F：5’-GGTTTCTACTGGTGCTGGTTTT-3’

FaPE-qRT-PCR-R：5’-CTCGGACTGTATCGTGTTGC-3’

FaPL-qRT-PCR-F：5’-CTCGGACTGTATCGTG-3’

FaPL-qRT-PCR-R：5’-GAATGCTCGTATCAACCAGAGA-3’

FaPG-qRT-PCR-F：5’-GCAAGTAGAGTCGCACAGTTTT-3’

FaPG-qRT-PCR-R：5’-TCAGTATTAGGCTTCCCACCA-3’

FaSS-qRT-PCR-F：5’-CCCTGATTCTGACCTTTACTGG-3’

FaSS-qRT-PCR-R：5’-GATGATGAAGTCGGTGTGGTT-3’

FaSUT1-qRT-PCR-F：5’-GAGTGTTTGTGT TTGGGTTTTG-3’

FaSUT1-qRT-PCR-R：5’-CGATGGTCCTTTC CAGTGA-3’

FaSPS1-qRT-PCR-F：5’-CGTAGATTGGAGTTATGGAGAGC-3’

FaSPS1-qRT-PCR-R：5’-CGAATGATGTAAGAACCACTGC-3’

FaGAL2-qRT-PCR-F：5’-GAGGGAAGGAACGATTTGG-3’

FaGAL2-qRT-PCR-R：5’-ACAGAGGAAAGCCACCGTAA-3’。

结果如图4B所示。结果显示，与转空载体果实相比，抑制FaNAC2的表达，这些成熟相关品质合成基因的表达量大多数显著上调。野生型果实与转空载体对照果实的检测结果无显著性差异。

上述结果说明FaNAC2基因在果实成熟过程中对成熟相关基因的表达具有重要调控作用。

五、FaNAC2调控果实成熟的可能机制

1、关键基因表达检测

待测果实：步骤二得到的FaNAC2-RNAi果实、转入空载体的对照草莓果实和野生型红颜草莓果实(每种检测5-6个果实)。

一般认为脱落酸(ABA)信号途径是调控草莓果实成熟的重要机制。采用实时荧光定量RT-PCR的检测方法，对待测果实的ABA信号途径关键组分基因进行了表达检测，包括FaABI1、FaABI4、FaPYR1、FaABI5、FaSnRK2E、FaABI3、FaNCED1和FaABAR等基因。

所用引物如下所示：

FaABI1-qRT-PCR-F：5’-GCTACACTCGCAACCAAAATC-3’

FaABI1qRT-PCR-R：5’-TGGAATAATCCAGGGTTTCA-3’

FaABI4-qRT-PCR-F：5’-TCCTCATCACCACCGTCTT-3’

FaABI4-qRT-PCR-R：5’-ACTCTGGCTCGTTTGCTCT-3’

FaPYR1-qRT-PCR-F：5’-AAACCTTGTTCCGCTCCT-3’

FaPYR1-qRT-PCR-R：5’-CAATGGCAATCTCCCTCC-3’

FaABI5-qRT-PCR-F：5’-GGAGCTGGCAATGGTCG-3’

FaABI5-qRT-PCR-R：5’-AGGCCCGCCTTTCCTT-3’

FaSnRK2E-qRT-PCR-F：5’-TAGAGGATGTGTGGAAGATTGGT-3’

FaSnRK2E-qRT-PCR-R：5’-ACCCCACAAGACCAGACATC-3’

FaABI3-qRT-PCR-F：5’-CGGCGCCTGTATTAGTCCC-3’

FaABI3-qRT-PCR-R：5’-TGCAGTCTCCAGCGTTTGAT-3

FaNCED1-qRT-PCR-F：5’-ACTGCTTCTGCTTCCATCTCT-3’

FaNCED1-qRT-PCR-R：5’-AGACACTCGTCGCATTCATT-3

FaABAR-qRT-PCR-F：5’-TCCTCATGGAATGATGAGAAGC-3’

FaABAR-qRT-PCR-R：5’-GTGGTGGTGTCAGCAATGTAAG-3。

结果如图5A所示。结果显示，与转空载体果实相比，抑制FaNAC2的表达，FaABI4、FaABI5、FaSnRK2E和FaABAR的基因表达显著上调。野生型果实与转空载体对照果实的检测结果无显著性差异。

上述结果说明FaNAC2可能通过正调控ABA信号途径来影响果实成熟。

2、烟草转化实验

(1)重组载体FaABI4pro的构建：提取草莓总DNA，以所述总DNA为模板，采用引物FaABI4-pro-F和引物FaABI4-pro-R组成的引物对进行扩增，得到PCR扩增产物。将PCR扩增产物纯化后采用同源重组载体构建法克隆于载体pGreenII0800-LUC的萤火虫荧光素酶(Firefly luciferase,LUC)报告基因的上游，得到重组载体FaABI4pro。对重组表达载体FaABI4pro描述如下：将载体pGreenII0800-LUC的HindIII和XBal位点之间的片段替换为了序列表的序列3所示的DNA分子(已经测序验证)。

FaABI4-pro-F：5’-GGTCGACGGTATCGATAAGCTTGTGTATAATCAGCTCCCATTATTTAGTC-3’；

FaABI4-pro-R：5’-CCGCTCTAGAACTAGTGGATCCGGTGGAAGAGATTTAAAGGGGGT-3’。

(2)重组载体FaABI5pro的构建：提取草莓总DNA，以所述总DNA为模板，采用引物FaABI5-pro-F和引物FaABI5-pro-R组成的引物对进行扩增，得到PCR扩增产物。将PCR扩增产物纯化后采用同源重组载体构建法克隆于载体pGreenII0800-LUC的萤火虫荧光素酶(Firefly luciferase,LUC)报告基因的上游，得到重组载体FaABI5pro。

对重组表达载体FaABI5pro描述如下：将载体pGreenII0800-LUC的HindIII和XBal位点之间的片段替换为了序列表的序列4所示的DNA分子(已经测序验证)。

FaABI5-pro-F：5’-GGTCGACGGTATCGATAAGCTTGCTCAACACTAATGTTGTGGTTG-3’；

FaABI5-pro-R：5’-CCGCTCTAGAACTAGTGGATCCGTCCATACATCACAAAAGTCCAAC-3’。

(3)重组载体FaABARpro的构建：重组载体FaABI5pro的构建：提取草莓总DNA，以所述总DNA为模板，采用引物FaABAR-pro-F和引物FaABAR-pro-R组成的引物对进行扩增，得到PCR扩增产物。将PCR扩增产物纯化后采用同源重组载体构建法克隆于载体pGreenII0800-LUC的萤火虫荧光素酶(Firefly luciferase,LUC)报告基因的上游，得到重组载体FaABARpro。

对重组表达载体FaABARpro描述如下：将载体pGreenII0800-LUC的HindIII和XBal位点之间的片段替换为了序列表的序列5所示的DNA分子(已经测序验证)。

FaABAR-pro-F：5’-GGTCGACGGTATCGATAAGCTTAGCCGGTCAATAAAGAGAAGAGG-3’；

FaABAR-pro-R：5’-CCGCTCTAGAACTAGTGGATCCATTTGGTGGGTGATCAAAACCC-3’。

(3)将步骤(1)-(3)构建的重组载体分别转化农杆菌GV3101后得到重组菌。将重组菌与实施例2中含有pEAQ-BD-FaNAC2载体的农杆菌共转化烟草，采用双荧光***激活***检测FaNAC2转录因子对ABA途径关键基因的启动子的激活/抑制活性(具体方法参照实施例2)。

结果如图5B所示。结果显示，含有FaABI4和FaABAR基因启动子的LUC酶活性明显低于对照组，说明草莓FaNAC2对FaABI4和FaABAR基因启动子有明显抑制活性，草莓FaNAC2直接抑制ABA信号途径关键基因的表达来加速果实成熟。

序列表

<110> 中国科学院植物研究所

<120> 草莓成熟相关转录因子基因FaNAC2及其应用

<160> 5

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 1035

<212> DNA

<213> 草莓(Fragaria × ananassa Duch.)

<400> 1

atggagagca ccgactcgtc ttccggctcg cagccgccgc cgcagccaaa cctaccgccg 60

ggattccgct tccaccccac cgatgaggag ctagtcgttc attacctcaa gaaaaaggcc 120

tcctcggctc ccctcccagt tgccatcatc gccgaagtcg acctctacaa attcgatcca 180

tggcagctcc cagaaaaggc gacgttcgga gagcaagagt ggtatttttt cagtcctaga 240

gaccggaagt acccgaacgg agcacggcct aatagagcag cgacttcagg atattggaag 300

gcgaccggaa ctgacaagcc ggttttgagt actactgatg agggaggtgg gggtactcgg 360

aaagttgggg tgaaaaaagc acttgttttc tacagaggaa agcccccaaa aggaatcaaa 420

accaattgga tcatgcatga gtataggatt gctgataaca acacaagtaa caagccaccc 480

cctgggtgtc atgacttggg taacaagaag aactccttaa ggcttgatga ttgggtgctt 540

tgtcgaattt acaagaagaa caacacgcat aggccgatgg atctggagga ctccatggac 600

ggcacgatgg gatcgtcgtt tcccctgtcg aagctgcacc accttccccc gaaatcgacg 660

acatcaacct acggccaatt catggacaac gaccataatt tctacgacgg gatggtaagc 720

agcgaaggga tcaatactag tgcttctttt cttccaaact cggctttggc caacagctct 780

ctccctctaa aacgggaact cccgaatctg tactggaatc atgatccgga ggacgaagca 840

gggccttcaa ggagactaca catggacagc agtgatcaga gcactggaaa tggttctatt 900

gccattctgc tttctcagct ccctcagaca cctcctccat tgcaccagca gccaatgctg 960

gggacgtcac agctcggtgg cgacgctctg tttcgtagta cacagtatca acttccgggg 1020

aattggtatt cttag 1035

<210> 2

<211> 344

<212> PRT

<213> 草莓(Fragaria × ananassa Duch.)

<400> 2

Met Glu Ser Thr Asp Ser Ser Ser Gly Ser Gln Pro Pro Pro Gln Pro

1 5 10 15

Asn Leu Pro Pro Gly Phe Arg Phe His Pro Thr Asp Glu Glu Leu Val

20 25 30

Val His Tyr Leu Lys Lys Lys Ala Ser Ser Ala Pro Leu Pro Val Ala

35 40 45

Ile Ile Ala Glu Val Asp Leu Tyr Lys Phe Asp Pro Trp Gln Leu Pro

50 55 60

Glu Lys Ala Thr Phe Gly Glu Gln Glu Trp Tyr Phe Phe Ser Pro Arg

65 70 75 80

Asp Arg Lys Tyr Pro Asn Gly Ala Arg Pro Asn Arg Ala Ala Thr Ser

85 90 95

Gly Tyr Trp Lys Ala Thr Gly Thr Asp Lys Pro Val Leu Ser Thr Thr

100 105 110

Asp Glu Gly Gly Gly Gly Thr Arg Lys Val Gly Val Lys Lys Ala Leu

115 120 125

Val Phe Tyr Arg Gly Lys Pro Pro Lys Gly Ile Lys Thr Asn Trp Ile

130 135 140

Met His Glu Tyr Arg Ile Ala Asp Asn Asn Thr Ser Asn Lys Pro Pro

145 150 155 160

Pro Gly Cys His Asp Leu Gly Asn Lys Lys Asn Ser Leu Arg Leu Asp

165 170 175

Asp Trp Val Leu Cys Arg Ile Tyr Lys Lys Asn Asn Thr His Arg Pro

180 185 190

Met Asp Leu Glu Asp Ser Met Asp Gly Thr Met Gly Ser Ser Phe Pro

195 200 205

Leu Ser Lys Leu His His Leu Pro Pro Lys Ser Thr Thr Ser Thr Tyr

210 215 220

Gly Gln Phe Met Asp Asn Asp His Asn Phe Tyr Asp Gly Met Val Ser

225 230 235 240

Ser Glu Gly Ile Asn Thr Ser Ala Ser Phe Leu Pro Asn Ser Ala Leu

245 250 255

Ala Asn Ser Ser Leu Pro Leu Lys Arg Glu Leu Pro Asn Leu Tyr Trp

260 265 270

Asn His Asp Pro Glu Asp Glu Ala Gly Pro Ser Arg Arg Leu His Met

275 280 285

Asp Ser Ser Asp Gln Ser Thr Gly Asn Gly Ser Ile Ala Ile Leu Leu

290 295 300

Ser Gln Leu Pro Gln Thr Pro Pro Pro Leu His Gln Gln Pro Met Leu

305 310 315 320

Gly Thr Ser Gln Leu Gly Gly Asp Ala Leu Phe Arg Ser Thr Gln Tyr

325 330 335

Gln Leu Pro Gly Asn Trp Tyr Ser

340

<210> 3

<211> 1368

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 3

ttaaaattgt ctaattattt atttttatta tggaagttta atttgatcag attaaaaaat 60

aaaaatgaaa ggaagaaatt tagaggtcta tattatttat ttgatattct catatgacgg 120

tttaaacact tatacattaa taatgcaagt acaccttagt gtgtataatc agctcccatt 180

atttagtcca ttgtaacttg attgctagcg ctctaagtta cataccagat atagccatcg 240

tttttaatga aattatgtcg tagagaagac tgaccaatta tatacatttt ttgatatttt 300

cctttttgaa aaatgatttc aactttaaaa aaaggaatag agatcatggg tggtcaatta 360

attagttcaa atggggggtt tttgataaaa ccaattcaga agcagctact actttgaatt 420

tgaactttaa taagcttaga ctttgactac cttgaaaata tgcgtggtta ttagttagtt 480

aggtaaatgg taagttaaag atctttgatc tgaaagcgaa atataccttg cccttctgag 540

aagcacagag ggctagagcc gtgctgagtg ctgaggcctc ttgttcctag gtcagaagac 600

ccaaaattat gaccaaatcc cgtatcaagt tgaaaaagtt gtacatgttt ttcgttagac 660

gtgctggtat atatcatgtc tcatatacga gacatcatat gtcaatactt aggatgatga 720

ttataaactc aaatcaataa aaaataccgt ttttcgataa cagataggaa aaacccttta 780

attagttgtg gactaattga tttttatttc aaatgcatgc tcttgatgtt agacagcaaa 840

accatagaca tagatgaaga aatataaagc atatagacaa tatacagtag tactaaaaca 900

aacttttaat agattgtata atttgcgttt gttttttctt ctttttatat gaacttgctt 960

gatgtttttc attttcaata tttttatctc aatattaggt taattatgca gaagaccagc 1020

cccgtaccgg aaatgaaaaa accagggata taaaagaaaa ttaacaagat gaataagaaa 1080

taaggaagca aaatatggat gcaaattcta aacccaatgt gcaagcactg agcctgtctt 1140

ctccactgca cagcaatcac ggtctctctc tttcctcttc tcctacagta gaaaaagcaa 1200

atatgtatat aaaagagagc accgccctat tccaccatta acaaagatga cattcaaaat 1260

ccgaccacag actctctcat cttgtatttt cgactaatca agaacactga acgaggcggt 1320

agtggtctcc atctttcaca ccacaacccc ctttaaatct cttccacc 1368

<210> 4

<211> 528

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 4

aacttctcat ttgaagtgag gcccagatcc ccccagatcg cacaccctca ttggccacac 60

gtcacatcag cctcatcggc gattggtcca cgtctcccat tattaaaatg ctaaaacaga 120

tataataatt gtacgcccca cccctcgatg tcttaaaagc caaacgcgac tggcgaagga 180

gcttcagaca cttgtcgctc ctcaaagttc aaaaattccc caaaatagta accaggaggt 240

aaaaagactc aaagcctaca tcaggcgaat ttttatttta ttttttttaa atttcttttg 300

ataatccagt tgttcatctg gaaaatttga gctggttact taattttgtt cttgtttctt 360

gttgttgcat gagaaaactg agcttttggt aagtgatatg gagttgggtt aattacttat 420

cctgttaggt ttggattttt ttgattggct gaaagttgac ggtgtcaatt attgggtacg 480

cagttggact tttgtgatat atggacctta ttagttttac aggtttgt 528

<210> 5

<211> 2001

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 5

agccggtcaa taaagagaag aggaaactca cgttatgcag tattccattt tcactaacat 60

gtatacttta taagaatttc atcttggctg accctacagc agaggaagaa tcgatcatgg 120

aaacacttgt aactgtggtt ttagattcat ctggtcaact tgtgtctctt tacaagccag 180

gtggaccagt tcttgcctat acatcggcta tccaggttgg ttacctagtt tctacccttg 240

tgtcatgtca atgttttaat ggttccctgc aattcaactt ggtaggatgt tgtgaatttc 300

agattttcgt tgtcttagtc tatctaactg agagtaataa agtgtatgtt cagattagta 360

atcatttcca tcacacatca gtaactaagg ttttaaaact gttttgagtc ttctgacatt 420

attgcatatc cacagaaata gaaaagagga gaagagtaca tttttccaat gttttcccga 480

tttaaccaat aatataaagg caatcaactc tactagtgtt caactttcaa ttggcttgaa 540

actaatgaaa atgcaagcaa ctctattact tgattccttt tcacataaag tatttttatg 600

agttactatt agacagtatt ggtggttttg ttatttgttt ataataaata actgctccat 660

tatgaaaatt aggctgaaag atgccaagtt atccaccatt ttttctgtat acatttctta 720

taaaccatgt ttttttaact gatgtatgta tataagagcg taagaataca atggctggtg 780

aaatattgtt atgaatcatt actcatgatc caaatgatga taaggaagac tctttggttg 840

caggattgtg ttgcactcac taggcaaaga gtgagggagc tccagatgat tttagatgaa 900

gcctccgctg gtatggaggt tgattagttt catctttcat ctcctaaggg gtgttgtctt 960

ttctattaac atcttgttct ggccttattt tgtattgata tttgttactc tagtcaaagg 1020

cttcagaaag gtggcaatag tcaatattga atcactatgt gaaactgttg tgcaatcttt 1080

tgtttgcatc gtcttaatgg ttacggtcac attgttagag caattagcag tcttatgcca 1140

tgggttgctt tccgtgtgtg caaagcttgt taccatactt gcctgacact cgctacatct 1200

gttcttgatt ggttcgagtt acggacatac atgttcatga tccccaattg attgtgcctt 1260

tgctatgttt tggttgtgct tataaaaatt taataaatag tagctgcatt ggtgattcat 1320

cttcaaagcc ttctccttgt taaaaaaata aaaaagaaaa aaaaataaaa aaaaggccta 1380

ctcatttcaa aagggatgtg tcagtgtgta attatggcta tgcgtgggga tcagattgat 1440

cagaatcttt acacacaaaa tgagcttcac ttgaagcaga gaccaaatat ctccttcccc 1500

ctctcttttt ctctctcatc atccaaccag caataccaga aatccaattg agccaatgag 1560

aattcagcaa actccatcag aatgacccat gtagatagat aagcaagtcc cctcccccaa 1620

tctctctccc ccaaaatccc caagcaaact tcacctcaga aacccaattt acttacactc 1680

agaatttgct tgaccaccca tcaagccacg tgtccccaac tcccaccacc agccatgaaa 1740

caccaaactg ttactgactc acactccctc caagtgtgct ttcttctcca cacaaactat 1800

aaaacttcaa ccttcaaatc cccacaagaa aaagatagaa gacacaaacc tcaaccctga 1860

tcacaactca caactagaga gagcagagga actcactctc tcacattctt ctcccactcc 1920

tcaaattttg aagcagagga gtctgctaac tgctacattt cttccttctt cttgttcttg 1980

ggttttgatc acccaccaaa t 2001

Claims (10)

1.FaNAC2蛋白或其编码基因在调控草莓果实成熟中的应用；

所述FaNAC2蛋白是如下(A1)或(A2)或(A3)或(A4)的蛋白质：

(A1)氨基酸序列为序列表的序列2的蛋白质；

(A2)将序列2所示的氨基酸序列经过一个或几个氨基酸残基的取代和/或缺失和/或添加且具有相同功能的蛋白质；

(A3)与(A1)-(A2)中任一所限定的氨基酸序列具有99％以上、95％以上、90％以上、85％以上或者80％以上同一性且具有相同功能的蛋白质；

(A4)在(A1)-(A3)中任一所限定的蛋白质的N端和/或C端连接蛋白标签后得到的融合蛋白。

2.如权利要求1所述的应用，其特征在于：所述FaNAC2蛋白或其编码基因在草莓中的活性和/或表达量越低，草莓成熟度越高或成熟速度越快。

3.FaNAC2蛋白或其编码基因的应用，为如下(C1)-(C5)中的至少一种：

(C1)调控草莓果实中糖含量；

(C2)调控草莓果实中有机酸含量；

(C3)调控草莓果实中花青苷含量；

(C4)调控草莓果实成熟相关基因的表达；

(C5)调控ABA信号途径关键基因的表达；

所述FaNAC2蛋白是如下(A1)或(A2)或(A3)或(A4)的蛋白质：

(A1)氨基酸序列为序列表的序列2的蛋白质；

(A2)将序列2所示的氨基酸序列经过一个或几个氨基酸残基的取代和/或缺失和/或添加且具有相同功能的蛋白质；

(A3)与(A1)-(A2)中任一所限定的氨基酸序列具有99％以上、95％以上、90％以上、85％以上或者80％以上同一性且具有相同功能的蛋白质；

(A4)在(A1)-(A3)中任一所限定的蛋白质的N端和/或C端连接蛋白标签后得到的融合蛋白。

4.一种促进草莓果实成熟的方法，包括如下步骤：降低目的草莓果实中FaNAC2蛋白的活性和/或表达量；

所述FaNAC2蛋白是如下(A1)或(A2)或(A3)或(A4)的蛋白质：

(A1)氨基酸序列为序列表的序列2的蛋白质；

(A2)将序列2所示的氨基酸序列经过一个或几个氨基酸残基的取代和/或缺失和/或添加且具有相同功能的蛋白质；

(A3)与(A1)-(A2)中任一所限定的氨基酸序列具有99％以上、95％以上、90％以上、85％以上或者80％以上同一性且具有相同功能的蛋白质；

(A4)在(A1)-(A3)中任一所限定的蛋白质的N端和/或C端连接蛋白标签后得到的融合蛋白。

5.一种促进草莓果实成熟的方法，包括如下步骤：抑制目的草莓果实中FaNAC2蛋白的编码基因的表达；

所述FaNAC2蛋白是如下(A1)或(A2)或(A3)或(A4)的蛋白质：

(A1)氨基酸序列为序列表的序列2的蛋白质；

(A2)将序列2所示的氨基酸序列经过一个或几个氨基酸残基的取代和/或缺失和/或添加且具有相同功能的蛋白质；

(A3)与(A1)-(A2)中任一所限定的氨基酸序列具有99％以上、95％以上、90％以上、85％以上或者80％以上同一性且具有相同功能的蛋白质；

(A4)在(A1)-(A3)中任一所限定的蛋白质的N端和/或C端连接蛋白标签后得到的融合蛋白。

6.如权利要求5所述的方法，其特征在于：

所述FaNAC2蛋白的编码基因为如下(B1)-(B3)任一所示：

(B1)序列表中序列1所示的DNA分子；

(B2)编码序列是序列表中序列1所示的DNA分子；

(B3)在严格条件下与B1)或B2)限定的DNA分子杂交，且编码相同功能蛋白质的DNA分子。

7.如权利要求5或6所述的方法，其特征在于：所述“抑制目的草莓果实中FaNAC2蛋白的编码基因的表达”是通过向目的草莓中导入干扰载体实现的；所述干扰载体包括特异DNA分子；所述特异DNA分子包括区段甲和区段乙；所述区段甲和所述区段乙为反向互补序列；所述区段甲的序列如序列表中序列1自5’端第615位至960位所示。

8.干扰载体，包括特异DNA分子；所述特异DNA分子包括区段甲和区段乙；所述区段甲和所述区段乙为反向互补序列；所述区段甲的序列如序列表中序列1自5’端第615位至960位所示。

9.FaNAC2蛋白或其编码基因，或，权利要求4至7任一所述的方法，或，权利要求8所述的干扰载体在草莓育种中的应用。

10.如权利要求1至7任一所述的应用或方法，或，权利要求9所述的应用，其特征在于：所述草莓为八倍体草莓。

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