CN110846335A - 可检测幽门螺杆菌高致病菌株抗体试剂盒的制备方法 - Google Patents

可检测幽门螺杆菌高致病菌株抗体试剂盒的制备方法 Download PDF

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Abstract

本发明公开了可检测幽门螺杆菌高致病菌株抗体试剂盒的制备方法，属于医疗设备技术领域，本发明利用基因工程技术制备了幽门螺旋杆菌两种毒素蛋白CagA和VacA嵌合物，并将此基因工程嵌合物偶联至聚苯乙烯羧基纳米微球表面，从而制备成可以特异性检测人血清中幽门螺杆菌高致病菌株抗体的试剂盒，具有对高致病型的幽门螺杆菌样本完全能够准确的检出的有益效果。

Description

可检测幽门螺杆菌高致病菌株抗体试剂盒的制备方法
技术领域
本发明涉及医疗技术领域，更具体地说，本发明涉及可检测幽门螺杆菌高致病菌株抗体试剂盒的制备方法。
背景技术
幽门螺旋杆菌(H.pylori)的感染可增加胃癌发生的危险，现在有充分的研究证据证明：H.pylori与肠型和弥漫型胃癌均相关。1994年世界卫生组织旗下的国际癌症研究机构 IARC将其定为Ⅰ类致癌原。
根据国内外的研究结果证实：幽门螺杆菌按照是否分泌毒素蛋白，可以分为以下几种不同的亚型(《中华消化杂志》1995年第S1期项兆英)：
类型 尿素酶表达情况 毒素蛋白表达情况 致病能力
Ⅰ型 UreB+ CagA+并且VacA+ 最强
Ⅱ型 UreB+ CagA-并且VacA- 极弱
中间型 UreB+ CagA或VacA阳性 强
另外，可续研究还发现，Ⅱ型幽门螺杆菌感染者大约占总感染人群的30％，这部分亚型的感染者终身无任何不良症状出现，不需要临床治疗。
目前幽门螺杆菌检测方法有放射性碳元素呼气试验法、胶体金免疫层析发和酶联免疫法法，上述所有方法均是基于检测是否存在尿素酶或热休克蛋白靶标来判断是否感染幽门螺杆菌，它们只能判断病人是否感染幽门螺杆菌，均无法区分感染的是致病型的Ⅰ型或中间型还是非致病性的Ⅱ型，这样会导致Ⅱ型幽门螺杆菌感染者的不必要的过渡治疗，并引起其他的医疗风险。
发明内容
为了克服现有技术的上述缺陷，本发明的实施例提供可检测幽门螺杆菌高致病菌株抗体试剂盒的制备方法，利用基因工程技术制备了幽门螺旋杆菌两种毒素蛋白CagA和VacA 嵌合物，并将此基因工程嵌合物偶联至聚苯乙烯羧基纳米微球表面，从而制备成可以特异性检测人血清中幽门螺杆菌高致病菌株抗体的试剂盒，以解决上述背景技术中提出的问题。
为实现上述目的，本发明提供如下技术方案：可检测幽门螺杆菌高致病菌株抗体试剂盒的制备方法，包括以下步骤：
步骤一、利用基因工程技术制备幽门螺旋杆菌细胞毒素蛋白CagA和幽门螺旋杆菌空泡细胞VacA；
步骤二、利用连接序列(Linker)将步骤一中的幽门螺旋杆菌细胞毒素蛋白CagA的肽段以及幽门螺旋杆菌空泡细胞VacA的肽段连接到一起成为一个完整的嵌合抗原；
步骤三、将步骤二中完整的嵌合抗原氨基酸序列按照大肠杆菌标准的密码子规则翻译成DNA序列；
步骤四、将步骤三中的DNA序列人工合成基因片段，并***至大肠杆菌质粒pET30a当中构建表达载体pET30a/CagA+VacA；
步骤五、将步骤四中的表达载体pET30a/CagA+VacA导入大肠杆菌BL21(DE3)感受态细胞，挑取单克隆菌株，在LB培养基中37℃培养并用0.2-1.0mM的IPTG诱导表达嵌合抗原CagA+VacA；
步骤六、表达的嵌合抗原CagA+VacA为包涵体状态，用6至8摩尔/升的尿素溶液溶解包涵体，再用镍离子亲和层析柱亲和纯化嵌合抗原CagA+VacA；
步骤七、上述纯化的嵌合抗原CagA+VacA利用梯度尿素浓度逐步透析的方法复性称为完整活性的蛋白，分装后-20℃冻存；
步骤八、嵌合抗原CagA+VacA偶联聚苯乙烯羧基纳米微球，从而制备成可以特异性检测人血清中幽门螺杆菌高致病菌株抗体的试剂盒。
进一步地，步骤一中选取幽门螺旋杆菌细胞毒素蛋白CagA上的肽段氨基酸序列如下：AFIKVDNAVASFDPDQKPIVDKNDRDNRQAFEKISQLREEYANKAIKNPAKKNQYFSDFINKSNDLINKDNLIAVDS SVESFKKFGDQRYQIFTSWVSLQKDPSKINTQQIRNFMENIIQPPISDDKEKAEFLRSAKQSFAGIIIGNQIRSDEK FMGVFDESLKARQEAEKNEEPTGGDWLDIFLSFVFNKKQSSDLKETLNQEPRPDFEQNLATTTTDIQGLPPEARDLL DERGNFFKFTLGDVEMLDVEGVADKDPNYKFNQLLIHNN。
进一步地，步骤一中选取幽门螺旋杆菌空泡细胞毒素蛋白VacA上的肽段氨基酸序列为： HYWVKGGQWNKLEVDMKDAVGTYKLSGLRNFTGGDLDVNMQKATLRLGQFNGNSFTSFKDSADRTTRVDFNAKNISI DNFLEINNRVGSGAGRKASSTVLTLQASEGITSGKNAEISLYDGATLNLASNSVKLMGNVWMGRLQYVGAYLAPSYS TINTSKVTGEVNFNHLTVGDHNAAQAGIIASKKTYIGTLDLWQSAGLNIIAPPEGGYKDKPNNTNSQSGAKNDKNES AKNDKQDSN。
进一步地，步骤二中选取连接序列(Linker)氨基酸序列如下：GGGGSGGGGSGGGG。
更进一步地，所述步骤二中完整的嵌合抗原氨基酸序列如下： HYWVKGGQWNKLEVDMKDAVGTYKLSGLRNFTGGDLDVNMQKATLRLGQFNGNSFTSFKDSADRTTRVDFNAK NISIDNFLEINNRVGSGAGRKASSTVLTLQASEGITSGKNAEISLYDGATLNLASNSVKLMGNVWMGRLQYVG AYLAPSYSTINTSKVTGEVNFNHLTVGDHNAAQAGIIASKKTYIGTLDLWQSAGLNIIAPPEGGYKDKPNNTN SQSGAKNDKNESAKNDKQDSNGGGGSGGGGSGGGGSAFIKVDNAVASFDPDQKPIVDKNDRDNRQAFEKISQL REEYANKAIKNPAKKNQYFSDFINKSNDLINKDNLIAVDSSVESFKKFGDQRYQIFTSWVSLQKDPSKINTQQ IRNFMENIIQPPISDDKEKAEFLRSAKQSFAGIIIGNQIRSDEKFMGVFDESLKARQEAEKNEEPTGGDWLDI FLSFVFNKKQSSDLKETLNQEPRPDFEQNLATTTTDIQGLPPEARDLLDERGNFFKFTLGDVEMLDVEGVADK DPNYKFNQLLIHNN。
更进一步地，所述步骤三中完整的DNA序列如下： CATTATTGGGTCAAAGGCGGGCAATGGAACAAGCTTGAAGTGGATATGAAAGATGCTGTAGGGACTTATAAAC TTTCAGGGCTAAGAAACTTTACCGGTGGGGATTTAGATGTGAATATGCAAAAAGCCACTTTGCGTTTGGGCCA ATTCAATGGCAATTCTTTCACAAGCTTTAAGGATAGCGCTGATCGCACCACGAGAGTGGATTTCAACGCTAAA AATATCTCAATTGATAATTTTTTAGAAATCAATAATCGCGTGGGTTCTGGAGCCGGTAGGAAGGCTAGCTCTA CGGTTTTAACTTTGCAAGCTTCAGAGGGGATCACTAGCGGTAAAAATGCGGAAATTTCTCTTTATGATGGCGC CACGCTTAATTTGGCTTCAAACAGCGTTAAATTAATGGGTAATGTGTGGATGGGCCGTTTGCAGTATGTGGGA GCGTATTTGGCCCCTTCATACAGCACGATAAACACTTCAAAAGTGACAGGGGAAGTGAATTTTAACCATCTCA CTGTGGGCGATCACAACGCCGCTCAAGCAGGGATTATTGCCAGTAAAAAGACTTATATTGGCACACTGGATTT GTGGCAAAGCGCAGGGTTAAACATTATCGCCCCTCCAGAAGGTGGTTATAAGGATAAACCTAATAATACCAAT TCTCAAAGTAGTGCTAAAAATGACAAAAATGAAAGTGCTAAAAACGACAAACAAGATAGTAACGGTGGCGGTG GAAGCGGCGGTGGCGGAAGCGGCGGTGGCGGCAGCGCTTTTATTAAAGTTGATAACGCTGTCGCTTCATTTGA TCCTGATCAAAAACCAATCGTTGATAAGAATGATAGGGATAATAGGCAAGCTTTTGAGAAAATCTCGCAACTA AGGGAAGAATACGCCAATAAAGCGATCAAAAATCCTGCCAAAAAAAATCAGTATTTTTCAGACTTTATCAATA AGAGCAATGATTTGATCAACAAAGACAATCTCATTGCTGTAGATTCTTCCGTAGAGAGCTTTAAGAAATTTGG GGATCAGCGTTACCAAATTTTTACGAGTTGGGTGTCCCTTCAAAAAGATCCGTCTAAAATCAACACACAACAA ATCCGAAATTTTATGGAAAATATCATACAACCCCCTATCTCTGATGATAAAGAAAAAGCGGAGTTTTTGAGGT CTGCCAAACAATCTTTTGCAGGAATTATCATAGGAAACCAAATCCGATCGGATGAAAAATTCATGGGCGTGTT TGATGAATCTTTGAAAGCAAGGCAAGAAGCAGAAAAAAATGAAGAGCCTACTGGTGGGGATTGGCTTGATATT TTTTTATCATTTGTGTTTAACAAAAAACAATCTTCCGATCTCAAAGAAACGCTCAATCAAGAGCCAAGGCCTG ATTTTGAACAAAATTTAGCCACTACCACCACCGACATACAAGGCTTACCGCCTGAAGCTAGAGATTTGCTTGA TGAAAGGGGTAATTTTTTTAAATTCACTCCTGGTGATGTGGAGATGTTGGATGTTGAGGGAGTCGCTGACAAG GATCCCAATTACAAGTTCAATCAATTATTGATCCACAATAACGCT。
更进一步地，步骤八中，嵌合抗原CagA+VacA偶联聚苯乙烯羧基纳米微球的方法如下：
第一步、选取粒径为150-300纳米的聚苯乙烯羧基纳米微球，用pH为4.0-6.0的MES缓冲液将微球稀释至1％的固含量，再加入至终浓度0.1-1mM的EDC，在25-35℃下活化微球表面的羧基基团5-20分钟；
第二步、向活化的微球中滴加嵌合抗原CagA+VacA至浓度为：0.5-2.0mg/ml；然后25-35℃温育0.5-2小时；
第三步、加入BSA至浓度0.5-1.0mg/ml，继续温育0.5-2小时进行封闭；
第四步、用细胞超声破碎仪在2-8℃条件下超声1-5分钟将凝聚的微球打散。
更进一步地，步骤八中可以特异性检测人血清中幽门螺杆菌高致病菌株抗体的试剂盒
包括试剂-1、试剂-2和相应的盛放试剂-1、试剂-2的试剂瓶，其中试剂-1、试剂-2
的配方如下：
试剂-1配方：
10mM-50mM Tris-HCl(pH7-9)；
50mM-150mM NaCl；
0.2％-2.0％PEG6000；
0.01-0.1％Proclin300；
试剂-2配方：
10mM-50mM Tris-HCl(pH7-9)；
0.2％-5％BSA；
50-150mM NaCl；
0.01％-0.05％已经偶联好嵌合抗原CagA+VacA的聚苯乙烯纳米微球；
0.01-0.1％Proclin300。。
本发明的有益效果：本试剂盒对高致病型的幽门螺杆菌样本完全能够准确的检出。
具体实施方式
下面将结合本发明实施例对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例仅仅是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。
本发明利用基因工程技术制备了幽门螺旋杆菌两种毒素蛋白CagA和VacA嵌合物，并将此基因工程嵌合物偶联至聚苯乙烯羧基纳米微球表面，从而制备成可以特异性检测人血清中幽门螺杆菌高致病菌株抗体的试剂盒。
幽门螺旋杆菌两种毒素蛋白CagA和VacA的基因工程嵌合物制备方法如下：
1、利用生物信息学技术对幽门螺旋杆菌两种毒素蛋白CagA和VacA的蛋白质抗原性进行预测，各选取一段抗原性比较强的肽段，用连接序列(Linker)将两个肽段连接到一起成为一个完整的嵌合抗原。
毒素蛋白CagA选取的肽段氨基酸序列(序列号为：DNA ID NO.1)如下：
AFIKVDNAVASFDPDQKPIVDKNDRDNRQAFEKISQLREEYANKAIKNPAKKNQYFSDFINKSNDLINKDNLI AVDSSVESFKKFGDQRYQIFTSWVSLQKDPSKINTQQIRNFMENIIQPPISDDKEKAEFLRSAKQSFAGIIIGNQIR SDEKFMGVFDESLKARQEAEKNEEPTGGDWLDIFLSFVFNKKQSSDLKETLNQEPRPDFEQNLATTTTDIQGLPPEA RDLLDERGNFFKFTLGDVEMLDVEGVADKDPNYKFNQLLIHNNA。
毒素蛋白VacA选取的肽段氨基酸序列(序列号为：DNA ID NO.2)如下：
HYWVKGGQWNKLEVDMKDAVGTYKLSGLRNFTGGDLDVNMQKATLRLGQFNGNSFTSFKDSADRTTRVDFNAK NISIDNFLEINNRVGSGAGRKASSTVLTLQASEGITSGKNAEISLYDGATLNLASNSVKLMGNVWMGRLQYVGAYLA PSYSTINTSKVTGEVNFNHLTVGDHNAAQAGIIASKKTYIGTLDLWQSAGLNIIAPPEGGYKDKPNNTNSQSGAKND KNESAKNDKQDSN。
Linker氨基酸序列(序列号为：DNA ID NO.3)如下：GGGGSGGGGSGGGGS。
完整的嵌合抗原氨基酸序列(序列号为：DNA ID NO.4)如下：
HYWVKGGQWNKLEVDMKDAVGTYKLSGLRNFTGGDLDVNMQKATLRLGQFNGNSFTSFKDSADRTTRVDFNAK NISIDNFLEINNRVGSGAGRKASSTVLTLQASEGITSGKNAEISLYDGATLNLASNSVKLMGNVWMGRLQYVGAYLA PSYSTINTSKVTGEVNFNHLTVGDHNAAQAGIIASKKTYIGTLDLWQSAGLNIIAPPEGGYKDKPNNTNSQSGAKND KNESAKNDKQDSNGGGGSGGGGSGGGGSAFIKVDNAVASFDPDQKPIVDKNDRDNRQAFEKISQLREEYANKAIKNP AKKNQYFSDFINKSNDLINKDNLIAVDSSVESFKKFGDQRYQIFTSWVSLQKDPSKINTQQIRNFMENIIQPPISDD KEKAEFLRSAKQSFAGIIIGNQIRSDEKFMGVFDESLKARQEAEKNEEPTGGDWLDIFLSFVFNKKQSSDLKETLNQ EPRPDFEQNLATTTTDIQGLPPEARDLLDERGNFFKFTLGDVEMLDVEGVADKDPNYKFNQLLIHNNA。
2、将上述完整的嵌合抗原氨基酸序列按照大肠杆菌标准的密码子规则翻译成DNA序列(序列号为：DNA ID NO.5)如下：
CATTATTGGGTCAAAGGCGGGCAATGGAACAAGCTTGAAGTGGATATGAAAGATGCTGTAGGGACTTATAAAC TTTCAGGGCTAAGAAACTTTACCGGTGGGGATTTAGATGTGAATATGCAAAAAGCCACTTTGCGTTTGGGCCAATTC AATGGCAATTCTTTCACAAGCTTTAAGGATAGCGCTGATCGCACCACGAGAGTGGATTTCAACGCTAAAAATATCTC AATTGATAATTTTTTAGAAATCAATAATCGCGTGGGTTCTGGAGCCGGTAGGAAGGCTAGCTCTACGGTTTTAACTT TGCAAGCTTCAGAGGGGATCACTAGCGGTAAAAATGCGGAAATTTCTCTTTATGATGGCGCCACGCTTAATTTGGCT TCAAACAGCGTTAAATTAATGGGTAATGTGTGGATGGGCCGTTTGCAGTATGTGGGAGCGTATTTGGCCCCTTCATA CAGCACGATAAACACTTCAAAAGTGACAGGGGAAGTGAATTTTAACCATCTCACTGTGGGCGATCACAACGCCGCTC AAGCAGGGATTATTGCCAGTAAAAAGACTTATATTGGCACACTGGATTTGTGGCAAAGCGCAGGGTTAAACATTATC GCCCCTCCAGAAGGTGGTTATAAGGATAAACCTAATAATACCAATTCTCAAAGTAGTGCTAAAAATGACAAAAATGA AAGTGCTAAAAACGACAAACAAGATAGTAACGGTGGCGGTGGAAGCGGCGGTGGCGGAAGCGGCGGTGGCGGCAGCG CTTTTATTAAAGTTGATAACGCTGTCGCTTCATTTGATCCTGATCAAAAACCAATCGTTGATAAGAATGATAGGGAT AATAGGCAAGCTTTTGAGAAAATCTCGCAACTAAGGGAAGAATACGCCAATAAAGCGATCAAAAATCCTGCCAAAAA AAATCAGTATTTTTCAGACTTTATCAATAAGAGCAATGATTTGATCAACAAAGACAATCTCATTGCTGTAGATTCTT CCGTAGAGAGCTTTAAGAAATTTGGGGATCAGCGTTACCAAATTTTTACGAGTTGGGTGTCCCTTCAAAAAGATCCG TCTAAAATCAACACACAACAAATCCGAAATTTTATGGAAAATATCATACAACCCCCTATCTCTGATGATAAAGAAAA AGCGGAGTTTTTGAGGTCTGCCAAACAATCTTTTGCAGGAATTATCATAGGAAACCAAATCCGATCGGATGAAAAAT TCATGGGCGTGTTTGATGAATCTTTGAAAGCAAGGCAAGAAGCAGAAAAAAATGAAGAGCCTACTGGTGGGGATTGG CTTGATATTTTTTTATCATTTGTGTTTAACAAAAAACAATCTTCCGATCTCAAAGAAACGCTCAATCAAGAGCCAAG GCCTGATTTTGAACAAAATTTAGCCACTACCACCACCGACATACAAGGCTTACCGCCTGAAGCTAGAGATTTGCTTG ATGAAAGGGGTAATTTTTTTAAATTCACTCCTGGTGATGTGGAGATGTTGGATGTTGAGGGAGTCGCTGACAAGGAT CCCAATTACAAGTTCAATCAATTATTGATCCACAATAACGCT。
3、将上述DNA序列外包至生物公司人工合成基因片段，并***至大肠杆菌质粒pET30a 当中构建表达载体pET30a/CagA+VacA。
4、将上述表达载体pET30a/CagA+VacA导入大肠杆菌BL21(DE3)感受态细胞，挑取单克隆菌株，在LB培养基中37℃培养并用0.2-1.0mM的IPTG诱导表达嵌合抗原CagA+VacA。
5、表达的嵌合抗原CagA+VacA为包涵体状态，用6至8摩尔/升的尿素溶液溶解包涵体，再用镍离子亲和层析柱亲和纯化嵌合抗原CagA+VacA。
6、上述纯化的嵌合抗原CagA+VacA利用梯度尿素浓度逐步透析的方法复性称为完整活性的蛋白，分装后-20℃冻存。
嵌合抗原CagA+VacA偶联聚苯乙烯羧基纳米微球的方法如下：
1、选取粒径为150-300纳米的聚苯乙烯羧基纳米微球，用pH为4.0-6.0的MES缓冲液将微球稀释至1％的固含量，再加入至终浓度0.1-1mM的EDC，在25-35℃下活化微球表面的羧基基团5-20分钟；
2、向活化的微球中滴加嵌合抗原CagA+VacA终浓度为：0.5-2.0mg/ml；然后25-35℃温育0.5-2小时；
3、然后加入BSA至终浓度0.5-1.0mg/ml，继续温育0.5-2小时进行封闭。
4、用细胞超声破碎仪在2-8℃条件下超声1-5分钟将凝聚的微球打散。
本发明可以特异性检测人血清中幽门螺杆菌高致病菌株抗体的试剂盒组成如下：试剂 -1、试剂-2和相应的盛放试剂-1、试剂-2的试剂瓶。其中：
试剂-1配方：
10mM-50mM Tris-HCl(pH7-9)
50mM-150mM NaCl
0.2％-2.0％PEG6000
0.01-0.1％Proclin300。
试剂-2配方：
10mM-50mM Tris-HCl(pH7-9)
0.2％-5％BSA
50-150mM NaCl
0.01％-0.05％已经偶联好嵌合抗原CagA+VacA的聚苯乙烯纳米微球
0.01-0.1％Proclin300。
用PCR方法检测20份胃部样本中幽门螺杆菌尿素酶UreB基因和毒素蛋白CagA和CacA基因，并同时用本发明可以特异性检测人血清中幽门螺杆菌高致病菌株抗体的试剂盒检测相应的血清样本，两者结果进行比较，以检验本发明可以特异性检测人血清中幽门螺杆菌高致病菌株抗体的试剂盒检测结果的准确度。检测结果如下表所示：
Figure RE-GDA0001988247940000091
上述20例胃镜样本中，UreB基因阳性13例，表明这13例样本均为幽门螺杆菌(Hp)阳性。这13例Hp阳性样本，CagA或VacA基因阳性样本5例，表明这5例样本感染的为致病性的幽门螺杆菌亚型，需要进行药物治疗。其余8例感染的为非致病性的Ⅱ型幽门螺杆菌。
从上述检测结果我们能够看出：在所有5例CagA或VacA基因阳性病人的血清中，本试剂盒检测结果也全部为阳性。表明本试剂盒对高致病型的幽门螺杆菌样本完全能够准确的检出。
最后应说明的几点是：首先，在本申请的描述中，需要说明的是，除非另有规定和限定，术语“安装”、“相连”、“连接”应做广义理解，可以是机械连接或电连接，也可以是两个元件内部的连通，可以是直接相连，“上”、“下”、“左”、“右”等仅用于表示相对位置关系，当被描述对象的绝对位置改变，则相对位置关系可能发生改变；
其次：在不冲突情况下，本发明同一实施例及不同实施例可以相互组合；
最后：以上所述仅为本发明的优选实施例而已，并不用于限制本发明，凡在本发明的精神和原则之内，所作的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。
Figure IDA0002348570940000011
Figure IDA0002348570940000021

Claims (8)

1.可检测幽门螺杆菌高致病菌株抗体试剂盒的制备方法，其特征在于：包括以下步骤：
步骤一、利用基因工程技术制备幽门螺旋杆菌细胞毒素蛋白CagA和幽门螺旋杆菌空泡细胞VacA；
步骤二、利用连接序列(Linker)将步骤一中的幽门螺旋杆菌细胞毒素蛋白CagA的肽段以及幽门螺旋杆菌空泡细胞VacA的肽段连接到一起成为一个完整的嵌合抗原；
步骤三、将步骤二中完整的嵌合抗原氨基酸序列按照大肠杆菌标准的密码子规则翻译成DNA序列；
步骤四、将步骤三中的DNA序列人工合成基因片段，并***至大肠杆菌质粒pET30a当中构建表达载体pET30a/CagA+VacA；
步骤五、将步骤四中的表达载体pET30a/CagA+VacA导入大肠杆菌BL21(DE3)感受态细胞，挑取单克隆菌株，在LB培养基中37℃培养并用0.2-1.0mM的IPTG诱导表达嵌合抗原CagA+VacA；
步骤六、表达的嵌合抗原CagA+VacA为包涵体状态，用6至8摩尔/升的尿素溶液溶解包涵体，再用镍离子亲和层析柱亲和纯化嵌合抗原CagA+VacA；
步骤七、上述纯化的嵌合抗原CagA+VacA利用梯度尿素浓度逐步透析的方法复性称为完整活性的蛋白，分装后-20℃冻存；
步骤八、嵌合抗原CagA+VacA偶联聚苯乙烯羧基纳米微球，从而制备成可以特异性检测人血清中幽门螺杆菌高致病菌株抗体的试剂盒。
2.如权利要求1所述的可检测幽门螺杆菌高致病菌株抗体试剂盒的制备方法，其特征在于：步骤一中选取幽门螺旋杆菌细胞毒素蛋白CagA上的肽段氨基酸序列如下：
AFIKVDNAVASFDPDQKPIVDKNDRDNRQAFEKISQLREEYANKAIKNPAKKNQYFSDFINKSNDLINKDNLIAVDSSVESFKKFGDQRYQIFTSWVSLQKDPSKINTQQIRNFMENIIQPPISDDKEKAEFLRSAKQSFAGIIIGNQIRSDEKFMGVFDESLKARQEAEKNEEPTGGDWLDIFLSFVFNKKQSSDLKETLNQEPRPDFEQNLATTTTDIQGLPPEARDLLDERGNFFKFTLGDVEMLDVEGVADKDPNYKFNQLLIHNN。
3.如权利要求1所述的可检测幽门螺杆菌高致病菌株抗体试剂盒的制备方法，其特征在于：步骤一中选取幽门螺旋杆菌空泡细胞毒素蛋白VacA上的肽段氨基酸序列为：HYWVKGGQWNKLEVDMKDAVGTYKLSGLRNFTGGDLDVNMQKATLRLGQFNGNSFTSFKDSADRTTRVDFNAKNISIDNFLEINNRVGSGAGRKASSTVLTLQASEGITSGKNAEISLYDGATLNLASNSVKLMGNVWMGRLQYVGAYLAPSYSTINTSKVTGEVNFNHLTVGDHNAAQAGIIASKKTYIGTLDLWQSAGLNIIAPPEGGYKDKPNNTNSQSGAKNDKNESAKNDKQDSN。
4.如权利要求1所述的可检测幽门螺杆菌高致病菌株抗体试剂盒的制备方法，其特征在于：步骤二中选取连接序列(Linker)氨基酸序列如下：GGGGSGGGGSGGGG。
5.如权利要求1所述的可检测幽门螺杆菌高致病菌株抗体试剂盒的制备方法，其特征在于：所述步骤二中完整的嵌合抗原氨基酸序列如下：HYWVKGGQWNKLEVDMKDAVGTYKLSGLRNFTGGDLDVNMQKATLRLGQFNGNSFTSFKDSADRTTRVDFNAKNISIDNFLEINNRVGSGAGRKASSTVLTLQASEGITSGKNAEISLYDGATLNLASNSVKLMGNVWMGRLQYVGAYLAPSYSTINTSKVTGEVNFNHLTVGDHNAAQAGIIASKKTYIGTLDLWQSAGLNIIAPPEGGYKDKPNNTNSQSGAKNDKNESAKNDKQDSNGGGGSGGGGSGGGGSAFIKVDNAVASFDPDQKPIVDKNDRDNRQAFEKISQLREEYANKAIKNPAKKNQYFSDFINKSNDLINKDNLIAVDSSVESFKKFGDQRYQIFTSWVSLQKDPSKINTQQIRNFMENIIQPPISDDKEKAEFLRSAKQSFAGIIIGNQIRSDEKFMGVFDESLKARQEAEKNEEPTGGDWLDIFLSFVFNKKQSSDLKETLNQEPRPDFEQNLATTTTDIQGLPPEARDLLDERGNFFKFTLGDVEMLDVEGVADKDPNYKFNQLLIHNN。
6.如权利要求1所述的可检测幽门螺杆菌高致病菌株抗体试剂盒的制备方法，其特征在于：所述步骤三中完整的DNA序列如下：CATTATTGGGTCAAAGGCGGGCAATGGAACAAGCTTGAAGTGGATATGAAAGATGCTGTAGGGACTTATAAACTTTCAGGGCTAAGAAACTTTACCGGTGGGGATTTAGATGTGAATATGCAAAAAGCCACTTTGCGTTTGGGCCAATTCAATGGCAATTCTTTCACAAGCTTTAAGGATAGCGCTGATCGCACCACGAGAGTGGATTTCAACGCTAAAAATATCTCAATTGATAATTTTTTAGAAATCAATAATCGCGTGGGTTCTGGAGCCGGTAGGAAGGCTAGCTCTACGGTTTTAACTTTGCAAGCTTCAGAGGGGATCACTAGCGGTAAAAATGCGGAAATTTCTCTTTATGATGGCGCCACGCTTAATTTGGCTTCAAACAGCGTTAAATTAATGGGTAATGTGTGGATGGGCCGTTTGCAGTATGTGGGAGCGTATTTGGCCCCTTCATACAGCACGATAAACACTTCAAAAGTGACAGGGGAAGTGAATTTTAACCATCTCACTGTGGGCGATCACAACGCCGCTCAAGCAGGGATTATTGCCAGTAAAAAGACTTATATTGGCACACTGGATTTGTGGCAAAGCGCAGGGTTAAACATTATCGCCCCTCCAGAAGGTGGTTATAAGGATAAACCTAATAATACCAATTCTCAAAGTAGTGCTAAAAATGACAAAAATGAAAGTGCTAAAAACGACAAACAAGATAGTAACGGTGGCGGTGGAAGCGGCGGTGGCGGAAGCGGCGGTGGCGGCAGCGCTTTTATTAAAGTTGATAACGCTGTCGCTTCATTTGATCCTGATCAAAAACCAATCGTTGATAAGAATGATAGGGATAATAGGCAAGCTTTTGAGAAAATCTCGCAACTAAGGGAAGAATACGCCAATAAAGCGATCAAAAATCCTGCCAAAAAAAATCAGTATTTTTCAGACTTTATCAATAAGAGCAATGATTTGATCAACAAAGACAATCTCATTGCTGTAGATTCTTCCGTAGAGAGCTTTAAGAAATTTGGGGATCAGCGTTACCAAATTTTTACGAGTTGGGTGTCCCTTCAAAAAGATCCGTCTAAAATCAACACACAACAAATCCGAAATTTTATGGAAAATATCATACAACCCCCTATCTCTGATGATAAAGAAAAAGCGGAGTTTTTGAGGTCTGCCAAACAATCTTTTGCAGGAATTATCATAGGAAACCAAATCCGATCGGATGAAAAATTCATGGGCGTGTTTGATGAATCTTTGAAAGCAAGGCAAGAAGCAGAAAAAAATGAAGAGCCTACTGGTGGGGATTGGCTTGATATTTTTTTATCATTTGTGTTTAACAAAAAACAATCTTCCGATCTCAAAGAAACGCTCAATCAAGAGCCAAGGCCTGATTTTGAACAAAATTTAGCCACTACCACCACCGACATACAAGGCTTACCGCCTGAAGCTAGAGATTTGCTTGATGAAAGGGGTAATTTTTTTAAATTCACTCCTGGTGATGTGGAGATGTTGGATGTTGAGGGAGTCGCTGACAAGGATCCCAATTACAAGTTCAATCAATTATTGATCCACAATAACGCT。
7.如权利要求1所述的可检测幽门螺杆菌高致病菌株抗体试剂盒的制备方法，其特征在于：步骤八中，嵌合抗原CagA+VacA偶联聚苯乙烯羧基纳米微球的方法如下：
第一步、选取粒径为150-300纳米的聚苯乙烯羧基纳米微球，用pH为4.0-6.0的MES缓冲液将微球稀释至1％的固含量，再加入至终浓度0.1-1mM的EDC，在25-35℃下活化微球表面的羧基基团5-20分钟；
第二步、向活化的微球中滴加嵌合抗原CagA+VacA至浓度为：0.5-2.0mg/ml；然后25-35℃温育0.5-2小时；
第三步、加入BSA至浓度0.5-1.0mg/ml，继续温育0.5-2小时进行封闭；
第四步、用细胞超声破碎仪在2-8℃条件下超声1-5分钟将凝聚的微球打散。
8.如权利要求1所述的可检测幽门螺杆菌高致病菌株抗体试剂盒的制备方法，其特征在于：步骤八中可以特异性检测人血清中幽门螺杆菌高致病菌株抗体的试剂盒包括试剂-1、试剂-2和相应的盛放试剂-1、试剂-2的试剂瓶，其中试剂-1、试剂-2的配方如下：
试剂-1配方：
10mM-50mM Tris-HCl(pH7-9)；
50mM-150mM NaCl；
0.2％-2.0％PEG6000；
0.01-0.1％Proclin300；
试剂-2配方：
10mM-50mM Tris-HCl(pH7-9)；
0.2％-5％BSA；
50-150mM NaCl；
0.01％-0.05％已经偶联好嵌合抗原CagA+VacA的聚苯乙烯纳米微球；
0.01-0.1％Proclin300。
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Cited By (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN113005133A (zh) * 2021-03-11 2021-06-22 中南大学湘雅三医院 VacA重组蛋白的制备、复性和保存方法

Citations (4)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN1800413A (zh) * 2005-01-04 2006-07-12 上海第二医科大学附属仁济医院 幽门螺杆菌致病岛疾病基因检测芯片
CN101775094A (zh) * 2010-01-26 2010-07-14 宁波美康生物科技有限公司 用于免疫检测技术的表面带羧基的聚苯乙烯胶乳的制备方法
CN101905018A (zh) * 2010-04-06 2010-12-08 中国人民解放军第三军医大学 治疗和预防幽门螺杆菌感染的重组融合蛋白疫苗及减毒活菌载体疫苗
CN104360086A (zh) * 2014-12-05 2015-02-18 重庆中元生物技术有限公司 一种可溶性瘦素受体的胶乳增强免疫比浊检测试剂盒

Patent Citations (4)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN1800413A (zh) * 2005-01-04 2006-07-12 上海第二医科大学附属仁济医院 幽门螺杆菌致病岛疾病基因检测芯片
CN101775094A (zh) * 2010-01-26 2010-07-14 宁波美康生物科技有限公司 用于免疫检测技术的表面带羧基的聚苯乙烯胶乳的制备方法
CN101905018A (zh) * 2010-04-06 2010-12-08 中国人民解放军第三军医大学 治疗和预防幽门螺杆菌感染的重组融合蛋白疫苗及减毒活菌载体疫苗
CN104360086A (zh) * 2014-12-05 2015-02-18 重庆中元生物技术有限公司 一种可溶性瘦素受体的胶乳增强免疫比浊检测试剂盒

Non-Patent Citations (4)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
NCBI: "cytochrome c oxidase subunit II, partial [Helicobacter pylori]", 《NCBI GENBANK DATABASE》 *
张丽萍等: "幽门螺杆菌细胞毒素相关基因A、空泡毒素基因A抗体与胃十二指肠疾病的关系", 《兰州大学学报(医学版)》 *
林珊珊等: "幽门螺杆菌vacA毒性片段与cagA融合基因的构建与表达", 《中国***共患病杂志》 *
王保宁等: "重组幽门螺杆菌多表位疫苗工程菌株的构建及其微生物学特性研究", 《四川大学学报(医学版)》 *

Cited By (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN113005133A (zh) * 2021-03-11 2021-06-22 中南大学湘雅三医院 VacA重组蛋白的制备、复性和保存方法

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