CN110876752A - 长链非编码rna nron功能基序在制备抑制骨吸收及防治骨质疏松药物中的应用 - Google Patents
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Abstract
本发明属于生物医学领域,具体涉及一种长链非编码RNA NRON功能基序在制备抑制骨吸收及防治骨质疏松药物中的应用。本发明通过将人的lncRNA NRON功能基序或小鼠的lncRNA NRON功能基序,制备成质粒或转化体,通过上调***受体α(ERα)的表达,促进FasL等ERα下游基因的上调,促进破骨细胞死亡,进而实现防治骨质疏松的目的。本发明提供的长链非编码RNANRON功能基序可以用于制备抑制骨吸收及防治骨质疏松药物,为骨吸收异常激活相关疾病如骨质疏松症的防治提供了新的研究方向。
Description
技术领域
本发明属于生物医学领域,具体涉及一种长链非编码RNA NRON的功能基序在制备抑制骨吸收及防治骨质疏松药物中的应用。
背景技术
骨质疏松症是一种以骨量减少和骨结构塌陷为主要原因,进而导致骨脆性增加,骨强度降低,骨折风险增加为主要特征的全身性骨疾病。随着人口老龄化的加剧,骨质疏松的发病率逐年上升,现已成为一个全球性的公共健康问题。目前我国60岁以上人口已超过2.1亿,约占总人口的15.5%,是世界上老年人口绝对数最大的国家。最新流行病学报告显示我国男性和女性每十年的骨质疏松症人口增长率分别为15%和20%,目前全国约有1.4亿骨质疏松症患者,预计到2020年,我国骨质疏松患者人数会超过2亿,将占全世界骨质疏松患者的一半以上。而骨质疏松症及其引起的骨折,是老年人致残、致死的主要原因之一。研究发现骨质疏松患者发生骨折的风险较正常人群高40%,据统计50岁后因骨质疏松导致的骨折发生率在男性中为7.5%,在女性中达到10%,而在70岁以上的人群中,则高达30%以上。其中髋部骨折是最严重的骨质疏松性骨折,高达70%-90%的髋部骨折由骨质疏松所造成,而研究显示发生髋部骨折后1年之内,20%患者会死于各种并发症,约50%患者致残,生活质量明显下降。调查显示在2010年,我国共233万人次发生骨质疏松性骨折,花费医疗费用94.5亿美元。预计到2035年,这一数字将翻倍,而到2050年,我国人口的骨质疏松性骨折将增加到599万人次每年,花费的医疗费用将高达254.3亿美元。骨质疏松症及骨质疏松性骨折导致的住院病人,其医疗和护理需要投入大量的资源,将造成沉重的家庭和社会负担。世界卫生组织已将骨质疏松症与糖尿病、心血管病共同列为危害老年人健康的三大杀手。每年的10月20日被定为“国际骨质疏松日”,可见骨质疏松不仅是我们国家需要面对的老龄化问题,而且是国际社会共同关注的人类重大健康问题。
骨质疏松按照发病机理不同可以分为原发性(包括绝经后骨质疏松和衰老导致的老年性骨质疏松)、继发性和特发性三种,其中原发性骨质疏松影响的人群最多,为国内外研究主要的关注对象。骨质疏松的发生主要是由于激素水平改变或衰老导致的骨形成和骨吸收过程的失衡导致,因而目前临床常用的治疗骨质疏松的药物主要包括促进骨形成的药物:如甲状旁腺激素类似物;抑制骨吸收的药物:如双膦酸盐类、降钙素类、***、选择性***受体调节剂等;其他机制类药物:如活性维生素D及其类似物等和中药如:骨碎补总黄酮制剂等在骨质疏松治疗中也有应用。其中抑制骨吸收的药物如唑来膦酸、阿仑膦酸钠、迪诺塞麦等由于具有较广的抗骨折谱而被定为临床治疗的首选药物,但现有抑制骨吸收的药物所存在的安全隐患和疗效有限的问题仍不容忽略。如双膦酸盐类药物会诱导下颌骨坏死、非典型股骨骨折、胃肠道不良反应、诱导发热、肌肉关节疼痛、肾脏毒性等副作用。降钙素类和***类药物长期使用会存在增加肿瘤风险的可能。FDA于2017年因存在增加心血管疾病风险的原因拒绝了靶向Sclerostin蛋白的单抗药物Romosozumab的上市申请,而已批准上市的靶向RANKL的单抗药物迪诺塞麦(Denosumab)也存在增加下颌骨坏死的副作用。
破骨细胞作为直接参与骨吸收过程的细胞,在骨质疏松的形成过程中发挥着至关重要的作用。已有研究显示破骨细胞的数量和活性在骨质疏松形成过程中均显著增强。因此,基于骨质疏松的病理学特点,进一步深入探究骨质疏松发生发展过程中破骨细胞分化和活性调控的分子生物学机制,寻找治疗骨质疏松的新药物靶点并筛选更加安全有效的抗骨质疏松药物,具有重要的研究价值及应用前景。长链非编码RNA(Long non-coding RNA,lncRNA)是一类长度在200个碱基以上,一般不具备蛋白质编码功能的RNA分子。人体细胞内的RNA分子,只有2%左右能够翻译成蛋白质,而高达98%的RNA属于非编码RNA,其中lncRNA占到所有非编码RNA的70%以上。现有研究显示,lncRNA能够在基因转录,蛋白翻译及翻译后修饰,表观遗传学等多个层面参与个体的发育、维持生命体的正常生理活动、同时参与到众多疾病的发生发展,如肿瘤、糖尿病、病毒感染等。近年的研究显示,lncRNA在骨骼的生长发育及骨稳态调控中发挥重要功能,部分lncRNA甚至可以作为骨相关疾病的生物学标志。同时目前尚未见文献报道lncRNA调控体内骨吸收过程,同时未见文献将调控骨吸收的lncRNA及其功能基序用于骨质疏松的治疗。长链非编码RNA由于其调控方式的多样性决定了一个lncRNA可能存在多种发挥功能的作用方式,并且一个lncRNA可同时调控众多细胞内分子的功能,因此将全长lncRNA分子直接应用于疾病的治疗有可能会产生不可预见的脱靶效应或毒副作用。最新研究报道,lncRNA功能的发挥依赖于存在其核酸序列内的特殊功能基序,因此针对某疾病寻找lncRNA的特定功能基序,将很大程度上减少全长lncRNA直接应用所导致的脱靶效应或毒副作用,促进lncRNA类药物的临床转化。
综上所述,现有的关于lncRNA的应用中并没有与骨质疏松相关的应用被报道,且如选择lncRNA的全长RNA序列,容易造成毒副作用大的危险,脱靶性高,lncRNA作用范围小的缺点。
发明内容
为了克服现有技术中存在的缺点,本发明的目的在于提供一种长链非编码RNANRON功能基序在制备抑制骨吸收及防治骨质疏松药物中的应用。本发明提供的lncRNANRON功能基序通过上调***受体α(ERα)的表达,促进FasL等ERα下游基因的上调,促进破骨细胞死亡,进而实现抑制骨吸收的目的。
为了达到上述目的,本发明采用的技术方案为:
一种长链非编码RNA NRON功能基序在制备防治骨质疏松药物中的应用。
优选地,所述长链非编码RNA NRON功能基序可上调破骨细胞***受体α的表达,促进FasL等ERα下游基因的上调,进而促进破骨细胞死亡。
优选地,所述长链非编码RNA NRON功能基序为质粒或转化体。
优选地,所述转化体可以为腺病毒、腺相关病毒,慢病毒中的一种。
优选地,所述长链非编码RNA NRON功能基序包含如SEQ ID NO.1所述的人lncRNANRON的核苷酸序列,或如SEQ ID NO.2所述的小鼠的lncRNA NRON的核苷酸序列。
AACTTTGAAACTTTCCTTTGTATATTACATTAATCCATATAAGAAAATCTCTTTTAATGAGGAGTGATGTAGTTACAAACTCTCCAGAGCCATAATTAGAGCAAACTAATTGAAGTTGTGTTTTGACACACTTTCCAAATTCACGGGTGCCGGATGACATATTCACAACACTGCTGCCGCACAACCATGGCGACGGCAAAATCATTAGGCTAATAACGCTTATTTGCATTCTTATCATGCCGGCAGCTCGCCCTTAAATACTGTTTCCACTACTGCTCCTTTACTGTAAGTTTCCACCGAAAGATATTAACAGTAATTATTAGTACTTTAGTGGAATTTTAATGTTAA(SEQ ID NO.1);
AACTTTGAAACTTTCCTTTGTATATTACATTAATCCACATAAGAAAATCTCTTTTAATGAGGAGTGATGTAGTCACAAACTCTCCAGAGCCATAATTAGAGCAAACTAATTGAAGTTGTGTTTTGACACACTTTCCAAATTCACGGGTGCTGGATGACATATTCACAACACTGGTGCCGCACAACCATGGCGACGGCAGAATCATTAGGCTAATAACGCTTATTTGCATTCTTCTCATGCCGCCAGCTCTCCCTTAAATACTGTTTCTACCACTGCTCCTTTACTGTAACTTTCCACTCGACGGTATTAACAGTAATTATTAGTGCTTTAGTGGAATTTTAATGTTAAGAATCA(SEQ ID NO.2)。
优选地,扩增所述人lncRNA NRON的核苷酸序列的引物为Human-NRON,扩增所述小鼠lncRNA NRON的核苷酸序列的引物为Mouse-NRON。
优选地,所述引物Human-NRON的上游引物序列如SEQ ID NO.3所示,所述引物Human-NRON的下游引物序列如SEQ ID NO.4所示;所述引物Mouse-NRON的上游引物序列如SEQ ID NO.5所示,所述引物Mouse-NRON的下游引物序列如SEQ ID NO.6所示。
Human-NRON-F:CGGGATCCAACTTTGAAACTTTCC(SEQ ID NO.3);
Human-NRON-R:CGGAATTCTTAACATTAAAATTCC(SEQ ID NO.4);
Mouse-NRON-F:CGGGATCCAACTTTGAAACTTTCCTTTG(SEQ ID NO.5);
Mouse-NRON-R:CGGAATTCTGATTCTTAACATTAAAATTCC(SEQ ID NO.6)。
本发明将原代小鼠骨髓单核细胞分离并通过RANKL以及M-CSF的刺激诱导向破骨细胞分化,并将小鼠lncRNA NRON功能基序转染入小鼠原代骨髓单核细胞后通过RANKL以及M-CSF诱导破骨分化,通过TUNEL染色以及检测破骨细胞凋亡的指标判断lncRNA NRON功能基序对细胞破骨凋亡的影响。发现lncRNA NRON功能基序可以显著促进破骨细胞的凋亡。
为了探讨lncRNA NRON功能基序促进破骨细胞凋亡的可能分子机制,本发明通过信号通路分析及实验验证发现lncRNA NRON功能基序可抑制***受体α(ERα)的降解。而ERα是已知调控破骨细胞凋亡最重要的信号通路之一。因此本发明揭示了lncRNA NRON功能基序可通过增强***受体α的稳定性进而促进破骨细胞凋亡的分子机制。
为了在体内评价lncRNA NRON功能基序对骨吸收的抑制作用及对抗骨质疏松的效应。本发明构建了卵巢切除(OVX)小鼠骨质疏松模型,通过将lncRNA NRON功能基序利用核酸递送***递送到OVX小鼠体内后,通过microCT检测,发现递送lncRNA NRON功能基序的实验组OVX小鼠骨体积、骨小梁的数量和厚度均比对照组OVX小鼠增加,治疗效果和阳性对照药物唑来磷酸盐相当。说明lncRNA NRON功能基序对OVX疏松模型具有一定的治疗作用。
与现有技术相比,本发明提供的长链非编码RNA NRON功能基序在制备防治骨质疏松药物中的应用,具有如下优点:
(1)本发明实验结果是通过生物信息学分析及体内外实验验证获得,可信度高,治疗效果显著;
(2)本发明获得的长链非编码RNA NRON功能基序,作用于骨质疏松小鼠,直接作用于靶位点,且不会产生毒副作用,不会造成脱靶现象;
(3)本发明首次发现了可以将一段长链非编码RNA NRON功能基序用于制备防治骨质疏松的药物中,为骨吸收异常激活相关疾病的防治提供了新的研究方向。
附图说明
图1中,A为NRON和NRON功能基序对破骨细胞凋亡的染色体分析结果,B为A的统计定量分析结果;
图2为NRON和NRON功能基序对ERα下游基因FasL的表达的QPCR分析结果;
图3为NRON和NRON功能基序在蛋白水平上上调FasL和细胞凋亡相关蛋白PARP和Caspase3的表达的WB结果;
图4为将小鼠和人的NRON表达载体,NRON功能基序表达载体和空载体分别转染至人和小鼠的破骨细胞后WB检测ERα的表达情况;
图5为将小鼠和人的NRON表达载体,NRON功能基序表达载体和空载体分别转染转染至人和小鼠的破骨细胞后,检测ERα的泛素化修饰情况图。
图6中,A为治疗小鼠的骨组织TRAP染色分析图;B为治疗后microCT分析小鼠股骨的骨小梁三维重建图;C为对B图microCT的定量分析结果。
具体实施方式
下面结合具体实施例对本发明作进一步解释,但是应当注意的是,以下实施例仅用以解释本发明,而不能用来限制本发明,所有与本发明相同或相近的技术方案均在本发明的保护范围之内。若未特别指明,实施例中所用的技术手段为本领域技术人员所熟知的常规手段,所用原料为市售商品。
实施例1构建lncRNA NRON功能基序真核表达载体
分别以人全长NRON基因和小鼠全长NRON基因为模板,采用引物Human-NRON进行PCR扩增(扩增人源NRON功能基序),采用引物Mouse-NRON进行PCR扩增(扩增鼠源NRON功能基序)。
采用TRKARA公司高保真DNA聚合酶(货号R045Q)扩增NRON功能基序。PCR片段经过琼脂糖凝胶电泳鉴定后用天根生物科技公司普通琼脂糖凝胶DNA回收试剂盒(货号DP209)回收目的片段。目的片段及pcDNA3.1(+)载体用TRKARA公司BamHI和EcoRI限制性内切酶,37度酶切1h。随后进行琼脂糖凝胶电泳鉴定后用天根生物科技公司普通琼脂糖凝胶DNA回收试剂盒(货号DP209)回收酶切后的目的片段和pcDNA3.1(+)载体。将载体和目的片段按照50ng:200ng的比例用TAKARA公司T4连接酶(货号2011A)16度连接过夜。将连接产物用热击法转化至DH5a感受态细菌(天根生物,货号CB101)中,氨苄青霉素抗性筛选阳性克隆,并进行PCR鉴定。将PCR鉴定阳性的克隆,送至生工生物进行测序鉴定。将测序鉴定正确的克隆保存菌种,并用无内毒素质粒提取试剂盒(天根生物,货号DP117)提取质粒用于后续实验。
实施例2体外分化诱导破骨细胞
将2月龄C57BL/6小鼠的骨髓用无血清α-ME培养基冲出,用含10%FBS的α-MEM培养液重悬细胞,在5%CO2的37℃恒温培养箱中培养24小时。随后离心收集悬浮细胞,按照3×106细胞/mL的细胞密度接种培养板,加入50ng/mL M-CSF诱导3天,3天后加入50ng/mL M-CSF和100ng/mL RANKL诱导细胞,隔天给细胞换液,细胞培养4天后进行后续的分子检测和TRAP染色。
将人THP-1细胞饲养于含10%FBS的1640培养液中用于破骨细胞分化诱导,将THP-1细胞以5×105细胞/mL的密度铺板,并加入100ng/mL PMA刺激1天,随后更换为1640+10%FBS+50ng/mL M-CSF+100ng/mL RANKL的分化诱导培养基,隔天给细胞换液,细胞培养14天后进行后续的分子检测和TRAP染色。
实施例3转染lncRNA NRON功能基序真核表达载体至破骨细胞
小鼠破骨细胞分化第2天或人破骨细胞分化第12天,利用Lipo2000转染lncRNANRON功能基序表达载体至破骨细胞,转染按照说明书进行,取2000ng质粒加入含125μLopti-MEM培养基的EP管中吹打混匀,取5μL Lipo2000转染试剂加入含125μL opti-MEM培养基的EP管中吹打混匀,将2个含有试剂的EP管室温静置5min,随后1:1混合2个EP管内的试剂,室温静置20min,此后将转染混合物加入至培养板内。转染2天后进行基因和蛋白表达水平的分析。
实施例4破骨细胞TUNEL染色分析
培养破骨细胞,并进行NRON表达载体或NRON功能基序表达载体的转染,转染2天后,***处理组加入10nM***(碧云天生物,ST1101)处理8小时,此后收集细胞,按照试剂盒说明书进行TUNEL染色分析细胞凋亡(碧云天生物,C1086)。(1)PBS洗涤细胞一次。(2)4%多聚甲醛固定细胞30分钟。(3)PBS洗涤细胞一次。(4)0.3%Triton X-100的PBS,室温孵育5分钟。(5)PBS洗涤细胞一次。(6)配制反应液:将TdT酶5μL加入45μL荧光标记液中混合均匀。(7)按照每样品50μL的量加入荧光标记液,37℃避光孵育1小时。(8)用PBS洗涤细胞一次。(9)加入DAPI(碧云天生物生物,C1005)和鬼笔环肽(上海翊圣生物,40734ES75)染色液,室温避光孵育30分钟。(10)用PBS洗涤细胞一次,激光共聚焦显微镜拍摄照片,并分析TUNEL+凋亡破骨细胞的比例。具体结果见图1,由A图可知,NRON和NRON功能基序可显著促进破骨细胞凋亡,由B图可知,TUNEL+凋亡破骨细胞的比例高达90%以上。
实施例5破骨细胞RNA提取及基因表达水平分析
6孔板每个孔加入1mL Trizol裂解细胞并用枪头反复吹打,室温作用5分钟。将裂解液移入1.5mL离心管中,加入200μl氯仿,盖紧管盖,涡旋混匀室温静置3分钟,4℃,12000g/min离心15分钟。将上层水相液体转移至新的1.5mL离心管中,加入500μL异丙醇,涡旋混匀室温静置10分钟,4℃,12000g/min离心10分钟。将上清用移液器吸取,丢弃,保留底部白色沉淀。加入1mL 75%乙醇(DEPC水配制),用手轻轻将白色沉淀弹起,然后在4℃条件下,7500g/min离心5分钟。弃上清,室温干燥10-15分钟,加入30-40μL DEPC水重新溶解,RNA置于-80℃冰箱中保存或直接使用。使用反转录试剂盒(TaKaRa,货号RR047A),根据试剂盒的操作流程,将提取的1000ng总RNA反转录成cDNA。参考试剂盒说明书(TaKaRa,货号RR820A)使用实时荧光定量PCR技术检测基因的表达水平。具体见图2,由图2可知,NRON和NRON功能基序可显著促进ERα下游基因FasL的表达。
实施例6破骨细胞蛋白表达水平分析
用SDS裂解液提取细胞总蛋白,BCA比色法调节蛋白浓度达到一致。SDS-PAGE电泳对蛋白样品进行分离,转至PVDF膜,5%脱脂奶粉封闭1h,洗膜,孵一抗(ERα,FasL,PARP,GAPDH),4℃冰箱孵育过夜,洗膜,室温孵育荧光二抗1h,洗膜,采用ECL化学发光法显影得到目的条带,用Bandscan软件对条带进行灰度扫描,以GAPDH内参进行校正。具体结果见图3,由图3可知,NRON和NRON功能基序可以在蛋白水平上上调FasL和细胞凋亡相关蛋白PARP和Caspase3的表达,说明促进了破骨细胞凋亡。
实施例7 ERα表达水平和泛素化修饰水平分析
培养人的破骨细胞,并按照实施例3所示方法转染人NRON表达载体或人NRON功能基序表达载体。培养小鼠的破骨细胞,并按照实施例3所示方法转染小鼠NRON表达载体或小鼠NRON功能基序表达载体。细胞转染2天后,利用实施例6所示的蛋白电泳流程,分析转染效果,具体结果见图4,由图4可知,将小鼠和人的NRON表达载体,NRON无效基序表达载体,NRON功能基序表达载体分别转染转染至人和小鼠的破骨细胞,发现全长NRON和NRON功能基序能上调ERα的表达。
为了分析ERα的泛素化修饰水平,在质粒转染后的破骨细胞中加入泛素蛋白酶体抑制剂MG132(Selleck,货号S2619)处理细胞6小时。随后细胞用PBS洗涤一次,用Western及IP细胞裂解液(碧云天,货号P1003)冰上裂解细胞样品10分钟。随后14000转/分钟离心收集上清液。在细胞裂解液中加入ERα特异性抗体(Invitrogen,货号MA5-13065),冰上孵育2小时,随后加入Protein A/G琼脂糖珠(Santa,货号SC-2003),4度孵育过夜。1000转/分钟,离心5分钟收集琼脂糖珠。用PBS洗涤琼脂糖珠5次,最后一次离心后,完全吸弃上清,在琼脂糖珠沉淀中加入40μL SDS上样缓冲液,100度煮5分钟。此后14000转/分钟离心收集上清液,并取上清液按照实施例6的蛋白电泳和分析流程,孵育泛素一抗(CST,货号43124)检测ERα蛋白的泛素化修饰程度。具体泛素化结果见图5,由图5可知,NRON或NRON功能基序可抑制ERα的泛素化修饰。
实施例8构建小鼠卵巢切除模型
取同12周龄C57BL/6雌性未孕小鼠,腹腔注射戊巴比妥钠/水合氯醛深度麻醉小鼠,进行卵巢摘除。侧卧放置小鼠,并用75%酒精棉球消毒小鼠背侧、腹侧皮肤。在小鼠大腿根部稍上方水平,脊柱侧方不到1cm的地方,用眼科剪剪开一个与脊柱平行的约5mm长的皮肤切口,仔细剪开下方腰肌,仔细寻找包绕卵巢的脂肪组织,见到粉红色的卵巢后,在卵巢两侧结扎,摘除卵巢。对照组为进行手术操作但不摘除卵巢的假手术对照组。于术后3个月取模型组和对照组小鼠后肢骨和腰椎骨标本进行micro-CT扫描并分析骨参数。
实施例9卵巢切除小鼠的药物治疗
将小鼠分为5组,每组6只小鼠,其中OVX模型组4组,Sham对照组1组。Sham组和OVX组每三天静脉注射200μL生理盐水,共给药30天。载体递送治疗组,将1mg核酸递送***溶解到1mL生理盐水中,超声10min,随后同1mg载体进行混合均匀后备用。OVX空载体治疗组,OVX-NRON治疗组,OVX-NRON功能基序治疗组每三天静脉注射200μL包含载体的核酸递送***,共给药30天。阳性对照药物唑来磷酸盐组OVX小鼠按照80μg/kg剂量腹腔注射一次药物。给药30天后,用4%多聚甲醛心脏灌流固定小鼠。取出小鼠的股骨、胫骨、椎骨。4%多聚甲醛固定1周,microCT(μCT 50,Scanco Medical)对骨样本进行扫描,并分析骨小梁的体积比(BV/TV)、骨小梁的厚度(Tb.Th)和骨小梁的数量(Tb.N),并进行统计学分析。具体结果见图6。其中,A图为治疗模式图,B图为治疗后microCT分析小鼠股骨的骨小梁三维重建图,可以看出NRON功能基序治疗显著提升了小鼠骨量。C为对B图microCT的定量分析,发现NRON功能基序治疗可以显著上调OVX小鼠骨体积、骨小梁数量和骨小梁厚度,效果与阳性对照药物唑来磷酸盐(Zol)相当。A图为治疗小鼠的骨组织TRAP染色分析,C图为对骨组织TRAP染色的定量,NRON功能基序治疗显著抑制了小鼠的骨吸收活性,由此说明NRON功能基序可在体内抑制骨吸收。
此外需要说明的是,上述实施例仅用来进一步阐明本发明的疗效特点。所涉及到的方法是本领域的技术人员能够掌握和运用的技术手段。本发明所述lncRNA NRON功能基序可以为质粒或腺病毒、慢病毒、腺相关病毒等转化体,只要其包含SEQ ID NO.1和SEQ IDNO.2所示核苷酸序列片段或包含序列相似度大于80%的核酸序列片段即在本发明保护范围内。
序列表
<110> 暨南大学
<120> 长链非编码RNA NRON在制备抑制骨吸收及防治骨质疏松药物中的应用
<130> 2019.11.6
<160> 6
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 348
<212> DNA
<213> 人lncRNA NRON功能基序(Artificial Sequence)
<400> 1
aactttgaaa ctttcctttg tatattacat taatccatat aagaaaatct cttttaatga 60
ggagtgatgt agttacaaac tctccagagc cataattaga gcaaactaat tgaagttgtg 120
ttttgacaca ctttccaaat tcacgggtgc cggatgacat attcacaaca ctgctgccgc 180
acaaccatgg cgacggcaaa atcattaggc taataacgct tatttgcatt cttatcatgc 240
cggcagctcg cccttaaata ctgtttccac tactgctcct ttactgtaag tttccaccga 300
aagatattaa cagtaattat tagtacttta gtggaatttt aatgttaa 348
<210> 2
<211> 354
<212> DNA
<213> 小鼠lncRNA NRON功能基序(Artificial Sequence)
<400> 2
aactttgaaa ctttcctttg tatattacat taatccacat aagaaaatct cttttaatga 60
ggagtgatgt agtcacaaac tctccagagc cataattaga gcaaactaat tgaagttgtg 120
ttttgacaca ctttccaaat tcacgggtgc tggatgacat attcacaaca ctggtgccgc 180
acaaccatgg cgacggcaga atcattaggc taataacgct tatttgcatt cttctcatgc 240
cgccagctct cccttaaata ctgtttctac cactgctcct ttactgtaac tttccactcg 300
acggtattaa cagtaattat tagtgcttta gtggaatttt aatgttaaga atca 354
<210> 3
<211> 24
<212> DNA
<213> Human-NRON-F
<400> 3
cgggatccaa ctttgaaact ttcc 24
<210> 4
<211> 24
<212> DNA
<213> Human-NRON-R
<400> 4
cggaattctt aacattaaaa ttcc 24
<210> 5
<211> 28
<212> DNA
<213> Mouse-NRON-F
<400> 5
cgggatccaa ctttgaaact ttcctttg 28
<210> 6
<211> 30
<212> DNA
<213> Mouse-NRON-R
<400> 6
cggaattctg attcttaaca ttaaaattcc 30
Claims (7)
1.一种长链非编码RNA NRON功能基序在制备防治骨质疏松药物中的应用。
2.根据权利要求1所述的应用,其特征在于,所述长链非编码RNA NRON功能基序在骨质疏松患者中上调***受体ERα的表达,促进FasL等ERα下游基因的上调,进而促进破骨细胞死亡。
3.根据权利要求1所述的应用,其特征在于,所述长链非编码RNA NRON功能基序为质粒或转化体。
4.根据权利要求3所述的应用,其特征在于,所述转化体可以为腺病毒、腺相关病毒,慢病毒中的一种。
5.根据权利要求1所述的应用,其特征在于,所述长链非编码RNA NRON功能基序包含如SEQ ID NO.1所述的人lncRNA NRON的核苷酸序列或如SEQ ID NO.2所述的小鼠的lncRNANRON的核苷酸序列。
6.根据权利要求5所述的应用,其特征在于,扩增所述人lncRNA NRON的核苷酸序列的引物为Human-NRON,扩增所述小鼠lncRNA NRON的核苷酸序列的引物为Mouse-NRON。
7.如权利要求6所述的长链非编码RNA NRON序列,其特征在于,所述引物Human-NRON的上游引物序列如SEQ ID NO.3所示,所述引物Human-NRON的下游引物序列如SEQ ID NO.4所示;所述引物Mouse-NRON的上游引物序列如SEQ ID NO.5所示,所述引物Mouse-NRON的下游引物序列如SEQ ID NO.6所示。
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