CN110845619B - 一种识别氟苯尼考、氯霉素和甲砜霉素的单克隆抗体及其应用 - Google Patents

一种识别氟苯尼考、氯霉素和甲砜霉素的单克隆抗体及其应用 Download PDF

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Abstract

本发明实施例公开了一种识别氟苯尼考、氯霉素和甲砜霉素的单克隆抗体及其应用，所述单克隆抗体由保藏编号为CCTCC NO:C2019152的氟苯尼考FF 3C11细胞株分泌得到；本发明上述单克隆抗体能够同时与氟苯尼考、氯霉素和甲砜霉素特异性结合，能够用于氟苯尼考、氯霉素和甲砜霉素中任意一种或多种的同时检测，且上述单克隆抗体特异性强，检测灵敏度较高。

Description

一种识别氟苯尼考、氯霉素和甲砜霉素的单克隆抗体及其 应用
技术领域
本发明实施例涉及检测技术领域，具体涉及一种识别氟苯尼考、氯霉素和甲砜霉素的单克隆抗体及其应用。
背景技术
氟苯尼考是酰胺醇类第3代动物专用抗菌药，具有广谱、高效、吸收好、体内分布广、无致再生障碍性贫血作用等特点，作为氯霉素的替代药物被广泛用于治疗畜禽的细菌性疾病。研究表明，氟苯尼考、氯霉素、甲砜霉素具有胚胎毒性和耐药性，在畜禽生产上的大量应用也导致其在畜禽产品中残留，危害公众健康。欧盟、日本等国均制定了动物食品中氟苯尼考、氯霉素、甲砜霉素的最大残留量标准，中国农业部235号公告也对其残留限量做出了严格规定，家禽肌肉中氟苯尼考(FF)最高残留限量为100μg/kg，氯霉素Chloramphenico(CAP)及其盐、酯在所有食品动物可食用组织中不得检出，甲砜霉素Thiamphenicol(TAP)在家禽肌肉中最高残留限量为50μg/kg。
目前，抗生素的检测方法有多种，仪器方法主要有薄层色谱法(TLC)、气相色谱法(GC)、高压液相色谱法(HPLC)和各种联用技术如气质联用(GC-MS)、液质联用(HPLC-MS)等；快速方法主要是基于免疫化学基础上的免疫分析方法如免疫亲合柱-荧光检测(IAC-FLD)、酶联免疫吸附法(ELlSA)和胶体金免疫层析方法等。
确认方法测定的结果准确，但是仪器设备价格昂贵，前处理过程复杂、操作繁琐、效率低，成本极高，因此不适用于大规模样本的筛查和日常的内控检测。快速方法酶联免疫吸附法ELISA法和胶体金快速检测卡是企业常用的快速检测方法，但也均存在各自的优缺点：ELISA方法能灵敏度相对较高，且能定量检测，但操作的过程相对复杂，步骤较多，检测时间较长，对环境和人员要求高，环境和基质干扰严重，且需要使用标准品，对操作人员危害比较大；胶体金检测卡可以满足现场快速的要求，能在5-10min内快速测定，但是只能定性，定量的范围很窄，且灵敏度较低，家禽肉眼观察主观性较强，重复性差。
发明内容
为此，本发明实施例提供一种识别氟苯尼考、氯霉素和甲砜霉素的单克隆抗体，该单克隆抗体能够同时与氟苯尼考、氯霉素和甲砜霉素特异性结合，因此能够将上述单克隆抗体用于氟苯尼考、氯霉素和甲砜霉素中任意一种或多种的检测中，而且检测灵敏度较高。
为了实现上述目的，本发明实施例提供如下技术方案：
根据本发明实施例的第一方面提供一种识别氟苯尼考、氯霉素和甲砜霉素的单克隆抗体，所述单克隆抗体由保藏编号为CCTCC NO:C2019152的氟苯尼考FF 3C11细胞株分泌得到。
本发明上述单克隆抗体能够同时与氟苯尼考、氯霉素和甲砜霉素特异性结合，能够检测氟苯尼考、氯霉素和甲砜霉素中任意一种或多种。
根据本发明实施例的第二方面提供一种上述单克隆抗体在氟苯尼考、氯霉素和甲砜霉素检测中的应用。
根据本发明实施例的第三方面提供一种检测肉类中氟苯尼考、氯霉素和甲砜霉素残留的检测卡，所述检测卡包括底板、样品垫、结合垫、基膜和吸水垫，所述结合垫中含有量子点标记的单克隆抗体，所述量子点标记的单克隆抗体中的单克隆抗体由保藏编号为CCTCC NO:C2019152的氟苯尼考FF 3C11细胞株分泌得到，所述基膜上分别设置有检测线和控制线，所述控制线上包被有羊抗鼠IgG的抗体，所述检测线上包被有氯霉素全抗原。
本发明上述检测卡通过选择特定单克隆抗体以及采用量子点进行标记，能够快速、准确、定量地检测肉类中的氟苯尼考、氯霉素和甲砜霉素的残留。
进一步地，所述量子点为ZnS核/CdSe复合量子点。本发明选择ZnS核/CdSe复合量子点，荧光强度高，量子点效率级数为0.5，稳定性好，且可以耐受多次激发；量子点的吸收光谱宽且连续，可实现一元激发，多元发射，适合于多色标记能够发射红光，且耐受时间长的效果，能够更好的提高检测卡的检测效果。
进一步地，所述量子点标记的单克隆抗体通过如下方法制得：
(a)将量子点进行清洗、活化；
(b)将活化的量子点微球与单克隆抗体混匀、孵育；
(c)将向孵育后的混合物中添加封闭液、再次孵育、离心、收集沉淀并重悬，即得所述量子点标记的单克隆抗体。
进一步地，所述活化具体包括如下步骤：
将N-羟基琥珀酰亚胺(NHS)和N，N′-二环己基碳二亚胺(DCC)分别溶解于pH 6.050mM MES的缓冲液中，分别得到NHS溶液和DCC的溶液；随后，在清洗后的量子点中添加NHS溶液并混匀，再添加DCC溶液并混匀，然后室温孵育20-30min、离心去掉上清液、重悬即可。
进一步地，所述NHS和DCC的溶液的浓度均为20mg/ml；所述NHS溶液、DCC溶液和量子点的体积比是1∶1∶2。
进一步地，所述结合垫通过如下方法制得：
将含有0.5％Triton X-100、0.5％丙氨酸、0.05％NaN3的pH9.0 0.01M PBS缓冲液喷涂到结合垫上，烘干；随后，将量子点标记的单克隆抗体喷涂到烘干后的结合垫上，干燥即可。
进一步地，所述样品垫通过如下方法制得：
将含有0.5％Triton X-100、0.5％BSA的pH9.0 0.01M PBS缓冲液喷涂到样品垫上，烘干即可。
进一步地，所述全抗原通过如下方法制得：
将氯霉素与琥珀酸酐溶于无水吡啶中在60℃回流24h，随后氮吹去除吡啶，再采用乙酸乙酯进行复溶，静置分层，进行洗涤得到衍生溶液；再将衍生溶液进行减压浓缩、避光真空干燥得到半抗原；采用N，N-二甲基甲酰胺溶解半抗原，再加入N-羟基琥珀酰亚胺和N-N-二环己基碳酰亚胺，室温避光搅拌反应，即得活化中间产物；随后将活化中间产物在搅拌下逐滴加到含10mg载体蛋白的1ml PBS缓冲液中进行搅拌反应、透析，即得全抗原。
进一步地，所述载体蛋白为牛血清白蛋白或齿孔血蓝蛋白。
根据本发明实施例的第四方面提供一种肉类中氟苯尼考、氯霉素和甲砜霉素残留的检测方法，所述检测方法采用上述检测卡进行检测；
所述检测方法包括将样品置入乙酸乙酯水溶液中进行提取，取上清液进行氮气吹干，再采用样品稀释液进行复溶得到混合溶液，再将混合溶液用于检测；所述样品稀释液包括如下重量份组分：磷酸二氢钾0.6g、氯化钾0.3g、十二水磷酸氢二钠7.5g、氯化钠4.5g和蒸馏水0.5L。
本发明实施例具有如下优点：
(1)本发明采用免疫学、化学、生物技术、计算机软件、食品科学等几大学科交叉合作，本发明制备的基于量子点标记的同时定量检测肉类中氟苯尼考、氯霉素、甲砜霉素残留的检测卡，可同时快速、准确、定量地检测家禽肉类中氟苯尼考、氯霉素、甲砜霉素残留，解决了现有技术中利用一种抗体和抗原即可同时定量检测三种抗生素的瓶颈。
(2)本发明检测卡采用量子点标记单克隆抗体，包被原采用琥珀酸酐法偶联载体蛋白的氯霉素全抗原，满足氟苯尼考、氯霉素、甲砜霉素三种物质的同时定量检测。
(3)本发明检测卡可以快速、灵敏、准确的同时定量检测家禽肉类中氟苯尼考、氯霉素、甲砜霉素残留，大大缩短了检测时间，减少了操作步骤，而且各原料制作简单，降低了成本，为现场检测提供了方便；此外，本发明检测卡稳定性好，保存时间较长。
附图说明
为了更清楚地说明本发明的实施方式或现有技术中的技术方案，下面将对实施方式或现有技术描述中所需要使用的附图作简单地介绍。显而易见地，下面描述中的附图仅仅是示例性的，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动的前提下，还可以根据提供的附图引伸获得其它的实施附图。
图1为本发明实施例2提供的识别氟苯尼考、氯霉素和甲砜霉素的单克隆抗体的纯度鉴定图；
图2为本发明实验例1提供的检测卡检测氯霉素的标准曲线；
图3为本发明实验例1提供的检测卡检测氟苯尼考重金属镉的标准曲线；
图4为本发明实验例1提供的检测卡检测甲砜霉素的标准曲线。
具体实施方式
以下由特定的具体实施例说明本发明的实施方式，熟悉此技术的人士可由本说明书所揭露的内容轻易地了解本发明的其他优点及功效，显然，所描述的实施例是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。
实施例1
本实施例为氯霉素全抗原的制备方法，该制备方法包括如下步骤：
将氯霉素0.3g、琥珀酸酐2g搅拌溶于2.25ml无水吡啶中，60℃回流反应24h，氮吹去除吡啶，用5ml乙酸乙酯复溶蒸干物，转至分液漏斗中，待溶液分层后，用0.5mol/L HCl2ml洗涤3次，得到衍生溶液；减压浓缩上述溶液，避光真空干燥20h后得到半抗原；
用0.5ml的N，N-二甲基甲酰胺溶解5mg的半抗原，再加入10mg N-羟基琥珀酰亚胺和10mg N-N-二环己基碳酰亚胺，室温避光搅拌2h，即得活化中间产物；
将活化中间产物在搅拌下逐滴加到含10mg牛血清白蛋白的1ml PBS中，搅拌1h后转至4℃下搅拌6h；最后用p H7.4 0.01mol/L PBS透析，每1h换液1次，透析2d，即得氯霉素全抗原。
将蛋白、氯霉素标准品、氯霉素全抗原用0.01Mpbs配制成1mg/ml溶液，进行紫外扫描鉴定；蛋白在280nm处有强吸收峰，氯霉素标准品在270nm处有吸收峰，氯霉素全抗原吸收峰兼具蛋白和氯霉素标准品吸收峰的特征，故氯霉素-BSA免疫全抗原偶联成功。
实施例2
本实施例为识别氟苯尼考、氯霉素和甲砜霉素的单克隆抗体的制备方法，包括如下步骤：
将保藏编号为CCTCC NO:C2019152，保藏单位为中国典型培养物保藏中心，保藏地址为中国.武汉.武汉大学，保藏日期为2019年7月4日的氟苯尼考FF 3C11细胞株从液氮罐内快速取出一管后迅速放至37℃水中融化，完全融化后1000转离心3分钟，酒精擦拭消毒放置无菌工作台操作，弃上清，用600ul HT培养基悬浮管内细胞，转至24孔培养板中，放至37℃CO2培养箱中培养；
腹水制备：单克隆抗体的生产采用动物体内腹水诱生法，按照0.5ml矿物油/只小鼠的用量制敏，制敏后7至10天将至80％满时的细胞打入小小鼠腹腔，按照100万/只的数量注入，稀释液为无菌生理盐水，7至10天取腹水；
单克隆抗体的纯化：采用SPG柱法对腹水进行纯化，得到识别氟苯尼考、氯霉素和甲砜霉素的单克隆抗体。
按常规操作，抗体纯度鉴定结果如图1所示；
由图1可知，泳道1为纯化后的识别氟苯尼考、氯霉素和甲砜霉素的单克隆抗体SDS-PAGE电泳观察到25KD和55KD的清晰条带，分别是抗体的轻链和重连，并无杂带，表明抗体纯度达到95％以上。
实施例3
本实施例为量子点标记的单克隆抗体的制备方法，该制备方法包括：
一、量子点微球的清洗
选取100ul ZnS核/CdSe复合量子点微球(来源于山东绿都生物科技有限公司，批号为LD028-L)，并添加900ul标记缓冲液(50mM MES,pH 6.0)；随后，以17000rpm离心20min，去掉上清，用1000ul标记缓冲液重悬量子点微球；
二、微球活化
分别称取20mg NHS和DCC，采用标记缓冲液溶解，得到浓度为20mg/ml NHS溶液和DCC溶液；
取50ul NHS溶液，加入到清洗后的微球中，快速混匀；然后再取50ul DCC溶液加入到微球中，快速混匀，室温孵育25min，以17000rpm离心20min，去掉上清，再用1000ul标记缓冲液重悬微球；
三、量子点微球与单克隆抗体偶联
取0.1mg实施例2制备得到的单克隆抗体于2ml离心管中，加入活化后的微球，快速混匀后，室温孵育3h；随后加入100ul封闭液(20mg/ml的BSA溶液，即称取20mg BSA，用终浓度100mM乙醇胺溶液充分溶解)，室温孵育1h，再以17000rpm离心20min，去掉上清，用1000ul稀释液(稀释液为0.01M PB，pH6.0、5％酪蛋白、1％葡萄糖、1.5％丙氨酸、0.05％NaN3)重悬微球，即得到量子点标记的单克隆抗体。
实施例4
本实施例为结合垫的制备方法，该制备方法包括：
选择聚酯纤维6618作为结合垫，切割成0.6cm×30cm的条子；
将处理液A为含有0.5％Triton X-100、0.5％丙氨酸、0.05％NaN3的pH9.00.01MPBS缓冲液按照10μL/cm机喷到未处理的结合垫上，37℃烘干，备用；
将实施例3中制备得到的1mg/ml(以量子点质量计算)的量子点标记的单克隆抗体用划膜仪按照10μL/cm机喷到处理好的结合垫上，以室温自然晾干，制得结合垫。
实施例5
本实施例为样品垫的制备方法，该制备方法包括：
选择HD67为样品垫，切割成2cm×30cm的条子；
将处理液B为含有0.5％Triton X-100、0.5％BSA的pH9.0 0.01M PBS缓冲液，按照20μL/cm机喷到未处理的样品垫上，37℃烘干，得到样品垫。
实施例6
本实施例为基膜的制备方法，该制备方法包括：
质控线和检测线使用浓度的标准依据是：T/C＝1.0-2.0；T值＝200-500；C值＝200-500；
分别将实施例1制备的氯霉素全抗原和羊抗鼠IgG的抗体(山东绿都生物科技有限公司，产品批号为LDEK023)作为检测线和控制线划在NC膜上，用划膜仪依次以0.5μL/cm的浓度划在NC膜上，其中氯霉素全抗原浓度为0.02mg/ml，羊抗鼠IgG的抗体的浓度为0.01mg/ml，37℃包被2h后，室温自然晾干，制成基膜。
实施例7
本实施例为一种检重金属镉残留的检测卡，该检测卡包括底板、样品垫、结合垫、基膜和吸水垫，所述结合垫为实施例4中制备得到的结合垫；所述样品垫为实施例5中制备得到的样品垫；所述基膜为实施例6中制备得到的基膜。
实施例8
本实施例为上述实施例7中检测卡的使用方法：
使用前将样品稀释液恢复至室温，其中样品稀释液为包括如下重量份组分：磷酸二氢钾0.6g、氯化钾0.3g、十二水磷酸氢二钠7.5g、氯化钠4.5g和蒸馏水0.5L；
提前打开孵育器预热到37℃；
拉出孵育器槽，将检测卡平放于孵育器槽内靠里侧，用移液器吸取100微升待检样品溶液到检测卡的加样孔中静止10秒，然后将槽推进孵育器内孵育；
记时8min，孵育完毕后取出检测卡，请于2分钟内读数；
读数前5分钟打开量子点免疫分析仪到主界面，见图2，将检测卡***量子点分析仪中，点击项目与样品测试，选择样品类型，即时检测，结果将呈现于读数仪显示屏上，可按打印获得纸质的检测报告。
实施例9
本实施例为一种猪肉中氟苯尼考、氯霉素和甲砜霉素残留的检测方法；
所述检测方法包括：抽取50份已知阴性猪肉，50份已知阳性猪肉，称取猪肉5.0g±0.05g至50mL离心管中，加入5mL去离子水和10mL乙酸乙酯，震荡提取1min；4000rpm离心5min；小心取出1mL上清液至另一离心管，于50-60℃氮气吹干(勿取到中间层，吹干至尽头可能存有油滴，油滴不用吹干)；加入1mL样品稀释液复溶，混匀，取100μL，并采用实施例7中的检测卡进行分析，其中，样品稀释液包括如下重量份组分：磷酸二氢钾0.6g、氯化钾0.3g、十二水磷酸氢二钠7.5g、氯化钠4.5g和蒸馏水0.5L。
检测结果为假阴性为0％，假阳性率0％，由此可知，该样品稀释液适用于猪肉中氟苯尼考、氯霉素和甲砜霉素残留的样本前处理检测。
对照例1
本对照例为一种猪肉中氟苯尼考、氯霉素和甲砜霉素残留的检测方法，该检测方法与实施例9中检测方法基本相同，区别仅在于将样品稀释液替换为磷酸二氢钾1.0g、氯化钾0.3g、十二水磷酸氢二钠12g、氯化钠9g和蒸馏水0.5L。
检测结果为假阳性率为15％；由检测结果可知，采用该样品稀释液存在假阳现象。
对照例2
本对照例为一种猪肉中氟苯尼考、氯霉素和甲砜霉素残留的检测方法，该检测方法与实施例9中检测方法基本相同，区别仅在于将样品稀释液替换为磷酸二氢钾0.6g、氯化钾0.3g、十二水磷酸氢二钠7.5g、氯化钠2.5g和蒸馏水0.5L；。
检测结果为假阴性率为8％；由检测结果可知，采用该样品稀释液存在假阴现象。
实验例1
本实验例为确定实施例7中检测卡的标准曲线
一、氯霉素
取空白鸡胸肉5.0g，分别添加系列浓度CAP标准物质，分别为0μg/kg，0.2μg/kg，0.3μg/kg，1μg/kg，2μg/kg，3μg/kg，6μg/kg，10μg/kg；采用实施例7中的检测卡进行检测，读取t/c比值，以氯霉素标准物质系列浓度为横坐标，以t/c比值为纵坐标，选择线性最好的5个点作为横纵标绘制标准曲线，见图2；
由图2可知，氯霉素线性R：0.9844，曲线方程：y＝-1.4932x－0.154。
二、氟苯尼考
取空白鸡胸肉5.0g，分别添加系列浓度FF标准物质，分别为0μg/kg，1μg/kg，3μg/kg，5μg/kg，20μg/kg，30μg/kg，120μg/kg；采用实施例7中的检测卡进行检测，读取t/c比值，以氟苯尼考标准物质系列浓度为横坐标，以t/c比值为纵坐标，选择线性最好的5个点作为横纵标绘制标准曲线，见图3；
由图3可知，氟苯尼考线性R：0.9992，曲线方程：y＝-1.7370x+1.6723。
三、甲砜霉素
取空白鸡胸肉5.0g，分别添加系列浓度TAP标准物质，分别为0μg/kg，1μg/kg，3μg/kg，5μg/kg，20μg/kg，30μg/kg，100μg/kg；采用实施例7中的检测卡进行检测，读取t/c比值，以甲砜霉素标准物质系列浓度为横坐标，以t/c比值为纵坐标，选择线性最好的5个点作为横纵标绘制标准曲线，见图4；
由图4可知，甲砜霉素线性R：0.9985，曲线方程：y＝-1.7435x+1.6136。
实验例2
本实验例为实施例7中检测卡的准确度和精密度的研究
准确度是指测得值与真值的符合程度，准确度常以回收率表示，精密度常以变异系数来表示。将同时定量检测家禽肉类中氟苯尼考、氯霉素、甲砜霉素残留的检测卡按下表浓度进行添加，每个浓度各5个平行；计算平均值、添加回收率以及变异系数，检测结果如表1所示：
表1
Figure GDA0002362834790000101
Figure GDA0002362834790000111
由表1可知，各添加浓度的平均回收率均在93％～98％之间，各添加浓度的批内变异系数小于5％，批间变异系数小于国标法要求的20％。
实验例3
将实施例7中的检测卡，分别放置于37℃和4℃，分别在0天、7天、14天、21天、30天、6个月、12个月、15个月进行检测，检测结果如表2所示；
表2
Figure GDA0002362834790000112
由表2可知，37℃加速破坏检测卡的稳定性，本发明检测卡在4℃的保质期为至少12个月，具有较好的稳定性。
虽然，上文中已经用一般性说明及具体实施例对本发明作了详尽的描述，但在本发明基础上，可以对之作一些修改或改进，这对本领域技术人员而言是显而易见的。因此，在不偏离本发明精神的基础上所做的这些修改或改进，均属于本发明要求保护的范围。

Claims (7)

1.一种检测肉类中氟苯尼考、氯霉素和甲砜霉素残留的检测卡，其特征在于，所述检测卡包括底板、样品垫、结合垫、基膜和吸水垫，所述结合垫中含有量子点标记的单克隆抗体，所述量子点标记的单克隆抗体由保藏编号为CCTCC NO:C2019152的氟苯尼考FF 3C11细胞株分泌得到，所述基膜上分别设置有检测线和控制线，所述控制线上包被有羊抗鼠IgG的抗体，所述检测线上包被有氯霉素全抗原；所述量子点为ZnS核/CdSe复合量子点。
2.根据权利要求1所述的检测卡，其特征在于，所述量子点标记的单克隆抗体通过如下方法制得：（a）将量子点进行清洗、活化；
（b）将活化的量子点微球与单克隆抗体混匀、孵育；
（c）将向孵育后的混合物中添加封闭液、再次孵育、离心、收集沉淀并重悬，即得所述量子点标记的单克隆抗体。
3.根据权利要求2所述的检测卡，其特征在于，所述活化具体包括如下步骤：将NHS 和DCC分别溶解于pH 6.0 50mM MES的缓冲液中，分别得到NHS溶液和DCC的溶液；随后，在清洗后的量子点中添加NHS溶液并混匀，再添加DCC溶液并混匀，然后室温孵育20-30min、离心去掉上清液、重悬即可。
4.根据权利要求3所述的检测卡，其特征在，所述NHS 和 DCC的溶液的浓度均为20mg/ml；所述NHS溶液、DCC溶液和量子点的体积比是1∶1∶2。
5.根据权利要求1所述的检测卡，其特征在于，所述结合垫通过如下方法制得：将含有0.5 %Triton X-100、0.5%丙氨酸、0.05% NaN3的pH9.0 0.01M PBS缓冲液喷涂到结合垫上，烘干；随后，将量子点标记的单克隆抗体喷涂到烘干后的结合垫上，干燥即可。
6.根据权利要求1所述的检测卡，其特征在于，所述样品垫通过如下方法制得：将含有0.5%Triton X-100、0.5 %BSA 的pH9.0 0.01 M PBS缓冲液喷涂到样品垫上，烘干即可。
7.一种肉类中氟苯尼考、氯霉素和甲砜霉素残留的检测方法，其特征在于，采用权利要求1-6任一所述的检测卡进行检测；所述检测方法包括将样品置入乙酸乙酯水溶液中进行提取，取上清液进行氮气吹干，再采用样品稀释液进行复溶得到混合溶液，再将混合溶液用于检测；所述样品稀释液包括如下重量份组分：磷酸二氢钾0.6g、氯化钾0.3g、十二水磷酸氢二钠7.5g、氯化钠4.5g和蒸馏水0.5L。
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