CN110856724A - 包含核酸及car修饰的免疫细胞的治疗剂及其应用 - Google Patents

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Abstract

涉及包含核酸及CAR修饰的免疫细胞的治疗剂及应用。所述治疗剂包含第一组合物和第二组合物，第一组合物包含用于导入肿瘤细胞和/或癌细胞的、具有标记性多肽编码序列的核酸；所述标记性多肽具有可操作地连接的胞外抗原决定区、间隔部分和跨膜部分，能够经表达而修饰在所述肿瘤细胞和/或癌细胞的表面；所述胞外抗原决定区的氨基酸序列含有一个或多个抗原表位多肽的氨基酸序列；其中在自然状态下，哺乳动物细胞膜蛋白或分泌蛋白的氨基酸序列不含有所述抗原表位多肽的氨基酸序列；所述第二组合物包含嵌合抗原受体修饰的免疫细胞；所述嵌合抗原受体修饰的免疫细胞能够特异性识别并结合所述标记性多肽的所述胞外抗原决定区。本发明实现了协同疗效。

Description

包含核酸及CAR修饰的免疫细胞的治疗剂及其应用
技术领域
本发明属于医学生物工程领域，具体而言，涉及包含核酸及CAR修饰的免疫细胞的治疗剂、标记性多肽、嵌合抗原受体、编码核酸、表达载体、重组病毒、药盒及其应用。
背景技术
癌症免疫治疗是通过激活体内的免疫***，特异性地清除癌症微小残留病灶或明显抑制癌症细胞增殖的治疗方法。这种治疗方法具有作用期长和副作用小等优点，被称为现代癌症治疗的第4种模式。最近几年，癌症免疫治疗获得了不少进展，《Science》杂志把癌症免疫治疗列为2013年的重大科学突破。嵌合性抗原受体CAR修饰的免疫细胞是现在最有效、最有希望的肿瘤细胞免疫治疗产品。CAR免疫细胞技术具有抗体药的专一性与细胞疗法的可持续性，是精准医疗，也是个性化医疗。在未来5年内，免疫疗法，包括CAR免疫疗法，有望取代化疗，成为癌症治疗的标准疗法。CAR免疫疗法目前主要以T-细胞为载体，在治疗恶性血液癌症方面已取得革命性进展，全球市场达到百亿美元。但CAR-T在实体瘤治疗中当前的结果不佳，仍需要解决安全性、有效性和大规模生产等问题。这些问题解决后CAR免疫疗法会逐渐渗透千亿美元的实体瘤市场。
CAR是人工改造的受体，因此可将识别任意抗原的特异性受体嫁接到免疫效应细胞上。CAR的基础设计中包括一个肿瘤相关抗原(tumor-associated antigen，TAA)结合区(通常来源于单克隆抗体抗原结合区域的scFV段)，一个胞外铰链区，一个跨膜区和一个胞内信号区。由于这种受体的不同部分有不同的来源，因此这种受体被称为嵌合受体。简单地说，CAR-T就是将识别肿瘤细胞表面抗原的抗体与激活T细胞所需的信号分子连接，这样就可以让T细胞在抗体的指引下直接进攻癌细胞。CAR免疫细胞技术克服了发展抗肿瘤免疫治疗上一项高挑战性问题，即肿瘤形成的免疫逃逸机制。逃逸机制可使肿瘤免受免疫***的攻击，主要包括处理加工抗原能力下降，组织相容性复合体表达下降，肿瘤表面抗原表达下降，细胞因子表达下降，免疫抑制性分子表达增加。CAR免疫细胞的靶标跟细胞毒性T淋巴细胞不同，不是攻击肿瘤表面的通过抗原提呈途径被提呈的抗原，而是攻击肿瘤表面特异性分子，可以是蛋白，也可以是其它非蛋白分子。这些分子的表达与肿瘤细胞抗原加工能力及组织相容性复合体表达无关。所以，CAR免疫细胞的功能不受组织相容性复合物相关调节的限制。
但CAR-T技术在治疗实体瘤方面还存在很大的挑战，主要难点包括：1)实体瘤表达高度异质性的肿瘤抗原，即是多样性，使癌细胞容易逃过免疫***的监视；这与血液癌症不一样，如CD19白血病基本上都是CD19阳性；由于实体瘤抗原多样性，很难找到能杀伤所有的癌细胞的合适靶点，残余的靶点阴性癌细胞会引起肿瘤复发；2)实体瘤肿瘤抗原很多在正常组织上也有表达，很难设计肿瘤专一性的CAR，脱靶概率很大，靶向/脱靶毒性的风险高；3)T细胞肿瘤归巢差；实体肿瘤的细胞被致密的基质包裹，形成肿瘤的微环境；基质由被募集来的正常组织和骨髓来源的(基质)细胞聚集而成，阻止免疫细胞穿透这一屏障；4)实体瘤有很强的免疫抑制能力，许多肿瘤微环境中的细胞能抑制免疫细胞抗癌功能；所以浸润进入实体瘤的CAR-T也无法发挥高效癌细胞杀伤作用。
发明内容
为解决上述现有技术中所存在的问题，本发明提供了治疗剂、标记性多肽、嵌合抗原受体、编码核酸、表达载体、重组病毒、药盒及其应用。
具体而言，本发明提供了：
(1)一种用于***和/或癌症的治疗剂，包含：
(a)第一组合物，其中该第一组合物包含位于第一可药用载体中的第一活性成分，所述第一活性成分包括或含有用于导入肿瘤细胞和/或癌细胞的、具有标记性多肽编码序列的核酸；所述标记性多肽具有可操作地连接的胞外抗原决定区、间隔部分和跨膜部分，能够经表达而修饰在所述肿瘤细胞和/或癌细胞的表面；所述胞外抗原决定区的氨基酸序列含有一个或多个抗原表位多肽的氨基酸序列；其中在自然状态下，哺乳动物细胞膜蛋白或分泌蛋白的氨基酸序列不含有所述抗原表位多肽的氨基酸序列；以及
(b)第二组合物，其中该第二组合物包含位于第二可药用载体中的第二活性成分，所述第二活性成分包含嵌合抗原受体修饰的免疫细胞；所述的嵌合抗原受体修饰的免疫细胞能够特异性识别并结合所述标记性多肽的所述胞外抗原决定区。
(2)根据(1)所述的治疗剂，其中所述抗原表位多肽的氨基酸序列来源于自然界存在的蛋白的氨基酸序列，或者为人工合成的自然界不存在的氨基酸序列。
(3)根据(2)所述的治疗剂，其中所述自然界存在的蛋白包括哺乳动物细胞内蛋白、病毒蛋白、和所有其它非哺乳动物蛋白。
(4)根据(1)所述的治疗剂，其中所述抗原表位多肽的氨基酸序列包括以下标签的氨基酸序列：Myc标签、HA标签、Strep标签II、Flag标签、HAT标签、S标签、S1标签、蛋白C标签、tag-100标签、E2标签、TAP标签、HSV标签、KT3标签、S1标签、V5标签、VSV-G标签、His标签或RFP标签。
(5)根据(1)所述的治疗剂，其中所述胞外抗原决定区的氨基酸序列如SEQ ID NO:1、SEQ ID NO:2、SEQ ID NO:3、SEQ ID NO:4或SEQ ID NO:5所示。
(6)根据(1)所述的治疗剂，其中所述间隔部分来自CD8α的铰链区、IgG的铰链区或IgD的铰链区；优选地，所述间隔部分的氨基酸序列如SEQ ID NO:6所示；其中所述跨膜部分来源于CD8、CD3ζ、CD4或CD28的跨膜区；优选地，所述跨膜部分的氨基酸序列如SEQ ID NO:7所示。
(7)根据(1)所述的治疗剂，其中所述标记性多肽的氨基酸序列如SEQ ID NO:11、SEQ ID NO:12、SEQ ID NO:13、SEQ ID NO:14或SEQ ID NO:15所示。
(8)根据(1)所述的治疗剂，其中所述核酸包括DNA或RNA；所述RNA包括由所述DNA转录的mRNA。
(9)根据(1)所述的治疗剂，其中所述第一活性成分为重组病毒，所述重组病毒的基因组具有标记性多肽编码序列；其中，所述重组病毒包括选择复制型重组溶瘤病毒或复制缺陷型重组病毒。
(10)根据(9)所述的治疗剂，其中所述重组溶瘤病毒来源于具有溶瘤作用的经基因突变的病毒和具有溶瘤作用的野生型病毒；优选地，所述重组溶瘤病毒来源于具有溶瘤作用的腺病毒、痘病毒、单纯疱疹病毒、麻疹病毒、塞姆利基森林病毒、水疱性口炎病毒、脊髓灰质炎病毒、逆转录病毒、呼肠孤病毒、塞内卡谷病毒、埃可型肠道病毒、柯萨奇病毒、新城疫病毒和马拉巴病毒。
(11)根据(1)所述的治疗剂，其中所述嵌合抗原受体包括可操作地连接的、依次串联的抗原结合结构域、间隔区、跨膜区和胞内结构域，所述抗原结合结构域能够特异性识别并结合所述标记性多肽的所述胞外抗原决定区。
(12)根据(11)所述的治疗剂，其中所述抗原结合结构域的氨基酸序列如SEQ IDNO:42、SEQ ID NO:43或SEQ ID NO:44所示。
(13)根据(11)所述的治疗剂，其中所述胞内结构域来自淋巴细胞胞内激活信号转导区和可任选的淋巴细胞共刺激信号转导区，其中所述胞内激活信号转导区选自CD3ζ或DAP12的胞内激活信号转导区；所述可任选的淋巴细胞共刺激信号转导区选自4-1BB、CD28、CD27、OX40、GITR、和/或ICOSS的共刺激信号转导区。
(14)根据(11)所述的治疗剂，其中所述间隔区来自CD8α的铰链区、IgG的铰链区或IgD的铰链区，所述跨膜区来自CD8α的跨膜区、CD3ζ的跨膜区、CD4的跨膜区或CD28的跨膜区。
(15)根据(11)所述的治疗剂，其中所述嵌合抗原受体的氨基酸序列如SEQ ID NO:46、SEQ ID NO:47或SEQ ID NO:48所示。
(16)根据(1)所述的治疗剂，其中所述免疫细胞包括T细胞或NK细胞；其中，所述NK细胞包括自体NK细胞、异体NK细胞或NK细胞株，并且所述T细胞包括原始T细胞或其前体细胞，效应T细胞，记忆T细胞，NKT细胞，或T细胞株。
(17)根据(1)所述的治疗剂，其中所述第一组合物和所述第二组合物各自独立地存在于所述治疗剂中而互不混合。
(18)根据(8)所述的治疗剂，其中所述第一组合物包含治疗有效量的所述DNA、或治疗有效量的所述mRNA。
(19)根据(9)所述的治疗剂，其中所述第一组合物包含治疗有效量的所述重组病毒。
(20)根据(1)所述的治疗剂，其中所述第二组合物包含治疗有效量的所述的嵌合抗原受体修饰的免疫细胞。
(21)根据(8)所述的治疗剂，其中所述DNA配制成通过瘤内注射或静脉给药；所述mRNA配制成通过瘤内注射或静脉给药。
(22)根据(9)所述的治疗剂，其中所述重组病毒配制成通过瘤内注射给药或静脉给药。
(23)根据(1)所述的治疗剂，其中所述的嵌合抗原受体修饰的免疫细胞配制成通过静脉给药或局部给药。
(24)根据(1)所述的治疗剂，其中所述治疗剂由所述第一组合物和所述第二组合物组成。
(25)根据(1)-(24)中任一项所述的治疗剂在制备用于***和/或癌症的药物中的用途。
(26)根据(25)所述的用途，其中所述肿瘤和/或癌症包括：乳腺癌，头颈部肿瘤，滑膜癌，肾癌，***癌，黑色素瘤，肺癌，食管癌，结肠癌，直肠癌，脑癌，肝癌，骨癌，绒毛膜癌，胃泌素瘤，嗜铬细胞瘤，催乳素瘤，von Hippel-Lindau病，Zollinger-Ellison综合征，***癌，胆管癌，膀胱癌，输尿管癌，神经胶质瘤，神经母细胞瘤，脑膜瘤，脊髓肿瘤，骨软骨瘤，软骨肉瘤，尤文氏肉瘤，原发部位不明癌，类癌，纤维肉瘤，佩吉特病，***，胆囊癌，眼癌，卡波西氏肉瘤，***癌，睾丸癌，皮肤鳞状细胞癌，间皮瘤，多尖端骨髓瘤，卵巢癌，胰腺内分泌瘤，胰高血糖素瘤，胰腺癌，***癌，垂体癌，软组织肉瘤，视网膜母细胞瘤，小肠癌，胃癌，胸腺癌，滋养细胞癌，***，子宫内膜癌，***癌，外阴癌，蕈样真菌病，胰岛素瘤，心脏癌，脑膜癌，腹膜癌，胸膜癌和血液癌。
(27)一种标记性多肽，其特征在于，所述标记性多肽具有可操作地连接的胞外抗原决定区、间隔部分和跨膜部分，能够经表达而修饰在肿瘤细胞和/或癌细胞的表面；所述胞外抗原决定区的氨基酸序列含有一个或多个抗原表位多肽的氨基酸序列；其中在自然状态下，哺乳动物细胞膜蛋白或分泌蛋白的氨基酸序列不含有所述抗原表位多肽的氨基酸序列。
(28)根据(27)所述的标记性多肽，其中所述抗原表位多肽的氨基酸序列来源于自然界存在的蛋白的氨基酸序列，或者为人工合成的自然界不存在的氨基酸序列。
(29)根据(28)所述的标记性多肽，其中所述自然界存在的蛋白包括哺乳动物细胞内蛋白、病毒蛋白、和所有其它非哺乳动物蛋白。
(30)根据(27)所述的标记性多肽，其中所述抗原表位多肽的氨基酸序列包括以下标签的氨基酸序列：Myc标签、HA标签、Strep标签II、Flag标签、HAT标签、S标签、S1标签、蛋白C标签、tag-100标签、E2标签、TAP标签HSV标签、KT3标签、S1标签、V5标签、VSV-G标签、His标签或RFP标签。
(31)根据(27)所述的标记性多肽，其中所述胞外抗原决定区的氨基酸序列如SEQID NO:1、SEQ ID NO:2、SEQ ID NO:3、SEQ ID NO:4或SEQ ID NO:5所示。
(32)根据(27)所述的标记性多肽，其中所述间隔部分来自CD8α的铰链区、IgG的铰链区或IgD的铰链区；优选地，所述间隔部分的氨基酸序列如SEQ ID NO:6所示；其中所述跨膜部分来源于CD8、CD3ζ、CD4或CD28的跨膜区；优选地，所述跨膜部分的氨基酸序列如SEQID NO:7所示。
(33)根据(27)所述的标记性多肽，其中所述标记性多肽的氨基酸序列如SEQ IDNO:11、SEQ ID NO:12、SEQ ID NO:13、SEQ ID NO:14或SEQ ID NO:15所示。
(34)一种分离的、具有根据(27)-(33)中任一项所述的标记性多肽的编码序列的核酸。
(35)根据(34)所述的核酸，其中所述核酸依次包含可操作地连接的启动子、信号肽编码序列、以及根据(27)-(33)中任一项所述的标记性多肽的编码序列。
(36)根据(34)所述的核酸，其中所述核酸包括DNA和mRNA。
(37)一种重组表达载体，其中所述重组表达载体依次包含可操作地连接的启动子、信号肽编码序列、以及根据(27)-(33)中任一项所述的标记性多肽的编码序列。
(38)一种分离的重组病毒，其中所述重组病毒的基因组具有依次的可操作地连接的启动子、信号肽编码序列、以及根据(27)-(33)中任一项所述的标记性多肽的编码序列，并且所述标记性多肽能够经表达而修饰在肿瘤细胞和/或癌细胞的表面；并且，所述重组病毒包括选择复制型重组溶瘤病毒或复制缺陷型重组病毒。
(39)根据(38)所述的重组病毒，其中所述重组病毒为选择复制型重组溶瘤病毒，并且所述重组溶瘤病毒来源于具有溶瘤作用的经基因突变的病毒和具有溶瘤作用的野生型病毒；优选地，所述重组溶瘤病毒来源于具有溶瘤作用的腺病毒、痘病毒、单纯疱疹病毒、麻疹病毒、塞姆利基森林病毒、水疱性口炎病毒、脊髓灰质炎病毒、逆转录病毒、呼肠孤病毒、塞内卡谷病毒、埃可型肠道病毒、柯萨奇病毒、新城疫病毒和马拉巴病毒。
(40)一种嵌合抗原受体，该嵌合抗原受体包括可操作地连接的、依次串联的抗原结合结构域、间隔区、跨膜区和胞内结构域，其特征在于，所述抗原结合结构域能够识别并结合根据(27)-(33)中任一项所述的标记性多肽的胞外抗原决定区。
(41)根据(40)所述的嵌合抗原受体，其中所述抗原结合结构域的氨基酸序列如SEQ ID NO:42、SEQ ID NO:43或SEQ ID NO:44所示。
(42)根据(40)所述的嵌合抗原受体，其中所述胞内结构域来自淋巴细胞胞内激活信号转导区和可任选的淋巴细胞共刺激信号转导区，其中所述胞内激活信号转导区选自CD3ζ或DAP12的胞内激活信号转导区；所述可任选的淋巴细胞共刺激信号转导区选自4-1BB、CD28、CD27、OX40、GITR、和/或ICOSS的共刺激信号转导区。
(43)根据(40)所述的嵌合抗原受体，其中所述间隔区来自CD8α的铰链区、IgG的铰链区或IgD的铰链区，所述跨膜区来自CD8α的跨膜区、CD3ζ的跨膜区、CD4的跨膜区或CD28的跨膜区。
(44)根据(40)所述的嵌合抗原受体，其中所述嵌合抗原受体的氨基酸序列如SEQID NO:46、SEQ ID NO:47或SEQ ID NO:48所示。
(45)一种分离的、具有根据(40)-(44)中任一项所述的嵌合抗原受体的编码序列的DNA。
(46)根据(45)所述的DNA，其核苷酸序列如SEQ ID NO:53、SEQ ID NO:54或SEQ IDNO:55所示。
(47)一种分离的、由根据(45)或(46)所述的DNA转录的mRNA。
(48)一种重组表达载体，其中所述重组表达载体依次包含可操作地连接的启动子、信号肽编码序列、以及根据(40)-(44)中任一项所述的嵌合抗原受体的编码序列。
(49)一种嵌合抗原受体修饰的免疫细胞，该免疫细细胞的表面被(40)-(44)中任一项所述的嵌合抗原受体修饰。
(50)根据(49)所述的嵌合抗原受体修饰的免疫细胞，其中所述免疫细胞为NK细胞或T细胞；其中，所述NK细胞包括自体NK细胞、异体NK细胞或NK细胞株，并且所述T细胞包括原始T细胞或其前体细胞，效应T细胞，记忆T细胞，NKT细胞，或T细胞株。
(51)一种用于***和/或癌症的具有协同作用的联合药物的药盒，包括：
第一容器，该第一容器装有根据(1)-(24)中任一项所述的治疗剂中的第一组合物；
第二容器，该第二容器装有根据(1)-(24)中任一项所述的治疗剂中的第二组合物，其中所述第一容器和所述第二容器是独立的；以及
载明给药时机和给药方式的说明书。
(52)根据(34)-(36)中任一项所述的核酸在制备用于治疗或预防肿瘤和/或癌症的药物中的用途。
(53)根据(38)或(39)所述的重组病毒在制备用于治疗或预防肿瘤和/或癌症的药物中的用途。
(54)根据(49)或(50)所述的嵌合抗原受体修饰的免疫细胞在制备用于治疗或预防肿瘤和/或癌症的药物中的用途。
(55)根据(51)所述的药盒在制备用于治疗或预防肿瘤和/或癌症的药物中的用途。
(56)根据(52)-(55)中任一项所述的用途，其中所述肿瘤和/或癌症包括：乳腺癌，头颈部肿瘤，滑膜癌，肾癌，***癌，黑色素瘤，肺癌，食管癌，结肠癌，直肠癌，脑癌，肝癌，骨癌，绒毛膜癌，胃泌素瘤，嗜铬细胞瘤，催乳素瘤，von Hippel-Lindau病，Zollinger-Ellison综合征，***癌，胆管癌，膀胱癌，输尿管癌，神经胶质瘤，神经母细胞瘤，脑膜瘤，脊髓肿瘤，骨软骨瘤，软骨肉瘤，尤文氏肉瘤，原发部位不明癌，类癌，纤维肉瘤，佩吉特病，***，胆囊癌，眼癌，卡波西氏肉瘤，***癌，睾丸癌，皮肤鳞状细胞癌，间皮瘤，多尖端骨髓瘤，卵巢癌，胰腺内分泌瘤，胰高血糖素瘤，胰腺癌，***癌，垂体癌，软组织肉瘤，视网膜母细胞瘤，小肠癌，胃癌，胸腺癌，滋养细胞癌，***，子宫内膜癌，***癌，外阴癌，蕈样真菌病，胰岛素瘤，心脏癌，脑膜癌，腹膜癌，胸膜癌和血液癌。
(57)一种***和/或癌症的方法，包括：
对肿瘤和/或癌症患者施用根据(1)-(24)中任一项所述的治疗剂中的第一组合物；和
对所述肿瘤和/或癌症患者施用根据(1)-(24)中任一项所述的治疗剂中的第二组合物。
(58)根据(57)所述的方法，包括以下依次进行的步骤：
1)对所述肿瘤和/或癌症患者施用所述第一组合物；和
2)在施用所述第一组合物之后，对所述肿瘤和/或癌症患者施用所述第二组合物。
(59)根据(57)所述的方法，其中所述肿瘤和/或癌症包括：乳腺癌，头颈部肿瘤，滑膜癌，肾癌，***癌，黑色素瘤，肺癌，食管癌，结肠癌，直肠癌，脑癌，肝癌，骨癌，绒毛膜癌，胃泌素瘤，嗜铬细胞瘤，催乳素瘤，von Hippel-Lindau病，Zollinger-Ellison综合征，***癌，胆管癌，膀胱癌，输尿管癌，神经胶质瘤，神经母细胞瘤，脑膜瘤，脊髓肿瘤，骨软骨瘤，软骨肉瘤，尤文氏肉瘤，原发部位不明癌，类癌，纤维肉瘤，佩吉特病，***，胆囊癌，眼癌，卡波西氏肉瘤，***癌，睾丸癌，皮肤鳞状细胞癌，间皮瘤，多尖端骨髓瘤，卵巢癌，胰腺内分泌瘤，胰高血糖素瘤，胰腺癌，***癌，垂体癌，软组织肉瘤，视网膜母细胞瘤，小肠癌，胃癌，胸腺癌，滋养细胞癌，***，子宫内膜癌，***癌，外阴癌，蕈样真菌病，胰岛素瘤，心脏癌，脑膜癌，腹膜癌，胸膜癌和血液癌。
本发明与现有技术相比具有以下优点和积极效果：
本发明为了提高CAR修饰的免疫细胞***的效果，以及增加CAR修饰的免疫细胞***的适用范围，提出用外源标记性多肽标记肿瘤和/或癌症细胞的表面以及采用与识别该标记性多肽的CAR修饰的免疫细胞联用的策略，有效解决了肿瘤(特别是实体肿瘤)抗原表达的异质性和肿瘤和/或癌症细胞逃脱免疫监视的问题，提高了CAR修饰的免疫细胞对肿瘤和/或癌症细胞的识别敏感性，且有效降低靶向/脱靶毒性的风险，从而提高了CAR修饰的免疫细胞杀伤肿瘤细胞的疗效。当通过溶瘤病毒作为载体介导外源标记性多肽在肿瘤细胞中的表达时，在溶瘤病毒已有的溶瘤杀伤作用上，靶向标记性多肽的CAR修饰的细胞能有效清除已被溶瘤病毒感染的残余肿瘤细胞。同时由于溶瘤病毒破坏肿瘤的微环境，CAR修饰的细胞肿瘤归巢能力会有所提高，进一步提升实体瘤治疗的有效性。
具体而言，本发明首先设计了具有胞外抗原决定区、间隔部分和跨膜部分的标记性多肽氨基酸序列，以及具有该标记性多肽的编码序列的核酸，使得所述核酸在转染肿瘤细胞和/或癌细胞后、或在将所述核酸***病毒基因组后使所得到的重组病毒感染肿瘤细胞和/或癌细胞后，肿瘤细胞和/或癌细胞能够表达所述标记性多肽，该标记性多肽会最终修饰在肿瘤细胞和/或癌细胞表面。由于所述标记性多肽的胞外抗原决定区的氨基酸序列含有一个或多个抗原表位多肽的氨基酸序列，因此本发明有效解决了实体肿瘤抗原表达的异质性和肿瘤逃避免疫监视的问题。本发明还提出将包括或含有该标记性多肽的编码核酸的活性成分与识别胞外抗原决定区(特别是其中的抗原表位肽)的CAR修饰的免疫细胞联用，提高了CAR修饰的免疫细胞对肿瘤细胞的识别敏感性，从而进一步提高了CAR修饰的免疫细胞杀伤肿瘤细胞的能力。并且由于在自然状态下，哺乳动物细胞膜蛋白或分泌蛋白的氨基酸序列不含有所述抗原表位多肽的氨基酸序列，因此识别外源标记性多肽的胞外抗原决定区(特别是其中的抗原表位肽)的CAR修饰的免疫细胞不会对患者体内其它的表面未修饰外源标记性多肽的正常细胞进行识别和杀伤，因此本发明大大降低了CAR修饰的免疫细胞可能对患者造成的脱靶毒性。
进一步地，本发明通过溶瘤病毒将所述标记性多肽编码核酸导入肿瘤细胞和/或癌细胞，使得溶瘤病毒在杀伤肿瘤细胞和/或癌症细胞作用的同时，进一步达到上述显著加强外源的抗原表位肽在肿瘤细胞表面的表达与CAR修饰的免疫细胞联合所达到的协同治疗效果。由于溶瘤病毒破坏了肿瘤的微环境，使得CAR修饰的免疫细胞的肿瘤归巢能力提高，从而进一步了提升肿瘤(特别是实体瘤)治疗的有效性。此外，CAR修饰的免疫细胞还可以有效清除被溶瘤病毒感染后，不能完成复制周期并产生足够数量的子病毒而发生裂解的肿瘤细胞；由此实现了进一步的协同作用。此外，被溶瘤病毒裂解的肿瘤细胞所释放的抗原可进一步激活机体自身的抗肿瘤免疫，从而可实现比单独使用溶瘤病毒或CAR修饰的免疫细胞更好的肿瘤杀伤效果，实现了协同治疗效果。
本发明通过上述发明构思提供了一个全新的肿瘤治疗概念，具有成为有效的抗肿瘤生物药的强大发展前景。
定义
在本发明中，词语“肿瘤”、“癌症”、“肿瘤细胞”、“癌细胞”涵盖本领域通常认为的含义。
本文所用的词语“溶瘤病毒”是指能够选择性地在肿瘤细胞中复制并裂解肿瘤细胞的病毒。
本文所用的词语“治疗有效量”是指功能药剂或药物组合物能够表现出可检测的治疗效果或抑制效果的量，或者起到抗肿瘤效果的量。所述效果可以通过本领域任何已知的检验方法检测。
本文所用的词语“给药”或“施用”是指向受试者提供化合物、复合物或组合物(包括病毒和细胞)。
本文所用的词语“患者”是指人或非人类生物。因此，本文所述的方法和组合物适用于人类疾病和兽类疾病。在一些实施方案中，患者患有肿瘤。在一些例子中，患者同时患有一种或多种类型的癌症。
本文所用的词语“协同效果”是指两种或多种药剂共同起到的效果，该效果大于其中各药剂的单独效果的总和。
本文所用的术语“pfu”或“蚀斑形成单位”(plaque forming unit)是指：产生一个蚀斑的病毒量称为一个蚀斑形成单位(pfu)。
本文所用的术语“VP”是指病毒颗粒的个数。
本文所用的术语“VP/kg”是指病毒颗粒数/千克患者体重。
本文所用的术语“TCID50”是指半数组织培养感染剂量(median tissue cultureinfective dose)，表示使半数组织培养物遭受感染，而发生细胞病变的病毒剂量。
本文所用的术语“MOI”或“感染复数”(Multiplicity of infection)也即，病毒与细胞个数比，是指用以起始病毒感染的每个细胞感染病毒颗粒的粒数。MOI＝pfu/细胞，即细胞个数×MOI＝总PFU。
附图说明
图1是示出本发明一种构思的示意图。
图2是示出本发明一个实施方案中包含标记性多肽编码序列的核酸的结构示意图，从5’到3’端分别包括启动子、信号肽、胞外抗原决定区、间隔部分和跨膜部分。
图3是本发明一个实施方案中利用Crisper Cas9技术制备重组溶瘤痘病毒时供体质粒的结构示意图，从左到右分别是bla启动子、氨苄抗性基因、pUC起始点、先导RNA-1(gRNA1)的剪切位点、左侧同源臂(LHR480)、标记性多肽TT3编码序列、信号肽编码序列(未示出)、pS启动子、LoxP位点、p7.5启动子、PuroGFP编码序列、LoxP位点、右侧同源臂(RHR520)、先导RNA-2(gRNA2)的剪切位点。
图4是本发明一个实施方案中Crisper Cas9对DDVV-RFP溶瘤痘病毒基因组TK位点进行剪切的示意图。上图代表DDVV-RFP溶瘤痘病毒基因组，下图示意性示出两个先导RNA对TK基因的左半部分和右半部分介导的剪切。
图5示出本发明制备例1中利用电转技术对肿瘤细胞进行标记，并通过流式细胞术检测标记性多肽在肿瘤细胞表面表达的结果。图5A和B分别示出TT1和TT2标记的Jurkat永生化T淋巴细胞的结果，图5C-E分别示出TT3标记的人卵巢癌细胞SKOV3-luc、人结直肠癌细胞HCT116-luc和人肝癌细胞SK-HEP-1的结果。图中横坐标为流式细胞仪所显示的荧光强度读数，纵坐标表示相对细胞数。
图6示出本发明实施例1中针对TT1的CAR-T细胞对标记后的Jurkat细胞的体外杀伤实验结果。其中纵坐标表示肿瘤细胞被杀伤后的％特异性裂解(即，特异性裂解的比例)；横坐标表示效应细胞和肿瘤细胞的比例；实线即“TT1-BBZ”示出靶向TT1的CAR修饰的T细胞组对TT1标记的Jurkat细胞的杀伤结果；虚线即“空白”(Mock)示出空白电转的T细胞组(阴性对照组)对TT1标记的Jurkat细胞的杀伤结果。
图7示出本发明实施例1中针对TT2的CAR-T细胞对标记后的Jurkat细胞的体外杀伤实验结果。其中纵坐标表示肿瘤细胞被杀伤后的％特异性裂解；横坐标表示效应细胞和肿瘤细胞的比例；实线即“TT2-BBZ”示出靶向TT2的CAR修饰的T细胞组对TT2标记的Jurkat细胞的杀伤结果；虚线即“空白”示出空白电转的T细胞组(阴性对照组)对TT2标记的Jurkat细胞的杀伤结果。
图8示出本发明实施例2中靶向TT3的CAR-T细胞对标记后的HCT116-luc(A)和Jurkat(B)细胞的体外杀伤实验结果。其中纵坐标表示肿瘤细胞被杀伤后特异性裂解的比例；横坐标表示效应细胞和肿瘤细胞的比例；实线即“CAR T/HCT116TT3”和“CAR T/JurkatTT3”分别示出靶向TT3的CAR修饰的T细胞组的结果；虚线即“WT T/HCT116TT3”和“WT T/Jurkat TT3”分别示出野生型T细胞组(阴性对照组)的结果。
图9示出本发明实施例3中靶向TT3的CAR-T细胞对被TT3标记和没有被标记的HCT116-luc的体外杀伤实验结果。图A为HCT116-luc标记有TT3，图B为HCT116-luc没有被TT3标记。其中纵坐标表示肿瘤细胞被杀伤后特异性裂解的比例；横坐标表示效应细胞和肿瘤细胞的比例；实线即“αTT3-41BBζ”示出靶向TT3的CAR修饰的T细胞组的结果；虚线即“GFP-ζ”示出mGFP-Z修饰的T细胞组(阴性对照组)的结果。
图10示出本发明实施例4中靶向TT1或TT2的CAR-T细胞与标记后的Jurkat细胞共培养后，释放IFN-γ的Elispot结果。左图为Elispot实验孔的图片，右图为Elispot的分析统计结果。图中“Mock-T”表示没有被CAR修饰的T细胞组(对照组)，“TT1CAR-T”和“TT2CAR-T”分别表示被靶向TT1或TT2的CAR修饰的T细胞组。右图中横坐标表示用不同标记性多肽标记的Jurkat细胞，纵坐标表示相对IFN-γ数量(以每5×104个T细胞中的斑点数表示)。
图11示出本发明实施例5中靶向TT3的CAR-NK细胞(图中示为NK aTT3CAR)对被标记和没有标记的SKOV3-luc或SK-HEP-1的体外杀伤实验结果。图A为没有被TT3标记的SKOV3-luc(图中示为SKOV3)的结果，图B为通过电转被标记有TT3的SKOV3-luc(图中示为SKOV3-EP)的结果；图C为没有被TT3标记的SK-HEP-1(图中示为SK-HEP-1)的结果，图D为通过电转被标记有TT3的SK-HEP-1(图中示为SK-HEP-1-EP)的结果。其中以mGFP-Z修饰的NK细胞(图中示为NK mGFPZ)作为阴性对照；纵坐标表示肿瘤细胞被杀伤后特异性裂解的比例；横坐标表示不同的实验组；效应细胞和靶细胞的比例为10:1。
图12示出本发明实施例6中过继回输靶向TT3CAR-T细胞对肿瘤细胞的杀伤作用。肿瘤接种7天后，小鼠分别被给与(1)PBS、(2)对照RNA CAR-T、(3)靶向TT3RNA CAR-T、(4)靶向TT3DNA CAR-T。图A示出分别在第7天和第14天通过生物荧光成像所显示的小鼠体内的肿瘤。图B示出第14天小鼠体内肿瘤细胞的BLI荧光强度。图B中横坐标表示不同的治疗组，纵坐标表示活体成像仪记录的动物体内肿瘤细胞荧光强度，其中纵坐标中所示辐射率(单位为“p/sec”，即，光子/秒)指单位时间从动物体表发出的光子数。
图13示出本发明制备例7中利用重组溶瘤痘病毒对肿瘤细胞进行标记后，通过流式细胞术检测GFP的表达和标记性多肽在肿瘤细胞表面表达的结果。各图中左侧峰为抗体染色的野生型肿瘤细胞(未经重组溶瘤痘病毒感染，阴性对照曲线)，右侧峰为肿瘤细胞被重组溶瘤痘病毒感染48小时之后GFP(图A-C)或TT3(图D-F)的表达强度曲线，图A和D为SKOV3-luc细胞的结果；图B和E为HCT116-luc细胞的结果；C和F为SK-HEP-1细胞的结果。各图中横坐标表示用流式细胞仪所显示的GFP或TT3荧光强度读数，纵坐标表示相对细胞数。
图14示出本发明实施例7中靶向TT3的CAR-NK细胞对标记和没有标记的SKOV3-luc或SK-HEP-1的体外杀伤实验结果。图A为没有被TT3标记的SKOV3-luc的结果；图B为通过重组溶瘤痘病毒感染后被标记有TT3的SKOV3-luc的结果；图C为没有被TT3标记的SK-HEP-1的结果；图D为通过重组溶瘤痘病毒感染后被标记有TT3的SK-HEP-1的结果。各图中纵坐标表示肿瘤细胞被杀伤后特异性裂解的比例；横坐标为不同的实验组；效应细胞和靶细胞的比例为10:1。
具体实施方式
以下通过具体实施方式的描述并参照附图对本发明作进一步说明，但这并非是对本发明的限制，本领域技术人员根据本发明的基本思想，可以做出各种修改或改进，但是只要不脱离本发明的基本思想，均在本发明的范围之内。
本发明的发明人意识到上述现有技术中的不足，通过理论研究和实验验证，设计了能够经表达而修饰在所述肿瘤细胞和/或癌细胞的表面并具有胞外抗原决定区的标记性多肽，并提出用该标记性多肽标记肿瘤和/或癌症细胞，并与识别该标记性多肽的CAR修饰的免疫细胞联用的策略，有效解决了肿瘤(特别是实体肿瘤)抗原表达的异质性和肿瘤和/或癌症细胞逃脱免疫监视的问题，提高了CAR修饰的免疫细胞对肿瘤和/或癌症细胞的识别敏感性，并能有效降低靶向/脱靶毒性的风险，从而提高了CAR修饰的免疫细胞杀伤肿瘤细胞的能力。
具体而言，本发明一个方面提供了一种用于***和/或癌症的治疗剂，包含：
(a)第一组合物，其中该第一组合物包含位于第一可药用载体中的第一活性成分，所述第一活性成分包括或含有用于导入肿瘤细胞和/或癌细胞的、具有标记性多肽编码序列的核酸；所述标记性多肽具有可操作地连接的胞外抗原决定区、间隔部分和跨膜部分，能够经表达而修饰在所述肿瘤细胞和/或癌细胞的表面；所述胞外抗原决定区的氨基酸序列含有一个或多个抗原表位多肽的氨基酸序列；其中在自然状态下，哺乳动物细胞膜蛋白或分泌蛋白的氨基酸序列不含有所述抗原表位多肽的氨基酸序列；以及
(b)第二组合物，其中该第二组合物包含位于第二可药用载体中的第二活性成分，所述第二活性成分包含嵌合抗原受体修饰的免疫细胞；所述的嵌合抗原受体修饰的免疫细胞能够特异性识别并结合所述标记性多肽的所述胞外抗原决定区。
以下逐一对所述治疗剂中的活性成分进行详细说明。
标记性多肽
本发明特别设计了用于修饰肿瘤细胞和/或癌细胞表面的标记性多肽的氨基酸序列，其中所述标记性多肽具有可操作地连接的胞外抗原决定区、间隔部分和跨膜部分，能够经表达而修饰在肿瘤细胞和/或癌细胞的表面；所述胞外抗原决定区的氨基酸序列含有一个或多个抗原表位多肽的氨基酸序列；其中在自然状态下，哺乳动物细胞膜蛋白或分泌蛋白的氨基酸序列不含有所述抗原表位多肽的氨基酸序列。
本文所用的术语“胞外抗原决定区”是指标记性多肽在表达于细胞表面时，位于细胞膜以外的含有抗原表位多肽的部分。
优选地，所述抗原表位多肽的氨基酸序列来源于自然界存在的蛋白的氨基酸序列，或者为人工合成的自然界不存在的氨基酸序列。其中，自然界存在的蛋白包括哺乳动物细胞内蛋白和除哺乳动物外的其它生物的蛋白。除哺乳动物外的其它生物的蛋白包括病毒蛋白、细菌蛋白、真菌蛋白、原生动物蛋白、植物蛋白、除哺乳动物外的其它动物蛋白。
在本发明的一些实施方案中，所述抗原表位多肽的氨基酸序列来源于以下标签的氨基酸序列：Myc标签、HA标签、Strep标签II、Flag标签、HAT标签、S标签、S1标签、蛋白C标签、tag-100标签、E2标签、TAP标签HSV标签、KT3标签、S1标签、V5标签、VSV-G标签、His标签或RFP标签等。
上述标签的氨基酸序列和核苷酸序列均为已知的，可以由本领域常用的公开数据库查询到。
在本发明的优选实施方案中，所述抗原表位多肽的氨基酸序列来源于以下标签的氨基酸序列：人Myc标签(相应的标记性多肽记为TT1)、流感病毒HA标签(相应的标记性多肽记为TT2)、Strep标签II(相应的标记性多肽记为TT3)。还优选地，所述抗原表位多肽的氨基酸序列与人Myc蛋白的第410位-第419位氨基酸序列一致；或者所述抗原表位多肽的氨基酸序列与流感病毒HA蛋白的第119位-第127位氨基酸序列一致；或者所述抗原表位多肽的氨基酸序列与Strep标签II(Strep标签II的详细描述见文献“Molecular InteractionBetween the Strep-tag Affinity Peptide and its Cognate Target,Streptavidin，Thomas G.M.Schmidt,Jurgen Koepke,Ronald Frank and Arne Skerra”)一致。在本发明另一些实施方案中，TT1和TT2的抗原表位多肽的氨基酸序列可向上述序列的上下游扩展不超过10个氨基酸。其中，人Myc蛋白的氨基酸序列可为UniProtKB中编号为P01106isoform1的氨基酸序列。流感病毒HA蛋白的氨基酸序列可为UniProtKB中编号为Q03909的氨基酸序列。
在一个具体实施方案中，所述标记性多肽的胞外抗原决定区的氨基酸序列包括一个或多个所述抗原表位多肽的氨基酸序列，其中当所述标记性多肽的胞外抗原决定区的氨基酸序列包括多个所述抗原表位多肽的氨基酸序列时，每两个相邻的所述抗原表位多肽之间是可操作地连接的，例如可以采用接头连接，也可以不采用接头而直接连接。所述接头的氨基酸序列可以为(例如)：G(如标记性多肽C1&2a、C1&2b中所采用)、GGS(如C1&2a、C1&2b中所采用)、GGGGSGGGGS(如TT1-TT3中所采用)。
为了增强标记性多肽的免疫原性，所述标记性多肽的胞外抗原决定区优选包含n个抗原表位多肽，其中n为大于等于1的整数，例如n＝1、2、3、4…。优选的是，n为1-10之间的整数；还优选的是，n为2-5之间的整数；还优选的是，n＝2或3。例如，所述标记性多肽的胞外抗原决定区可以包含3个重复的来源于Myc标签的抗原表位多肽(参见(例如)TT1)，或包含3个重复的来源于HA标签的抗原表位多肽(参见(例如)TT2)，或包含3个重复的来源于Strep标签II的抗原表位多肽(参见(例如)TT3)、或包含3个重复的来源于Myc标签的抗原表位多肽以及3个重复的来源于HA标签的抗原表位多肽(参见(例如)C1&2a)、或包含2个重复的来源于Myc标签的抗原表位多肽以及2个重复的来源于HA标签的抗原表位多肽(参见(例如)C1&2b)。
在本发明的一个实施方案中，所述胞外抗原决定区的氨基酸序列如SEQ ID NO:1(对应于TT1)、SEQ ID NO:2(对应于TT2)、SEQ ID NO:3(对应于TT3)、SEQ ID NO:4(对应于C1&2a)、SEQ ID NO:5所示(对应于C1&2b)。
优选地，所述跨膜部分来源于CD8、CD3ζ、CD4或CD28的跨膜区，其全长氨基酸序列和核苷酸序列均为已知的，可以由本领域常用的公开数据库查询到。还优选地，所述跨膜部分来源于人CD8α的跨膜区。更优选地，所述跨膜部分的氨基酸序列包含如SEQ ID NO:7所示的氨基酸序列。CD8为跨膜的糖基化膜蛋白，由α和β两个亚基组成，与T细胞表面受体共同作用使T细胞与特定抗原结合，CD8特异性结合MHC I，介导细胞毒性T细胞的杀伤作用。跨膜区通常为跨越细胞膜的疏水性α螺旋。
在本发明的标记性多肽中，所述跨膜部分与所述胞外抗原决定区可以通过间隔部分相连。这一区域的结构应该是易弯曲的，这样可以使胞外抗原决定区适应不同的方向，以促进相应的CAR的识别和结合。形式最简单的间隔部分是免疫球蛋白IgG l的铰链区，也可以是免疫球蛋白CH2CH3区的一部分。通过研究和实验摸索，本发明发现，所述间隔部分优选来自CD8α的铰链区，并且所述跨膜区优选来自CD8α的跨膜区。优选地，所述间隔部分的氨基酸序列如SEQ ID NO:6所示。还优选地，所述间隔部分和跨膜部分构成间隔跨膜部分，并且其中所述间隔跨膜部分的氨基酸序列与CD8α的第Y位-第210位氨基酸序列一致，且118≤Y≤128，Y为整数。其中，CD8α的氨基酸序列的UniProtKB编号可为P01732。也就是说，所述间隔跨膜部分的氨基酸序列优选选自CD8α的第118-210位氨基酸、并且包含第128-210位氨基酸。例如，所述间隔跨膜部分的氨基酸序列如以下氨基酸序列组中任一氨基酸序列所示：CD8α的第118-210位氨基酸、第119-210位氨基酸、第120-210位氨基酸、第121-210位氨基酸、第122-210位氨基酸、第123-210位氨基酸、第124-210位氨基酸、第125-210位氨基酸、第126-210位氨基酸、第127-210位氨基酸、或第128-210位氨基酸。
本文所用的术语“间隔部分”和“跨膜部分”的定义是本领域已知的，具体可参考“《免疫学导论》，于善谦，高等教育出版社，2008”；以及“《Immunobiology》，第七版，KennethMurphy,Paul Travers,Mark Walport等”。
在本发明的具有标记性多肽编码序列的核酸中，在标记性多肽编码序列的5’端之前还优选包含信号肽编码序列，信号肽具有引导目的蛋白分泌到细胞表面的功能。本发明发现，将所述胞外抗原决定区与来自GM-CSFα链的信号肽进行组合，可使标记性多肽表达于肿瘤细胞表面。GM-CSFα链信号肽是将本发明的标记性多肽靶向至分泌途径的前导序列，其编码序列首先与标记性多肽的编码序列一起在细胞内被翻译成蛋白质，引导合成的蛋白进入胞内分泌途径。在细胞表面表达标记性多肽前，信号肽被去除。GM-CSFα链的全长氨基酸序列和核苷酸序列均为已知的，可以由本领域常用的公开数据库查询到。优选地，所述信号肽的氨基酸序列选自人GM-CSFα链的第1位-第22位氨基酸。更优选的，所述信号肽的氨基酸序列如SEQ ID NO:8所示。其中，GM-CSFα链的氨基酸序列来自UniProtKB-P15509。
在本发明具体的实施方案中，所述标记性多肽包括可操作地连接且依次串联的以下氨基酸序列：胞外抗原决定区(其包括一个或多个所述抗原表位多肽的氨基酸序列)、间隔部分和跨膜部分。在本发明更具体的实施方案中，所述胞外抗原决定区的抗原表位多肽的氨基酸序列来自以下多肽中的抗原表位多肽的氨基酸序列：源于人细胞内蛋白Myc的Myc标签、源于流感病毒HA蛋白的HA标签、人工合成自然界不存在的序列Strep标签II，所述间隔部分来自人CD8α铰链区，所述跨膜部分来自人CD8α跨膜区。
如上所述，信号肽和胞外抗原决定区之间、胞外抗原决定区和间隔部分之间、间隔部分和跨膜部分之间是可操作地连接的，例如可以采用接头连接，也可以不采用接头而直接连接。在本发明的一个实施方案中，信号肽和胞外抗原决定区之间采用接头连接，例如为GAHADITS(如TT1-TT3中所采用)、GAHAAQLTLTKGNK(如C1&2a中所采用)、GAHA(如C1&2b中所采用)。胞外抗原决定区和间隔部分之间采用接头连接，(例如)为-Ala-Ser-、G，而间隔部分和跨膜部分之间未采用接头而直接连接。
本发明还进一步发现标记性多肽可以同时表达两种抗原表位多肽，具体而言，本发明设计了标记性多肽C1&2a，其抗原决定区含有Myc标签和HA标签的各三个重复。本发明还设计了标记性多肽C1&2b，其抗原决定区含有Myc标签和HA标签的各两个重复；为了进一步稳定标记性多肽在细胞膜表面的表达，在C1&2b的间隔部分加入了TIGIT的间隔区，其中所述加入的间隔区的氨基酸序列与TIGIT的第24位-第140位氨基酸序列一致。其中，TIGIT的氨基酸序列来自UniProtKB-Q495A1。更优选的，所述添加的TIGIT间隔的氨基酸序列如SEQ ID NO:9所示，所述C1&2b的间隔跨膜部分的氨基酸序列如SEQ ID NO:10所示。
优选地，所述标记性多肽的氨基酸序列如SEQ ID NO:11(对应于TT1)、SEQ ID NO:12(对应于TT2)、SEQ ID NO:13(对应于TT3)、SEQ ID NO:14(对应于C1&2a)或SEQ ID NO:15(对应于C1&2b)所示。
SEQ ID NO:11：
Figure BDA0001776469610000211
其中黑体示出抗原表位多肽，灰色部分示出来自CD8铰链区的间隔部分，下划线示出来自CD8跨膜区的跨膜部分。
SEQ ID NO:12：
Figure BDA0001776469610000212
其中黑体示出抗原表位多肽，灰色部分示出来自CD8铰链区的间隔部分，下划线示出来自CD8跨膜区的跨膜部分。
SEQ ID NO:13：
Figure BDA0001776469610000213
Figure BDA0001776469610000221
其中黑体示出抗原表位多肽，灰色部分示出来自CD8铰链区的间隔部分，下划线示出来自CD8跨膜区的跨膜部分。
SEQ ID NO:14：
Figure BDA0001776469610000222
其中黑体示出抗原表位多肽，灰色部分示出来自CD8铰链区的间隔部分，下划线示出来自CD8跨膜区的跨膜部分。
SEQ ID NO:15：
Figure BDA0001776469610000223
其中黑体示出抗原表位多肽，深灰色部分示出间隔部分中来自TIGIT间隔区的部分，浅灰色部分示出间隔部分中来自CD8铰链区的部分，下划线示出来自CD8跨膜区的跨膜部分。
具有标记性多肽编码序列的核酸
所述标记性多肽编码序列包含胞外抗原决定区编码序列、间隔部分和跨膜部分编码序列，所述胞外抗原决定区编码序列编码所述标记性多肽的胞外抗原决定区，所述间隔部分编码序列编码所述标记性多肽的间隔部分，所述跨膜部分编码序列编码所述标记性多肽的跨膜部分。所述胞外抗原决定区编码序列含有一个或多个抗原表位多肽的编码序列；其中在自然状态下，哺乳动物细胞膜蛋白或分泌蛋白的编码序列不含有所述抗原表位多肽的编码序列。
在本发明的一些实施方案中，所述抗原表位多肽编码序列来源于以下标签的编码序列：Myc标签、HA标签、Strep标签II、Flag标签、HAT标签、S标签、S1标签、蛋白C标签、tag-100标签、E2标签、TAP标签HSV标签、KT3标签、S1标签、V5标签、VSV-G标签、His标签或RFP标签等。
优选地，所述抗原表位多肽编码序列来源于以下标签的氨基酸序列：Myc标签的编码序列、HA标签的编码序列、Strep标签II的编码序列。
在一个具体实施方案中，所述标记性多肽的胞外抗原决定区编码序列包括一个或多个所述抗原表位多肽的编码序列，其中当所述标记性多肽的胞外抗原决定区编码序列包括多个所述抗原表位多肽的编码序列时，每两个相邻的所述抗原表位多肽编码序列之间是可操作地连接的，例如可以采用接头编码序列连接，也可以不采用接头编码序列而直接连接。
如上所述，为了增强标记性多肽的免疫原性，所述标记性多肽的胞外抗原决定区优选包含n个抗原表位多肽，其中n为大于等于1的整数，例如n＝1、2、3、4…。优选的是，n为1-10之间的整数；还优选的是，n为2-5之间的整数；还优选的是，n＝2或3。例如，所述标记性多肽的胞外抗原决定区可以包含3个重复的来源于人Myc蛋白的抗原表位多肽，或包含2个重复的来源于流感病毒HA蛋白的抗原表位多肽。因此，所述标记性多肽的胞外抗原决定区编码序列相应地优选包含3个重复或2个重复的所述抗原表位多肽编码序列。
在本发明的优选实施方案中，所述胞外抗原决定区编码序列的核苷酸序列如SEQID NO:16(对应于TT1)、SEQ ID NO:17(对应于TT2)、SEQ ID NO:18(对应于TT3)、SEQ IDNO:19(对应于C1&2a)或SEQ ID NO:20(对应于C1&2b)所示。
优选地，所述跨膜部分编码序列来源于CD8、CD3ζ、CD4或CD28的跨膜区的编码序列。还优选地，所述跨膜部分编码序列来源于人CD8α的跨膜区的编码序列。更优选地，所述跨膜部分编码序列的核苷酸序列包含如SEQ ID NO:21所示的核苷酸序列。
在所述标记性多肽编码序列中，所述跨膜部分编码序列与所述胞外抗原决定区编码序列可以通过间隔部分编码序列相连。形式最简单的间隔部分是免疫球蛋白IgG l的铰链区，也可以是免疫球蛋白CH2CH3区的一部分。通过研究和实验摸索，本发明发现，所述间隔部分编码序列优选来自CD8α的铰链区编码序列，并且所述跨膜部分编码序列优选来自CD8α的跨膜区编码序列。优选地，所述间隔部分编码序列的核苷酸序列如SEQ ID NO:22所示。还优选地，所述间隔部分编码序列和跨膜部分编码序列构成间隔跨膜部分编码序列，间隔部分和跨膜部分之间可以不采用接头而直接连接。
在本发明的具有标记性多肽编码序列的核酸中，在标记性多肽编码序列的5’端之前还优选包含信号肽编码序列，该信号肽编码序列编码所述信号肽，信号肽具有引导目的蛋白分泌到细胞表面的功能，其是将本发明的标记性多肽靶向至分泌途径的前导序列，其编码序列首先与标记性多肽的编码序列一起在细胞内被翻译成蛋白质，引导合成的蛋白进入胞内分泌途径。在细胞表面表达标记性多肽前，信号肽被去除。
优选地，所述信号肽编码序列的核苷酸序列来源于人GM-CSFα链的信号肽编码序列。更优选的，所述信号肽编码序列的核苷酸序列如SEQ ID NO:23所示。
在本发明具体的实施方案中，具有标记性多肽编码序列的核酸中包括可操作地连接且依次串联的以下编码序列：信号肽编码序列、胞外抗原决定区编码序列(其包括一个或多个所述抗原表位多肽的编码序列)、间隔部分编码序列和跨膜部分编码序列。在本发明更具体的实施方案中，所述胞外抗原决定区的抗原表位多肽的编码序列来自以下标签的编码序列：Myc标签、HA标签或Strep标签II；所述信号肽编码序列来自人GM-CSFα链的信号肽编码序列；所述间隔部分编码序列来自人CD8α铰链区编码序列，所述跨膜部分编码序列来自人CD8α跨膜区编码序列。
如上所述，信号肽编码序列和胞外抗原决定区编码序列之间、胞外抗原决定区编码序列和间隔部分编码序列之间、间隔部分编码序列和跨膜部分编码序列之间是可操作地连接的，例如可以采用接头编码序列连接，也可以不采用接头编码序列而直接连接。在本发明的一个实施方案中，信号肽编码序列和胞外抗原决定区编码序列采用接头编码序列连接，例如，GGCGCGCATGCCGACATTACTAGT(如具有TT1-TT3编码序列的核酸中所采用)、GGCGCGCATGCCGCTCAGTTGACATTGACGAAGGGCAATAAA(如具有C1&2a编码序列的核酸中所采用)、GGCGCGCATGCC(如具有C1&2b编码序列的核酸中所采用)，胞外抗原决定区编码序列和间隔部分编码序列之间采用接头编码序列连接，(例如)为GCTAGC、GGG，而间隔部分编码序列和跨膜部分编码序列之间未采用接头编码序列而直接连接。
优选地，在C1&2b的间隔部分编码序列中加入了TIGIT间隔区编码序列，其中所述TIGIT间隔区编码序列编码TIGIT的第24位-第140位氨基酸。其中，TIGIT的氨基酸序列来自UniProtKB-Q495A1。优选地，所述TIGIT间隔区编码序列包含如SEQ ID NO:24所示的核苷酸序列。优选地，所述C1&2b的间隔跨膜部分编码序列包含如SEQ ID NO:25所示的核苷酸序列。
优选地，所述具有标记性多肽编码序列的核酸的核苷酸序列如SEQ ID NO:26(对应于TT1)、SEQ ID NO:27(对应于TT2)、SEQ ID NO:28(对应于TT3)、SEQ ID NO:29(对应于C1&2a)或SEQ ID NO:30(对应于C1&2b)所示。
优选地，所述具有标记性多肽编码序列的核酸包括DNA或RNA；所述RNA包括由所述DNA转录的mRNA。
优选地，所述核酸依次包含可操作地连接的启动子和所述标记性多肽编码序列。所述启动子的例子包括本领域已知的用于启动下游DNA序列转录的任何启动子，例如CMV启动子、T7启动子等。
重组病毒
在本发明一个实施方案中，所述第一活性成分为重组病毒，所述重组病毒的基因组具有依次的、可操作地连接的启动子、信号肽编码序列、所述标记性多肽编码序列；其中，所述重组病毒包括选择复制型重组溶瘤病毒或复制缺陷型重组病毒。
优选地，所述重组溶瘤病毒来源于具有溶瘤作用的经基因突变的病毒和具有溶瘤作用的野生型病毒；优选地，所述重组溶瘤病毒来源于具有溶瘤作用的腺病毒、痘病毒、单纯疱疹病毒、麻疹病毒、塞姆利基森林病毒、水疱性口炎病毒、脊髓灰质炎病毒、逆转录病毒、呼肠孤病毒、塞内卡谷病毒、埃可型肠道病毒、柯萨奇病毒、新城疫病毒和马拉巴病毒。
溶瘤病毒疗法具有悠久的历史，有很多种类的病毒已被改造用于溶瘤病毒研发，包括腺病毒、疱疹病毒、痘病毒、小核糖核酸病毒、副粘病毒、呼肠孤病毒、细小病毒、弹状病毒。截止至目前，有两种溶瘤病毒(H101和T-VEC)获批可用于临床肿瘤的治疗。溶瘤病毒是经人工改造的病毒，这些病毒的致病基因被敲除，基本无法在正常组织细胞内复制，但在可以在肿瘤细胞内选择性的复制以发挥溶瘤作用。以痘病毒为例，溶瘤痘病毒通常通过遗传生物工程手段利用同源重组技术敲除痘病毒内源性胸苷激酶(Thymidine Kinase，TK)基因或双敲除TK和痘苗生长因子(Vaccinia growth factor，VGF)基因来构建。TK是DNA合成的关键酶之一，痘病毒在复制过程中需要借助TK作用形成高浓度核酸池以完成子代顺利复制。痘病毒常通过VGF基因产物促进宿主及周边细胞增殖，实现自身的复制增殖，而缺失VGF的痘病毒大大减弱了病毒对正常细胞的损伤。由于缺失TK和VGF基因，病毒在正常细胞内的复制能力受到限制，在溶瘤病毒载体上***的外源性基因的表达也会受到极大的限制。但大多数肿瘤细胞环境内TK基因是高表达的状态，为痘病毒的复制、包装提供了有利的环境，使得痘病毒具有选择性在肿瘤细胞内复制、溶瘤的功能，并且高表达在溶瘤病毒载体上***的外源性基因。除了直接的溶瘤作用，溶瘤病毒还可以使肿瘤细胞释放全息的肿瘤抗原以激活机体内在的抗肿瘤免疫，同时对肿瘤微环境具有一定的调节作用。
本发明将所述标记性多肽编码序列***溶瘤病毒的基因组，从而将所述标记性多肽编码核酸导入肿瘤细胞和/或癌细胞，这样在发挥溶瘤病毒杀伤肿瘤细胞和/或癌症细胞作用的同时，外源的抗原表位肽在肿瘤细胞表面表达与CAR修饰的免疫细胞联合达到协同治疗效果。由于溶瘤病毒破坏了肿瘤的微环境，使得CAR修饰的免疫细胞的肿瘤归巢能力提高，从而进一步了提升实体瘤治疗的有效性。此外，CAR修饰的免疫细胞还可以有效清除被溶瘤病毒感染后，不能完成复制周期并产生足够数量的子病毒而发生裂解的肿瘤细胞；由此实现了进一步的协同作用。此外，被溶瘤病毒裂解的肿瘤细胞所释放的抗原可进一步激活机体自身的抗肿瘤免疫，从而可实现比单独使用溶瘤病毒或CAR修饰的免疫细胞更好的肿瘤杀伤效果，实现了协同治疗效果。
在本发明的一个实施方案中，所得到的选择复制型重组溶瘤痘病毒的基因组中***有具有标记性多肽编码序列的核酸(其核苷酸序列可为(例如)SEQ ID NO:26-30中任意一者)。
优选地，所述重组溶瘤病毒是TK基因和VGF基因功能缺陷型的重组溶瘤痘病毒。所述TK基因可以通过***外源核苷酸序列而使该TK基因功能缺陷。所述VGF基因可以通过基因敲除或***外源核苷酸序列而使该VGF基因功能缺陷，但优选将所述VGF基因敲除。
本发明在提及溶瘤病毒的基因时所使用的术语“功能缺陷”是指该溶瘤病毒无法发挥该基因应有的功能，即功能丧失，该目的可通过(例如)在基因中***外源片段或敲除该基因而实现。
还优选地，所述重组溶瘤痘病毒是惠氏株或WR株。
所述标记性多肽编码序列可以***TK基因中，从而得到本发明所述的重组溶瘤病毒。所述标记性多肽编码序列也可以***VGF基因中，从而得到本发明所述的重组溶瘤病毒。
在一个优选的实施方案中，所述重组溶瘤痘病毒是对VSC20痘病毒进行基因改造而得到的。VSC20痘病毒是VGF基因缺失的痘病毒，制备方法可参见科技文献：“McCart,JA,et al.Systemic cancer therapy with a tumor-selective vaccinia virus mutantlacking thymidine kinase and vaccinia growth factor genes.Cancer Res(2001)61:8751–8757.”。所述基因改造包括将外源标记性多肽编码序列***该VSC20痘病毒的TK基因中，从而使该TK基因功能缺陷。
所述重组病毒的基因组中还可以整合有其它外源基因，例如外源筛选基因，所述外源筛选基因包括嘌呤霉素基因、gpt基因和/或LacZ基因。所述外源筛选基因可以在纯化含有外源标记性多肽编码基因的时候通过基因敲除***(例如，LoxP)敲除。
在一些实施方案中，本发明通过分别使用痘病毒早/晚启动子p7.5控制外源筛选基因，以及人工合成痘病毒早启动子pSEL控制信号肽序列和外源标记性多肽编码序列，使用体外细胞内重组技术将外源筛选基因编码序列以及信号肽编码序列和标记性多肽编码序列***到痘病毒VSC20株的TK基因区中，以此构建溶瘤病毒，两个启动子以背靠背的方式分别启动各自调控基因的表达。
在本发明的另一个实施方案中，利用Crisper-Cas9基因编辑技术构建重组溶瘤痘病毒。
优选地，所述Crisper-Cas9基因编辑方法可以同时在一个基因的两个位点进行剪切和进行同源重组，以达到一次性完成对一段序列进行敲除和转基因***的目的。
优选地，所述Crisper-Cas9基因编辑方法可以同时对靶序列和供体(donor)序列进行剪切，以提高同源重组的效率。
本发明所述的Crisper-Cas9基因编辑方法的剪切和同源重组的设计如图3和图4所示。
具体而言，所述Crisper-Cas9体系可以包括先导RNA、供体DNA。
优选地，先导RNA包括先导RNA-1和先导RNA-2。所述先导RNA-1的核苷酸序列优选与痘病毒TK基因中第123位到第145位核苷酸一致，所述先导RNA-2的核苷酸序列优选与痘病毒TK基因中第411位到第433位核苷酸一致，TK基因的核苷酸序列的Genbank编号可为AAO89373.1。优选地，所述先导RNA-1的核苷酸序列如SEQ ID NO:31所示，所述先导RNA-2的核苷酸序列如SEQ ID NO:32所示。
优选地，所述供体DNA中左侧同源臂的核苷酸序列如SEQ ID NO:33所示，右侧同源臂的核苷酸序列如SEQ ID NO:34所示。
优选地，所述供体DNA的核苷酸序列包含上述信号肽编码序列(例如，SEQ ID NO:23)和标记性多肽编码序列，并且同时含有puro-GFP编码序列。所述puro-GFP编码序列的核苷酸序列如SEQ ID NO:35所示。
所述puro-GFP编码序列优选在核苷酸序列为SEQ ID NO:36的启动子的控制下，所述信号肽编码序列和标记性多肽编码序列优选在核苷酸序列为SEQ ID NO:37的启动子的控制下。
在本发明一个优选的实施方案中，所述供体DNA的核苷酸序列如SEQ ID NO:38所示。
嵌合抗原受体
所述嵌合抗原受体包括可操作地连接的、依次串联的抗原结合结构域、间隔区、跨膜区和胞内结构域，所述抗原结合结构域能够特异性识别并结合所述标记性多肽的所述胞外抗原决定区，所述间隔区用于间隔抗原结合结构域和跨膜区，所述胞内结构域用于信号传递。
本发明所述术语“抗原结合结构域”、“间隔区”、“跨膜区”、“胞内结构域”的定义可参考“《免疫学导论》，于善谦，高等教育出版社，2008”；以及“《Immunobiology》，第七版，Kenneth Murphy,Paul Travers,Mark Walport等”。
所述抗原结合结构域优选是包括轻链和重链的单链抗体(ScFv)，该轻链和重链可以通过一段连接子彼此连接，如图1所示。
本发明进一步发现，优选的是，靶向TT1的抗原结合结构域的轻链的氨基酸序列与抗Myc抗体(例如克隆9e10)的轻链的第1位-第111位氨基酸序列一致(在本发明另一些实施方案中，靶向TT1的抗原结合结构域的轻链的氨基酸序列可向上述序列的下游扩展不超过10个氨基酸)，重链的氨基酸序列与抗Myc抗体(例如克隆9e10)的重链的第23位-第143位的氨基酸序列一致(在本发明另一些实施方案中，靶向TT1的抗原结合结构域的重链的氨基酸序列可向上述序列的上下游扩展不超过10个氨基酸)。
优选的是，靶向TT2的抗原结合结构域的轻链的氨基酸序列与抗HA抗体(例如克隆12ca5)的轻链的第2位-第121位氨基酸序列一致(在本发明另一些实施方案中，靶向TT2的抗原结合结构域的轻链的氨基酸序列可向上述序列的下游扩展不超过10个氨基酸)，重链的氨基酸序列与抗HA抗体(例如克隆12ca5)的重链的第2位-第114位氨基酸序列一致(在本发明另一些实施方案中，靶向TT2的抗原结合结构域的重链的氨基酸序列可向上述序列的下游扩展不超过10个氨基酸)。
优选的是，靶向TT3的抗原结合结构域的轻链的氨基酸序列与抗Strep标签II抗体(参见(例如)专利文献EP2871189A1)的轻链一致，重链的氨基酸序列与抗Strep标签II抗体(参见(例如)专利文献EP2871189A1)的重链的一致。
其中，抗Myc抗体(克隆9e10)轻链的氨基酸序列可以源自编号为PDB:2ORB_L的氨基酸序列(https://www.ncbi.nlm.nih.gov/protein/2ORB_L)，抗Myc抗体(克隆9e10)重链的氨基酸序列可以源自编号为GenBank:CAA73271.1的氨基酸序列(https://www.ncbi.nlm.nih.gov/protein/CAA73271.1？report＝genbank&lo g$＝protalign&blast_rank＝1&RID＝P597FX1S014)，连接轻链和重链的连接子的氨基酸序列如SEQ IDNO:39所示。抗HA抗体(克隆12ca5)轻链的氨基酸序列可以源自编号为PDB:5XCS_B的氨基酸序列(https://www.ncbi.nlm.nih.gov/protein/1258501213)，抗HA抗体(克隆12ca5)重链的氨基酸序列可以源自编号为PDB:5XCS_A的氨基酸序列(https://www.ncbi.nlm.nih.gov/protein/5XCS_A)，连接轻链和重链的连接子的氨基酸序列可以如SEQ ID NO:40所示。抗Strep标签抗体轻链和重链的氨基酸序列可以源自专利文献EP2871189A1所公开的氨基酸序列，连接轻链和重链的连接子的氨基酸序列可以如SEQ IDNO:41所示。
更优选地，所述靶向TT1、TT2和TT3的抗原结合结构域的氨基酸序列分别如SEQ IDNO:42-44所示。
胞内结构域起到信号传递从而活化T或NK细胞的作用。最初用于T细胞的CAR的胞内结构域只有一个信号分子，通常为免疫球蛋白E的受体相关FcεRIγ(与IgE有高亲和力的受体的一个亚基)或T细胞抗原受体信号的基础传导分子CD3ζ；有的胞内结构域包含由一种或几种T细胞活化基序组成的T细胞活化结构域。
优选地，所述胞内结构域来自淋巴细胞胞内激活信号转导区和可任选的淋巴细胞共刺激信号转导区(可包括0-2个共刺激信号转导区)。优选地，所述胞内激活信号转导区来自CD3ζ、DAP12的胞内信号区，共刺激信号转导区来自4-1BB、CD28、CD27、OX40、GITR和/或ICOS的胞内信号区。
更优选地，本发明发现，将上述抗原结合结构域与来自4-1BB和CD3ζ的胞内信号区进行组合，可得到能够使T或NK细胞发挥强烈的靶向杀瘤活性的CAR。优选地，所述胞内结构域的氨基酸序列选自4-1BB的第209-255位氨基酸以及CD3ζ的第52-164位氨基酸。其中，CD3ζ的氨基酸序列编号为UniProtKB-P20963，4-1BB的氨基酸序列的编号为UniProtKB-Q07011。所述胞内结构域的氨基酸序列更优选如SEQ ID NO:45所示。
本发明更进一步选择了间隔区和跨膜区，从而获得了具有抗原结合结构域-间隔区-跨膜区-胞内结构域的特定组合的CAR。间隔区连接抗原结合结构域和跨膜区，这一区域的结构应该是易弯曲的，这样可以使抗原结合结构域适应不同的方向，以促进相应的针对抗原的识别和结合。形式最简单的间隔区是免疫球蛋白IgGl的铰链区，也可以是免疫球蛋白CH2CH3区的一部分。跨膜区一般是跨越细胞膜的疏水性α螺旋。所述间隔区可以来自CD8α的铰链区、IgG的铰链区或IgD的铰链区，所述跨膜区可以来自CD8α的跨膜区、CD3ζ的跨膜区、CD4的跨膜区或CD28的跨膜区。
通过研究和实验摸索，本发明发现，所述间隔区更优选来自CD8α的铰链区，所述跨膜区更优选来自CD8α的跨膜区。CD8为跨膜的糖基化膜蛋白，由α和β两个亚基组成，与T细胞表面受体共同作用使T细胞与特定抗原结合，CD8特异性结合MHC I，介导细胞毒性T细胞的杀伤作用。
更优选地，所述间隔区和跨膜区构成间隔跨膜区，并且其中所述间隔跨膜区的氨基酸序列与CD8α的第Y位-第210位氨基酸序列一致，且118≤Y≤128，Y为整数。其中，CD8α的氨基酸序列的UniProtKB编号可为P01732。也就是说，所述间隔跨膜区的氨基酸序列优选选自CD8α的第118-210位氨基酸、并且包含第128-210位氨基酸。例如，所述间隔跨膜区的氨基酸序列如以下氨基酸序列组中任一氨基酸序列所示：CD8α的第118-210位氨基酸、第119-210位氨基酸、第120-210位氨基酸、第121-210位氨基酸、第122-210位氨基酸、第123-210位氨基酸、第124-210位氨基酸、第125-210位氨基酸、第126-210位氨基酸、第127-210位氨基酸、或第128-210位氨基酸。
优选地，所述嵌合抗原受体的表达受信号肽引导。信号肽具有引导目的蛋白分泌到细胞表面的功能。本发明发现，将上述抗原结合结构域与来自GM-CSFα链的信号肽进行组合，可有效地使嵌合抗原受体表达于免疫效应细胞表面。GM-CSFα链信号肽是将本发明的嵌合抗原受体靶向至分泌途径的前导序列，其编码序列首先与嵌合抗原受体的编码序列一起在细胞内被翻译成蛋白质，引导合成的蛋白进入胞内分泌途径。在细胞表面表达嵌合抗原受体前信号肽被去除。
优选地，所述信号肽的氨基酸序列选自GM-CSF的第1位-第22位氨基酸，其中，信号肽的氨基酸序列编号为UniProtKB-P15509。更优选的，所述信号肽的氨基酸序列如SEQ IDNO:8所示。
在本发明具体的实施方案中，所述嵌合抗原受体包括可操作地连接且依次串联的抗原结合结构域、间隔区、跨膜区和胞内结构域。在本发明更具体的实施方案中，所述抗原结合结构域为ScFv，轻链和重链分别来自抗Myc、HA或Strep标签抗体的轻链和重链，所述间隔区来自人CD8α铰链区，所述跨膜区来自人CD8α跨膜区，所述胞内结构域来自CD3ζ和4-1BB的胞内信号区的组合。
在本发明中，信号肽、抗原结合结构域、间隔区、跨膜区、胞内结构域是依次串联的；信号肽和抗原结合结构域之间、抗原结合结构域和间隔区之间、间隔区和跨膜区之间、跨膜区和胞内结构域之间是可操作地连接的，例如可以采用接头连接，也可以不采用接头而直接连接。在本发明一个实施方案中，信号肽和抗原结合结构域之间采用接头连接，例如GAHA，抗原结合结构域和间隔区之间采用接头连接(所述接头(例如)为-Ala-Ser-)，而间隔区和跨膜区之间、跨膜区和胞内结构域之间未采用接头而直接连接。
在本发明一个优选的实施方案中，所述嵌合抗原受体的氨基酸序列如SEQ ID NO:46(对应于靶向TT1)、SEQ ID NO:47(对应于靶向TT2)或SEQ ID NO:48(对应于靶向TT3)所示。
SEQ ID NO:46：
Figure BDA0001776469610000331
其中深灰色示出嵌合抗原受体的ScFv，斜体示出连接轻链和重链的连接子，浅灰色示出间隔区，单下划线示出跨膜区，黑体示出胞内信号区中来自4-1BB的部分，双下划线示出胞内信号区中来自CD3ζ的部分。
SEQ ID NO:47：
Figure BDA0001776469610000341
其中深灰色示出嵌合抗原受体的ScFv，斜体示出连接轻链和重链的连接子，浅灰色示出间隔区，单下划线示出跨膜区，黑体示出胞内信号区中来自4-1BB的部分，双下划线示出胞内信号区中来自CD3ζ的部分。
SEQ ID NO:48：
Figure BDA0001776469610000342
其中深灰色示出嵌合抗原受体的ScFv，斜体示出连接轻链和重链的连接子，浅灰色示出间隔区，单下划线示出跨膜区，黑体示出胞内信号区中来自4-1BB的部分，双下划线示出胞内信号区中来自CD3ζ的部分。
嵌合抗原受体编码DNA
本发明所述的嵌合抗原受体的编码DNA包括可操作地连接的、依次串联的抗原结合结构域编码元件、间隔区编码元件、跨膜区编码元件和胞内结构域编码元件，其特征在于，所述抗原结合结构域编码元件编码的抗原结合结构域能够识别并结合根据本发明所述的标记性多肽的胞外抗原决定区。
所述抗原结合结构域编码元件的核苷酸序列编码所述抗原结合结构域的氨基酸序列。优选地，靶向TT1的抗原结合结构域编码元件的核苷酸序列如SEQ ID NO:49所示。优选地，靶向TT2的抗原结合结构域编码元件的核苷酸序列如SEQ ID NO:50所示。优选地，靶向TT3的抗原结合结构域编码元件的核苷酸序列如SEQ ID NO:51所示。
所述胞内结构域编码元件的核苷酸序列编码所述胞内结构域的氨基酸序列。优选地，所述胞内激活信号转导区编码元件来自CD3ζ、DAP12的胞内信号区编码DNA，共刺激信号转导区编码元件来自4-1BB、CD28、CD27、OX40、GITR和/或ICOS的胞内信号区编码DNA。更优选地，所述胞内结构域编码元件来自4-1BB和CD3ζ的胞内信号区编码DNA。更优选地，所述胞内结构域编码元件的核苷酸序列如SEQ ID NO:52。
所述间隔区编码元件优选来自CD8α的铰链区编码DNA、IgG的铰链区编码DNA或IgD的铰链区编码DNA。所述跨膜区编码元件优选来自CD8α的跨膜区编码DNA、CD3ζ的跨膜区编码DNA、CD4的跨膜区编码DNA或CD28的跨膜区编码DNA。其中，间隔区编码元件更优选来自CD8α的铰链区编码DNA，所述跨膜区编码元件更优选来自CD8α的跨膜区编码DNA。
优选地，所述间隔区编码元件和所述跨膜区编码元件构成间隔跨膜区编码元件，所述间隔跨膜区编码元件的核苷酸序列编码所述间隔跨膜区的氨基酸序列。优选地，所述间隔区编码元件的核苷酸序列包含SEQ ID NO:22所示的序列。
优选地，所述嵌合抗原受体的表达受信号肽引导，信号肽的核苷酸序列编码所述信号肽的氨基酸序列。优选地，所述信号肽的氨基酸序列选自GM-CSFα的第1-22位氨基酸。优选地，所述信号肽编码元件的核苷酸序列如SEQ ID NO:23所示。
在本发明一个具体实施方案中，所述嵌合抗原受体编码DNA包括可操作地连接的且依次串联的抗原结合结构域码元件、间隔区编码元件、跨膜区编码元件和胞内区编码元件，其特征在于，抗原结合结构域的轻链和重链的编码元件分别来自抗Myc标签、HA标签或Strep标签II抗体的轻链和重链的编码DNA，所述间隔区编码元件来自CD8α的铰链区编码DNA，所述跨膜区编码元件来自CD8α的跨膜区编码DNA，所述胞内结构域来自4-1BB和CD3ζ的胞内信号区编码DNA。
优选地，具有信号肽编码序列和所述嵌合抗原受体编码序列的DNA的核苷酸序列如SEQ ID NO:53(对应于靶向TT1)、SEQ ID NO:54(对应于靶向TT2)或SEQ ID NO:55(对应于靶向TT3)所示。
嵌合抗原受体修饰的免疫细胞
所述免疫细胞包括T细胞或NK细胞；其中，所述NK细胞包括自体NK细胞、异体NK细胞或NK细胞株，并且所述T细胞包括原始T细胞或其前体细胞，效应T细胞，记忆T细胞，NKT细胞，或T细胞株。
所述嵌合抗原受体对免疫细胞的修饰可以是通过慢病毒感染和mRNA电转。
优选地，所述第一组合物和所述第二组合物各自独立地存在于所述治疗剂中而互不混合。
所述具有标记性多肽编码序列的核酸包括DNA或RNA；所述RNA包括由所述DNA转录的mRNA。优选地，所述第一组合物包含治疗有效量的所述DNA、或治疗有效量的所述mRNA。优选地，所述第一组合物包含剂量为0.01-10mg/天的所述DNA或mRNA。
优选地，所述第一组合物包含治疗有效量的所述重组病毒。还优选地，所述第一组合物包含每个疗程总剂量范围为5×107-5×1012个病毒颗粒或5×107-5×1012PFU的所述重组溶瘤痘病毒。
优选地，所述第二组合物包含治疗有效量的所述的嵌合抗原受体修饰的免疫细胞。优选地，包含每个疗程总剂量范围为1×104至1×109个细胞/Kg体重的所述嵌合抗原受体修饰的免疫细胞。
所述DNA可以配制成通过瘤内注射或静脉给药；所述mRNA可以配制成通过瘤内注射或静脉给药。例如，以质粒的形式直接肿瘤内注射，也可用脂质体包装后瘤内注射，也可连接到纳米颗粒上(如多聚L-赖氨酸、聚氨基酸、聚亚乙基亚胺和壳聚糖等聚合物)瘤内注射，也可瘤内注射后用电转方法加强转染率。
所述重组病毒可以配制成通过瘤内注射给药或静脉给药。
所述的嵌合抗原受体修饰的免疫细胞可以配制成通过静脉给药或局部给药。
优选地，所述治疗剂由所述第一组合物和所述第二组合物组成。
本领域的技术人员可以理解，本发明的治疗剂还可包含合适的可药用的辅料，包括药用或生理载体、赋形剂、稀释剂(包括生理盐水、PBS溶液)、以及各种添加剂，包括糖类、脂类、多肽、氨基酸、抗氧化剂、佐剂、保鲜剂等。
本发明还提供了所述的治疗剂在制备用于***和/或癌症的药物中的用途。
所述肿瘤和/或癌症包括：乳腺癌，头颈部肿瘤，滑膜癌，肾癌，***癌，黑色素瘤，肺癌，食管癌，结肠癌，直肠癌，脑癌，肝癌，骨癌，绒毛膜癌，胃泌素瘤，嗜铬细胞瘤，催乳素瘤，von Hippel-Lindau病，Zollinger-Ellison综合征，***癌，胆管癌，膀胱癌，输尿管癌，神经胶质瘤，神经母细胞瘤，脑膜瘤，脊髓肿瘤，骨软骨瘤，软骨肉瘤，尤文氏肉瘤，原发部位不明癌，类癌，纤维肉瘤，佩吉特病，***，胆囊癌，眼癌，卡波西氏肉瘤，***癌，睾丸癌，皮肤鳞状细胞癌，间皮瘤，多尖端骨髓瘤，卵巢癌，胰腺内分泌瘤，胰高血糖素瘤，胰腺癌，***癌，垂体癌，软组织肉瘤，视网膜母细胞瘤，小肠癌，胃癌，胸腺癌，滋养细胞癌，***，子宫内膜癌，***癌，外阴癌，蕈样真菌病，胰岛素瘤，心脏癌，脑膜癌，腹膜癌，胸膜癌和血液癌。
本发明还提供了本发明上文所述的标记性多肽。所述标记性多肽的各实施方案如上文所述。
优选地，所述标记性多肽的氨基酸序列如SEQ ID NO:11、SEQ ID NO:12、SEQ IDNO:13、SEQ ID NO:14或SEQ ID NO:15所示。
本发明还提供了一种分离的、具有根据本发明所述的标记性多肽的编码序列的核酸。所述核酸的各实施方案如上文所述。
所述核酸依次包含可操作地连接的启动子、信号肽编码序列、以及根据本发明所述的标记性多肽的编码序列。
所述核酸包括DNA和mRNA。优选地，所述核酸为DNA，其核苷酸序列如SEQ ID NO:26、SEQ ID NO:27、SEQ ID NO:28、SEQ ID NO:29或SEQ ID NO:30所示。
本发明还提供了一种重组表达载体，其中所述重组表达载体依次包含可操作地连接的启动子、信号肽编码序列、以及根据本发明所述的标记性多肽的编码序列。
为了可以使一种肿瘤细胞可以同时被两种以上的标记性多肽标记，所述重组表达载体可以包含两种以上的本发明所述的标记性多肽的编码序列。
优选地，所述用于制备标记性多肽mRNA的重组表达载体(例如pFastbac1-TT1、pFastbac1-TT2、pFastbac1-TT3、pFastbac1-C1&2a、pFastbac1-C1&2b)在根据本发明所述的标记性多肽的编码序列之前依次包含CMV启动子、T7启动子、具有kozak序列的5’UTR和GM-CSFα链信号肽编码序列；并且在根据本发明所述的标记性多肽的编码序列之后包含具有polyA信号的α球蛋白的3’UTR。本发明的重组表达载体的上述作用元件的组合能够促进DNA的转录和翻译，并增强mRNA的稳定性。本发明还对上述各作用元件的结构作了如下优化，从而更好地发挥其应有的功能。优选地，在本发明中，CMV启动子序列为SEQ ID NO:56。CMV启动子功能为使下游的DNA序列开始转录。
优选地，在本发明中，T7启动子序列为SEQ ID NO:57。T7启动子功能为使下游的DNA序列开始转录。
优选地，在本发明中，具有kozak序列的5’UTR的序列为SEQ ID NO:58，具有kozak序列的5’UTR的功能为增强mRNA的翻译效率。
优选地，在本发明中，GM-CSFα链信号肽编码序列的序列为SEQ ID NO:23。
优选地，在本发明中，α球蛋白的3’UTR序列为SEQ ID NO:59，其中含有polyA信号。其作用是增强mRNA的稳定性。
在一个具体实施方案中，所述重组表达载体的基本骨架为市售可得的pFastbac1载体，然后在其中***上述各元件。
由于本发明优化了3’UTR和5’UTR结构，因此可以例如应用Tail-PCR技术由所述重组表达载体合成其中正链带有PolyA、反链带有对应的PolyT的DNA双链模板，这样降低了DNA模板的不稳定性，进而可在体外合成mRNA。所述的正链中所带有的PolyA中的A的个数范围(或者其反链中对应的PolyT中的T的个数范围)为140-170个，优选为150-170个，更优选为150个左右(例如150个)。
将这种重组表达载体导入肿瘤细胞的方法包括病毒和非病毒的方法。非病毒的方法包括生物、物理、化学介导的基因转染方法。生物转染方法包括直接注射、受体介导基因转移等。物理转染方法包括电转、显微注射等。化学转染方法包括脂质体和各种阳离子聚合物介导的转染等。
本发明还提供了一种分离的重组病毒，其中所述重组病毒的基因组具有依次的可操作地连接的启动子、信号肽编码序列、以及根据本发明所述的标记性多肽的编码序列，并且所述标记性多肽能够经表达而修饰在肿瘤细胞和/或癌细胞的表面；并且，所述重组病毒包括选择复制型重组溶瘤病毒或复制缺陷型重组病毒。
优选地，所述重组病毒为选择复制型重组溶瘤病毒，并且所述重组溶瘤病毒来源于具有溶瘤作用的经基因突变的病毒和具有溶瘤作用的野生型病毒；优选地，所述重组溶瘤病毒来源于具有溶瘤作用的腺病毒、痘病毒、单纯疱疹病毒、麻疹病毒、塞姆利基森林病毒、水疱性口炎病毒、脊髓灰质炎病毒、逆转录病毒、呼肠孤病毒、塞内卡谷病毒、埃可型肠道病毒、柯萨奇病毒、新城疫病毒和马拉巴病毒。
所述重组病毒的各实施方案如上文所述。
本发明还提供了一种用于制备重组病毒的重组表达载体(pFastbac1-TT3-PuroGFP(其核苷酸序列如SEQ ID NO:38所示))，其含有与pS启动子有效连接的含有上文所述的TT3标记性多肽编码序列(即，SEQ ID NO:28)、与p7.5启动子有效连接的含有上文所述的puro-GFP筛选基因编码序列、LoxP位点、左侧和右侧同源臂和gRNA剪切位点的供体DNA。该重组表达载体用于利用Crisper-Cas9基因编辑技术构建重组溶瘤痘病毒。
本发明对上述各作用元件的结构作了如下优化，从而更好地发挥其应有的功能。
优选地，在本发明中，pS启动子序列为SEQ ID NO:37。pS启动子功能为使下游的TT3标记性多肽编码序列开始转录。
优选地，在本发明中，p7.5启动子序列为SEQ ID NO:36。p7.5启动子功能为使下游的puro-GFP编码序列开始转录。
优选地，在本发明中，LoxP位点的序列为SEQ ID NO:60。LoxP位点的功能为去除筛选基因提供了方便。
优选地，在本发明中，左侧同源臂的序列为SEQ ID NO:33，右侧同源臂的序列为SEQ ID NO:34。同源臂的功能为使痘病毒基因组与供体质粒进行同源重组。
优选地，在本发明中，gRNA-1剪切位点的序列为SEQ ID NO:61，gRNA-2剪切位点的序列为SEQ ID NO:62。gRNA剪切位点的功能为使Crisper-Cas9可以对供体(donor)质粒进行剪切，以提高同源重组的效率。
在一个具体实施方案中，所述重组表达载体的基本骨架为市售可得的pFastbac1载体，然后在其中***上文所述的各元件。
本发明还提供了一种嵌合抗原受体，该嵌合抗原受体包括可操作地连接的、依次串联的抗原结合结构域、间隔区、跨膜区和胞内结构域，其特征在于，所述抗原结合结构域能够识别并结合根据本发明所述的标记性多肽的胞外抗原决定区。
所述嵌合抗原受体的各实施方案如上文所述。
优选地，所述嵌合抗原受体的氨基酸序列如SEQ ID NO:46(对应于靶向TT1)、SEQID NO:47(对应于靶向TT2)或SEQ ID NO:48(对应于靶向TT3)所示。
本发明还提供了一种分离的、具有编码根据本发明所述的嵌合抗原受体编码序列的DNA。
所述具有嵌合抗原受体编码序列的DNA的各实施方案如上文所述。
优选地，所述DNA的核苷酸序列如SEQ ID NO:53(对应于靶向TT1)、SEQ ID NO:54(对应于靶向TT2)或SEQ ID NO:55(对应于靶向TT3)所示。
本发明还提供了一种分离的、由根据本发明所述的DNA转录的mRNA。
本发明还提供了一种重组表达载体(例如pFastbac1-aTT1-CD8a-4-1BB-CD3ζ、pFastbac1-aTT2-CD8a-4-1BB-CD3ζ、pFastbac1-aTT3-CD8a-4-1BB-CD3ζ)，其中所述重组表达载体依次包含可操作地连接的启动子、信号肽编码序列、以及根据本发明所述的嵌合抗原受体的编码序列。
优选地，所述重组表达载体在根据本发明所述的嵌合抗原受体的编码序列之前依次包含CMV启动子、T7启动子、具有kozak序列的5’UTR和GM-CSFα链信号肽编码序列；并且在根据本发明所述的嵌合抗原受体的编码序列之后包含具有polyA信号的α球蛋白的3’UTR。本发明的重组表达载体的上述作用元件的组合能够促进DNA的转录和翻译，并增强mRNA的稳定性。本发明还对上述各作用元件的结构作了如下优化，从而更好地发挥其应有的功能。
优选地，在本发明中，CMV启动子序列为SEQ ID NO:56。CMV启动子功能为使下游的DNA序列开始转录。
优选地，在本发明中，T7启动子序列为SEQ ID NO:57。T7启动子功能为使下游的DNA序列开始转录。
优选地，在本发明中，具有kozak序列的5’UTR的序列为SEQ ID NO:58，具有kozak序列的5’UTR的功能为增强mRNA的翻译效率。
优选地，在本发明中，GM-CSFα链信号肽编码序列的序列为SEQ ID NO:23。
优选地，在本发明中，α球蛋白的3’UTR序列为SEQ ID NO:59，其中含有polyA信号。其作用是增强mRNA的稳定性。
在一个具体实施方案中，所述重组表达载体的基本骨架为市售可得的pFastbac1载体，然后在其中***上述各元件。
由于本发明优化了3’UTR和5’UTR结构，因此可以例如应用Tail-PCR技术由所述重组表达载体合成其中正链带有PolyA、反链带有对应的PolyT的DNA双链模板，这样降低了DNA模板的不稳定性，进而可在体外合成mRNA。所述的正链中所带有的PolyA中的A的个数范围(或者其反链中对应的PolyT中的T的个数范围)为140-170个，优选为150-170个，更优选为150个左右(例如150个)。
本发明还提供了一种嵌合抗原受体修饰的免疫细胞，该免疫细细胞的表面被本发明所述的嵌合抗原受体修饰。
所述免疫细胞可以为NK细胞或T细胞；其中，所述NK细胞包括自体NK细胞、异体NK细胞或NK细胞株，并且所述T细胞包括原始T细胞或其前体细胞，效应T细胞，记忆T细胞，NKT细胞，或T细胞株。
所述嵌合抗原受体对免疫细胞的修饰可以是通过慢病毒感染、转座子以及mRNA电转。
本发明还提供了一种用于***和/或癌症的具有协同作用的联合药物的药盒，包括：
第一容器，该第一容器装有根据本发明所述的治疗剂中的第一组合物；
第二容器，该第二容器装有根据本发明所述的治疗剂中的第二组合物，其中所述第一容器和所述第二容器是独立的；以及
载明给药时机和给药方式的说明书。
本发明还提供了所述的分离的、具有根据本发明所述的标记性多肽的编码序列的核酸在制备用于治疗或预防肿瘤和/或癌症的药物中的用途。
本发明还提供了所述的重组病毒在制备用于治疗或预防肿瘤和/或癌症的药物中的用途。
本发明还提供了所述的嵌合抗原受体修饰的免疫细胞在制备用于治疗或预防肿瘤和/或癌症的药物中的用途。
本发明还提供了所述的药盒在制备用于治疗或预防肿瘤和/或癌症的药物中的用途。
所述肿瘤和/或癌症包括：乳腺癌，头颈部肿瘤，滑膜癌，肾癌，***癌，黑色素瘤，肺癌，食管癌，结肠癌，直肠癌，脑癌，肝癌，骨癌，绒毛膜癌，胃泌素瘤，嗜铬细胞瘤，催乳素瘤，von Hippel-Lindau病，Zollinger-Ellison综合征，***癌，胆管癌，膀胱癌，输尿管癌，神经胶质瘤，神经母细胞瘤，脑膜瘤，脊髓肿瘤，骨软骨瘤，软骨肉瘤，尤文氏肉瘤，原发部位不明癌，类癌，纤维肉瘤，佩吉特病，***，胆囊癌，眼癌，卡波西氏肉瘤，***癌，睾丸癌，皮肤鳞状细胞癌，间皮瘤，多尖端骨髓瘤，卵巢癌，胰腺内分泌瘤，胰高血糖素瘤，胰腺癌，***癌，垂体癌，软组织肉瘤，视网膜母细胞瘤，小肠癌，胃癌，胸腺癌，滋养细胞癌，***，子宫内膜癌，***癌，外阴癌，蕈样真菌病，胰岛素瘤，心脏癌，脑膜癌，腹膜癌，胸膜癌和血液癌。
本发明还提供了一种***和/或癌症的方法，包括：
对肿瘤和/或癌症患者施用根据本发明所述的治疗剂中的第一组合物；和
对所述肿瘤和/或癌症患者施用根据本发明所述的治疗剂中的第二组合物。
所述治疗剂中的第一组合物和第二组合物可以同时(例如，作为混合物)、分开但同时(例如，分别通过瘤内和静脉注射给药)或依次施用(例如，首先施用第一组合物，然后施用第一组合物)。
优选地，所述方法包括以下依次进行的步骤：
1)对所述肿瘤和/或癌症患者首先施用所述第一组合物；和
2)在施用所述第一组合物之后，对所述肿瘤和/或癌症患者施用所述的治疗剂中的第二组合物。
优选地，在首先施用所述第一组合物之后的第1-30天，对所述肿瘤和/或癌症患者施用所述的治疗剂中的第二组合物。
“在首先施用所述第一组合物之后的第1-30天，对所述肿瘤和/或癌症患者施用所述的治疗剂中的第二组合物”是指首次第二组合物的施用与首次第一组合物施用的时间间隔为1-30天(例如，1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13……30天)，或首次第二组合物的施用与在其之前最相邻一次的所述第一组合物施用的时间间隔为1-30天(例如，1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13……30天)。优选地，首次第二组合物的施用与在其之前最相邻一次的所述第一组合物施用的时间间隔为1-30天(例如，1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13……30天)。
在本发明的一个优选实施方案中，所述核酸的施用剂量为0.01-10mg/天，1天施用1-3次，连续施用1-7天。
在本发明的一个优选实施方案中，所述重组溶瘤痘病毒的施用剂量为约5×107-5×1012个病毒颗粒(可以单次施用或多次施用)，或上述范围间的任何值，或者所述重组溶瘤痘病毒的施用剂量为约5×107-5×1012PFU(可以单次施用或多次施用)，或上述范围间的任何值。其精确剂量还取决于从业者的判断以及每个人的特有情况。在多次施用的情况下，1天施用1-3次，连续施用1-7天。
在本发明的一个优选实施方案中，所述嵌合抗原受体修饰的免疫细胞的施用剂量为，每个疗程总剂量范围为1×104-1×109个细胞/Kg体重。优选地，1天施用1-3次，连续施用1-7天。
在某些实施方案中，所述***和/或癌症的方法还包括对患者施用其它用于***和/或癌症的药物，和/或用于调节患者免疫***的药物，以增强所述嵌合抗原受体修饰的免疫细胞在体内的数量和功能。所述其它用于***和/或癌症的药物包括但不限于，化疗药物，例如环磷酰胺、氟达拉滨(fludarabine)；放疗药物；免疫抑制剂，例如环孢素、硫唑嘌呤、甲氨蝶呤、麦考酚酯(mycophenolate)、FK50；抗体，例如抗CD3、IL-2、IL-6、IL-17、TNF的抗体。
所述DNA可以配制成通过瘤内注射或静脉给药；所述mRNA可以配制成通过瘤内注射或静脉给药。例如，以质粒的形式直接肿瘤内注射，也可用脂质体包装后瘤内注射，也可连接到纳米颗粒上(如多聚L-赖氨酸、聚氨基酸、polyethyleneimine和壳聚糖等聚合物)瘤内注射，也可瘤内注射后用电转方法加强转染率。
所述重组病毒可以配制成通过瘤内注射给药或静脉给药。
所述的嵌合抗原受体修饰的免疫细胞可以配制成通过静脉给药或局部给药。
以下通过例子的方式进一步解释或说明本发明的内容，但这些例子不应被理解为对本发明的保护范围的限制。
例子
以下除非特别说明，否则以下例子中所用实验方法均使用医学生物工程领域的常规实验流程、操作、材料和条件进行。
以下除非特别说明，否则各试剂的百分浓度(％)均指该试剂的体积百分浓度(％(v/v))。
除非特别说明，否则细胞培养在37℃、5％CO2、潮化(95％相对湿度)的条件下进行。
以下例子中所用实验材料的来源如下：
PBMC来源于健康捐献者外周血。
人重组IL-2(hrIL2)购自Peprotech。
DPBS购自Gibco。
电击杯购自Bio-Rad。
人卵巢癌细胞系SKOV3-luc、人T细胞系Jurkat、人肝癌细胞系SK-HEP-1、非洲绿猴肾细胞CV-1、人骨肉瘤细胞143B细胞购自ATCC，人结直肠癌细胞系HCT116-luc购自PerkinElmer。
痘病毒(DDVV-RFP：溶瘤痘病毒DDVV-RFP是已知的，属于溶瘤痘病毒WR株(可参见(例如)科技文献：“X Song,et al.T-cell Engager-armed Oncolytic Vaccinia VirusSignificantly Enhances Antitumor TherapyMolecular Therapy.(2014)；22 1,102-111”)，该病毒的TK基因和VGF基因均为功能缺陷型，且携带有外源红色荧光蛋白(RFP)基因。由于RFP基因仅起到筛选/报告作用，因此溶瘤痘病毒DDVV-RFP的抗肿瘤功能基本等同TK基因和VGF基因功能缺陷型的溶瘤痘病毒。溶瘤痘病毒DDvv-RFP也可采用本领域常规技术对VSC20痘病毒进行基因改造而得到。VSC20痘病毒是VGF基因缺失的痘病毒，制备方法可参见科技文献：“McCart,JA,et al.Systemic cancer therapy with a tumor-selectivevaccinia virus mutant lacking thymidine kinase and vaccinia growth factorgenes.Cancer Res(2001)61:8751–8757.”。所述基因改造包括使用人工合成痘病毒早/晚期启动子pSEL调控外源DsRed基因(即RFP基因)，使用体外细胞内重组技术将DsRed基因***到痘病毒VSC20株的TK基因区中，从而构建得到溶瘤痘病毒DDVV-RFP。
制备例1：通过电穿孔技术分别制备被TT1、TT2、TT3、C1&2a、C1&2b标记的肿瘤细胞
将5×106个Jurkat细胞、HCT116-luc、SKOV3-luc或SK-HEP-1与5μg分别具有TT1(SEQ ID NO:11)、TT2(SEQ ID NO:12)或TT3(SEQ ID NO:13)、C1&2a(SEQ ID NO:14)、C1&2b(SEQ ID NO:15)编码序列的mRNA(分别按照制备例8的方法得到)混合于电转液P3(产品名称“P3Primary Cell 4D-X Kit L”，Lonza，货号V4XP-3012)中，置于100μl NucleocuvetteTM管(产品名称“P3Primary Cell 4D-X Kit L”，Lonza，货号V4XP-3012)，并进行冰浴5分钟。然后使用4D-NucleofectorTM电转仪(Lonza)，选择其自带的肿瘤细胞电转程序进行电转。电转后，将细胞取出置于相应的肿瘤细胞培养液中。Jurkat培养液为RPMI(Gibco)+10％FBS(Hyclone)，SKOV3-luc和HCT116-luc培养液为McCoy’s 5A+10％FBS，SK-HEP-1培养液为EMEM+10％FBS)。并加入DNase(Roche)使其终浓度为10ng/mL，置于37℃，5％CO2孵箱中恢复过夜。24小时后，收集细胞，使用流式细胞仪(购自BD，型号C6Samplar)对电转细胞进行鉴定，得到了分别由TT1、TT2、TT3、C1&2a、或C1&2b标记的各肿瘤细胞。
试验例1：利用电穿孔技术对肿瘤细胞进行标记性多肽的标记的验证
按照制备例1的方法，分别将具有TT1(SEQ ID NO:11)、TT2(SEQ ID NO:12)或TT3(SEQ ID NO:13)编码序列的mRNA(分别按照制备例8的方法得到)通过4D-NucleofectorTM电转仪(Lonza)电转至Jurkat永生化T淋巴细胞、人卵巢癌细胞SKOV3-luc、人结直肠癌细胞HCT116-luc或人肝癌细胞SK-HEP-1内。分别用FITC偶联的抗Myc抗体(Santa Cruz)、FITC偶联的抗HA抗体(Biolegend)、FITC偶联的抗Strep tag II抗体(Genscript)(稀释比例各是1:50)进行染色，使用流式细胞仪(购自BD，型号C6Samplar)对细胞进行鉴定。
结果如图5所示，可成功检测到TT1、TT2和TT3在肿瘤细胞表面的高强度表达。其中TT1和TT2标记的是Jurkat永生化T淋巴细胞(如图5A和B所示)，TT3标记的是人卵巢癌细胞SKOV3-luc(图5C)、人结直肠癌细胞HCT116-luc(图5D)和人肝癌细胞SK-HEP-1(图5E)。图中左侧峰为上述抗体染色的野生型肿瘤细胞(阴性对照曲线)，右侧峰为肿瘤细胞分别电转编码TT1、TT2或TT3的mRNA后，TT1(A)、TT2(B)或TT3(C-E)的表达强度曲线。
制备例2：制备分别靶向TT1、TT2、TT3的CAR-T细胞
将2×106人PBMC细胞重悬于1ml T细胞培养液(添加有1％人AB血清(ValleyBiomedical)的AIMV(Gibco))中，添加终浓度为100ng/ml的OKT3(eBioscience)和300IU/ml的hrIL-2(Peprotech)，接种至24孔板的一个孔，置于37℃、5％CO2的潮化细胞培养箱(Thermo Fisher)。每隔2-3天补充终浓度300IU/ml的hrIL-2，根据细胞的生长，补充新鲜的T细胞培养液，调整细胞数至1×106个细胞/ml。
将培养7-14天的T细胞(1×107个)与4μg aTT3-CD8-41BB-CD3ζmRNA(即SEQ IDNO:55所示核苷酸序列所对应的mRNA(按照制备例8的方法得到))混合于电转液P3(产品名称“P3Primary Cell4D-X Kit L”，Lonza，货号V4XP-3012)中，置于100μl NucleocuvetteTM管(产品名称“P3Primary Cell 4D-X Kit L”,Lonza，货号V4XP-3012)，并进行冰浴冷冻5分钟。然后使用4D-NucleofectorTM电转仪(Lonza)，选择其自带的T细胞电转程序进行电转。电转后，将细胞取出置于T培养液中，加入300IU/ml(终浓度)的hrIL2和10ng/mL的DNase(Roche)，置于37℃，5％CO2孵箱中恢复过夜。24小时后，收集细胞，使用流式细胞仪对电转细胞进行鉴定，得到了靶向TT3的CAR(即，aTT3-CD8-41BB-CD3ζCAR)修饰的T细胞。
靶向TT1、TT2的CAR-T细胞的制备方法同上，不同之处在于其中分别采用aTT1-CD8-41BB-CD3ζmRNA(即SEQ ID NO:53所示核苷酸序列所对应的mRNA(按照制备例8的方法得到))、aTT2-CD8-41BB-CD3ζmRNA(即SEQ ID NO:54所示核苷酸序列所对应的mRNA(按照制备例8的方法得到))。
实施例1：靶向标记性多肽的CAR-T细胞对通过电转而标记有标记性多肽的肿瘤细胞的杀瘤能力
本实施例测试了针对标记性多肽的CAR-T细胞对电转标记后Jurkat细胞的杀伤能力。将按制备例2的方法得到的靶向TT1或TT2的CAR修饰的或没有修饰的T细胞分别与按制备例1的方法得到的通过电转被TT1或TT2标记的人T细胞系Jurkat共培养于U型96孔板，上述CAR-T效应细胞与靶标细胞的个数比例(E:T)范围为1.25:1-20:1。每组实验重复3次。经过2小时的共培养后，用DELFIA EuTDA细胞毒性试剂盒(美国的PerkinElmer公司)检测CAR-T细胞溶解肿瘤细胞的能力，杀伤效果用如下公式计算：％特异性裂解＝((实验组释放(读数)-空白组释放(读数))/(最大释放(读数)-空白组释放(读数))×100。
结果如图6和7所示：与阴性对照的T细胞组相比(Mock组，不加入编码CAR的mRNA，只对T细胞进行空白电转)，针对TT1或TT2的CAR-T细胞对电转TT1或TT2后的Jurkat细胞的杀伤能力显著升高，其杀伤值可分别增加15％和40％(E:T＝20:1)。
实施例2：靶向标记性多肽的CAR-T可杀伤多种通过电转而标记有标记性多肽的肿瘤细胞
本实施例测试了CAR-T对电转标记的肿瘤细胞杀伤的广谱适用性。将按制备例2的方法得到的靶向TT3的CAR修饰的T细胞或野生型T细胞(作为CAR的阴性对照组)分别与通过电转被TT3标记的人T细胞系Jurkat或人结直肠癌细胞系HCT116-luc共培养于U型96孔板，上述效应细胞与靶标细胞的个数比例(E:T)范围为由2.5:1到20:1。每组实验重复3次。经过2小时的共培养后，用DELFIA EuTDA细胞毒性试剂盒(得自美国的PerkinElmer公司)检测CAR-T细胞溶解肿瘤细胞的能力，杀伤效果用如下公式计算：％特异性裂解＝((实验组释放(读数)-空白组释放(读数))/(最大释放(读数)-空白组释放(读数))×100。
结果如图8所示：与野生型T细胞相比，靶向TT3的CAR-T细胞不仅可以显著杀伤电转TT3标记的Jurkat细胞，也可以杀伤电转TT3标记的HCT116-luc细胞。其杀伤值可分别增加超过40％(HCT116-luc细胞)和35％(Jurkat细胞)(E:T＝20:1)。
实施例3：靶向标记性多肽的CAR-T细胞可特异性地杀伤电转标记的肿瘤细胞
本实施例测试了本发明的靶向标记性多肽的CAR-T细胞对被标记的肿瘤细胞的特异性。将按制备例2的方法得到的靶向TT3的CAR-T细胞或mGFP-Z修饰的T细胞(用GFP序列(其Genbank编号为YP_002302326.1)代替aTT3-CD8-41BB-CD3ζCAR中的抗原结合结构域，作为CAR的阴性对照组)分别与电转被TT3标记或没有被标记的人结直肠癌细胞系HCT116-luc共培养于U型96孔板，上述效应细胞与靶标细胞的个数比例(E:T)范围为由5:1到20:1。每组实验重复3次。经过2小时的共培养后，用DELFIA EuTDA细胞毒性试剂盒(得自美国的PerkinElmer公司)检测CAR-T细胞溶解肿瘤细胞的能力，杀伤效果用如下公式计算：％特异性裂解＝((实验组释放(读数)-空白组释放(读数))/(最大释放(读数)-空白组释放(读数))×100。
结果如图9所示：与CAR的阴性对照组(mGFP-Z)相比，靶向TT3的CAR-T细胞可以显著杀伤电转TT3被标记的HCT116-luc细胞(图9A)，其杀伤值可增加超过20％(E:T 20:1)。而对于没有被标记的HCT116-luc细胞，CAR的阴性对照组和靶向TT3的CAR-T细胞对HCT116-luc的杀伤几乎没有区别。这证明了靶向TT3的CAR对TT3的特异性。
实施例4：肿瘤细胞可被2种抗原表位多肽标记并被相应的CAR-T细胞识别
将两种抗原表位多肽克隆到一个载体中，使肿瘤细胞被两种抗原表位多肽多肽同时标记，从而可以用不同的CAR-T同时或先后对被标记的肿瘤细胞进行追踪和杀伤。进一步而言，按制备例8所示的方法，将2种抗原表位多肽克隆至pFastbac1载体(LifeTechnologies)中，采用不同的间隔跨膜区，制备得到了表达标记性多肽C1&2a和C1&2b的载体(分别为pFastbac1-C1&2a、pFastbac1-C1&2b)，进而制备得到C1&2a(SEQ ID NO:14)、C1&2b(SEQ ID NO:15)编码序列的mRNA。进一步按制备例1的方法得到被C1&2a或C1&2b标记的Jurkat细胞。其中，C1&2a包含3个重复的来源于Myc标签的抗原表位多肽以及3个重复的来源于HA标签的抗原表位多肽。C1&2b包含2个重复的来源于Myc标签的抗原表位多肽以及2个重复的来源于HA标签的抗原表位多肽。C1&2a的氨基酸序列如SEQ ID NO:14，C1&2b的氨基酸序列如SEQ ID NO:15所示。具有标记性多肽C1&2a编码序列的核酸的核苷酸序列如SEQID NO:29，具有标记性多肽C1&2b编码序列的核酸的核苷酸序列如SEQ ID NO:30所示。
通过IFNγELISpot(Mabtech)检测CAR-T被肿瘤细胞刺激后其IFNγ的分泌。将空白电转的T细胞(Mock-T)或按制备例2的方法得到的电转靶向TT1或TT2CAR的mRNA的T细胞分别与按制备例1的方法得到的、被C1&2a或C1&2b标记的Jurkat细胞共培养于IFNγELISPOT检测板，上述CAR-T效应细胞与靶标细胞的数量比例(E:T)为10:1。每组实验重复3次。经过24小时的共培养后，显影并使用软件Immunospot进行ELISPOT点计数。
如图10所示：左图是IFNγELISpot的代表性图片，右图是对IFNγ斑点数目的统计。与没有CAR修饰的T细胞相比，靶向TT1或TT2的CAR-T可同时对C1&2a或C1&2b标记的Jurkat细胞表现出应答。针对TT1或TT2的CAR-T对C1&2b的应答比C1&2a要强。
制备例3：制备靶向TT3的嵌合抗原受体修饰的NK细胞
将细胞数为20×106个的PBMCs细胞和2mL NK细胞活化剂I(购自深圳达科为，DKW35-CYT-NK001)均匀混合于400ml NK培养液(NK培养液为AIM
Figure BDA0001776469610000511
培养基(购自LifeTechnologies)+1％人类血清(购自Valley Biomedical，货号HP1022HI)中，接种于一个G-Rex100细胞培养器(购自Wilson Wolf)，加入IL2(终浓度：50IU/ml)，放置于37℃细胞培养箱中，每隔一天补充全液体积的IL2(终浓度：50IU/ml)，培养10天，收集细胞计数，计数完毕取出收集细胞中的20×106个细胞与另外的2mL NK细胞活化剂I均匀混合于400ml NK培养液中，接种回G-Rex100细胞培养器，相同条件继续培养7天。上述第10天时的剩余细胞冻存备用，第16天时的细胞收集计数，取出2×106个细胞用于流式细胞仪进行细胞表型分析(使用抗CD3和抗CD56抗体，分别为：PE偶联的抗人CD3抗体和APC偶联的抗人CD56抗体(购自Miltenyi)，1:50稀释)。
将培养16天的NK细胞(1×107个)与4μg aTT3-CD8-41BB-CD3ζmRNA(按照制备例8的方法得到)混合于电转液P3(产品名称“P3Primary Cell 4D-X Kit L”，Lonza，货号V4XP-3012)中，置于100μl NucleocuvetteTM管(产品名称“P3Primary Cell 4D-X Kit L”，Lonza，货号V4XP-3012)，并进行冰浴冷冻5分钟。然后使用4D-NucleofectorTM电转仪(Lonza)，选择其自带的NK细胞电转程序进行电转。电转后，将细胞取出置于NK细胞培养液中，加入50IU/ml的IL2和10ng/mL的DNase，置于37℃，5％CO2孵箱中恢复过夜。24小时后，收集细胞，使用流式细胞仪(购自B D，型号C6Samplar)对电转细胞进行鉴定，得到了靶向TT3的CAR(即，aTT3-CD8-41BB-CD3ζCAR)修饰的NK细胞。
实施例5：靶向标记性多肽的CAR-NK细胞对电转标记肿瘤细胞的杀瘤能力
本实施例还测试了针对标记性多肽的CAR修饰的NK细胞对电转标记的SKOV3-luc或SK-HEP-1细胞的杀伤能力。将靶向TT3的CAR修饰的NK细胞或mGFP-Z修饰的NK细胞(用GFP序列(其Genbank编号为YP_002302326.1)代替aTT3-CD8-41BB-CD3ζCAR的抗原结合结构域，作为CAR的阴性对照组)分别与按制备例1的方法得到的、通过电转被TT3标记的人卵巢癌细胞系SKOV3-luc或人肝癌细胞系SK-HEP-1共培养于U型96孔板，上述CAR-NK效应细胞与靶标细胞的个数比例(E:T)为10:1。每组实验重复3次。经过2小时的共培养后，用DELFIA EuTDA细胞毒性试剂盒(美国的PerkinElmer公司)检测CAR-NK细胞溶解肿瘤细胞的能力，杀伤效果用如下公式计算：％特异性裂解＝((实验组释放(读数)-空白组释放(读数))/(最大释放(读数)-空白组释放(读数))×100。
结果如图11所示：与阴性对照组相比，靶向TT3的CAR-NK细胞对电转TT3后的SKOV3-luc和SK-HEP-1细胞的杀伤能力显著升高，其杀伤值可分别增加约40％。
制备例4：制备被TT3稳定标记的HCT116-luc细胞系
首先将可用于mRNA合成的重组表达载体pFastbac1-TT3用ClaI限制性内切酶线性化后，通过切胶回收线性化后的片段。接种4×105个HCT116-luc细胞至6孔板的一个孔，将2μg线性化的质粒与4μl P3000，125μl的Opti-MEM混合，命名为混合物1；将6μl Lipo3000与125μl的Opti-MEM混合，命名为混合物2。将混合物1和混合物2混合，命名为混合物3，室温孵育15分钟。弃掉6孔板中的培养液，添加2ml McCoy’s 5A+10％FBS培养液，将混合物3加入培养液中。转染24小时后，弃掉培养液，更换2ml新鲜的McCoy’s 5A+10％FBS培养液。培养一周后用FITC偶联的抗Strep Tag II抗体(购自Genscript，1:50稀释)染色HCT116-luc细胞(于4度染色半个小时)，通过BD FACSAria IIsorter进行单细胞分选，分选出表达TT3(即FITC阳性)的细胞，继续培养扩大即可使用。
制备例5：通过慢病毒制备靶向TT3的嵌合抗原受体修饰的T细胞
具有靶向TT3的嵌合抗原受体编码序列的DNA的核苷酸序列(如SEQ ID NO:55所示)按本领域常规技术被***第三代自我灭活的慢病毒表达载体(CD810A-1；SystemBiosciences)。慢病毒通过HEK293FT细胞生产(LifeTechnologies)。收获病毒上清液后，通过超速离心在25,000转浓缩3小时。为制备慢病毒转导的CAR-T细胞，首先通过Ficoll-Paque密度梯度离心(GE Healthcare)从健康捐赠者的新鲜血中分离出人外周血单个核细胞(PBMCs)。将分离的PBMC用人类CD3/CD28
Figure BDA0001776469610000531
(Life Technologies)激活后，培养在添加5％人AB血清(Valley Biomedical)和300IU/ml IL-2(Peprotech)的AIM-V(LifeTechnologies)培养液中。培养一周后，用含有靶向TT3的嵌合抗原受体序列的慢病毒感染被激活的PBMC细胞，继续培养一周后，即可使用。
实施例6：靶向TT3的CAR-T在小鼠体内有效杀伤通过慢病毒而被TT3稳定标记的肿瘤细胞
进一步利用植入人体肿瘤的小鼠模型测试了靶向TT3CAR-T细胞的体内杀瘤效果。实验用小鼠为非肥胖型糖尿病/重症联合免疫缺陷/IL-2Rγcnull(NSG)小鼠(6-8周，雌性)，每只小鼠被植入1×107个被TT3标记的人结直肠癌细胞系HCT116-luc(通过制备例4制备)。肿瘤植入7天后，利用活体生物成像技术(BLI)，在IVIS Spectrum成像平台观测到了肿瘤的生长，并用成像仪(得自美国PerkinElmer公司)拍照记录肿瘤的生长情况。拥有相似BLI强度(BLI强度指的是活体成像仪记录的小鼠体内肿瘤细胞荧光强度)的小鼠被随机分为4组，分别为：磷酸盐缓冲液(PBS)组，对照RNA CAR-T细胞组，靶向TT3RNA CAR-T细胞组，和靶向TT3DNA CAR-T细胞组，每组5只小鼠。对照RNA CAR-T(转染了mGFPZ-CAR)和靶向TT3RNA CAR-T按照制备例2的方法制备，靶向TT3DNA CAR-T按照制备例5的制备方法制备。所有CAR-T细胞组以每只小鼠每次1×107细胞数腹腔注射，PBS组每只小鼠每次腹腔注射100μL量的PBS。细胞注射方案为：肿瘤接种第7天时注射。密切地观察小鼠的行为和生存情况，并将肿瘤的发展状况由BLI记录。所有的光信号和图片都由Xenogen活体成像软件v2.5记录分析。
如图12所示，肿瘤植入后第14天，肿瘤生长状况显示PBS组小鼠肿瘤持续生长，；对照RNA CAR-T细胞组(图中显示为“对照RNA CAR/T”)的全部5只小鼠肿瘤生长停止，其肿瘤大小显著小于PBS组；靶向TT3RNA CAR-T细胞组(图中显示为“靶向TT3RNA CAR/T”)的肿瘤有所缓解，其肿瘤大小显著小于对照RNA CAR/T组；靶向TT3DNA CAR-T细胞组(图中显示为“靶向TT3DNA CAR/T”)的肿瘤有显著的缓解，肿瘤几乎完全消失。由此可见，靶向TT3CAR修饰的T细胞能够有效杀死体内被TT3标记的肿瘤。
DNA CAR-T比RNA CAR-T效果更好是因为DNA CAR-T中CAR的元件是持续表达的，因此CAR-T遇到抗原后可以在体内持续扩增；而RNA CAR-T中CAR的元件是RNA，只可持续表达5-7天，在这5-7天内表达量也会越来越低，且随着T细胞的扩增RNA会逐渐被稀释，因此DNACAR-T的效果比RNA CAR-T的效果好。DNA CAR-T只需单次注射，RNA CAR-T需要反复多次注射，这里都只注射了一次。
制备例6：通过Crisper-Cas9技术制备基因组中含有TT3的重组溶瘤痘病毒
将4×105CV-1细胞重悬于2ml添加10％FBS(Sigma)的DMEM(Gibco)培养基中，接种于6孔板(Costar)的一个孔。培养过夜后，弃掉旧的培养基。用无血清的DMEM培养基稀释痘病毒(DDVV-RFP)，添加1ml的病毒稀释液(0.05MOI)。病毒感染4小时后，弃掉含有病毒的培养液，添加2ml含有5％FBS的DMEM培养液。将1.5μg Cas9蛋白(购自IDT)、9pmol先导RNA-1和9pmol tracr RNA(购自IDT)稀释至37.5μl Opti-MEM(Gibco)，室温孵育10分钟，命名为混合物1；另将1.5μg Cas9蛋白(购自IDT)、9pmol先导RNA-2和9pmol tracr RNA(购自IDT)稀释至37.5μl Opti-MEM(Gibco)，室温孵育10分钟，命名为混合物2。将6μl的Lipo3000(购自Life Technologies)和150μl的Opti-MEM混合在一起，命名为混合物3。将混合物1、混合物2和75μl的混合物3混合在一起，室温继续孵育15分钟，命名为混合物4。将2μg供体质粒pFastbac1-TT3-PuroGFP(如图3所示)、4μL的P3000和75μl的Opti-MEM混合在一起，再与75μl的混合物3混合在一起，室温孵育15分钟，命名为混合物5。最后将混合物4和5混合在一起，加入上述CV-1细胞的6孔板中。转染后48小时，收集上清液和细胞，反复冻融，可得到重组痘病毒。用重组痘病毒感染143B细胞，可见带有绿色荧光的重组子。利用绿色荧光可对重组子进行筛斑纯化，可得到纯化的携带TT3编码序列的重组痘病毒(vvDD-TT3)。
按本领域的常规技术制备供体质粒pFastbac1-TT3-PuroGFP(如图3所示)，包括：首先，改造pfastbac1，包括只保留pUC ori、AmpR、bla启动子、f1ori，加上Ecor1、sal1、age1、Hind3、Kpn1和Cla克隆位点，产生pBS1质粒；通过IDT分别合成片段1(ecor1-gRNA1-LHR480-sal1)片段2(sal1-TT3-age1)片段3(age1-pSEL-loxp-p7.5-hind3)片段4(hind3-puromycin-gfp-loxp-kpn1)片段5(kpn1-RHR520-gRNA2-cla1)；依次将5个片段连接入pBS1即可。所得质粒的核苷酸序列如SEQ ID NO:38所示。
制备例7：通过重组溶瘤痘病毒感染制备细胞表面表达TT3的肿瘤细胞
第0天，分别接种1.5×106个SKOV3-luc、HCT116-luc和SK-HEP-1至10cm细胞培养皿。第1天，弃掉细胞培养液(SKOV3-luc和HCT116-luc的细胞培养液为McCoy5A+10％FBS，SK-HEP-1的培养液为EMEM+10％FBS)，将按照制备例6的方法得到的重组溶瘤痘病毒(vvDD-TT3)分别稀释至5ml相应的无血清细胞培养液中，分别加入SKOV3-luc、HCT116-luc和SK-HEP-1的细胞培养皿中，感染MOI分别为0.02、0.2、0.02，每半小时轻轻晃一下细胞培养皿。感染2小时后，弃掉病毒稀释液，加入含有5％FBS(Sigma)的细胞培养液(SKOV3-luc和HCT116-luc为McCoy5A，SK-HEP-1的培养液为EMEM)。继续培养46小时后，收获细胞。用生物素偶联的抗Strep tag II抗体(Genscript)作为一抗和链亲和素-APC作为二抗(均为1:50稀释)进行染色，使用流式细胞仪(购自BD，型号C6Samplar)检测细胞表面TT3的表达。
结果如图13所示，可成功地检测到GFP的表达，并且TT3在被感染肿瘤细胞表面具有高强度的表达。
实施例7：靶向TT3的CAR-NK对利用重组溶瘤痘病毒被标记的肿瘤细胞的体外杀伤作用
本实施例测试了针对标记性多肽的CAR修饰的NK细胞对用重组溶瘤痘病毒感染后被标记的SKOV3-luc或SK-HEP-1细胞的杀伤能力。将按照制备例3的方法得到的靶向TT3的CAR修饰的NK细胞和mGFP-Z修饰的NK细胞(用GFP代替aTT3-CD8-41BB-CD3ζCAR的抗原结合结构域，作为CAR的阴性对照组)分别与通过重组溶瘤痘病毒感染从而被TT3标记的SKOV3-luc和SK-HEP-1(按照制备例7的方法得到，各肿瘤细胞感染重组溶瘤痘病毒后48小时与上述NK细胞混合)、以及未经标记的SKOV3-luc和SK-HEP-1共培养于U型96孔板，上述CAR-NK效应细胞与靶标细胞的个数比例(E:T)为10:1。每组实验重复3次。经过2小时的共培养后，用DELFIA EuTDA细胞毒性试剂盒(美国的PerkinElmer公司)检测CAR-T细胞溶解肿瘤细胞的能力，杀伤效果用如下公式计算：％特异性裂解＝((实验组释放(读数)-空白组释放(读数))/(最大释放(读数)-空白组释放(读数))×100。
结果如图14所示，与阴性对照组的mGFP-Z修饰的NK细胞(图中显示为NK mGFPCAR)相比，靶向TT3的CAR-NK细胞(图中显示为NK anti-TT3CAR)对重组溶瘤痘病毒感染后被TT3标记的SKOV3-luc和SK-HEP-1细胞的杀伤能力显著升高，其杀伤值可分别增加约18％和23％。
制备例8：编码标记性多肽TT1、TT2、TT3、C1&2a、C1&2b的mRNA以及分别靶向TT1、TT2、TT3的aTT1-CD8a-4-1BB-CD3ζmRNA、aTT2-CD8a-4-1BB-CD3ζmRNA、aTT3-CD8a-4-1BB-CD3ζmRNA的体外合成
重组表达载体pFastbac1-aTT1-CD8a-4-1BB-CD3ζ、pFastbac1-aTT2-CD8a-4-1BB-CD3ζ、pFastbac1-aTT3-CD8a-4-1BB-CD3ζ的构建：按照本领域常规技术，首先合成一段依次含有T7启动子、含有Kozak序列的5’UTR、GM-CSFα信号肽、含有EcoRI、SphI、SalI、Hind IIIand ClaI的多克隆位点以及α球蛋白3’UTR的序列(AIT Biotech)，并***pFastbac1载体(Life Technologies)，以构建载体pFBCMV-T7。再合成含有以下序列的片段：EcoRI酶切位点的接头序列，分别靶向TT1、TT2或TT3的嵌合抗原受体的编码序列，SalI酶切位点的接头序列。将pFBCMV-T7载体和合成的基因片段分别进行EcoRI和SalI(NEB)双酶切反应，酶切产物用琼脂糖凝胶DNA回收试剂盒进行DNA片段回收，然后进行连接、转化One
Figure BDA0001776469610000581
Chemically Competent TOP10化学感受态细胞(购自Life Technologies)，37℃培养18小时后挑取单克隆，37℃，250rpm培养16小时后用质粒小提试剂盒(购自Omega Bio Tek)提取质粒，分别得到pFastbac1-aTT1-CD8a-4-1BB-CD3ζ、pFastbac1-aTT2-CD8a-4-1BB-CD3ζ、pFastbac1-aTT3-CD8a-4-1BB-CD3ζ。各质粒经测序鉴定无误。
重组表达载体pFastbac1-TT1、pFastbac1-TT2、pFastbac1-TT3、pFastbac1-C1&2a、pFastbac1-C1&2b的构建：首先按照上述方法得到载体pFBCMV-T7。并且合成含有以下序列的片段：EcoRI酶切位点的接头序列，标记性多肽(TT1、TT2、TT3、C1&2a或C1&2b)的编码序列、SalI酶切位点的接头序列。将pFBCMV-T7载体和合成的基因片段分别进行EcoRI和SalI(NEB)双酶切反应，酶切产物用琼脂糖凝胶DNA回收试剂盒进行DNA片段回收，然后进行连接、转化One
Figure BDA0001776469610000582
Chemically Competent TOP10化学感受态细胞(购自LifeTechnologies)，37℃培养18小时后挑取单克隆，37℃，250rpm培养16小时后用质粒小提试剂盒(购自Omega Bio Tek)提取质粒，分别得到pFastbac1-TT1、pFastbac1-TT2、pFastbac1-TT3、pFastbac1-C1&2a、pFastbac1-C1&2b。各质粒经测序鉴定后无误。
应用Tail-PCR技术大剂量合成其中正链带有PolyA、反链带有对应的PolyT的DNA双链模板用来进行试管内RNA合成，减少了DNA模板的不稳定性。具有标记性多肽TT1、TT2、TT3、C1&2a或C1&2b编码序列的DNA分别以所述pFastbac1-TT1、pFastbac1-TT2、pFastbac1-TT3、pFastbac1-C1&2a、pFastbac1-C1&2b载体作为DNA模板进行Tail-PCR扩增，用以分别合成具有标记性多肽TT1、TT2、TT3、C1&2a、C1&2b编码序列的线性化DNA模板。
具有嵌合抗原受体编码序列的DNA分别以所述的pFastbac1-aTT1-CD8a-4-1BB-CD3ζ、pFastbac1-aTT2-CD8a-4-1BB-CD3ζ、pFastbac1-aTT3-CD8a-4-1BB-CD3ζ载体作为DNA模板进行Tail-PCR扩增，用以分别合成具有嵌合抗原受体aTT1-CD8a-4-1BB-CD3ζ、aTT2-CD8a-4-1BB-CD3ζ、aTT3-CD8a-4-1BB-CD3ζ编码序列的线性化DNA模板。Tail-PCR反应条件参照KAPA HiFiHotStartReadyMix(2X)的说明书，反应体系(50μL)如下:
双蒸水(nuclease free)：25μL
2X KAPA HiFiHotStart Uracil+ReadyMix：25μL
P7(SEQ ID NO:15)(100μM)：0.15μL
P8(SEQ ID NO:16)(100μM)：0.15μL
载体DNA模板(500ng/μL)：0.5μL
将上述PCR产物用1％(w/v)的琼脂糖凝胶进行鉴定。鉴定正确的产物用于编码标记性多肽TT1、TT2、TT3、C1&2a、C1&2b的mRNA(分别为SEQ ID No:26、27、28、29、30所示核苷酸序列所对应的mRNA)以及分别靶向TT1、TT2、TT3的aTT1-CD8a-4-1BB-CD3ζmRNA、aTT2-CD8a-4-1BB-CD3ζmRNA、aTT3-CD8a-4-1BB-CD3ζmRNA(分别为SEQ ID No:53、54、55所示核苷酸序列所对应的mRNA)的体外合成。用mRNA体外合成试剂盒合成戴帽的mRNA，试剂盒为mMESSAGEmMACHINE T7ULTRA转录试剂盒(可得自美国Invitrogen公司)或者mScriptTMRNAsystem(可得自美国Epicentre公司)。按照试剂盒的说明，并用试剂盒提供的试剂进行合成即可。
将体外合成的mRNA产物用1％(w/v)的琼脂糖凝胶进行分离鉴定。鉴定正确的mRNA存放于-80℃保存备用。
SEQUENCE LISTING
<110> 杭州优善生物科技有限公司
杭州康万达医药科技有限公司
<120> 包含核酸及CAR修饰的免疫细胞的治疗剂及其应用
<130> FI-183581-59:52/C
<160> 62
<170> PatentIn version 3.5
<210> 1
<211> 58
<212> PRT
<213> 人工序列（artificial sequence）
<400> 1
Gly Ala His Ala Asp Ile Thr Ser Glu Gln Lys Leu Ile Ser Glu Glu
1 5 10 15
Asp Leu Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Glu Gln Lys Leu
20 25 30
Ile Ser Glu Glu Asp Leu Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser
35 40 45
Glu Gln Lys Leu Ile Ser Glu Glu Asp Leu
50 55
<210> 2
<211> 55
<212> PRT
<213> 人工序列（artificial sequence）
<400> 2
Gly Ala His Ala Asp Ile Thr Ser Tyr Pro Tyr Asp Val Pro Asp Tyr
1 5 10 15
Ala Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Tyr Pro Tyr Asp Val
20 25 30
Pro Asp Tyr Ala Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Tyr Pro
35 40 45
Tyr Asp Val Pro Asp Tyr Ala
50 55
<210> 3
<211> 55
<212> PRT
<213> 人工序列（artificial sequence）
<400> 3
Gly Ala His Ala Asp Ile Thr Ser Asn Trp Ser His Pro Gln Phe Glu
1 5 10 15
Lys Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Asn Trp Ser His Pro
20 25 30
Gln Phe Glu Lys Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Asn Trp
35 40 45
Ser His Pro Gln Phe Glu Lys
50 55
<210> 4
<211> 78
<212> PRT
<213> 人工序列（artificial sequence）
<400> 4
Gly Ala His Ala Ala Gln Leu Thr Leu Thr Lys Gly Asn Lys Glu Gln
1 5 10 15
Lys Leu Ile Ser Glu Glu Asp Leu Gly Glu Gln Lys Leu Ile Ser Glu
20 25 30
Glu Asp Leu Gly Glu Gln Lys Leu Ile Ser Glu Glu Asp Leu Gly Gly
35 40 45
Ser Tyr Pro Tyr Asp Val Pro Asp Tyr Ala Gly Tyr Pro Tyr Asp Val
50 55 60
Pro Asp Tyr Ala Gly Tyr Pro Tyr Asp Val Pro Asp Tyr Ala
65 70 75
<210> 5
<211> 47
<212> PRT
<213> 人工序列（artificial sequence）
<400> 5
Gly Ala His Ala Glu Gln Lys Leu Ile Ser Glu Glu Asp Leu Gly Glu
1 5 10 15
Gln Lys Leu Ile Ser Glu Glu Asp Leu Gly Gly Ser Tyr Pro Tyr Asp
20 25 30
Val Pro Asp Tyr Ala Gly Tyr Pro Tyr Asp Val Pro Asp Tyr Ala
35 40 45
<210> 6
<211> 55
<212> PRT
<213> 人（Homo sapiens）
<400> 6
Phe Val Pro Val Phe Leu Pro Ala Lys Pro Thr Thr Thr Pro Ala Pro
1 5 10 15
Arg Pro Pro Thr Pro Ala Pro Thr Ile Ala Ser Gln Pro Leu Ser Leu
20 25 30
Arg Pro Glu Ala Cys Arg Pro Ala Ala Gly Gly Ala Val His Thr Arg
35 40 45
Gly Leu Asp Phe Ala Cys Asp
50 55
<210> 7
<211> 28
<212> PRT
<213> 人（Homo sapiens）
<400> 7
Ile Tyr Ile Trp Ala Pro Leu Ala Gly Thr Cys Gly Val Leu Leu Leu
1 5 10 15
Ser Leu Val Ile Thr Leu Tyr Cys Asn His Arg Asn
20 25
<210> 8
<211> 22
<212> PRT
<213> 人工序列（artificial sequence）
<400> 8
Met Leu Leu Leu Val Thr Ser Leu Leu Leu Cys Glu Leu Pro His Pro
1 5 10 15
Ala Phe Leu Leu Ile Pro
20
<210> 9
<211> 117
<212> PRT
<213> 人（Homo sapiens）
<400> 9
Thr Gly Thr Ile Glu Thr Thr Gly Asn Ile Ser Ala Glu Lys Gly Gly
1 5 10 15
Ser Ile Ile Leu Gln Cys His Leu Ser Ser Thr Thr Ala Gln Val Thr
20 25 30
Gln Val Asn Trp Glu Gln Gln Asp Gln Leu Leu Ala Ile Cys Asn Ala
35 40 45
Asp Leu Gly Trp His Ile Ser Pro Ser Phe Lys Asp Arg Val Ala Pro
50 55 60
Gly Pro Gly Leu Gly Leu Thr Leu Gln Ser Leu Thr Val Asn Asp Thr
65 70 75 80
Gly Glu Tyr Phe Cys Ile Tyr His Thr Tyr Pro Asp Gly Thr Tyr Thr
85 90 95
Gly Arg Ile Phe Leu Glu Val Leu Glu Ser Ser Val Ala Glu His Gly
100 105 110
Ala Arg Phe Gln Ile
115
<210> 10
<211> 202
<212> PRT
<213> 人工序列（artificial sequence）
<400> 10
Thr Gly Thr Ile Glu Thr Thr Gly Asn Ile Ser Ala Glu Lys Gly Gly
1 5 10 15
Ser Ile Ile Leu Gln Cys His Leu Ser Ser Thr Thr Ala Gln Val Thr
20 25 30
Gln Val Asn Trp Glu Gln Gln Asp Gln Leu Leu Ala Ile Cys Asn Ala
35 40 45
Asp Leu Gly Trp His Ile Ser Pro Ser Phe Lys Asp Arg Val Ala Pro
50 55 60
Gly Pro Gly Leu Gly Leu Thr Leu Gln Ser Leu Thr Val Asn Asp Thr
65 70 75 80
Gly Glu Tyr Phe Cys Ile Tyr His Thr Tyr Pro Asp Gly Thr Tyr Thr
85 90 95
Gly Arg Ile Phe Leu Glu Val Leu Glu Ser Ser Val Ala Glu His Gly
100 105 110
Ala Arg Phe Gln Ile Ala Ser Phe Val Pro Val Phe Leu Pro Ala Lys
115 120 125
Pro Thr Thr Thr Pro Ala Pro Arg Pro Pro Thr Pro Ala Pro Thr Ile
130 135 140
Ala Ser Gln Pro Leu Ser Leu Arg Pro Glu Ala Cys Arg Pro Ala Ala
145 150 155 160
Gly Gly Ala Val His Thr Arg Gly Leu Asp Phe Ala Cys Asp Ile Tyr
165 170 175
Ile Trp Ala Pro Leu Ala Gly Thr Cys Gly Val Leu Leu Leu Ser Leu
180 185 190
Val Ile Thr Leu Tyr Cys Asn His Arg Asn
195 200
<210> 11
<211> 153
<212> PRT
<213> 人工序列（artificial sequence）
<400> 11
Gly Ala His Ala Asp Ile Thr Ser Glu Gln Lys Leu Ile Ser Glu Glu
1 5 10 15
Asp Leu Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Glu Gln Lys Leu
20 25 30
Ile Ser Glu Glu Asp Leu Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser
35 40 45
Glu Gln Lys Leu Ile Ser Glu Glu Asp Leu Gly Gly Gly Gly Ser Gly
50 55 60
Gly Gly Gly Ser Ala Ser Phe Val Pro Val Phe Leu Pro Ala Lys Pro
65 70 75 80
Thr Thr Thr Pro Ala Pro Arg Pro Pro Thr Pro Ala Pro Thr Ile Ala
85 90 95
Ser Gln Pro Leu Ser Leu Arg Pro Glu Ala Cys Arg Pro Ala Ala Gly
100 105 110
Gly Ala Val His Thr Arg Gly Leu Asp Phe Ala Cys Asp Ile Tyr Ile
115 120 125
Trp Ala Pro Leu Ala Gly Thr Cys Gly Val Leu Leu Leu Ser Leu Val
130 135 140
Ile Thr Leu Tyr Cys Asn His Arg Asn
145 150
<210> 12
<211> 150
<212> PRT
<213> 人工序列（artificial sequence）
<400> 12
Gly Ala His Ala Asp Ile Thr Ser Tyr Pro Tyr Asp Val Pro Asp Tyr
1 5 10 15
Ala Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Tyr Pro Tyr Asp Val
20 25 30
Pro Asp Tyr Ala Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Tyr Pro
35 40 45
Tyr Asp Val Pro Asp Tyr Ala Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly
50 55 60
Ser Ala Ser Phe Val Pro Val Phe Leu Pro Ala Lys Pro Thr Thr Thr
65 70 75 80
Pro Ala Pro Arg Pro Pro Thr Pro Ala Pro Thr Ile Ala Ser Gln Pro
85 90 95
Leu Ser Leu Arg Pro Glu Ala Cys Arg Pro Ala Ala Gly Gly Ala Val
100 105 110
His Thr Arg Gly Leu Asp Phe Ala Cys Asp Ile Tyr Ile Trp Ala Pro
115 120 125
Leu Ala Gly Thr Cys Gly Val Leu Leu Leu Ser Leu Val Ile Thr Leu
130 135 140
Tyr Cys Asn His Arg Asn
145 150
<210> 13
<211> 150
<212> PRT
<213> 人工序列（artificial sequence）
<400> 13
Gly Ala His Ala Asp Ile Thr Ser Asn Trp Ser His Pro Gln Phe Glu
1 5 10 15
Lys Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Asn Trp Ser His Pro
20 25 30
Gln Phe Glu Lys Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Asn Trp
35 40 45
Ser His Pro Gln Phe Glu Lys Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly
50 55 60
Ser Ala Ser Phe Val Pro Val Phe Leu Pro Ala Lys Pro Thr Thr Thr
65 70 75 80
Pro Ala Pro Arg Pro Pro Thr Pro Ala Pro Thr Ile Ala Ser Gln Pro
85 90 95
Leu Ser Leu Arg Pro Glu Ala Cys Arg Pro Ala Ala Gly Gly Ala Val
100 105 110
His Thr Arg Gly Leu Asp Phe Ala Cys Asp Ile Tyr Ile Trp Ala Pro
115 120 125
Leu Ala Gly Thr Cys Gly Val Leu Leu Leu Ser Leu Val Ile Thr Leu
130 135 140
Tyr Cys Asn His Arg Asn
145 150
<210> 14
<211> 163
<212> PRT
<213> 人工序列（artificial sequence）
<400> 14
Gly Ala His Ala Ala Gln Leu Thr Leu Thr Lys Gly Asn Lys Glu Gln
1 5 10 15
Lys Leu Ile Ser Glu Glu Asp Leu Gly Glu Gln Lys Leu Ile Ser Glu
20 25 30
Glu Asp Leu Gly Glu Gln Lys Leu Ile Ser Glu Glu Asp Leu Gly Gly
35 40 45
Ser Tyr Pro Tyr Asp Val Pro Asp Tyr Ala Gly Tyr Pro Tyr Asp Val
50 55 60
Pro Asp Tyr Ala Gly Tyr Pro Tyr Asp Val Pro Asp Tyr Ala Ala Ser
65 70 75 80
Phe Val Pro Val Phe Leu Pro Ala Lys Pro Thr Thr Thr Pro Ala Pro
85 90 95
Arg Pro Pro Thr Pro Ala Pro Thr Ile Ala Ser Gln Pro Leu Ser Leu
100 105 110
Arg Pro Glu Ala Cys Arg Pro Ala Ala Gly Gly Ala Val His Thr Arg
115 120 125
Gly Leu Asp Phe Ala Cys Asp Ile Tyr Ile Trp Ala Pro Leu Ala Gly
130 135 140
Thr Cys Gly Val Leu Leu Leu Ser Leu Val Ile Thr Leu Tyr Cys Asn
145 150 155 160
His Arg Asn
<210> 15
<211> 250
<212> PRT
<213> 人工序列（artificial sequence）
<400> 15
Gly Ala His Ala Glu Gln Lys Leu Ile Ser Glu Glu Asp Leu Gly Glu
1 5 10 15
Gln Lys Leu Ile Ser Glu Glu Asp Leu Gly Gly Ser Tyr Pro Tyr Asp
20 25 30
Val Pro Asp Tyr Ala Gly Tyr Pro Tyr Asp Val Pro Asp Tyr Ala Gly
35 40 45
Thr Gly Thr Ile Glu Thr Thr Gly Asn Ile Ser Ala Glu Lys Gly Gly
50 55 60
Ser Ile Ile Leu Gln Cys His Leu Ser Ser Thr Thr Ala Gln Val Thr
65 70 75 80
Gln Val Asn Trp Glu Gln Gln Asp Gln Leu Leu Ala Ile Cys Asn Ala
85 90 95
Asp Leu Gly Trp His Ile Ser Pro Ser Phe Lys Asp Arg Val Ala Pro
100 105 110
Gly Pro Gly Leu Gly Leu Thr Leu Gln Ser Leu Thr Val Asn Asp Thr
115 120 125
Gly Glu Tyr Phe Cys Ile Tyr His Thr Tyr Pro Asp Gly Thr Tyr Thr
130 135 140
Gly Arg Ile Phe Leu Glu Val Leu Glu Ser Ser Val Ala Glu His Gly
145 150 155 160
Ala Arg Phe Gln Ile Ala Ser Phe Val Pro Val Phe Leu Pro Ala Lys
165 170 175
Pro Thr Thr Thr Pro Ala Pro Arg Pro Pro Thr Pro Ala Pro Thr Ile
180 185 190
Ala Ser Gln Pro Leu Ser Leu Arg Pro Glu Ala Cys Arg Pro Ala Ala
195 200 205
Gly Gly Ala Val His Thr Arg Gly Leu Asp Phe Ala Cys Asp Ile Tyr
210 215 220
Ile Trp Ala Pro Leu Ala Gly Thr Cys Gly Val Leu Leu Leu Ser Leu
225 230 235 240
Val Ile Thr Leu Tyr Cys Asn His Arg Asn
245 250
<210> 16
<211> 174
<212> DNA
<213> 人工序列（artificial sequence）
<400> 16
ggcgcgcatg ccgacattac tagtgagcag aagctcataa gcgaggaaga ccttgggggc 60
ggcggctctg gagggggcgg atcagagcag aaactgatta gcgaggagga tcttggaggc 120
ggtggttctg gagggggagg aagtgagcaa aaattgataa gtgaagagga tttg 174
<210> 17
<211> 165
<212> DNA
<213> 人工序列（artificial sequence）
<400> 17
ggcgcgcatg ccgacattac tagttaccct tatgatgtac cggattacgc tggaggcggc 60
gggtctggag gtgggggtag ttacccctac gacgttcccg actacgctgg tggcggcggg 120
tcaggaggtg gcgggtccta cccatacgat gtcccggact acgcc 165
<210> 18
<211> 165
<212> DNA
<213> 人工序列（artificial sequence）
<400> 18
ggcgcgcatg ccgacattac tagtaactgg agccacccac aattcgagaa gggcgggggg 60
ggaagtggag gcggcggtag taattggtct cacccacaat ttgagaaagg gggcgggggc 120
tctggagggg gagggagtaa ttggagccac ccccaatttg aaaag 165
<210> 19
<211> 234
<212> DNA
<213> 人工序列（artificial sequence）
<400> 19
ggcgcgcatg ccgctcagtt gacattgacg aagggcaata aagaacagaa gcttattagt 60
gaagaggact tgggagagca gaagcttata tccgaggagg accttggcga gcaaaaattg 120
atttcagagg aagatttggg tgggagttac ccctacgacg tccctgatta cgctggctat 180
ccatacgatg taccagacta tgcaggttac ccctatgacg tacctgatta tgcg 234
<210> 20
<211> 141
<212> DNA
<213> 人工序列（artificial sequence）
<400> 20
ggcgcgcatg ccgagcagaa gcttatatcc gaggaggacc ttggcgagca aaaattgatt 60
tcagaggaag atttgggtgg gagttacccc tacgacgtcc ctgattacgc tggctatcca 120
tacgatgtac cagactatgc a 141
<210> 21
<211> 84
<212> DNA
<213> 人（Homo sapiens）
<400> 21
atctacatct gggcgccctt ggccgggact tgtggggtcc ttctcctgtc actggttatc 60
accctttact gcaaccacag gaac 84
<210> 22
<211> 165
<212> DNA
<213> 人（Homo sapiens）
<400> 22
ttcgtgccgg tcttcctgcc agcgaagccc accacgacgc cagcgccgcg accaccaaca 60
ccggcgccca ccatcgcgtc gcagcccctg tccctgcgcc cagaggcgtg ccggccagcg 120
gcggggggcg cagtgcacac gagggggctg gacttcgcct gtgat 165
<210> 23
<211> 66
<212> DNA
<213> 人工序列（artificial sequence）
<400> 23
atgcttctcc tggtgacaag ccttctgctc tgtgagttac cacacccagc attcctcctg 60
atccca 66
<210> 24
<211> 351
<212> DNA
<213> 人（Homo sapiens）
<400> 24
acaggcacaa tagaaacaac ggggaacatt tctgcagaga aaggtggctc tatcatctta 60
caatgtcacc tctcctccac cacggcacaa gtgacccagg tcaactggga gcagcaggac 120
cagcttctgg ccatttgtaa tgctgacttg gggtggcaca tctccccatc cttcaaggat 180
cgagtggccc caggtcccgg cctgggcctc accctccagt cgctgaccgt gaacgataca 240
ggggagtact tctgcatcta tcacacctac cctgatggga cgtacactgg gagaatcttc 300
ctggaggtcc tagaaagctc agtggctgag cacggtgcca ggttccagat t 351
<210> 25
<211> 606
<212> DNA
<213> 人工序列（artificial sequence）
<400> 25
acaggcacaa tagaaacaac ggggaacatt tctgcagaga aaggtggctc tatcatctta 60
caatgtcacc tctcctccac cacggcacaa gtgacccagg tcaactggga gcagcaggac 120
cagcttctgg ccatttgtaa tgctgacttg gggtggcaca tctccccatc cttcaaggat 180
cgagtggccc caggtcccgg cctgggcctc accctccagt cgctgaccgt gaacgataca 240
ggggagtact tctgcatcta tcacacctac cctgatggga cgtacactgg gagaatcttc 300
ctggaggtcc tagaaagctc agtggctgag cacggtgcca ggttccagat tgctagcttc 360
gtgccggtct tcctgccagc gaagcccacc acgacgccag cgccgcgacc accaacaccg 420
gcgcccacca tcgcgtcgca gcccctgtcc ctgcgcccag aggcgtgccg gccagcggcg 480
gggggcgcag tgcacacgag ggggctggac ttcgcctgtg atatctacat ctgggcgccc 540
ttggccggga cttgtggggt ccttctcctg tcactggtta tcacccttta ctgcaaccac 600
aggaac 606
<210> 26
<211> 528
<212> DNA
<213> 人工序列（artificial sequence）
<400> 26
atgcttctcc tggtgacaag ccttctgctc tgtgagttac cacacccagc attcctcctg 60
atcccaggcg cgcatgccga cattactagt gagcagaagc tcataagcga ggaagacctt 120
gggggcggcg gctctggagg gggcggatca gagcagaaac tgattagcga ggaggatctt 180
ggaggcggtg gttctggagg gggaggaagt gagcaaaaat tgataagtga agaggatttg 240
ggaggtggag gttcaggggg aggcggtagt gctagcttcg tgccggtctt cctgccagcg 300
aagcccacca cgacgccagc gccgcgacca ccaacaccgg cgcccaccat cgcgtcgcag 360
cccctgtccc tgcgcccaga ggcgtgccgg ccagcggcgg ggggcgcagt gcacacgagg 420
gggctggact tcgcctgtga tatctacatc tgggcgccct tggccgggac ttgtggggtc 480
cttctcctgt cactggttat caccctttac tgcaaccaca ggaactga 528
<210> 27
<211> 519
<212> DNA
<213> 人工序列（artificial sequence）
<400> 27
atgcttctcc tggtgacaag ccttctgctc tgtgagttac cacacccagc attcctcctg 60
atcccaggcg cgcatgccga cattactagt tacccttatg atgtaccgga ttacgctgga 120
ggcggcgggt ctggaggtgg gggtagttac ccctacgacg ttcccgacta cgctggtggc 180
ggcgggtcag gaggtggcgg gtcctaccca tacgatgtcc cggactacgc cgggggcggt 240
ggaagtggag gaggtggctc cgctagcttc gtgccggtct tcctgccagc gaagcccacc 300
acgacgccag cgccgcgacc accaacaccg gcgcccacca tcgcgtcgca gcccctgtcc 360
ctgcgcccag aggcgtgccg gccagcggcg gggggcgcag tgcacacgag ggggctggac 420
ttcgcctgtg atatctacat ctgggcgccc ttggccggga cttgtggggt ccttctcctg 480
tcactggtta tcacccttta ctgcaaccac aggaactga 519
<210> 28
<211> 519
<212> DNA
<213> 人工序列（artificial sequence）
<400> 28
atgcttctcc tggtgacaag ccttctgctc tgtgagttac cacacccagc attcctcctg 60
atcccaggcg cgcatgccga cattactagt aactggagcc acccacaatt cgagaagggc 120
ggggggggaa gtggaggcgg cggtagtaat tggtctcacc cacaatttga gaaagggggc 180
gggggctctg gagggggagg gagtaattgg agccaccccc aatttgaaaa gggcgggggg 240
ggatctgggg ggggtgggtc tgctagcttc gtgccggtct tcctgccagc gaagcccacc 300
acgacgccag cgccgcgacc accaacaccg gcgcccacca tcgcgtcgca gcccctgtcc 360
ctgcgcccag aggcgtgccg gccagcggcg gggggcgcag tgcacacgag ggggctggac 420
ttcgcctgtg atatctacat ctgggcgccc ttggccggga cttgtggggt ccttctcctg 480
tcactggtta tcacccttta ctgcaaccac aggaactga 519
<210> 29
<211> 558
<212> DNA
<213> 人工序列（artificial sequence）
<400> 29
atgcttctcc tggtgacaag ccttctgctc tgtgagttac cacacccagc attcctcctg 60
atcccaggcg cgcatgccgc tcagttgaca ttgacgaagg gcaataaaga acagaagctt 120
attagtgaag aggacttggg agagcagaag cttatatccg aggaggacct tggcgagcaa 180
aaattgattt cagaggaaga tttgggtggg agttacccct acgacgtccc tgattacgct 240
ggctatccat acgatgtacc agactatgca ggttacccct atgacgtacc tgattatgcg 300
gctagcttcg tgccggtctt cctgccagcg aagcccacca cgacgccagc gccgcgacca 360
ccaacaccgg cgcccaccat cgcgtcgcag cccctgtccc tgcgcccaga ggcgtgccgg 420
ccagcggcgg ggggcgcagt gcacacgagg gggctggact tcgcctgtga tatctacatc 480
tgggcgccct tggccgggac ttgtggggtc cttctcctgt cactggttat caccctttac 540
tgcaaccaca ggaactga 558
<210> 30
<211> 819
<212> DNA
<213> 人工序列（artificial sequence）
<400> 30
atgcttctcc tggtgacaag ccttctgctc tgtgagttac cacacccagc attcctcctg 60
atcccaggcg cgcatgccga gcagaagctt atatccgagg aggaccttgg cgagcaaaaa 120
ttgatttcag aggaagattt gggtgggagt tacccctacg acgtccctga ttacgctggc 180
tatccatacg atgtaccaga ctatgcaggt acaggcacaa tagaaacaac ggggaacatt 240
tctgcagaga aaggtggctc tatcatctta caatgtcacc tctcctccac cacggcacaa 300
gtgacccagg tcaactggga gcagcaggac cagcttctgg ccatttgtaa tgctgacttg 360
gggtggcaca tctccccatc cttcaaggat cgagtggccc caggtcccgg cctgggcctc 420
accctccagt cgctgaccgt gaacgataca ggggagtact tctgcatcta tcacacctac 480
cctgatggga cgtacactgg gagaatcttc ctggaggtcc tagaaagctc agtggctgag 540
cacggtgcca ggttccagat tgctagcttc gtgccggtct tcctgccagc gaagcccacc 600
acgacgccag cgccgcgacc accaacaccg gcgcccacca tcgcgtcgca gcccctgtcc 660
ctgcgcccag aggcgtgccg gccagcggcg gggggcgcag tgcacacgag ggggctggac 720
ttcgcctgtg atatctacat ctgggcgccc ttggccggga cttgtggggt ccttctcctg 780
tcactggtta tcacccttta ctgcaaccac aggaactga 819
<210> 31
<211> 23
<212> DNA
<213> 人工序列（artificial sequence）
<400> 31
taacgataat agatacggaa cgg 23
<210> 32
<211> 23
<212> DNA
<213> 人工序列（artificial sequence）
<400> 32
gtgtatgaaa tgctttaagg agg 23
<210> 33
<211> 480
<212> DNA
<213> 人工序列（artificial sequence）
<400> 33
ctttctgtta ttattattga tccaatcaaa aaataaatta gaagccgtgg gtcattgtta 60
tgaatctctt tcagaggaat acagacaatt gacaaaattc acagactttc aagattttaa 120
aaaactgttt aacaaggtcc ctattgttac agatggaagg gtcaaactta ataaaggata 180
tttgttcgac tttgtgatta gtttgatgcg attcaaaaaa gaatcctctc tagctaccac 240
cgcaatagat cctgttagat acatagatcc tcgtcgcaat atcgcatttt ctaacgtgat 300
ggatatatta aagtcgaata aagtgaacaa taattaattc tttattgtca tcatgaacgg 360
cggacatatt cagttgataa tcggccccat gttttcaggt aaaagtacag aattaattag 420
acgagttaga cgttatcaaa tagctcaata taaatgcgtg actataaaat attctaacga 480
<210> 34
<211> 520
<212> DNA
<213> 人工序列（artificial sequence）
<400> 34
tccttttcta aacgattggg tgaggaaacc gagatagaaa taataggagg taatgatatg 60
tatcaatcgg tgtgtagaaa gtgttacatc gactcataat attatatttt ttatctaaaa 120
aactaaaaat aaacattgat taaattttaa tataatactt aaaaatggat gttgtgtcgt 180
tagataaacc gtttatgtat tttgaggaaa ttgataatga gttagattac gaaccagaaa 240
gtgcaaatga ggtcgcaaaa aaactgccgt atcaaggaca gttaaaacta ttactaggag 300
aattattttt tcttagtaag ttacagcgac acggtatatt agatggtgcc accgtagtgt 360
atataggatc tgctcccggt acacatatac gttatttgag agatcatttc tataatttag 420
gagtgatcat caaatggatg ctaattgacg gccgccatca tgatcctatt ttaaatggat 480
tgcgtgatgt gactctagtg actcggttcg ttgatgagga 520
<210> 35
<211> 1323
<212> DNA
<213> 人工序列（artificial sequence）
<400> 35
atgaccgaat acaaacctac agtaagactg gctacgcgag acgacgtacc cagagcggtt 60
cggacgttgg cagccgcctt tgcagattac cctgcgacac ggcatactgt cgatcctgat 120
cgacatatag aacgagtgac cgagttgcaa gagttgtttt tgacccgcgt cggtcttgat 180
attgggaagg tatgggtcgc agacgacggc gccgcggtgg cggtctggac cacgccggag 240
agcgtcgaag cgggggcggt gttcgccgag atcggcccgc gcatggccga gttgagcggt 300
tcccggctgg ccgcgcagca acagatggaa ggcctcctgg cgccgcaccg gcccaaggag 360
cccgcgtggt tcctggccac cgtcggcgtc tcgcccgacc accagggcaa gggtctgggc 420
agcgccgtcg tgctccccgg agtggaggcg gccgagcgcg ccggggtgcc cgccttcctg 480
gagacctccg cgccccgcaa cctccccttc tacgagcggc tcggcttcac cgtcaccgcc 540
gacgtcgagg tgcccgaagg accgcgcacc tggtgcatga cccgcaagcc cggtgccact 600
agcatggtga gcaagggcga ggagctgttc accggggtgg tgcccatcct ggtcgagctg 660
gacggcgacg taaacggcca caagttcagc gtgtccggcg agggcgaggg cgatgccacc 720
tacggcaagc tgaccctgaa gttcatctgc accaccggca agctgcccgt gccctggccc 780
accctcgtga ccaccctgac ctacggcgtg cagtgcttca gccgctaccc cgaccacatg 840
aagcagcacg acttcttcaa gtccgccatg cccgaaggct acgtccagga gcgcaccatc 900
ttcttcaagg acgacggcaa ctacaagacc cgcgccgagg tgaagttcga gggcgacacc 960
ctggtgaacc gcatcgagct gaagggcatc gacttcaagg aggacggcaa catcctgggg 1020
cacaagctgg agtacaacta caacagccac aacgtctata tcatggccga caagcagaag 1080
aacggcatca aggtgaactt caagatccgc cacaacatcg aggacggcag cgtgcagctc 1140
gccgaccact accagcagaa cacccccatc ggcgacggcc ccgtgctgct gcccgacaac 1200
cactacctga gcacccagtc cgccctgagc aaagacccca acgagaagcg cgatcacatg 1260
gtcctgctgg agttcgtgac cgccgccggg atcactctcg gcatggacga gctgtacaag 1320
taa 1323
<210> 36
<211> 129
<212> DNA
<213> 人工序列（artificial sequence）
<400> 36
cactaattcc aaacccaccc gctttttata gtaagttttt cacccataaa taataaatac 60
aataattaat ttctcgtaaa agtagaaaat atattctaat ttattgcacg gtaaggaagt 120
agatcataa 129
<210> 37
<211> 40
<212> DNA
<213> 人工序列（artificial sequence）
<400> 37
aaaaattgaa attttatttt ttttttttgg aatataaata 40
<210> 38
<211> 5632
<212> DNA
<213> 人工序列（artificial sequence）
<400> 38
gacgcgccct gtagcggcgc attaagcgcg gcgggtgtgg tggttacgcg cagcgtgacc 60
gctacacttg ccagcgccct agcgcccgct cctttcgctt tcttcccttc ctttctcgcc 120
acgttcgccg gctttccccg tcaagctcta aatcgggggc tccctttagg gttccgattt 180
agtgctttac ggcacctcga ccccaaaaaa cttgattagg gtgatggttc acgtagtggg 240
ccatcgccct gatagacggt ttttcgccct ttgacgttgg agtccacgtt ctttaatagt 300
ggactcttgt tccaaactgg aacaacactc aaccctatct cggtctattc ttttgattta 360
taagggattt tgccgatttc ggcctattgg ttaaaaaatg agctgattta acaaaaattt 420
aacgcgaatt ttaacaaaat attaacgttt acaatttcag gtggcacttt tcggggaaat 480
gtgcgcggaa cccctatttg tttatttttc taaatacatt caaatatgta tccgctcatg 540
agacaataac cctgataaat gcttcaataa tattgaaaaa ggaagagtat gagtattcaa 600
catttccgtg tcgcccttat tccctttttt gcggcatttt gccttcctgt ttttgctcac 660
ccagaaacgc tggtgaaagt aaaagatgct gaagatcagt tgggtgcacg agtgggttac 720
atcgaactgg atctcaacag cggtaagatc cttgagagtt ttcgccccga agaacgtttt 780
ccaatgatga gcacttttaa agttctgcta tgtggcgcgg tattatcccg tattgacgcc 840
gggcaagagc aactcggtcg ccgcatacac tattctcaga atgacttggt tgagtactca 900
ccagtcacag aaaagcatct tacggatggc atgacagtaa gagaattatg cagtgctgcc 960
ataaccatga gtgataacac tgcggccaac ttacttctga caacgatcgg aggaccgaag 1020
gagctaaccg cttttttgca caacatgggg gatcatgtaa ctcgccttga tcgttgggaa 1080
ccggagctga atgaagccat accaaacgac gagcgtgaca ccacgatgcc tgtagcaatg 1140
gcaacaacgt tgcgcaaact attaactggc gaactactta ctctagcttc ccggcaacaa 1200
ttaatagact ggatggaggc ggataaagtt gcaggaccac ttctgcgctc ggcccttccg 1260
gctggctggt ttattgctga taaatctgga gccggtgagc gtgggtctcg cggtatcatt 1320
gcagcactgg ggccagatgg taagccctcc cgtatcgtag ttatctacac gacggggagt 1380
caggcaacta tggatgaacg aaatagacag atcgctgaga taggtgcctc actgattaag 1440
cattggtaac tgtcagacca agtttactca tatatacttt agattgattt aaaacttcat 1500
ttttaattta aaaggatcta ggtgaagatc ctttttgata atctcatgac caaaatccct 1560
taacgtgagt tttcgttcca ctgagcgtca gaccccgtag aaaagatcaa aggatcttct 1620
tgagatcctt tttttctgcg cgtaatctgc tgcttgcaaa caaaaaaacc accgctacca 1680
gcggtggttt gtttgccgga tcaagagcta ccaactcttt ttccgaaggt aactggcttc 1740
agcagagcgc agataccaaa tactgtcctt ctagtgtagc cgtagttagg ccaccacttc 1800
aagaactctg tagcaccgcc tacatacctc gctctgctaa tcctgttacc agtggctgct 1860
gccagtggcg ataagtcgtg tcttaccggg ttggactcaa gacgatagtt accggataag 1920
gcgcagcggt cgggctgaac ggggggttcg tgcacacagc ccagcttgga gcgaacgacc 1980
tacaccgaac tgagatacct acagcgtgag cattgagaaa gcgccacgct tcccgaaggg 2040
agaaaggcgg acaggtatcc ggtaagcggc agggtcggaa caggagagcg cacgagggag 2100
cttccagggg gaaacgcctg gtatctttat agtcctgtcg ggtttcgcca cctctgactt 2160
gagcgtcgat ttttgtgatg ctcgtcaggg gggcggagcc tatggaaaaa cgccagcaac 2220
gcggcctttt tacggttcct ggccttttgc tggccttttg ctcacatgtt ctttcctgcg 2280
ttatcccctg attctgtgga taaccgtatt accgcctttg agtgagctga taccgctcgc 2340
cgcagccgaa cgaccgagcg cagcgagtca gtgagcgagg aaggaattct aacgataata 2400
gatacggaac ggctttctgt tattattatt gatccaatca aaaaataaat tagaagccgt 2460
gggtcattgt tatgaatctc tttcagagga atacagacaa ttgacaaaat tcacagactt 2520
tcaagatttt aaaaaactgt ttaacaaggt ccctattgtt acagatggaa gggtcaaact 2580
taataaagga tatttgttcg actttgtgat tagtttgatg cgattcaaaa aagaatcctc 2640
tctagctacc accgcaatag atcctgttag atacatagat cctcgtcgca atatcgcatt 2700
ttctaacgtg atggatatat taaagtcgaa taaagtgaac aataattaat tctttattgt 2760
catcatgaac ggcggacata ttcagttgat aatcggcccc atgttttcag gtaaaagtac 2820
agaattaatt agacgagtta gacgttatca aatagctcaa tataaatgcg tgactataaa 2880
atattctaac gatttttatc catcaggtga tctgttttta ttgtggagtt gtcgacttag 2940
ttcctgtggt tgcagtaaag ggtgataacc agtgacagga gaaggacccc acaagtcccg 3000
gccaagggcg cccagatgta gatatcacag gcgaagtcca gccccctcgt gtgcactgcg 3060
ccccccgccg ctggccggca cgcctctggg cgcagggaca ggggctgcga cgcgatggtg 3120
ggcgccggtg ttggtggtcg cggcgctggc gtcgtggtgg gcttcgctgg caggaagacc 3180
ggcacgaagc tagcagaccc acccccccca gatccccccc cgcccttttc aaattggggg 3240
tggctccaat tactccctcc ccctccagag cccccgcccc ctttctcaaa ttgtgggtga 3300
gaccaattac taccgccgcc tccacttccc cccccgccct tctcgaattg tgggtggctc 3360
cagttactag taatgtcggc atgcgcgcct gggatcagga ggaatgctgg gtgtggtaac 3420
tcacagagca gaaggcttgt caccaggaga agcataccgg tttcgagctt atttatattc 3480
caaaaaaaaa aaataaaatt tcaatttttg gatccataac ttcgtatagc atacattata 3540
cgaagttatc actaattcca aacccacccg ctttttatag taagtttttc acccataaat 3600
aataaataca ataattaatt tctcgtaaaa gtagaaaata tattctaatt tattgcacgg 3660
taaggaagta gatcataaaa gcttatgacc gaatacaaac ctacagtaag actggctacg 3720
cgagacgacg tacccagagc ggttcggacg ttggcagccg cctttgcaga ttaccctgcg 3780
acacggcata ctgtcgatcc tgatcgacat atagaacgag tgaccgagtt gcaagagttg 3840
tttttgaccc gcgtcggtct tgatattggg aaggtatggg tcgcagacga cggcgccgcg 3900
gtggcggtct ggaccacgcc ggagagcgtc gaagcggggg cggtgttcgc cgagatcggc 3960
ccgcgcatgg ccgagttgag cggttcccgg ctggccgcgc agcaacagat ggaaggcctc 4020
ctggcgccgc accggcccaa ggagcccgcg tggttcctgg ccaccgtcgg cgtctcgccc 4080
gaccaccagg gcaagggtct gggcagcgcc gtcgtgctcc ccggagtgga ggcggccgag 4140
cgcgccgggg tgcccgcctt cctggagacc tccgcgcccc gcaacctccc cttctacgag 4200
cggctcggct tcaccgtcac cgccgacgtc gaggtgcccg aaggaccgcg cacctggtgc 4260
atgacccgca agcccggtgc cactagcatg gtgagcaagg gcgaggagct gttcaccggg 4320
gtggtgccca tcctggtcga gctggacggc gacgtaaacg gccacaagtt cagcgtgtcc 4380
ggcgagggcg agggcgatgc cacctacggc aagctgaccc tgaagttcat ctgcaccacc 4440
ggcaagctgc ccgtgccctg gcccaccctc gtgaccaccc tgacctacgg cgtgcagtgc 4500
ttcagccgct accccgacca catgaagcag cacgacttct tcaagtccgc catgcccgaa 4560
ggctacgtcc aggagcgcac catcttcttc aaggacgacg gcaactacaa gacccgcgcc 4620
gaggtgaagt tcgagggcga caccctggtg aaccgcatcg agctgaaggg catcgacttc 4680
aaggaggacg gcaacatcct ggggcacaag ctggagtaca actacaacag ccacaacgtc 4740
tatatcatgg ccgacaagca gaagaacggc atcaaggtga acttcaagat ccgccacaac 4800
atcgaggacg gcagcgtgca gctcgccgac cactaccagc agaacacccc catcggcgac 4860
ggccccgtgc tgctgcccga caaccactac ctgagcaccc agtccgccct gagcaaagac 4920
cccaacgaga agcgcgatca catggtcctg ctggagttcg tgaccgccgc cgggatcact 4980
ctcggcatgg acgagctgta caagtaaata acttcgtata gcatacatta tacgaagtta 5040
tggtaccctt ccttttctaa acgattgggt gaggaaaccg agatagaaat aataggaggt 5100
aatgatatgt atcaatcggt gtgtagaaag tgttacatcg actcataata ttatattttt 5160
tatctaaaaa actaaaaata aacattgatt aaattttaat ataatactta aaaatggatg 5220
ttgtgtcgtt agataaaccg tttatgtatt ttgaggaaat tgataatgag ttagattacg 5280
aaccagaaag tgcaaatgag gtcgcaaaaa aactgccgta tcaaggacag ttaaaactat 5340
tactaggaga attatttttt cttagtaagt tacagcgaca cggtatatta gatggtgcca 5400
ccgtagtgta tataggatct gctcccggta cacatatacg ttatttgaga gatcatttct 5460
ataatttagg agtgatcatc aaatggatgc taattgacgg ccgccatcat gatcctattt 5520
taaatggatt gcgtgatgtg actctagtga ctcggttcgt tgatgaggag tgtatgaaat 5580
gctttaagga ggatcgatat caacgcttat ttgcagcctg aatggcgaat gg 5632
<210> 39
<211> 18
<212> PRT
<213> 人工序列（artificial sequence）
<400> 39
Gly Ser Thr Ser Gly Ser Gly Lys Pro Gly Ser Gly Glu Gly Ser Thr
1 5 10 15
Lys Gly
<210> 40
<211> 15
<212> PRT
<213> 人工序列（artificial sequence）
<400> 40
Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser
1 5 10 15
<210> 41
<211> 18
<212> PRT
<213> 人工序列（artificial sequence）
<400> 41
Gly Ser Thr Ser Gly Ser Gly Lys Pro Gly Ser Gly Glu Gly Ser Thr
1 5 10 15
Lys Gly
<210> 42
<211> 260
<212> PRT
<213> 人工序列（artificial sequence）
<400> 42
Gly Ala His Ala Asp Ile Val Leu Thr Gln Ser Pro Ala Phe Leu Ala
1 5 10 15
Val Ser Leu Gly Gln Arg Ala Thr Ile Ser Cys Arg Ala Ser Glu Ser
20 25 30
Val Asp Asn Tyr Gly Phe Ser Phe Met Asn Trp Phe Gln Gln Lys Pro
35 40 45
Gly Gln Pro Pro Lys Leu Leu Ile Tyr Ala Ile Ser Asn Arg Gly Ser
50 55 60
Gly Val Pro Ala Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Ser
65 70 75 80
Leu Asn Ile His Pro Val Glu Glu Asp Asp Pro Ala Met Tyr Phe Cys
85 90 95
Gln Gln Thr Lys Glu Val Pro Trp Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu
100 105 110
Glu Ile Lys Gly Ser Thr Ser Gly Ser Gly Lys Pro Gly Ser Gly Glu
115 120 125
Gly Ser Thr Lys Gly Gln Val Gln Leu Gln Glu Ser Gly Gly Asp Leu
130 135 140
Val Lys Pro Gly Gly Ser Leu Lys Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe
145 150 155 160
Thr Phe Ser His Tyr Gly Met Ser Trp Val Arg Gln Thr Pro Asp Lys
165 170 175
Arg Leu Glu Trp Val Ala Thr Ile Gly Ser Arg Gly Thr Tyr Thr His
180 185 190
Tyr Pro Asp Ser Val Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Asp
195 200 205
Lys Asn Ala Leu Tyr Leu Gln Met Asn Ser Leu Lys Ser Glu Asp Thr
210 215 220
Ala Met Tyr Tyr Cys Ala Arg Arg Ser Glu Phe Tyr Tyr Tyr Gly Asn
225 230 235 240
Thr Tyr Tyr Tyr Ser Ala Met Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Ala Ser Val
245 250 255
Thr Val Ser Ser
260
<210> 43
<211> 252
<212> PRT
<213> 人工序列（artificial sequence）
<400> 43
Gly Ala His Ala Glu Val Lys Leu Val Glu Ser Gly Gly Asp Leu Val
1 5 10 15
Lys Pro Gly Gly Ser Leu Lys Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr
20 25 30
Phe Ser Ser Tyr Gly Met Ser Trp Val Arg Gln Thr Pro Asp Lys Arg
35 40 45
Leu Glu Trp Val Ala Thr Ile Ser Arg Gly Gly Ser Tyr Thr Tyr Tyr
50 55 60
Pro Asp Ser Val Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ala Lys
65 70 75 80
Asn Thr Leu Tyr Leu Gln Met Ser Ser Leu Lys Ser Glu Asp Thr Ala
85 90 95
Met Tyr Tyr Cys Ala Arg Arg Glu Thr Tyr Asp Glu Lys Gly Phe Ala
100 105 110
Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Thr Val Thr Val Ser Ser Gly Gly Gly Gly
115 120 125
Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Asp Ile Glu Leu Thr
130 135 140
Gln Ser Pro Ser Ser Leu Thr Val Thr Ala Gly Glu Lys Val Thr Met
145 150 155 160
Ser Cys Lys Ser Ser Gln Ser Leu Leu Asn Ser Gly Asn Gln Lys Asn
165 170 175
Tyr Leu Thr Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln Pro Pro Lys Leu Leu
180 185 190
Ile Tyr Trp Ala Ser Thr Arg Glu Ser Gly Val Pro Asp Arg Phe Thr
195 200 205
Gly Ser Gly Ser Gly Arg Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Val Gln
210 215 220
Ala Glu Asp Leu Ala Val Tyr Tyr Cys Gln Asn Asp Asn Ser His Pro
225 230 235 240
Leu Thr Phe Gly Ala Gly Thr Lys Leu Glu Leu Lys
245 250
<210> 44
<211> 253
<212> PRT
<213> 人工序列（artificial sequence）
<400> 44
Gly Ala His Ala Glu Leu Val Met Thr Gln Ser Pro Ala Ser Leu Ala
1 5 10 15
Val Ser Leu Gly Gln Arg Ala Thr Ile Ser Cys Arg Ala Ser Glu Ser
20 25 30
Val Asp Ser Tyr Gly Lys Ser Phe Met His Trp Tyr Gln Leu Lys Pro
35 40 45
Gly Gln Pro Pro Lys Leu Leu Ile Tyr Arg Ala Ser Asn Leu Glu Ser
50 55 60
Gly Val Pro Ala Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Arg Thr Asp Phe Thr
65 70 75 80
Leu Thr Ile Asp Pro Val Glu Ala Asp Asp Ala Ala Thr Tyr Tyr Cys
85 90 95
Gln Gln Asn Asn Glu Asp Pro Trp Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu
100 105 110
Glu Ile Lys Gly Ser Thr Ser Gly Ser Gly Lys Pro Gly Ser Gly Glu
115 120 125
Gly Ser Thr Lys Gly Glu Val Gln Leu Glu Gln Ser Gly Pro Glu Leu
130 135 140
Val Lys Pro Gly Ala Ser Val Lys Met Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr
145 150 155 160
Thr Phe Thr Asn Tyr Tyr Met Lys Trp Val Lys Gln Ser His Gly Lys
165 170 175
Ser Leu Glu Trp Ile Gly Asp Leu Asn Pro Asn Asn Gly Asp Thr Phe
180 185 190
Tyr Asn Gln Lys Phe Lys Gly Lys Ala Thr Leu Thr Val Asp Lys Ser
195 200 205
Ser Asn Thr Ala Tyr Met Gln Leu Asn Ser Leu Thr Ser Glu Asp Ser
210 215 220
Ala Val Tyr Tyr Cys Ala Arg Thr Gly Arg Tyr Glu Glu Asn Ala Met
225 230 235 240
Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Ser Val Thr Val Ser Ser
245 250
<210> 45
<211> 159
<212> PRT
<213> 人工序列（artificial sequence）
<400> 45
Arg Phe Ser Val Val Lys Arg Gly Arg Lys Lys Leu Leu Tyr Ile Phe
1 5 10 15
Lys Gln Pro Phe Met Arg Pro Val Gln Thr Thr Gln Glu Glu Asp Gly
20 25 30
Cys Ser Cys Arg Phe Pro Glu Glu Glu Glu Gly Gly Cys Glu Leu Arg
35 40 45
Val Lys Phe Ser Arg Ser Ala Asp Ala Pro Ala Tyr Gln Gln Gly Gln
50 55 60
Asn Gln Leu Tyr Asn Glu Leu Asn Leu Gly Arg Arg Glu Glu Tyr Asp
65 70 75 80
Val Leu Asp Lys Arg Arg Gly Arg Asp Pro Glu Met Gly Gly Lys Pro
85 90 95
Arg Arg Lys Asn Pro Gln Glu Gly Leu Tyr Asn Glu Leu Gln Lys Asp
100 105 110
Lys Met Ala Glu Ala Tyr Ser Glu Ile Gly Met Lys Gly Glu Arg Arg
115 120 125
Arg Gly Lys Gly His Asp Gly Leu Tyr Gln Gly Leu Ser Thr Ala Thr
130 135 140
Lys Asp Thr Tyr Asp Ala Leu His Met Gln Ala Leu Pro Pro Arg
145 150 155
<210> 46
<211> 504
<212> PRT
<213> 人工序列（artificial sequence）
<400> 46
Gly Ala His Ala Asp Ile Val Leu Thr Gln Ser Pro Ala Phe Leu Ala
1 5 10 15
Val Ser Leu Gly Gln Arg Ala Thr Ile Ser Cys Arg Ala Ser Glu Ser
20 25 30
Val Asp Asn Tyr Gly Phe Ser Phe Met Asn Trp Phe Gln Gln Lys Pro
35 40 45
Gly Gln Pro Pro Lys Leu Leu Ile Tyr Ala Ile Ser Asn Arg Gly Ser
50 55 60
Gly Val Pro Ala Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Ser
65 70 75 80
Leu Asn Ile His Pro Val Glu Glu Asp Asp Pro Ala Met Tyr Phe Cys
85 90 95
Gln Gln Thr Lys Glu Val Pro Trp Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu
100 105 110
Glu Ile Lys Gly Ser Thr Ser Gly Ser Gly Lys Pro Gly Ser Gly Glu
115 120 125
Gly Ser Thr Lys Gly Gln Val Gln Leu Gln Glu Ser Gly Gly Asp Leu
130 135 140
Val Lys Pro Gly Gly Ser Leu Lys Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe
145 150 155 160
Thr Phe Ser His Tyr Gly Met Ser Trp Val Arg Gln Thr Pro Asp Lys
165 170 175
Arg Leu Glu Trp Val Ala Thr Ile Gly Ser Arg Gly Thr Tyr Thr His
180 185 190
Tyr Pro Asp Ser Val Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Asp
195 200 205
Lys Asn Ala Leu Tyr Leu Gln Met Asn Ser Leu Lys Ser Glu Asp Thr
210 215 220
Ala Met Tyr Tyr Cys Ala Arg Arg Ser Glu Phe Tyr Tyr Tyr Gly Asn
225 230 235 240
Thr Tyr Tyr Tyr Ser Ala Met Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Ala Ser Val
245 250 255
Thr Val Ser Ser Ala Ser Phe Val Pro Val Phe Leu Pro Ala Lys Pro
260 265 270
Thr Thr Thr Pro Ala Pro Arg Pro Pro Thr Pro Ala Pro Thr Ile Ala
275 280 285
Ser Gln Pro Leu Ser Leu Arg Pro Glu Ala Cys Arg Pro Ala Ala Gly
290 295 300
Gly Ala Val His Thr Arg Gly Leu Asp Phe Ala Cys Asp Ile Tyr Ile
305 310 315 320
Trp Ala Pro Leu Ala Gly Thr Cys Gly Val Leu Leu Leu Ser Leu Val
325 330 335
Ile Thr Leu Tyr Cys Asn His Arg Asn Arg Phe Ser Val Val Lys Arg
340 345 350
Gly Arg Lys Lys Leu Leu Tyr Ile Phe Lys Gln Pro Phe Met Arg Pro
355 360 365
Val Gln Thr Thr Gln Glu Glu Asp Gly Cys Ser Cys Arg Phe Pro Glu
370 375 380
Glu Glu Glu Gly Gly Cys Glu Leu Arg Val Lys Phe Ser Arg Ser Ala
385 390 395 400
Asp Ala Pro Ala Tyr Gln Gln Gly Gln Asn Gln Leu Tyr Asn Glu Leu
405 410 415
Asn Leu Gly Arg Arg Glu Glu Tyr Asp Val Leu Asp Lys Arg Arg Gly
420 425 430
Arg Asp Pro Glu Met Gly Gly Lys Pro Arg Arg Lys Asn Pro Gln Glu
435 440 445
Gly Leu Tyr Asn Glu Leu Gln Lys Asp Lys Met Ala Glu Ala Tyr Ser
450 455 460
Glu Ile Gly Met Lys Gly Glu Arg Arg Arg Gly Lys Gly His Asp Gly
465 470 475 480
Leu Tyr Gln Gly Leu Ser Thr Ala Thr Lys Asp Thr Tyr Asp Ala Leu
485 490 495
His Met Gln Ala Leu Pro Pro Arg
500
<210> 47
<211> 496
<212> PRT
<213> 人工序列（artificial sequence）
<400> 47
Gly Ala His Ala Glu Val Lys Leu Val Glu Ser Gly Gly Asp Leu Val
1 5 10 15
Lys Pro Gly Gly Ser Leu Lys Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr
20 25 30
Phe Ser Ser Tyr Gly Met Ser Trp Val Arg Gln Thr Pro Asp Lys Arg
35 40 45
Leu Glu Trp Val Ala Thr Ile Ser Arg Gly Gly Ser Tyr Thr Tyr Tyr
50 55 60
Pro Asp Ser Val Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ala Lys
65 70 75 80
Asn Thr Leu Tyr Leu Gln Met Ser Ser Leu Lys Ser Glu Asp Thr Ala
85 90 95
Met Tyr Tyr Cys Ala Arg Arg Glu Thr Tyr Asp Glu Lys Gly Phe Ala
100 105 110
Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Thr Val Thr Val Ser Ser Gly Gly Gly Gly
115 120 125
Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Asp Ile Glu Leu Thr
130 135 140
Gln Ser Pro Ser Ser Leu Thr Val Thr Ala Gly Glu Lys Val Thr Met
145 150 155 160
Ser Cys Lys Ser Ser Gln Ser Leu Leu Asn Ser Gly Asn Gln Lys Asn
165 170 175
Tyr Leu Thr Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln Pro Pro Lys Leu Leu
180 185 190
Ile Tyr Trp Ala Ser Thr Arg Glu Ser Gly Val Pro Asp Arg Phe Thr
195 200 205
Gly Ser Gly Ser Gly Arg Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Val Gln
210 215 220
Ala Glu Asp Leu Ala Val Tyr Tyr Cys Gln Asn Asp Asn Ser His Pro
225 230 235 240
Leu Thr Phe Gly Ala Gly Thr Lys Leu Glu Leu Lys Ala Ser Phe Val
245 250 255
Pro Val Phe Leu Pro Ala Lys Pro Thr Thr Thr Pro Ala Pro Arg Pro
260 265 270
Pro Thr Pro Ala Pro Thr Ile Ala Ser Gln Pro Leu Ser Leu Arg Pro
275 280 285
Glu Ala Cys Arg Pro Ala Ala Gly Gly Ala Val His Thr Arg Gly Leu
290 295 300
Asp Phe Ala Cys Asp Ile Tyr Ile Trp Ala Pro Leu Ala Gly Thr Cys
305 310 315 320
Gly Val Leu Leu Leu Ser Leu Val Ile Thr Leu Tyr Cys Asn His Arg
325 330 335
Asn Arg Phe Ser Val Val Lys Arg Gly Arg Lys Lys Leu Leu Tyr Ile
340 345 350
Phe Lys Gln Pro Phe Met Arg Pro Val Gln Thr Thr Gln Glu Glu Asp
355 360 365
Gly Cys Ser Cys Arg Phe Pro Glu Glu Glu Glu Gly Gly Cys Glu Leu
370 375 380
Arg Val Lys Phe Ser Arg Ser Ala Asp Ala Pro Ala Tyr Gln Gln Gly
385 390 395 400
Gln Asn Gln Leu Tyr Asn Glu Leu Asn Leu Gly Arg Arg Glu Glu Tyr
405 410 415
Asp Val Leu Asp Lys Arg Arg Gly Arg Asp Pro Glu Met Gly Gly Lys
420 425 430
Pro Arg Arg Lys Asn Pro Gln Glu Gly Leu Tyr Asn Glu Leu Gln Lys
435 440 445
Asp Lys Met Ala Glu Ala Tyr Ser Glu Ile Gly Met Lys Gly Glu Arg
450 455 460
Arg Arg Gly Lys Gly His Asp Gly Leu Tyr Gln Gly Leu Ser Thr Ala
465 470 475 480
Thr Lys Asp Thr Tyr Asp Ala Leu His Met Gln Ala Leu Pro Pro Arg
485 490 495
<210> 48
<211> 497
<212> PRT
<213> 人工序列（artificial sequence）
<400> 48
Gly Ala His Ala Glu Leu Val Met Thr Gln Ser Pro Ala Ser Leu Ala
1 5 10 15
Val Ser Leu Gly Gln Arg Ala Thr Ile Ser Cys Arg Ala Ser Glu Ser
20 25 30
Val Asp Ser Tyr Gly Lys Ser Phe Met His Trp Tyr Gln Leu Lys Pro
35 40 45
Gly Gln Pro Pro Lys Leu Leu Ile Tyr Arg Ala Ser Asn Leu Glu Ser
50 55 60
Gly Val Pro Ala Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Arg Thr Asp Phe Thr
65 70 75 80
Leu Thr Ile Asp Pro Val Glu Ala Asp Asp Ala Ala Thr Tyr Tyr Cys
85 90 95
Gln Gln Asn Asn Glu Asp Pro Trp Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu
100 105 110
Glu Ile Lys Gly Ser Thr Ser Gly Ser Gly Lys Pro Gly Ser Gly Glu
115 120 125
Gly Ser Thr Lys Gly Glu Val Gln Leu Glu Gln Ser Gly Pro Glu Leu
130 135 140
Val Lys Pro Gly Ala Ser Val Lys Met Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr
145 150 155 160
Thr Phe Thr Asn Tyr Tyr Met Lys Trp Val Lys Gln Ser His Gly Lys
165 170 175
Ser Leu Glu Trp Ile Gly Asp Leu Asn Pro Asn Asn Gly Asp Thr Phe
180 185 190
Tyr Asn Gln Lys Phe Lys Gly Lys Ala Thr Leu Thr Val Asp Lys Ser
195 200 205
Ser Asn Thr Ala Tyr Met Gln Leu Asn Ser Leu Thr Ser Glu Asp Ser
210 215 220
Ala Val Tyr Tyr Cys Ala Arg Thr Gly Arg Tyr Glu Glu Asn Ala Met
225 230 235 240
Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Ser Val Thr Val Ser Ser Ala Ser Phe
245 250 255
Val Pro Val Phe Leu Pro Ala Lys Pro Thr Thr Thr Pro Ala Pro Arg
260 265 270
Pro Pro Thr Pro Ala Pro Thr Ile Ala Ser Gln Pro Leu Ser Leu Arg
275 280 285
Pro Glu Ala Cys Arg Pro Ala Ala Gly Gly Ala Val His Thr Arg Gly
290 295 300
Leu Asp Phe Ala Cys Asp Ile Tyr Ile Trp Ala Pro Leu Ala Gly Thr
305 310 315 320
Cys Gly Val Leu Leu Leu Ser Leu Val Ile Thr Leu Tyr Cys Asn His
325 330 335
Arg Asn Arg Phe Ser Val Val Lys Arg Gly Arg Lys Lys Leu Leu Tyr
340 345 350
Ile Phe Lys Gln Pro Phe Met Arg Pro Val Gln Thr Thr Gln Glu Glu
355 360 365
Asp Gly Cys Ser Cys Arg Phe Pro Glu Glu Glu Glu Gly Gly Cys Glu
370 375 380
Leu Arg Val Lys Phe Ser Arg Ser Ala Asp Ala Pro Ala Tyr Gln Gln
385 390 395 400
Gly Gln Asn Gln Leu Tyr Asn Glu Leu Asn Leu Gly Arg Arg Glu Glu
405 410 415
Tyr Asp Val Leu Asp Lys Arg Arg Gly Arg Asp Pro Glu Met Gly Gly
420 425 430
Lys Pro Arg Arg Lys Asn Pro Gln Glu Gly Leu Tyr Asn Glu Leu Gln
435 440 445
Lys Asp Lys Met Ala Glu Ala Tyr Ser Glu Ile Gly Met Lys Gly Glu
450 455 460
Arg Arg Arg Gly Lys Gly His Asp Gly Leu Tyr Gln Gly Leu Ser Thr
465 470 475 480
Ala Thr Lys Asp Thr Tyr Asp Ala Leu His Met Gln Ala Leu Pro Pro
485 490 495
Arg
<210> 49
<211> 780
<212> DNA
<213> 人工序列（artificial sequence）
<400> 49
ggcgcgcatg ccgatattgt gctcacacaa tcacccgcgt tccttgccgt tagtcttgga 60
caaagagcga cgattagctg tagggcatct gagagcgtag acaattatgg atttagtttt 120
atgaactggt ttcagcaaaa gccaggccaa cctccgaaac tgttgatcta tgcaatatca 180
aaccgaggga gtggggttcc tgcaaggttc tcagggagtg gcagcgggac ggacttttca 240
cttaatatcc atcccgtcga ggaagatgat ccggcgatgt acttctgcca gcagacgaaa 300
gaggttcctt ggacctttgg cgggggtacg aagttggaga tcaaaggttc aacttcagga 360
tccggaaagc cgggctccgg agagggttcc actaagggcc aggtgcagct ccaggaaagt 420
ggcggagacc ttgttaagcc ggggggttca ctcaaacttt catgtgctgc gagtggcttt 480
accttttcac actatgggat gtcctgggta cggcaaacgc ctgataaacg ccttgagtgg 540
gtcgctacta ttggaagcag gggaacatat acacattacc cagattccgt taaaggtaga 600
tttactatca gtagggacaa tgataagaac gcactgtatt tgcaaatgaa ctccctgaaa 660
tccgaggata cggcaatgta ttactgtgct agacgaagcg aattttatta ctatggcaat 720
acatattact acagcgctat ggactactgg ggccagggtg ccagtgtgac ggtctcctct 780
<210> 50
<211> 756
<212> DNA
<213> 人工序列（artificial sequence）
<400> 50
ggcgcgcatg ccgaagttaa gctggtcgaa agcggtggtg atcttgtcaa gccgggtggg 60
tctctcaagc tctcctgcgc tgctagtggc ttcaccttct ctagctacgg gatgtcatgg 120
gtccggcaga cccccgataa aagactggaa tgggttgcga ctataagccg cggtggcagt 180
tacacctact accctgattc cgtcaaaggg cgctttacca taagcagaga taacgccaaa 240
aacacactgt acttgcagat gagttcactt aaaagtgagg atacggccat gtactattgc 300
gcccgccggg aaacctatga tgagaagggg ttcgcttatt gggggcaagg tacgactgta 360
acggtctcat caggtggtgg gggaagcggt gggggagggt caggaggggg tgggagcgat 420
atagagttga cccaatctcc cagtagtctt accgtcacgg cgggagaaaa agtaacgatg 480
agctgcaagt ctagtcaatc acttcttaac agtggaaatc aaaaaaatta tctcacctgg 540
tatcaacaga agccaggaca accgcctaaa ttgctgatat attgggcgag taccagagaa 600
tcaggcgtgc cggaccgatt taccggttca ggttctggtc gggactttac tctgactatt 660
tccagtgttc aggcagaaga tcttgccgtg tattattgcc agaatgataa ttcacacccg 720
ttgacatttg gggcgggcac aaagttggag ctcaaa 756
<210> 51
<211> 759
<212> DNA
<213> 人工序列（artificial sequence）
<400> 51
ggcgcgcatg ccgaactggt aatgacccaa tcaccagctt cacttgctgt ctctcttggg 60
caacgagcta ctatctcatg tagagcctcc gagagtgtcg attcctatgg caaatctttc 120
atgcactggt accaactcaa acctggccaa ccacccaagc tcctgatata tagagccagt 180
aacttggaaa gtggggttcc tgcccggttc tccggtagtg gttcaagaac agatttcacg 240
ctgacaatag atccagtgga agcggacgat gccgccacat attattgcca acaaaataat 300
gaggatccgt ggacctttgg cggagggacc aagcttgaaa ttaaaggttc aacgtccgga 360
agtggaaaac caggtagcgg agagggctct acaaaaggcg aggttcaact cgaacagagt 420
ggtccagagc tggtcaagcc tggtgcgagt gttaaaatgt cctgtaaagc gtccggctac 480
acatttacca actattacat gaaatgggtg aagcaatctc acggaaagag tttggagtgg 540
ataggggacc tgaatcctaa caatggagat acgttctata accaaaagtt caagggaaaa 600
gcaacgctca cggtcgataa gagcagtaat acggcctata tgcagttgaa cagcctgaca 660
agcgaggact cagctgtcta ctactgtgct cgcactggcc ggtatgaaga gaatgcgatg 720
gactactggg ggcaggggac aagcgtaacg gtttctagc 759
<210> 52
<211> 477
<212> DNA
<213> 人工序列（artificial sequence）
<400> 52
cgtttctctg ttgttaaacg gggcagaaag aagctcctgt atatattcaa acaaccattt 60
atgagaccag tacaaactac tcaagaggaa gatggctgta gctgccgatt tccagaagaa 120
gaagaaggag gatgtgaact gagagtgaag ttcagcagga gcgcagacgc ccccgcgtac 180
cagcagggcc agaaccagct ctataacgag ctcaatctag gacgaagaga ggagtacgat 240
gttttggaca agagacgtgg ccgggaccct gagatggggg gaaagccgag aaggaagaac 300
cctcaggaag gcctgtacaa tgaactgcag aaagataaga tggcggaggc ctacagtgag 360
attgggatga aaggcgagcg ccggaggggc aaggggcacg atggccttta ccagggtctc 420
agtacagcca ccaaggacac ctacgacgcc cttcacatgc aggccctgcc ccctcgc 477
<210> 53
<211> 1581
<212> DNA
<213> 人工序列（artificial sequence）
<400> 53
atgcttctcc tggtgacaag ccttctgctc tgtgagttac cacacccagc attcctcctg 60
atcccaggcg cgcatgccga tattgtgctc acacaatcac ccgcgttcct tgccgttagt 120
cttggacaaa gagcgacgat tagctgtagg gcatctgaga gcgtagacaa ttatggattt 180
agttttatga actggtttca gcaaaagcca ggccaacctc cgaaactgtt gatctatgca 240
atatcaaacc gagggagtgg ggttcctgca aggttctcag ggagtggcag cgggacggac 300
ttttcactta atatccatcc cgtcgaggaa gatgatccgg cgatgtactt ctgccagcag 360
acgaaagagg ttccttggac ctttggcggg ggtacgaagt tggagatcaa aggttcaact 420
tcaggatccg gaaagccggg ctccggagag ggttccacta agggccaggt gcagctccag 480
gaaagtggcg gagaccttgt taagccgggg ggttcactca aactttcatg tgctgcgagt 540
ggctttacct tttcacacta tgggatgtcc tgggtacggc aaacgcctga taaacgcctt 600
gagtgggtcg ctactattgg aagcagggga acatatacac attacccaga ttccgttaaa 660
ggtagattta ctatcagtag ggacaatgat aagaacgcac tgtatttgca aatgaactcc 720
ctgaaatccg aggatacggc aatgtattac tgtgctagac gaagcgaatt ttattactat 780
ggcaatacat attactacag cgctatggac tactggggcc agggtgccag tgtgacggtc 840
tcctctgcta gcttcgtgcc ggtcttcctg ccagcgaagc ccaccacgac gccagcgccg 900
cgaccaccaa caccggcgcc caccatcgcg tcgcagcccc tgtccctgcg cccagaggcg 960
tgccggccag cggcgggggg cgcagtgcac acgagggggc tggacttcgc ctgtgatatc 1020
tacatctggg cgcccttggc cgggacttgt ggggtccttc tcctgtcact ggttatcacc 1080
ctttactgca accacaggaa ccgtttctct gttgttaaac ggggcagaaa gaagctcctg 1140
tatatattca aacaaccatt tatgagacca gtacaaacta ctcaagagga agatggctgt 1200
agctgccgat ttccagaaga agaagaagga ggatgtgaac tgagagtgaa gttcagcagg 1260
agcgcagacg cccccgcgta ccagcagggc cagaaccagc tctataacga gctcaatcta 1320
ggacgaagag aggagtacga tgttttggac aagagacgtg gccgggaccc tgagatgggg 1380
ggaaagccga gaaggaagaa ccctcaggaa ggcctgtaca atgaactgca gaaagataag 1440
atggcggagg cctacagtga gattgggatg aaaggcgagc gccggagggg caaggggcac 1500
gatggccttt accagggtct cagtacagcc accaaggaca cctacgacgc ccttcacatg 1560
caggccctgc cccctcgctg a 1581
<210> 54
<211> 1557
<212> DNA
<213> 人工序列（artificial sequence）
<400> 54
atgcttctcc tggtgacaag ccttctgctc tgtgagttac cacacccagc attcctcctg 60
atcccaggcg cgcatgccga agttaagctg gtcgaaagcg gtggtgatct tgtcaagccg 120
ggtgggtctc tcaagctctc ctgcgctgct agtggcttca ccttctctag ctacgggatg 180
tcatgggtcc ggcagacccc cgataaaaga ctggaatggg ttgcgactat aagccgcggt 240
ggcagttaca cctactaccc tgattccgtc aaagggcgct ttaccataag cagagataac 300
gccaaaaaca cactgtactt gcagatgagt tcacttaaaa gtgaggatac ggccatgtac 360
tattgcgccc gccgggaaac ctatgatgag aaggggttcg cttattgggg gcaaggtacg 420
actgtaacgg tctcatcagg tggtggggga agcggtgggg gagggtcagg agggggtggg 480
agcgatatag agttgaccca atctcccagt agtcttaccg tcacggcggg agaaaaagta 540
acgatgagct gcaagtctag tcaatcactt cttaacagtg gaaatcaaaa aaattatctc 600
acctggtatc aacagaagcc aggacaaccg cctaaattgc tgatatattg ggcgagtacc 660
agagaatcag gcgtgccgga ccgatttacc ggttcaggtt ctggtcggga ctttactctg 720
actatttcca gtgttcaggc agaagatctt gccgtgtatt attgccagaa tgataattca 780
cacccgttga catttggggc gggcacaaag ttggagctca aagctagctt cgtgccggtc 840
ttcctgccag cgaagcccac cacgacgcca gcgccgcgac caccaacacc ggcgcccacc 900
atcgcgtcgc agcccctgtc cctgcgccca gaggcgtgcc ggccagcggc ggggggcgca 960
gtgcacacga gggggctgga cttcgcctgt gatatctaca tctgggcgcc cttggccggg 1020
acttgtgggg tccttctcct gtcactggtt atcacccttt actgcaacca caggaaccgt 1080
ttctctgttg ttaaacgggg cagaaagaag ctcctgtata tattcaaaca accatttatg 1140
agaccagtac aaactactca agaggaagat ggctgtagct gccgatttcc agaagaagaa 1200
gaaggaggat gtgaactgag agtgaagttc agcaggagcg cagacgcccc cgcgtaccag 1260
cagggccaga accagctcta taacgagctc aatctaggac gaagagagga gtacgatgtt 1320
ttggacaaga gacgtggccg ggaccctgag atggggggaa agccgagaag gaagaaccct 1380
caggaaggcc tgtacaatga actgcagaaa gataagatgg cggaggccta cagtgagatt 1440
gggatgaaag gcgagcgccg gaggggcaag gggcacgatg gcctttacca gggtctcagt 1500
acagccacca aggacaccta cgacgccctt cacatgcagg ccctgccccc tcgctga 1557
<210> 55
<211> 1560
<212> DNA
<213> 人工序列（artificial sequence）
<400> 55
atgcttctcc tggtgacaag ccttctgctc tgtgagttac cacacccagc attcctcctg 60
atcccaggcg cgcatgccga actggtaatg acccaatcac cagcttcact tgctgtctct 120
cttgggcaac gagctactat ctcatgtaga gcctccgaga gtgtcgattc ctatggcaaa 180
tctttcatgc actggtacca actcaaacct ggccaaccac ccaagctcct gatatataga 240
gccagtaact tggaaagtgg ggttcctgcc cggttctccg gtagtggttc aagaacagat 300
ttcacgctga caatagatcc agtggaagcg gacgatgccg ccacatatta ttgccaacaa 360
aataatgagg atccgtggac ctttggcgga gggaccaagc ttgaaattaa aggttcaacg 420
tccggaagtg gaaaaccagg tagcggagag ggctctacaa aaggcgaggt tcaactcgaa 480
cagagtggtc cagagctggt caagcctggt gcgagtgtta aaatgtcctg taaagcgtcc 540
ggctacacat ttaccaacta ttacatgaaa tgggtgaagc aatctcacgg aaagagtttg 600
gagtggatag gggacctgaa tcctaacaat ggagatacgt tctataacca aaagttcaag 660
ggaaaagcaa cgctcacggt cgataagagc agtaatacgg cctatatgca gttgaacagc 720
ctgacaagcg aggactcagc tgtctactac tgtgctcgca ctggccggta tgaagagaat 780
gcgatggact actgggggca ggggacaagc gtaacggttt ctagcgctag cttcgtgccg 840
gtcttcctgc cagcgaagcc caccacgacg ccagcgccgc gaccaccaac accggcgccc 900
accatcgcgt cgcagcccct gtccctgcgc ccagaggcgt gccggccagc ggcggggggc 960
gcagtgcaca cgagggggct ggacttcgcc tgtgatatct acatctgggc gcccttggcc 1020
gggacttgtg gggtccttct cctgtcactg gttatcaccc tttactgcaa ccacaggaac 1080
cgtttctctg ttgttaaacg gggcagaaag aagctcctgt atatattcaa acaaccattt 1140
atgagaccag tacaaactac tcaagaggaa gatggctgta gctgccgatt tccagaagaa 1200
gaagaaggag gatgtgaact gagagtgaag ttcagcagga gcgcagacgc ccccgcgtac 1260
cagcagggcc agaaccagct ctataacgag ctcaatctag gacgaagaga ggagtacgat 1320
gttttggaca agagacgtgg ccgggaccct gagatggggg gaaagccgag aaggaagaac 1380
cctcaggaag gcctgtacaa tgaactgcag aaagataaga tggcggaggc ctacagtgag 1440
attgggatga aaggcgagcg ccggaggggc aaggggcacg atggccttta ccagggtctc 1500
agtacagcca ccaaggacac ctacgacgcc cttcacatgc aggccctgcc ccctcgctga 1560
<210> 56
<211> 589
<212> DNA
<213> 人工序列（artificial sequence）
<400> 56
tagttattaa tagtaatcaa ttacggggtc attagttcat agcccatata tggagttccg 60
cgttacataa cttacggtaa atggcccgcc tggctgaccg cccaacgacc cccgcccatt 120
gacgtcaata atgacgtatg ttcccatagt aacgccaata gggactttcc attgacgtca 180
atgggtggag tatttacggt aaactgccca cttggcagta catcaagtgt atcatatgcc 240
aagtacgccc cctattgacg tcaatgacgg taaatggccc gcctggcatt atgcccagta 300
catgacctta tgggactttc ctacttggca gtacatctac gtattagtca tcgctattac 360
catggtgatg cggttttggc agtacatcaa tgggcgtgga tagcggtttg actcacgggg 420
atttccaagt ctccacccca ttgacgtcaa tgggagtttg ttttggcacc aaaatcaacg 480
ggactttcca aaatgtcgta acaactccgc cccattgacg caaatgggcg gtaggcgtgt 540
acggtgggag gtctatataa gcagagctgg tttagtgaac cgtcagatc 589
<210> 57
<211> 18
<212> DNA
<213> 人工序列（artificial sequence）
<400> 57
taatacgact cactatag 18
<210> 58
<211> 44
<212> DNA
<213> 人工序列（artificial sequence）
<400> 58
aaataagaga gaaaagaaga gtaagaagaa atataagagc cacc 44
<210> 59
<211> 94
<212> DNA
<213> 人（Homo sapiens）
<400> 59
gctgccttct gcggggcttg ccttctggcc atgcccttct tctctccctt gcacctgtac 60
ctcttggtct ttgaataaag cctgagtagg aagt 94
<210> 60
<211> 34
<212> DNA
<213> 人工序列（artificial sequence）
<400> 60
ataacttcgt atagcataca ttatacgaag ttat 34
<210> 61
<211> 23
<212> DNA
<213> 人工序列（artificial sequence）
<400> 61
taacgataat agatacggaa cgg 23
<210> 62
<211> 23
<212> DNA
<213> 人工序列（artificial sequence）
<400> 62
gtgtatgaaa tgctttaagg agg 23

Claims (59)

1.一种用于***和/或癌症的治疗剂，包含：
(a)第一组合物，其中该第一组合物包含位于第一可药用载体中的第一活性成分，所述第一活性成分包括或含有用于导入肿瘤细胞和/或癌细胞的、具有标记性多肽编码序列的核酸；所述标记性多肽具有可操作地连接的胞外抗原决定区、间隔部分和跨膜部分，能够经表达而修饰在所述肿瘤细胞和/或癌细胞的表面；所述胞外抗原决定区的氨基酸序列含有一个或多个抗原表位多肽的氨基酸序列；其中在自然状态下，哺乳动物细胞膜蛋白或分泌蛋白的氨基酸序列不含有所述抗原表位多肽的氨基酸序列；以及
(b)第二组合物，其中该第二组合物包含位于第二可药用载体中的第二活性成分，所述第二活性成分包含嵌合抗原受体修饰的免疫细胞；所述的嵌合抗原受体修饰的免疫细胞能够特异性识别并结合所述标记性多肽的所述胞外抗原决定区。
2.根据权利要求1所述的治疗剂，其中所述抗原表位多肽的氨基酸序列来源于自然界存在的蛋白的氨基酸序列，或者为人工合成的自然界不存在的氨基酸序列。
3.根据权利要求2所述的治疗剂，其中所述自然界存在的蛋白包括哺乳动物细胞内蛋白、病毒蛋白、和所有其它非哺乳动物蛋白。
4.根据权利要求1所述的治疗剂，其中所述抗原表位多肽的氨基酸序列包括以下标签的氨基酸序列：Myc标签、HA标签、Strep标签II、Flag标签、HAT标签、S标签、S1标签、蛋白C标签、tag-100标签、E2标签、TAP标签、HSV标签、KT3标签、S1标签、V5标签、VSV-G标签、His标签或RFP标签。
5.根据权利要求1所述的治疗剂，其中所述胞外抗原决定区的氨基酸序列如SEQ IDNO:1、SEQ ID NO:2、SEQ ID NO:3、SEQ ID NO:4或SEQ ID NO:5所示。
6.根据权利要求1所述的治疗剂，其中所述间隔部分来自CD8α的铰链区、IgG的铰链区或IgD的铰链区；优选地，所述间隔部分的氨基酸序列如SEQ ID NO:6所示；其中所述跨膜部分来源于CD8、CD3ζ、CD4或CD28的跨膜区；优选地，所述跨膜部分的氨基酸序列如SEQ IDNO:7所示。
7.根据权利要求1所述的治疗剂，其中所述标记性多肽的氨基酸序列如SEQ ID NO:11、SEQ ID NO:12、SEQ ID NO:13、SEQ ID NO:14或SEQ ID NO:15所示。
8.根据权利要求1所述的治疗剂，其中所述核酸包括DNA或RNA；所述RNA包括由所述DNA转录的mRNA。
9.根据权利要求1所述的治疗剂，其中所述第一活性成分为重组病毒，所述重组病毒的基因组具有标记性多肽编码序列；其中，所述重组病毒包括选择复制型重组溶瘤病毒或复制缺陷型重组病毒。
10.根据权利要求9所述的治疗剂，其中所述重组溶瘤病毒来源于具有溶瘤作用的经基因突变的病毒和具有溶瘤作用的野生型病毒；优选地，所述重组溶瘤病毒来源于具有溶瘤作用的腺病毒、痘病毒、单纯疱疹病毒、麻疹病毒、塞姆利基森林病毒、水疱性口炎病毒、脊髓灰质炎病毒、逆转录病毒、呼肠孤病毒、塞内卡谷病毒、埃可型肠道病毒、柯萨奇病毒、新城疫病毒和马拉巴病毒。
11.根据权利要求1所述的治疗剂，其中所述嵌合抗原受体包括可操作地连接的、依次串联的抗原结合结构域、间隔区、跨膜区和胞内结构域，所述抗原结合结构域能够特异性识别并结合所述标记性多肽的所述胞外抗原决定区。
12.根据权利要求11所述的治疗剂，其中所述抗原结合结构域的氨基酸序列如SEQ IDNO:42、SEQ ID NO:43或SEQ ID NO:44所示。
13.根据权利要求11所述的治疗剂，其中所述胞内结构域来自淋巴细胞胞内激活信号转导区和可任选的淋巴细胞共刺激信号转导区，其中所述胞内激活信号转导区选自CD3ζ或DAP12的胞内激活信号转导区；所述可任选的淋巴细胞共刺激信号转导区选自4-1BB、CD28、CD27、OX40、GITR、和/或ICOSS的共刺激信号转导区。
14.根据权利要求11所述的治疗剂，其中所述间隔区来自CD8α的铰链区、IgG的铰链区或IgD的铰链区，所述跨膜区来自CD8α的跨膜区、CD3ζ的跨膜区、CD4的跨膜区或CD28的跨膜区。
15.根据权利要求11所述的治疗剂，其中所述嵌合抗原受体的氨基酸序列如SEQ IDNO:46、SEQ ID NO:47或SEQ ID NO:48所示。
16.根据权利要求1所述的治疗剂，其中所述免疫细胞包括T细胞或NK细胞。
17.权利要求1所述的治疗剂，其中所述第一组合物和所述第二组合物各自独立地存在于所述治疗剂中而互不混合。
18.根据权利要求8所述的治疗剂，其中所述第一组合物包含治疗有效量的所述DNA、或治疗有效量的所述mRNA。
19.根据权利要求9所述的治疗剂，其中所述第一组合物包含治疗有效量的所述重组病毒。
20.根据权利要求1所述的治疗剂，其中所述第二组合物包含治疗有效量的所述的嵌合抗原受体修饰的免疫细胞。
21.根据权利要求8所述的治疗剂，其中所述DNA配制成通过瘤内注射或静脉给药；所述mRNA配制成通过瘤内注射或静脉给药。
22.根据权利要求9所述的治疗剂，其中所述重组病毒配制成通过瘤内注射给药或静脉给药。
23.根据权利要求1所述的治疗剂，其中所述的嵌合抗原受体修饰的免疫细胞配制成通过静脉给药或局部给药。
24.根据权利要求1所述的治疗剂，其中所述治疗剂由所述第一组合物和所述第二组合物组成。
25.根据权利要求1-24中任一项所述的治疗剂在制备用于***和/或癌症的药物中的用途。
26.根据权利要求25所述的用途，其中所述肿瘤和/或癌症包括：乳腺癌，头颈部肿瘤，滑膜癌，肾癌，***癌，黑色素瘤，肺癌，食管癌，结肠癌，直肠癌，脑癌，肝癌，骨癌，绒毛膜癌，胃泌素瘤，嗜铬细胞瘤，催乳素瘤，von Hippel-Lindau病，Zollinger-Ellison综合征，***癌，胆管癌，膀胱癌，输尿管癌，神经胶质瘤，神经母细胞瘤，脑膜瘤，脊髓肿瘤，骨软骨瘤，软骨肉瘤，尤文氏肉瘤，原发部位不明癌，类癌，纤维肉瘤，佩吉特病，***，胆囊癌，眼癌，卡波西氏肉瘤，***癌，睾丸癌，皮肤鳞状细胞癌，间皮瘤，多尖端骨髓瘤，卵巢癌，胰腺内分泌瘤，胰高血糖素瘤，胰腺癌，***癌，垂体癌，软组织肉瘤，视网膜母细胞瘤，小肠癌，胃癌，胸腺癌，滋养细胞癌，***，子宫内膜癌，***癌，外阴癌，蕈样真菌病，胰岛素瘤，心脏癌，脑膜癌，腹膜癌，胸膜癌和血液癌。
27.一种标记性多肽，其特征在于，所述标记性多肽具有可操作地连接的胞外抗原决定区、间隔部分和跨膜部分，能够经表达而修饰在肿瘤细胞和/或癌细胞的表面；所述胞外抗原决定区的氨基酸序列含有一个或多个抗原表位多肽的氨基酸序列；其中在自然状态下，哺乳动物细胞膜蛋白或分泌蛋白的氨基酸序列不含有所述抗原表位多肽的氨基酸序列。
28.根据权利要求27所述的标记性多肽，其中所述抗原表位多肽的氨基酸序列来源于自然界存在的蛋白的氨基酸序列，或者为人工合成的自然界不存在的氨基酸序列。
29.根据权利要求28所述的标记性多肽，其中所述自然界存在的蛋白包括哺乳动物细胞内蛋白、病毒蛋白、和所有其它非哺乳动物蛋白。
30.根据权利要求27所述的标记性多肽，其中所述抗原表位多肽的氨基酸序列包括以下标签的氨基酸序列：Myc标签、HA标签、Strep标签II、Flag标签、HAT标签、S标签、S1标签、蛋白C标签、tag-100标签、E2标签、TAP标签HSV标签、KT3标签、S1标签、V5标签、VSV-G标签、His标签或RFP标签。
31.根据权利要求27所述的标记性多肽，其中所述胞外抗原决定区的氨基酸序列如SEQID NO:1、SEQ ID NO:2、SEQ ID NO:3、SEQ ID NO:4或SEQ ID NO:5所示。
32.根据权利要求27所述的标记性多肽，其中所述间隔部分来自CD8α的铰链区、IgG的铰链区或IgD的铰链区；优选地，所述间隔部分的氨基酸序列如SEQ ID NO:6所示；其中所述跨膜部分来源于CD8、CD3ζ、CD4或CD28的跨膜区；优选地，所述跨膜部分的氨基酸序列如SEQID NO:7所示。
33.根据权利要求27所述的标记性多肽，其中所述标记性多肽的氨基酸序列如SEQ IDNO:11、SEQ ID NO:12、SEQ ID NO:13、SEQ ID NO:14或SEQ ID NO:15所示。
34.一种分离的、具有根据权利要求27-33中任一项所述的标记性多肽的编码序列的核酸。
35.根据权利要求34所述的核酸，其中所述核酸依次包含可操作地连接的启动子、信号肽编码序列、以及根据权利要求27-33中任一项所述的标记性多肽的编码序列。
36.根据权利要求34所述的核酸，其中所述核酸包括DNA和mRNA。
37.一种重组表达载体，其中所述重组表达载体依次包含可操作地连接的启动子、信号肽编码序列、以及根据权利要求27-33中任一项所述的标记性多肽的编码序列。
38.一种分离的重组病毒，其中所述重组病毒的基因组具有依次的可操作地连接的启动子、信号肽编码序列、以及根据权利要求27-33中任一项所述的标记性多肽的编码序列，并且所述标记性多肽能够经表达而修饰在肿瘤细胞和/或癌细胞的表面；并且，所述重组病毒包括选择复制型重组溶瘤病毒或复制缺陷型重组病毒。
39.根据权利要求38所述的重组病毒，其中所述重组病毒为选择复制型重组溶瘤病毒，并且所述重组溶瘤病毒来源于具有溶瘤作用的经基因突变的病毒和具有溶瘤作用的野生型病毒；优选地，所述重组溶瘤病毒来源于具有溶瘤作用的腺病毒、痘病毒、单纯疱疹病毒、麻疹病毒、塞姆利基森林病毒、水疱性口炎病毒、脊髓灰质炎病毒、逆转录病毒、呼肠孤病毒、塞内卡谷病毒、埃可型肠道病毒、柯萨奇病毒、新城疫病毒和马拉巴病毒。
40.一种嵌合抗原受体，该嵌合抗原受体包括可操作地连接的、依次串联的抗原结合结构域、间隔区、跨膜区和胞内结构域，其特征在于，所述抗原结合结构域能够识别并结合根据权利要求27-33中任一项所述的标记性多肽的胞外抗原决定区。
41.根据权利要求40所述的嵌合抗原受体，其中所述抗原结合结构域的氨基酸序列如SEQ ID NO:42、SEQ ID NO:43或SEQ ID NO:44所示。
42.根据权利要求40所述的嵌合抗原受体，其中所述胞内结构域来自淋巴细胞胞内激活信号转导区和可任选的淋巴细胞共刺激信号转导区，其中所述胞内激活信号转导区选自CD3ζ或DAP12的胞内激活信号转导区；所述可任选的淋巴细胞共刺激信号转导区选自4-1BB、CD28、CD27、OX40、GITR、和/或ICOSS的共刺激信号转导区。
43.根据权利要求40所述的嵌合抗原受体，其中所述间隔区来自CD8α的铰链区、IgG的铰链区或IgD的铰链区，所述跨膜区来自CD8α的跨膜区、CD3ζ的跨膜区、CD4的跨膜区或CD28的跨膜区。
44.根据权利要求40所述的嵌合抗原受体，其中所述嵌合抗原受体的氨基酸序列如SEQID NO:46、SEQ ID NO:47或SEQ ID NO:48所示。
45.一种分离的、具有根据权利要求40-44中任一项所述的嵌合抗原受体的编码序列的DNA。
46.根据权利要求45所述的DNA，其核苷酸序列如SEQ ID NO:53、SEQ ID NO:54或SEQID NO:55所示。
47.一种分离的、由根据权利要求45或46所述的DNA转录的mRNA。
48.一种重组表达载体，其中所述重组表达载体依次包含可操作地连接的启动子、信号肽编码序列、以及根据权利要求40-44中任一项所述的嵌合抗原受体的编码序列。
49.一种嵌合抗原受体修饰的免疫细胞，该免疫细细胞的表面被权利要求40-44中任一项所述的嵌合抗原受体修饰。
50.根据权利要求49所述的嵌合抗原受体修饰的免疫细胞，其中所述免疫细胞为NK细胞或T细胞。
51.一种用于***和/或癌症的具有协同作用的联合药物的药盒，包括：
第一容器，该第一容器装有根据权利要求1-24中任一项所述的治疗剂中的第一组合物；
第二容器，该第二容器装有根据权利要求1-24中任一项所述的治疗剂中的第二组合物，其中所述第一容器和所述第二容器是独立的；以及
载明给药时机和给药方式的说明书。
52.根据权利要求34-36中任一项所述的核酸在制备用于治疗或预防肿瘤和/或癌症的药物中的用途。
53.根据权利要求38或39所述的重组病毒在制备用于治疗或预防肿瘤和/或癌症的药物中的用途。
54.根据权利要求49或50所述的嵌合抗原受体修饰的免疫细胞在制备用于治疗或预防肿瘤和/或癌症的药物中的用途。
55.根据权利要求51所述的药盒在制备用于治疗或预防肿瘤和/或癌症的药物中的用途。
56.根据权利要求52-55中任一项所述的用途，其中所述肿瘤和/或癌症包括：乳腺癌，头颈部肿瘤，滑膜癌，肾癌，***癌，黑色素瘤，肺癌，食管癌，结肠癌，直肠癌，脑癌，肝癌，骨癌，绒毛膜癌，胃泌素瘤，嗜铬细胞瘤，催乳素瘤，von Hippel-Lindau病，Zollinger-Ellison综合征，***癌，胆管癌，膀胱癌，输尿管癌，神经胶质瘤，神经母细胞瘤，脑膜瘤，脊髓肿瘤，骨软骨瘤，软骨肉瘤，尤文氏肉瘤，原发部位不明癌，类癌，纤维肉瘤，佩吉特病，***，胆囊癌，眼癌，卡波西氏肉瘤，***癌，睾丸癌，皮肤鳞状细胞癌，间皮瘤，多尖端骨髓瘤，卵巢癌，胰腺内分泌瘤，胰高血糖素瘤，胰腺癌，***癌，垂体癌，软组织肉瘤，视网膜母细胞瘤，小肠癌，胃癌，胸腺癌，滋养细胞癌，***，子宫内膜癌，***癌，外阴癌，蕈样真菌病，胰岛素瘤，心脏癌，脑膜癌，腹膜癌，胸膜癌和血液癌。
57.一种***和/或癌症的方法，包括：
对肿瘤和/或癌症患者施用根据权利要求1-24中任一项所述的治疗剂中的第一组合物；和
对所述肿瘤和/或癌症患者施用根据权利要求1-24中任一项所述的治疗剂中的第二组合物。
58.根据权利要求57所述的方法，包括以下依次进行的步骤：
1)对所述肿瘤和/或癌症患者施用所述第一组合物；和
2)在施用所述第一组合物之后，对所述肿瘤和/或癌症患者施用所述第二组合物。
59.根据权利要求57所述的方法，其中所述肿瘤和/或癌症包括：乳腺癌，头颈部肿瘤，滑膜癌，肾癌，***癌，黑色素瘤，肺癌，食管癌，结肠癌，直肠癌，脑癌，肝癌，骨癌，绒毛膜癌，胃泌素瘤，嗜铬细胞瘤，催乳素瘤，von Hippel-Lindau病，Zollinger-Ellison综合征，***癌，胆管癌，膀胱癌，输尿管癌，神经胶质瘤，神经母细胞瘤，脑膜瘤，脊髓肿瘤，骨软骨瘤，软骨肉瘤，尤文氏肉瘤，原发部位不明癌，类癌，纤维肉瘤，佩吉特病，***，胆囊癌，眼癌，卡波西氏肉瘤，***癌，睾丸癌，皮肤鳞状细胞癌，间皮瘤，多尖端骨髓瘤，卵巢癌，胰腺内分泌瘤，胰高血糖素瘤，胰腺癌，***癌，垂体癌，软组织肉瘤，视网膜母细胞瘤，小肠癌，胃癌，胸腺癌，滋养细胞癌，***，子宫内膜癌，***癌，外阴癌，蕈样真菌病，胰岛素瘤，心脏癌，脑膜癌，腹膜癌，胸膜癌和血液癌。
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