CN110876336A - 一种中国南瓜突变体的诱变方法 - Google Patents

Abstract

本发明提供了一种中国南瓜突变体的诱变方法，其包括步骤：(1)将饱满、大小均一的南瓜种子在水中进行浸种，然后进行催芽处理；然后利用体积浓度为1.6～1.8％的甲基磺酸乙酯溶液进行浸泡处理12小时；(2)用清水将经步骤(1)处理后的种子洗净，之后平铺在内覆湿润滤纸的培养皿中，在培养箱中进行催芽，之后依次进行播种、育苗和定植；(3)待植株长至5叶1心时进行摘心处理，双蔓整枝，植株记为M₁代；(4)对M₁代进行性状观察并进行同蔓自交留种，获得自交南瓜种子，记为M₂代；对M₂代植株性状进行观察，并筛选变异体，获得突变体。本发明的方法可以使得对南瓜进行诱变时，种子发芽率为59％，M₂代总体表型突变频率达11.2％，可以有效构建中国南瓜突变体库。

Description

一种中国南瓜突变体的诱变方法

技术领域

本发明属于农业技术领域，具体涉及一种中国南瓜突变体的诱变方法。

背景技术

中国南瓜(Cucurbita moschata D.)是南瓜属四个栽培种之一，是葫芦科重要的蔬菜作物，具有广泛的营养价值、药用价值和经济价值。我国南瓜相关研究以品种选育为主，基础研究薄弱，许多农艺性状的遗传规律至今还没有完全掌握，严重制约常规育种的发展。基因组学的迅速发展为打破常规育种的局限带来曙光，对目标性状基因的发掘和功能研究已成为基因组学研究的重点。正向和反向遗传学方法对基因组进行分析是功能基因组学研究的两种有效途径，而基因变异则是采用这两种方法进行研究的基础。突变体库构建作为获得基因变异的重要途径，逐年受到重视。

突变体库构建的方法主要分为物理诱变、化学诱变和生物诱变，其中理化诱变能够高效迅速地获得更多有价值的突变材料。目前，利用化学诱变剂对作物进行诱变是常用的方法之一。在诱变过程中，寻找半致死剂量(LD₅₀)是关键的步骤，对突变体库的高效构建至关重要，但由于作物种类、品种甚至是诱变部位的不同，化学诱变剂诱变的最佳处理浓度和时间千差万别。例如，利用同一种诱变剂，黄萍等(黄萍,李飞,颜谦.EMS诱变马铃薯抗寒突变体筛选[J].西南农业学报,2019,32(2):241-245)以马铃薯愈伤组织为材料，确定0.8％EMS处理4h可达到较好的半致死效果；而卢银等(卢银,刘梦洋,赵建军,王彦华,罗双霞,轩淑欣,代双燕,王超硕,申书兴.大白菜突变体库的构建及M₂叶片表型变异的研究[J].园艺学报,2014,41(8):1609-1619.)以大白菜种子为材料，确定0.4％EMS诱变处理16h为大白菜种子EMS诱变的半致死剂量。重要的是，在利用化学诱变剂进行诱变时，还存在发芽率接近半致死的同时难以保证一定的成苗率的问题。

因此，针对不同的作物进行化学诱变时，对于药剂及其浓度和处理时间的选择成为本领域的一个研究问题。

2017年南瓜全基因组测序顺利完成，使南瓜遗传育种的相关研究逐步步入后基因组时代，构建南瓜突变体库，深入***研究南瓜相关功能基因势在必行。然而，南瓜突变体库构建及相关研究工作目前国内外尚未见报道。

发明内容

针对技术的缺点和需求，本发明的目的在于提供一种中国南瓜突变体的诱变方法，所述诱变方法包括如下步骤：

(1)将饱满、大小均一的南瓜种子在水中进行浸种，然后进行催芽处理；然后利用体积浓度为1.6～1.8％的甲基磺酸乙酯溶液进行浸泡处理12小时；

(2)用清水将经步骤(1)处理后的种子洗净，之后平铺在内覆湿润滤纸的培养皿中，在培养箱中进行催芽，之后依次进行播种、育苗和定植；

(3)待植株长至5叶1心时进行摘心处理，双蔓整枝，植株记为M₁代；

(4)对M₁代进行性状观察并进行同蔓自交留种，获得自交南瓜种子，记为M₂代；对M₂代植株性状进行观察，并筛选变异体，获得突变体。

作为本发明的一个实施方案，步骤(1)中，所述南瓜的品种为中国南瓜高代自交系“N87”。

优选的，步骤(1)中，进行所述浸种时的方法为：于28℃温水中浸种4小时。

优选的，步骤(1)中，进行所述催芽的方法为：于28℃催芽12小时。

优选的，步骤(1)中，所述甲基磺酸乙酯溶液的体积浓度为1.6％。

优选的，步骤(1)中，制备甲基磺酸乙酯溶液时，使用的稀释剂为0.1mol·L^-1，pH＝7.0的磷酸缓冲液。

优选的，步骤(2)中，进行所述催芽的方法为：在28℃培养箱中催芽36h。

优选的，步骤(3)中，进行植株摘心的时间为：5叶1心期。

优选的，步骤(3)中，植株整枝方式为：双蔓整枝。

优选的，步骤(4)中，植株留种的方式为：同蔓自交留种。

通常情况下，步骤(4)中，所述性状包括叶色、叶形、叶片大小、株形、花色、瓜形和性别。

如本发明的一个实施例所示，在甲基磺酸乙酯(简称EMS，本说明书中其它地方同此含义)浓度大于0.8％时，随着诱变时间和EMS浓度的增加，种子的发芽率和成苗率均呈现下降的趋势，表明EMS诱变能够导致中国南瓜种子当代的致死。在1.6％EMS浓度下处理12h时，种子的发芽率为59％，芽势较弱，成苗率为65％，幼苗生长缓慢、真叶皱缩，综合成苗率为38.4％，在发芽率接近半致死的同时还可保证一定的成苗率。

如本发明的一个实施例所示，同蔓自交留种时，M₂代即可出现能够稳定遗传的突变材料，与单蔓整枝相比，极大提高了突变体的获得效率。

如本发明的一个实施例所示，本发明对98个家系进行了观测，发现M₂代总突变频率达11.2％，在株形、叶片大小、果形、花色等方面获得了一批稳定遗传的突变材料。

本发明的有益效果：

本发明的方法可以使得对南瓜进行诱变时，种子发芽率为59％，M₂代总体表型突变频率达11.2％，可以有效构建中国南瓜突变体库。

附图说明

图1为EMS处理对中国南瓜种子发芽及苗期的影响；

图2为M₂群体真叶表型变异情况；

图3为M₂群体株型表型变异情况；

图4为M₂群体生殖器官表型变异情况；

图5为M₂群体果型表型变异情况；

图6为白花突变材料；

图7为短蔓突变材料。

具体实施方式

下面通过实施例对本发明进行具体描述，有必要在此指出的是以下实施例只是用于对本发明进行进一步的说明，不能理解为对本发明保护范围的限制，该领域的技术熟练人员根据上述发明内容所做出的一些非本质的改进和调整，仍属于本发明的保护范围。

实施例1

1材料与方法

1.1材料及试剂

以中国南瓜高代自交系“N87”(与下文中的“中国南瓜“N87””同含义)种子为材料，由湖南省蔬菜研究所南瓜课题组提供。EMS诱变剂购于美国Sigma公司，为无色溶液，使用时用0.1mol·L^-1，pH＝7.0的磷酸缓冲液稀释成不同浓度。

1.2试验方法

1.2.1 EMS最佳诱变条件的筛选

将“N87”种子在28℃温水中浸种4h，28℃催芽12h，然后在通风橱中将其浸入50ml不同浓度(0.8％、1.0％、1.2％、1.4％、1.6％、1.8％)的EMS溶液中，以磷酸缓冲液浸种为对照，在28℃的摇床上分别震荡10h、12h、14h，浸种结束后，在通风橱中将EMS废液倒入废液桶并用1mol·L^-1的Na₂S₂O₃溶液处理24h，处理完成的种子在流水下冲洗8h后，将种子平铺在内覆湿润滤纸的培养皿中，在28℃培养箱中催芽36h，催芽结束后统计种子芽率及芽势，然后将种子播种于穴盘，7d后统计各处理的成苗率及植株苗期生长情况，综合评估以确定中国南瓜种子EMS诱变的最佳处理条件。以上每处理100粒种子，重复3次。

1.2.1中国南瓜突变体库的构建

2018年春季，将10000粒饱满、大小均一的中国南瓜“N87”的种子采用筛选的最佳诱变条件进行诱变处理，将处理后发芽的种子播种至穴盘内进行育苗，4月中旬定植于湖南省蔬菜研究所高桥科研基地，共成活3960个单株，双蔓整枝，构成中国南瓜突变体库M₁代群体，正常田间管理，严格同蔓自交授粉，共收获725份单株自交瓜种子，每份种子记为1个M₂株系。2018年秋季在三亚，M₂代中随机选取了98个株系进行种植，每株系定植16株(不足16株按实际株数种植)，共计1432个单株，构成中国南瓜突变体库M₂群体，正常田间管理。

参照农业部中国南瓜DUS测试指南，以野生型中国南瓜“N87”为对照，分别观察M₁、M₂变异群体的形态特征，记录变异群体的叶色、叶形、叶片大小、株形、花色、瓜形、性别等性状。M₂代中发现的变异材料自交留种的同时与野生型杂交以构建分离群体，对相关变异性状进行遗传分析。

2结果与分析

2.1中国南瓜种子EMS最佳诱变条件的筛选

由表1可以看出，在EMS浓度为0.8％时，种子的发芽率与对照相比有所提高，推测低浓度的EMS能促进中国南瓜种子的发芽。在EMS浓度大于0.8％时，随着诱变时间和EMS浓度的增加，种子的发芽率和成苗率均呈现下降的趋势，表明EMS诱变能够导致中国南瓜种子当代的致死。在1.6％EMS浓度下处理12h时，种子的发芽率为59％，芽势较弱，成苗率为65％，幼苗生长缓慢、真叶皱缩，综合成苗率为38.4％(图1中的A、B、C、D)，在发芽率接近半致死的同时还可保证一定的成苗率；未经EMS处理时则表现为发芽率97％，芽势强，成苗率96％，苗期生长旺盛、真叶平展(图1中的a、b、c、d)。综上确定1.6％EMS处理12h是中国南瓜种子最佳的诱变处理条件。

表1不同浓度EMS和处理时间对中国南瓜种子发芽率和成苗率的影响

2.2中国南瓜突变体库M₁群体的表型变异分析

2018年春季，将经EMS处理后发芽的种子播种至穴盘内进行育苗，最终田间成活3960个单株，构成中国南瓜突变体库M₁代群体。M₁群体中出现了很多表型变异，但前人研究表明这些变异很多是化学药害造成的，属不可遗传的变异，因此作者对M₁群体只进行观测而没有进行筛选。M₁群体正常田间管理，严格自交授粉，由于EMS处理后的植株很多表现出叶片黄化、白化、叶片皱缩、植株簇生、雌花畸形、花粉败育、花期不遇等情况，自交授粉率低，M₁群体只收获725个单株自交瓜种子，记为M₂代。

2.3 M₂群体田间性状调查及部分突变性状分析

2018年秋季在海南三亚南滨农场种植M₂代98个家系，每个家系种植16株，部分单株不足16株，共计1432个单株，自交留种，同时把突变体与野生型进行杂交。调查发现，M₂代突变材料中总体表型突变频率为11.2％，主要包括叶色、叶形、叶片大小、花色、花期、雌花节位、单性结实、株形、蔓长、果形等变异(表2)。

表2 M₂代群体表型变异情况

2.3.1 M₂群体真叶突变表型变异分析

野生型中国南瓜材料N87的真叶近掌状，边缘缺裂中等，上覆白斑，叶色深绿(图2中的A)。M₂群体中的真叶变异主要表现在叶形和叶色2两个方面，其中叶形有叶片小而尖、叶色淡绿(图2中的B)；叶片近圆形(图2中的C)；叶缘细锯齿状且内卷(图2中的D)；叶片小而皱缩、缺刻极深、叶色浓绿(图2中的E)等突变材料出现；叶色方面，出现了叶色淡绿(图2中的F)；全白色(图2中的G)；浅黄色上覆白斑(图2中的H)；深黄色(图2中的I)；浅黄色与绿色不规则嵌合(图2中的J)；浅黄色与绿色规则嵌合(图2中的K)；生长点黄化后逐渐又转为绿色等突变材料(图2中的L)。叶片变异是在M₂群体中突变频率较高的一种类型，其突变频率为4.55％，占总变异性状数的40.63％。

2.3.2 M₂群体株型突变表型变异分析

野生型南瓜N87属中国南瓜类型，主蔓长3.5m左右，叶片长约28cm、宽约26cm、上被白斑、叶色深绿，主生长点明显，主蔓节间长约23cm(图3中的A)。M2群体中株形突变主要表现为植株生长瘦弱、叶片变小(图3中的B)；植株叶片生长紧凑、叶柄与主蔓夹角变小(图3中的C)；植株叶片浅绿、主蔓无法正常伸长(图3中的D)；叶片皱缩无法正常展开、植株呈鸡爪状(图3中的E)；植株簇生无生长点(图3中的F)；花打顶(图3中的G)；植株节间长变短、呈半蔓生状(图3中的H)。株型变异频率仅次于叶片变异频率，其突变频率为2.31％，占总变异性状数的20.63％。

2.3.3 M₂群体生殖器官突变表型变异分析

野生型南瓜花冠颜色为橙黄色(图4中的A)，雄花柱头细长、上被花粉，雌花花冠能够正常打开、子房大小正常。M₂代生殖器官变异主要表现为花冠颜色变浅、呈白色(图4中的B)；雄花柱头短缩、无花粉(图4中的C)；雌花花冠不能正常打开、子房***膨大、可单性结实等现象(图4中的D)。生殖器官变异在M₂群体中突变频率为2.1％，占总变异频率的18.8％。

2.3.4 M₂群体果实突变表型变异分析

野生型中国南瓜N87为高代自交系，其果实长纺锤形、果长约24cm、宽约20cm、无明显果柄、浅棱、成熟果深黄色、上覆蜡粉、一致性好(图5中的A)。M₂群体中出现了很多果型变异的情况，主要表现为果长变短呈扁圆形(图5中的B)；高圆形(图5中的C)；正圆形(图5中的D)；果长与野生型基本一致、但果粗***呈近高圆形(图5中的E)；果柄和底部收窄变尖(图5中的F)；果长变长呈长圆筒形(图5中的G)；有瓜把和种腔膨大(图5中的H)。果型变异在M₂群体中突变频率为2.24％，占总变异频率的20％。

2.4花色与短蔓突变性状的观测与遗传分析

M₂群体中很多突变性状植株，无法收获自交种子，导致无法进行突变性状M₃代验证，目前已通过M₃代和F₂代分离群体验证，明确为稳定可遗传变异的有白花突变(图6中的B)和短蔓突变(图7中的B)，卡方测验结果(表3)表明，这两个性状F₂代的分离比均符合3：1，为单基因隐形突变，目前作者正在对这2个突变性状进行基因定位及相关研究。

表3两个突变性状的卡方值计算表

注:x²＜3.84时，分离比符合孟德尔3：1分离定律

本发明以中国南瓜高代自交系种子为材料，以半致死率为最佳诱变条件的筛选标准，发现中国南瓜种子用1.6％EMS处理12h时，其发芽率为59％，成苗率为65％，M₂代总体表型突变频率达11.2％，利用此方法进行中国南瓜突变体库的构建，即可产生较高的突变频率，又可保障突变体库具有一定的规模。

本发明利用1.6％EMS处理10000粒中国南瓜种子12h时，获得了由3960个单株组成的M₁群体，对M₁群体进行全生育期观察发现，该群体在苗期存在发芽缓慢、真叶皱缩，叶片黄化、白化、叶色嵌合，叶片细小或无法正常展开、植株矮小，生殖器官退化等变异现象。由于M₁代中很多变异是化学药害造成的假突变，因此我们没有对M₁代进行选择，但进行必要的观测仍很有必要，一方面可以通过M₁代的变异情况评估诱变效果，还可以对M₂代突变材料的筛选提供必要指导。M₁代全部自交留种，共收获725个单株自交瓜种子，记为M₂代。

每份M₂代种子记为一个家系，每家系种植16株进行表型变异的观察，由于南瓜种植所需面积大且需单株自交授粉，目前本试验只对98个家系进行了观测，发现M₂代总突变频率达11.2％，在株形、叶片大小、果形、花色等方面获得了一批稳定遗传的突变材料。本试验仍剩余627个家系未进行筛选，基于已筛选家系的突变频率推测，预期将获得很多突变材料，可为下一步进行相关基础研究及新品种选育打下坚实材料基础。

EMS诱变是非定向的，产生的突变材料在育种上是否有应用价值需要在生产实践中进一步检验，但这些突变材料在相关基础研究中意义重大，对突变性状进行遗传分析是进行相关基础研究的前提。M₁代中出现了很多叶色嵌合、叶片形态变化、生殖器官退化等表型，但是这些表型在其M₂代株系中大部分恢复正常，这与前人的研究结论是一致的。一般情况下，EMS导致的点突变往往导致基因的失活，假如突变位点为表型相关基因，则在M₂株系中会出现突变的隐性表型。本发明在M₂代中发现很多表型突变材料，经M₃代验证能够稳定遗传的有以下几种。花色突变材料，该材料可作为标记性状应用于南瓜的杂交制种过程、开发新型制种模式。短蔓突变材料节间长变短、半蔓生，株形紧凑，是培育短蔓品种的理想材料。强雄与单性结实突变材料，强雄材料45节内无雌花、单性结实突变材料雌花花冠无法正常打开但可正常坐果，这两个材料对研究南瓜性别意义重大。目前作者正对这些性状进行基因定位等方面的研究，将有力推动中国南瓜的基础研究水平。

本发明突变体库数量较大且南瓜突变体筛选相对困难，在突变性状的鉴定中，作者只对表型变异进行了鉴定，而其他一些与育种关系密切的性状如果实淀粉含量、纤维素含量、抗逆性等方面没有进行筛选，下一步做好已获得突变材料的基础研究的同时，将加强在这些方面的筛选工作，争取获得一些能够应用于育种实践的突变材料。

本发明确定了中国南瓜高代自交系“N87”种子EMS诱变的最佳条件为1.6％EMS处理12h，该处理下种子发芽率为59％，M₂代总体表型突变频率达11.2％，构建了由725个家系组成的中国南瓜突变体库。通过该突变体库筛选到了一些能够稳定遗传的突变材料，其中花色突变材料、短蔓突变材料、单性结实突变材料、强雄突变材料有望在南瓜轻简化栽培上发挥重要作用。另外，本研究已确定了花色突变和短蔓突变为单基因隐形突变所致，相关基因的定位工作正稳步推进。

Claims (10)

1.一种中国南瓜突变体的诱变方法，其特征在于，所述诱变方法包括如下步骤：

(1)将饱满、大小均一的南瓜种子在水中进行浸种，然后进行催芽处理；然后利用体积浓度为1.6～1.8％的甲基磺酸乙酯溶液进行浸泡处理12小时；

(2)用清水将经步骤(1)处理后的种子洗净，之后平铺在内覆湿润滤纸的培养皿中，在培养箱中进行催芽，之后依次进行播种、育苗和定植；

(3)待植株长至5叶1心时进行摘心处理，双蔓整枝，植株记为M₁代；

(4)对M₁代进行性状观察并进行同蔓自交留种，获得自交南瓜种子，记为M₂代；对M₂代植株性状进行观察，并筛选变异体，获得突变体。

2.根据权利要求1所述的诱变方法，其特征在于，步骤(1)中，所述南瓜的品种为中国南瓜高代自交系“N87”。

3.根据权利要求1所述的诱变方法，其特征在于，步骤(1)中，进行所述浸种时的方法为：于28℃温水中浸种4小时。

4.根据权利要求1所述的诱变方法，其特征在于，步骤(1)中，进行所述催芽的方法为：于28℃催芽12小时。

5.根据权利要求1所述的诱变方法，其特征在于，步骤(1)中，所述甲基磺酸乙酯溶液的体积浓度为1.6％。

6.根据权利要求1或5所述的诱变方法，其特征在于，步骤(1)中，制备甲基磺酸乙酯溶液时，使用的稀释剂为0.1mol·L^-1，pH＝7.0的磷酸缓冲液。

7.根据权利要求1所述的诱变方法，其特征在于，步骤(2)中，进行所述催芽的方法为：在28℃培养箱中催芽36h。

8.根据权利要求1所述的诱变方法，其特征在于，步骤(3)中，进行植株摘心时间为：5叶1心期；和/或，步骤(3)中，植株整枝方式为：双蔓整枝。

9.根据权利要求1所述的诱变方法，其特征在于，步骤(4)中，植株留种的方式为：同蔓自交留种。

10.根据权利要求1所述的诱变方法，其特征在于，步骤(4)中，所述性状包括叶色、叶形、叶片大小、株形、花色、瓜形和性别。

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