CN110836892B - 衍射超分辨显微成像方法及*** - Google Patents

衍射超分辨显微成像方法及*** Download PDF

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Abstract

本申请涉及一种显微成像方法及***。上述显微成像方法，利用衍射超分辨元件生成(大于等于2个)的阵列光斑。其中，所述阵列光斑成像于显微成像***的物面，以实现对成像物体的照明，进而提高成像效率。利用所述阵列光斑对成像物体进行扫描，并获取被扫描后的所述成像物体的图像信息，并根据所述图像信息，进行图像的重构。本申请的显微成像方法利用衍射超分辨元件调制照明光束生成超分辨的阵列光斑，能够突破光学***的衍射极限，实现光学超分辨成像，且超分辨能力可调。

Description

衍射超分辨显微成像方法及***
技术领域
本申请涉及显微镜成像领域，特别是涉及一种衍射超分辨显微成像方法及***。
背景技术
与电子显微镜相比，光学显微镜可以对生物样品在生理条件下进行实时动态的快速成像，已成为生命科学研究者们至关重要的研究工具。然而由于光学衍射极限的存在，使得光学显微镜的最高分辨率被限制在半个波长附近，这样的分辨率严重阻碍了生命科学研究者在亚波长尺度上进行更精细的研究。突破光学衍射极限已经成为超精密加工、超精密检测和生命科学研究等领域亟需解决的核心问题。共聚焦激光扫描显微镜(CLSM)、受激发射损耗荧光显微镜(STED)、随机光学重建显微镜(STORM)、结构光照明显微镜(SIM)和光激活定位显微镜(PLAM)等多种超分辨技术得到了广泛的应用。因此，2014年诺贝尔化学奖授予美国科学家埃里克·白兹格(Eric Betzig)、美国科学家威廉姆·艾斯科·莫尔纳尔(W.E.Moerner)和德国科学家斯特凡·W·赫尔(Stefan W.Hell)，以表彰他们在超分辨率荧光显微技术领域取得的成就。
以上几种超分辨技术中，CLSM是利用单点扫描物体实现超分辨重构，但超分辨能力受限且不可调控；SIM是利用结构光将高频信息加载到图像中，经重建后得到超分辨图像，但受到视场的限制且分辨率最多提高一倍；STED和STORM 则是利用荧光分子的受激辐射与自发荧光的光波不同而使点扩散函数被压缩，而不是通过直接改进光学***得到突破衍射极限的聚焦光斑。
发明内容
基于此，提供了一种衍射超分辨显微成像方法及***。
一种衍射超分辨显微成像方法，包括：
S10，利用衍射超分辨元件生成阵列光斑，所述阵列光斑成像于衍射超分辨显微成像***的物面；
S20，利用所述阵列光斑对成像物体进行扫描；
S30，获取被扫描后的所述成像物体的图像信息，并根据所述图像信息，进行图像的重构。
在其中一个实施例中，所述S20，利用所述阵列光斑对成像物体进行扫描的步骤包括：
将所述成像物体置于所述平移台；
利用所述平移台带动所述成像物体，从所述阵列光斑的初始位置移动至所述阵列光斑的终点位置，所述平移台的移动距离满足奈奎斯特采样定理。
在其中一个实施例中，所述平移台的移动方式为水平方向扫描式、竖直方向扫描式、斜扫描式或其他平面全覆盖扫描式中的任意一种。
在其中一个实施例中，所述S20，利用所述阵列光斑对成像物体进行扫描的步骤包括：
利用液晶、光楔或多个光楔组合实现不同的线性相移，使得所述阵列光斑相对所述成像物体的移动距离，满足奈奎斯特采样定理。
在其中一个实施例中，所述阵列光斑强度分布为等强度均匀分布或按照某一函数规律分布。
在其中一个实施例中，所述阵列光斑的形状为圆形、椭圆形、正方形及其他多边形中的任意一种或多种，所述阵列光斑形成的阵列形状为直线形、正方形、长方形或圆形中的任意一种或多种。
一种衍射超分辨显微成像***，包括：
发光组件；
第一分光棱镜，所述发光组件发出的一束光入射到所述第一分光棱镜，通过所述第一分光棱镜分为第一光信号和第二光信号；
衍射超分辨元件，所述第一光信号入射至所述衍射超分辨元件，通过所述衍射超分辨元件，调制后反射至第二光信号；
光学调整元件，所述第二光信号入射至所述光学调整元件，通过所述光学调整元件对所述第二光信号进行调制；
第二分光棱镜，调制后的所述第二光信号入射至所述第二分光棱镜，通过所述第二分光棱镜分为第三光信号和第四光信号；
物镜扫描组件，所述第三光信号在物镜扫描组件上生成阵列光斑，对成像物体进行扫描；
光电探测组件，用于获取被扫描后的所述成像物体的图像信息，并根据所述图像信息，进行图像的重构。
在其中一个实施例中，还包括：
偏振片，设置于所述第一分光棱镜与所述衍射超分辨元件之间。
在其中一个实施例中，所述衍射超分辨元件为全息光学元件、微纳光学元件、二元光学元件、超构表面(Metasurface)、空间光调制器或其他实现光场相位调制和/或振幅调制的各类元件中的任意一种。
在其中一个实施例中，所述光电探测组件为互补金属氧化物半导体相机、电荷耦合相机、光场相机或实现图像信息采集的其他各类器件中的任意一种。
上述衍射超分辨显微成像方法，利用衍射超分辨元件生成阵列光斑。其中，所述阵列光斑成像于衍射超分辨显微成像***的物面，以实现对成像物体的照明，进而提高成像效率。利用所述阵列光斑对成像物体进行扫描，并获取被扫描后的所述成像物体的图像信息，并根据所述图像信息，进行图像的重构。本申请的衍射超分辨显微成像方法利用衍射超分辨元件调制照明光束生成超分辨的阵列光斑，能够突破光学***的衍射极限，实现光学超分辨成像，且超分辨能力可调。
附图说明
图1为本申请一个实施例中提供的衍射超分辨显微成像方法流程图；
图2为本申请一个实施例中提供的衍射超分辨显微成像***结构图；
图3为本申请一个实施例中提供的衍射超分辨显微成像***结构图；
图4为本申请一个实施例中提供的平移台的路径示意图；
图5为本申请一个实施例中提供的阵列光斑示意图；
图6为本申请一个实施例中提供的衍射超分辨元件的相位分布示意图；
图7为本申请一个实施例中提供的运用显微物镜直接观察的实验结果图；
图8为本申请一个实施例中提供的运用本申请提供的衍射超分辨显微成像***得到的实验结果图。
主要元件附图标号说明
衍射超分辨显微成像***10
发光组件100
光源110
准直扩束器120
第一分光棱镜200
衍射超分辨元件300
光学调整元件400
反光镜410
透镜420
第二分光棱镜500
物镜扫描组件600
显微物镜610
平移台620
光电探测组件700
收集透镜710
光电探测器720
控制器730
偏振片800
具体实施方式
为使本申请的上述目的、特征和优点能够更加明显易懂，下面结合附图对本申请的具体实施方式做详细的说明。在下面的描述中阐述了很多具体细节以便于充分理解本申请。但是本申请能够以很多不同于在此描述的其它方式来实施，本领域技术人员可以在不违背本申请内涵的情况下做类似改进，因此本申请不受下面公开的具体实施的限制。
需要说明的是，当元件被称为“设置于”另一个元件，它可以直接在另一个元件上或者也可以存在居中的元件。当一个元件被认为是“连接”另一个元件，它可以是直接连接到另一个元件或者可能同时存在居中元件。
除非另有定义，本文所使用的所有的技术和科学术语与属于本申请的技术领域的技术人员通常理解的含义相同。本文中在本申请的说明书中所使用的术语只是为了描述具体的实施例的目的，不是旨在于限制本申请。本文所使用的术语“及/或”包括一个或多个相关的所列项目的任意的和所有的组合。
请参见图1，本申请一个实施例中提供一种衍射超分辨显微成像方法。所述衍射超分辨显微成像方法包括：
S10，利用衍射超分辨元件300生成阵列光斑，所述阵列光斑成像于衍射超分辨显微成像***10的物面。步骤S10中，所述衍射超分辨元件300可以产生多个(大于等于2个)衍射超分辨点。所述衍射超分辨元件300可以为二元光学元件，也可以是全息光学元件、微纳光学元件、超构表面(Metasurface)和空间光调制器等实现光场相位调制和/或振幅调制的各类元件。所述阵列光斑的形状为圆形、椭圆形、正方形及其他多边形中的任意一种。所述阵列光斑强度分布可以是等强度均匀分布，也可以是按照某一函数规律的强度分布。所述阵列光斑形成的阵列形状为直线形、正方形、长方形或圆形中的任意一种。所述阵列光斑成像于衍射超分辨显微成像***的物面，以实现对成像物体的照明，进而提高成像效率。
S20，利用所述阵列光斑对成像物体进行扫描。步骤S20中，可以利用平移台或基于相移方法使得超分辨阵列光斑对成像物体进行扫描。
S30，获取被扫描后的所述成像物体的图像信息，并根据所述图像信息，进行图像的重构。步骤S30中，利用光电探测器获取图像信息，并通过配准重构算法实现对成像物体的超分辨重构。
本实施例中，利用衍射超分辨元件300生成阵列光斑。其中，所述阵列光斑成像于衍射超分辨显微成像***的物面，以实现对成像物体的照明，进而提高成像效率。利用所述阵列光斑对成像物体进行扫描，并获取被扫描后的所述成像物体的图像信息，并根据所述图像信息，进行图像的重构。本申请的衍射超分辨显微成像方法利用衍射超分辨元件调制照明光束生成超分辨的阵列光斑，能够突破光学成像的衍射极限，实现光学超分辨成像，且超分辨能力可调。本申请的衍射超分辨显微成像方法具有很好的兼容性，可以与现有的超分辨衍射超分辨显微成像方法兼容，如受激发射损耗荧光显微成像(STED)等。
在其中一个实施例中，所述S20，利用所述阵列光斑对成像物体进行扫描的步骤包括：
将所述成像物体置于所述平移台。利用所述平移台带动所述成像物体，从所述阵列光斑的初始位置移动至所述阵列光斑的终点位置，所述平移台的移动距离满足奈奎斯特采样定理。在其中一个可选的实施例中，所述平移台的移动方式为水平方向扫描式、竖直方向扫描式、斜扫描式或其他平面全覆盖扫描式中的任意一种。
本实施例中，通过移动所述成像物体，使得所述阵列光斑对成像物体进行扫描，以使得所述阵列光斑可以对一个较大的成像物体进行照明，进而提高成像效率。
在其中一个实施例中，所述S20，利用所述阵列光斑对成像物体进行扫描的步骤包括：
利用液晶、光楔或多个光楔组合实现不同的线性相移，使得所述阵列光斑相对所述成像物体的移动距离，满足奈奎斯特采样定理。本实施例中，通过移动所述阵列光斑，使得所述阵列光斑对成像物体进行扫描，以使得所述阵列光斑可以对一个较大的成像物体进行照明，进而提高成像效率。
在其中一个实施例中，所述S10，利用衍射超分辨元件300生成阵列光斑，所述阵列光斑成像于衍射超分辨显微成像***10的物面的步骤包括：
根据所需所述阵列光斑的大小、个数、形状和分布，对所述衍射超分辨元件300进行优化。所述衍射超分辨元件300的设计原理为通过对所述衍射超分辨元件300的输出面加以特殊约束条件实现了超分辨阵列，即控制输出面光斑的相位分布来实现超分辨阵列。由于光束的干涉作用，相邻两点的相位差为π时，两点之间强度减少并出现零强度点，因此，相邻的两点可分开。相位控制算法的基本步骤与Gerchberg-Saxton(GS)算法相似，不同的是对输出面的振幅和相位加上了一些限制。在一个可选的实施例中，所述根据所需所述阵列光斑的大小、个数、形状和分布，对所述衍射超分辨元件300进行优化的步骤包括：
S110，获取所述衍射超分辨元件300的输入面的振幅分布和所述衍射超分辨元件300的输入面的相位分布。
步骤S110中，对输出面振幅进行控制，阵列区域的振幅将利用理想超分辨阵列光斑的振幅分布代替。设S、P分别为输入面上采样区域与补零区域，AreaI 与AreaII分别为输出面上阵列区域与背景区域。Iin为入射光强度分布，Ain为理想输入面振幅分布。
(1)初始相位取随机分布，输出面振幅分布为
Figure BDA0002288903120000081
S120，根据所述衍射超分辨元件300的输入面的振幅分布和所述衍射超分辨元件300的输入面的相位分布，利用傅里叶变换，获取所述衍射超分辨元件 300的输出面的相位分布。
Figure BDA0002288903120000082
为输入面相位分布。
Figure BDA0002288903120000083
为输出面复振幅分布，其中
Figure BDA0002288903120000084
为振幅分布，
Figure BDA0002288903120000085
为相位分布。步骤S120，利用快速傅里叶变换(FFT，Fast Fourier Transform)计算输出面复振幅分布：
Figure BDA0002288903120000091
Figure BDA0002288903120000092
Figure BDA0002288903120000093
S130，利用预设阵列光斑振幅分布替换所述衍射超分辨元件300的输出面的振幅分布，并对所述衍射超分辨元件300的输出面的复振幅分布进行傅里叶变换，以得到优化后所述衍射超分辨元件300的输入面的振幅分布。
步骤S130中，将上一步计算的输出面振幅归一化后，加以约束条件。阵列区域中，振幅分布替换为预设阵列光斑振幅分布
Figure BDA0002288903120000094
其中IS为归一化的理想阵列光斑的能量分布。
Figure BDA0002288903120000095
为加上约束条件后的输出面复振幅分布，
Figure BDA0002288903120000096
为加上约束条件后的输出面振幅分布，k代表迭代次数。背景区域中，振幅分布均乘以常数α，α的取值范围为0-1，计算公式为
Figure BDA0002288903120000097
加上约束条件后的输出面复振幅分布为
Figure BDA0002288903120000098
将
Figure BDA0002288903120000099
进行傅里叶变换，计算得到输入面复振幅分布，其中，输入面相位分布为
Figure BDA00022889031200000910
将输入面振幅分布替换为理想输入面振幅分布，重复步骤S110至S130，直至完成目标迭代次数，以完成对所述衍射超分辨元件300的优化。至此，可以得到满足要求的所述衍射超分辨元件300。
请参见图2，本申请提供一种衍射超分辨显微成像***10。所述衍射超分辨显微成像***10包括发光组件100、第一分光棱镜200、衍射超分辨元件300、光学调整元件400、第二分光棱镜500、物镜扫描组件600及光电探测组件700。
所述发光组件100发出的一束光入射到所述第一分光棱镜200，通过所述第一分光棱镜200分为第一光信号和第二光信号。所述第一光信号入射至所述衍射超分辨元件300，通过所述衍射超分辨元件300，调制后反射至第二光信号。所述第二光信号入射至所述光学调整元件400，通过所述光学调整元件400对所述第二光信号进行调制。调制后的所述第二光信号入射至所述第二分光棱镜500，通过所述第二分光棱镜500分为第三光信号和第四光信号。所述第三光信号在物镜扫描组件600上生成阵列光斑，对成像物体进行扫描。所述光电探测组件 700用于获取被扫描后的所述成像物体的图像信息，并根据所述图像信息，进行图像的重构。
可以理解，在一个可选的实施例中，所述衍射超分辨元件300为二元光学元件、全息光学元件、微纳光学元件、超构表面(Metasurface)或空间光调制器等实现光场相位调制和/或振幅调制的各类元件中的任意一种。所述光电探测组件700为互补金属氧化物半导体相机、电荷耦合相机或光场相机中的任意一种。
请参见图3，可以理解，所述发光组件100可以包括光源110和准直扩束器 120。所述光源110输出的光波经过所述准直扩束器120和所述分光棱镜后被分为两束光。其中一束光(所述第一光信号)照射到所述衍射超分辨元件300上。当然，为了实现照射到所述衍射超分辨元件300上的光为偏振光时，可以在所述第一分光棱镜200与所述衍射超分辨元件300之间设置一个偏振片800。所述光学调整元件400的设置可以使得所述衍射超分辨元件300的口径与显微物镜的入瞳进行匹配。在一个实施例中，所述光学调整元件400可以包括反光镜410 和两个透镜420。另一束光(所述第二光信号)经过所述反射镜410后反射至第一个透镜420和第二个透镜420上，这里第一个透镜420和第二个透镜420上组成一个4f光学***。
所述物镜扫描组件600可以包括显微物镜610和平移台620。光束通过第二个透镜420后，照射到所述第二分光棱镜500后被分为两束光，一束光(所述第三光信号)经所述显微物镜610照射到所述平移台620上，以对成像于所述平移台620上的成像物体进行照明。所述光电探测组件700包括收集透镜710、光电探测器720、控制器730。
另一束光(所述第四光信号)经过所述收集透镜710后照射到所述光电探测器720上。所述衍射超分辨元件300和所述光电探测器720可由所述控制器 730进行调控。
最后，将生成的超分辨阵列光斑对成像样品进行扫描并将采集到的图片进行配准重构。扫描成像样品时需先确定初始坐标和终点坐标，将阵列光斑置于初始坐标后移动平移台620对成像样品进行二维扫描，即从初始坐标处在水平方向往终点坐标的横坐标移动，移动到终点坐标的横坐标后，横坐标返回初始坐标处，竖直方向往终点坐标方向移动一个步进，水平方向和竖直方向的步距等长且满足奈奎斯特采样定理，图4为平移台620的路径示意图。配准重构可采用自相关函数进行配准，其目的是为了让特征区域进行重合，使重构效果更佳。
对上述方法及***进行实验验证，设计一个3×3均匀光强分布的70％超分辨能力的圆形阵列光斑(图5)。图5(a)为所述圆形阵列光斑的输出面强度分布图；图5(b)为所述圆形阵列光斑的阵列区域强度分布图；图5(c)为所述圆形阵列光斑的强度曲线图。由图5可知所述圆形阵列光斑强度分布按照正弦规律分布。若光源1输出波长为λ＝632.8nm的单色激光，α＝0.6，采用Holoeye PLUTO反射式纯相位液晶空间光调制器作为衍射超分辨元件300，其像素数为 1080×1920，像素尺寸为8μm×8μm，实验中有效像素数为256×256，第一个透镜420的焦距为300mm，第二个透镜420的焦距为900mm，其中图6为加载在液晶空间光调制器上的相位分布图。平移台620上放置的样品为分辨率板，显微物镜610采用Nikon PlanFluor,10x/0.3，收集透镜710为Nikon VM Lens C-2.5x，光电探测器620采用ANDOR公司的sCMOS，其像素尺寸为6.5μm×6.5μm。根据瑞利判据0.61λ/NA＝1.29μm，则该***的衍射极限分辨率为1.29μm，经过3×3超分辨阵列光斑扫描后的理论成像分辨率为0.90μm。图7(a)为运用显微物镜直接观察的实验结果图(白线为分辨率板1.2μm-2μm区域)；图7(b)为白线区域的强度曲线。由图7表明0.90μm处可以分辨。图8(a)为运用本方案得到的实验结果图；图8(b)为白线区域的强度曲线。由图7和图8的对比结果可以看出，本申请提出的衍射超分辨显微成像方法可以实现超分辨显微成像。
以上所述实施例的各技术特征可以进行任意的组合，为使描述简洁，未对上述实施例中的各个技术特征所有可能的组合都进行描述，然而，只要这些技术特征的组合不存在矛盾，都应当认为是本说明书记载的范围。
以上所述实施例仅表达了本申请的几种实施方式，其描述较为具体和详细，但并不能因此而理解为对申请专利范围的限制。应当指出的是，对于本领域的普通技术人员来说，在不脱离本申请构思的前提下，还可以做出若干变形和改进，这些都属于本申请的保护范围。因此，本申请专利的保护范围应以所附权利要求为准。

Claims (7)

1.一种衍射超分辨显微成像方法，其特征在于，包括：
S10，发光组件(100)发出的光束经衍射超分辨元件(300)调制，并经光学调整元件(400)调制后生成阵列光斑，所述阵列光斑成像于衍射超分辨显微成像***(10)的物面，其中，所述光学调整元件(400)包括反光镜(410)和两个透镜(420)，两个透镜组成一个4f光学***；
在所述发光组件(100)发出的光束经衍射超分辨元件(300)调制之前，还包括：根据需要的所述阵列光斑的大小、个数、形状和分布，对所述衍射超分辨元件(300)进行优化；
S20，利用所述阵列光斑对成像物体进行扫描；
S30，获取被扫描后的所述成像物体的图像信息，并根据所述图像信息，进行图像的重构；
所述S20，利用所述阵列光斑对成像物体进行扫描的步骤包括：
利用液晶、光楔或多个光楔组合实现不同的线性相移，使得所述阵列光斑相对所述成像物体的移动距离，满足奈奎斯特采样定理。
2.根据权利要求1所述的衍射超分辨显微成像方法，其特征在于，所述阵列光斑强度分布为等强度均匀分布或按照某一函数规律分布。
3.根据权利要求1所述的衍射超分辨显微成像方法，其特征在于，所述阵列光斑的形状为圆形、椭圆形、正方形及其他多边形中的任意一种或多种，所述阵列光斑形成的阵列形状为直线形、正方形、长方形或圆形中的任意一种或多种。
4.一种衍射超分辨显微成像***，其特征在于，所述衍射超分辨显微成像***用于实现权利要求1-3中任一项所述的衍射超分辨显微成像方法，所述衍射超分辨显微成像***，包括：
发光组件(100)；
第一分光棱镜(200)，所述发光组件(100)发出的一束光入射到所述第一分光棱镜(200)，通过所述第一分光棱镜(200)分为第一光信号和第二光信号；
衍射超分辨元件(300)，所述第一光信号入射至所述衍射超分辨元件(300)，通过所述衍射超分辨元件(300)调制后反射至第二光信号；
光学调整元件(400)，包括反光镜(410)和两个透镜(420)，两个透镜组成一个4f光学***，所述第二光信号经所述反光镜(410)反射后，依次通过两个透镜(420)，以对所述第二光信号进行调制；
第二分光棱镜(500)，调制后的所述第二光信号入射至所述第二分光棱镜(500)，通过所述第二分光棱镜(500)分为第三光信号和第四光信号；
物镜扫描组件(600)，所述第三光信号在物镜扫描组件(600)上生成阵列光斑，对成像物体进行扫描；
光电探测组件(700)，用于获取被扫描后的所述成像物体的图像信息，并根据所述图像信息，进行图像的重构；
利用液晶、光楔或多个光楔组合，以实现不同的线性相移，使得所述阵列光斑相对所述成像物体的移动距离，满足奈奎斯特采样定理。
5.根据权利要求4所述的衍射超分辨显微成像***，其特征在于，还包括：
偏振片(800)，设置于所述第一分光棱镜(200)与所述衍射超分辨元件(300)之间。
6.根据权利要求4所述的衍射超分辨显微成像***，其特征在于，所述衍射超分辨元件(300)为全息光学元件、微纳光学元件、二元光学元件、超构表面、空间光调制器或其他实现光场相位调制和/或振幅调制的各类元件中的任意一种。
7.根据权利要求4所述的衍射超分辨显微成像***，其特征在于，所述光电探测组件(700)为互补金属氧化物半导体相机、电荷耦合相机、光场相机或实现图像信息采集的其他各类器件中的任意一种。
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