乙型肝炎是一种严重危害人类健康并广为流行的疾病,特别是在发展中国家。在我国,乙肝病毒携带者达1亿以上,由乙肝或乙肝有关的疾病导致死亡人数巨大,危害极大,普遍接种疫苗是控制乙肝的重要措施。
在乙型肝炎病毒(HBV)感染的某些患者血清中存在有42nm具有感染的病毒颗粒,是由病毒衣壳蛋白即表面抗原(HBsAg),核心抗原(HBcAg)和病毒核酸(DNA)组成。另外还有不具有感染性的20-22nm的球状和棒状颗粒,仅含乙肝表面抗原。它能诱导产生特异抗乙肝病毒抗体,使人体产生免疫力。由病人血清中分离HBsAg,制成的血源疫苗,由于来源困难,成本昂贵,安全性差,不够理想。
利用基因工程技术,在不同体系中:酵母,哺乳动物细胞,重组痘苗等表达乙肝表面抗原,用作基因工程疫苗,比之血源疫苗更为安全,经济,有效,但就其免疫原性的本质与血源疫苗几乎相同,因而仍有一些不足之处:如1)5-10%的人群免疫反应低下或无免疫应答。2)所需抗原量大。3)免疫持久性4-5年。因此研究高效经济的新型乙肝疫苗十分必要。
乙肝表面抗原有三种蛋白组分:主蛋白(S),中蛋白(M)和大蛋白(L),这三种蛋白由HBV中同一阅读框架的DNA编码,从不同的起始码ATG起始翻译,差别在于M蛋白比S蛋白在氨端多了55个氨基酸,即前表面抗原2(preS2)区,而L蛋白比M蛋白在氨端又多了119个氨基酸,即前表面抗原1(preS1)区。M和L蛋白主要存在于病毒颗粒的外壳中。
preS1区含有不同于S的抗原决定簇。preS1区具有T细胞和B细胞水平上的免疫原性,其中氨端第21-47氨基酸的肽段,能与肝细胞膜结合(Neurath A.R.等cell 1986:46.429-436)具有诱导产生中和抗体的能力,从而能阻断乙肝病毒与肝细胞的结合,以保护机体不受感染。另外L蛋白能激活对preS1特异的T细胞,克服对S蛋白和M蛋白的不反应性。但L蛋白不易从细胞中分泌出来,并且还抑制了S蛋白的分泌(Persing,P.H.等,Science,1986,234,1388)。氨端的肉豆蔻酸化和氨端的18个氨基酸顺序都是影响分泌的原因,同时L蛋白易被降解。因此要获得含L蛋白的疫苗有一定的困难。
用合成的preS1(21-47)多肽研究证实,该区域含有HBV与肝细胞结合所必需的位点,抗preS1(21-47)单抗MA18/7和F35.25能有效地抑制HBV与肝细胞的结合,具有中和病毒的能力(Petit M.A.等,Virology 1991,180.483-491)。免疫猩猩能使其抵制HBV的攻击(Neurath A.R.等,Vaccine,1989,7,234-236)。但是,用合成多肽作为疫苗,免疫原性低,距实际应用尚有很大距离。
近来,利用乙肝表面抗原作载体蛋白,成功地将外源基因片段,如:人单纯疱疹病毒Ⅰ型(HSV-I)(Valenzuela,P.等,Bio-Technology,1985,3,323.),人免疫缺陷病毒(HIV)(Michel,M-L等,Proc.Natl.Acad.Sci.USA,1988,85,7957.),脊髓灰质炎病毒(plio)(Delpeyroux,F.等,Science 1986,233,472)都***preS2区,在酵母或哺乳动物细胞中获得表达。我们将促生长素抑制素基因(SS)融合在HBsAg主蛋白的羧端,也获得了成功(徐文忠等,生物化学与生物物理学报,1993,25,119-126)。因此,通过将preS1免疫决定簇与HBsAg主蛋白融合的办法,获得带preS1的新型乙肝疫苗不失为一条新的技术路线。
R.E.Streeck等人曾报道,将preS1氨端氨基酸顺序1-42,在乙肝表面抗原第223位,外加5个氨基酸的接头与之融合,在SV40启动子控制下,获得了暂时表达。虽然他们也发现在细胞内和培液中都有S和preS1的表达,能形成颗粒,但尚未构建稳定的表达株和对表达产物的免疫原性进行研究(Machein L,等,Arch.Virol,1992,4,133-136)。另外,他们使用的片段(1-42)中N端的20个氨基酸,可能会影响表达产物的分泌。
本发明的目的在于提供一个阻断乙肝病毒感染的新型乙肝重组疫苗,即一个含有乙肝表面抗原S基因与preS1肝细胞结合位点的抗原决定簇基因融合的重组痘苗病毒(Vaccinia Virus),能稳定地表达并分泌乙肝表面抗原与preS1的融合颗粒。颗粒同时具有乙肝HBsAg和preS1的双重抗原性,具良好的免疫性,免疫动物能迅速产生高滴度的双重抗体,这就具备了发展成高效、速效的新型乙肝疫苗的可能。本发明所提供的重组痘苗病毒能大量分泌产生HBsAg和preS1的融合颗粒。经分离纯化,可制成更为安全高效的新型乙肝基因工程颗粒疫苗。该重组痘苗病毒也可用于制备成新型乙肝活疫苗。
我们利用PCR技术,人工合成了preS1基因中对应氨基酸第21-47的核苷酸顺序,去除了可能影响S抗原分泌的氨端20个氨基酸。在乙肝表面抗原基因羧端,在对应氨基酸第223位与合成的preS1核苷酸片段相融合。获得了含有乙肝表面抗原S基因与preS1(21-47)的融合基因。并构建了含有该融合基因的重组痘苗病毒,成功地表达了带HBsAg和preS1双重抗原的颗粒。实验证明,我们的设计方案既不影响乙肝表面抗原颗粒的形成和白细胞的分泌,也不影响HBsAg的免疫原性,却同时带有preS1的免疫原性。免疫动物能高水平地产生抗HBsAg和抗preS1的抗体。
本发明提供将HBsAg主蛋白羧端与preS1抗原决定簇融合,以及组建一个能稳定表达分泌HBsAg主蛋白和preS1蛋白融合颗粒的重组痘苗病毒的方法,包括:
1.含肝细胞结合位点的preS1抗原决定簇(21-47)的PCR法合成和克隆(pWR/PS1)。
2.乙肝表面抗原基因(S)羧端与合成的preS1(21-47)基因融合的克隆构建(pUC/PSA-28)。
3.含融合基因的重组痘苗表达质粒的构建(pGJPSA-28)。
4.含乙肝S基因与preS1(21-47)基因的重组痘苗病毒的构建和筛选(vSA-28)。
5.重组痘苗病毒的增殖和带preS1的乙肝表面抗原的表达。
本发明的示意图说明如下:
图1.含肝细胞结合位点的preS1抗原决定簇(21-47)基因的PCR合成和克隆示意图。
图中符号说明:St:StuⅠ(限制酶);X:XbaⅠ;Pv:PvuⅡ;E:EcoRⅠ;S:SacⅠ;Sm:SmaⅠ;B:BamHⅠ;Sa:Sa1Ⅰ;Ps:PstⅠ;H:HindⅢ。
图2A.乙肝S基因3′端与preS1(21-47)的融合和克隆示意图。
图中符号说明:■ S基因,□ PreS1;Sp:Spel;Pf:pflmⅠ;Ac:AccⅠ;余者同图1。
图2B.乙肝S基因3′端与preS1(21-47)融合在痘苗表达载体上的克隆示意图。
图3.重组痘苗病毒vSA-28的Southern杂交鉴定ECL显影照片。
1.天坛株,2.pGJPSA-28,3.vSA-28。
图4.重组痘苗病毒vSA-28表达产物具S抗原和preS1双重抗原性。
图4A.培养液和细胞裂解液中35S甲硫氨酸标记的乙肝表面抗原与抗HBsAg免疫沉淀,经蛋白电泳的放射性自显影图。
图4B.培养液和细胞裂解液中35S甲硫氨酸标记的乙肝preS1抗原与抗preS1单抗MA18/7免疫沉淀,经蛋白电泳的放射自显影图。
图中:Mock对照;S带HBsAg的重组痘苗vTH-2;SA-28重组痘苗vSA-28。
M.为标准分子量 m.为培养液 C.为细胞裂解液
箭头表示糖苷化和非糖苷化的S和SA-28蛋白
图5.重组痘苗病毒vSA-28表达产物的分泌性测定。在不同细胞(CV-1,Vero,CEC)中分泌性水平的比较。
培养液;■细胞裂介液。
图6.重组痘苗病毒vSA-28表达产物颗粒性鉴定。
图6A.vTH-2(上)和vSA-28(下)融合颗粒的CsCl密度超离心测定。
图6B.vSA-28融合颗粒的电子显微镜观察照片(×12000)。
图7.重组痘苗病毒vSA-28表达产物的免疫原性测定。
本发明的内容具体描述如下:
1.preS1(21-47)基因片段的PCR合成及克隆;
我们选定乙肝病毒adr亚型含有肝细胞结合位点的preS1抗原决定簇,氨基酸序号第21-47位,以含preS1基因的克隆作模板,用PCR法合成了与preS1(21-47)相对应的核苷酸序列。为便于克隆,在此片段的5′端和3′端分别引入一个StuⅠ和XbaⅠ酶切点。PCR产物经上述酶双酶解后,克隆入PWR13质粒得PWR13质粒得PWR/PS1,在通过顺序测定验证后备用(见图1)。
2.乙肝表面抗原基因(adr型)羧端与合成的preS1(21-47)基因融合克隆
在含有preS1(21-47)的克隆上,将XbaⅠ切点打开,再补平重连,在preS1(21-47)片段3′端造成一个终止码TAG。为了在preS1(21-47)片段5′端与乙肝表面抗原基因融合后,仍保持阅读框架正确,在preS1片段5′端,装上10个寡核苷长的SmaⅠ接头,而在S基因3′端,对应第223氨基酸处,即AccⅠ酶切点,经同样酶切开补平,造成平头与preS1(21-47)氨端SmaⅠ接头连接,完成乙肝表面抗原基因与preS1(21-47)的基因融合。含preS1与HBsAg223位融合基因的重组质粒为PUC/SA-28(见图2A)。我们将重组质粒转入大肠杆菌中保存,此菌种为Escherichia coli TG-1/PGJPSA-28存放标记CCTCC NO:M93074。
3.融合基因在重组痘苗表达质粒上的构建
为实现设计的融合基因与痘苗病毒的重组,首先必须将融合基因***痘苗表达质粒。我们选择已成功用于多种外源基因表达的痘苗通用表达质粒pGJP-5(吴雪等,生物化学与生物物理学报1987,19(5)395)。该质粒带有痘苗启动子p7.5和痘苗TK基因顺序,其间带有几个克隆位点,若在中间***外源基因,即可造成TK基因的失活,而可用作重组病毒的选择标记。另外还带有氨苄青霉素(APr)耐药标记,可作为大肠杆菌中组建克隆时的重组子选择标记。将用BamHI切下的融合基因插在pGJP-5质粒的BamHI位点上,得重组质粒pGJPSA-28(见图2B)。
4.含S与preS1(21-47)基因融合与低毒痘苗病毒天坛株的重组及痘苗病毒的筛选。
我们选用已知的低毒痘苗病毒株,天坛株(Vaccinia Virus Tian Tan),由中华人民共和国***北京生物制品所获得。其特点是,由此产生的重组痘苗病毒用作活疫苗时,其毒性低,这已为长期的临床实践所证明。
将重组痘苗表达质粒pGJPSA-28从菌种CCTCC NO:93074中取出,按下述实施例的具体叙述制备方法获得的质粒DNA和天坛痘苗病毒引入CV-1细胞,由于表达质粒上的TK基因与痘苗TK基因具有同源顺序和彼此的亲和力,因而有可能同源交换,而发生体内重组,也即将表达质粒上失活的TK基因所包含的痘苗启动子p7.5和相连的乙肝表面抗原S与preS1(21-47)的融合基因重组到痘苗病毒基因组中去,再通过对TK-的多次选择,即可得纯化的重组痘苗病毒vSA-28(见图2B)。
5.重组痘苗病毒的增殖和带有preS1乙肝表面抗原的表达。
经过筛选的重组痘苗病毒vSA-28,并通过Southern杂交和产物的分析验证后,感染Vero,CV-1或者CEC细胞,即可进行病毒的增殖,以大量获得重组痘苗病毒。重组痘苗病毒感染细胞后能表达并分泌具有S和preS1双重免疫原性的融合的乙肝表面抗原颗粒,可用于生产高效和新型基因工程乙肝疫苗。vSA-28也可用作活疫苗使用。
本发明的内容在以下实施例的具体叙述:
材料和方法:
a.基因重组所用限制酶,连接酶,Klenow聚合酶,SmaI接头,皆为Boehringer产品;
细胞培养基,DMEM/HG高葡萄糖培液,胎牛血清(FCS),无甲硫氨酸培液(RPM1-1640,Met-Free),无甲硫氨酸胎牛血清(Met-Free,FCS)皆为GIBCO产品;
5-溴脱氧尿苷(BUdR)为FLUKA产品;
35S-标记甲硫氨酸(L-35S-Met)为Amersham产品;
PCR用试剂盒和Tag DNA聚合酶为Biolabs产品;
b.所用胸腺嘧啶核苷激酶(TK)基因缺陷型细胞Human Tk-143细胞,在含25μg/ml BUdR和5%胎牛血清的DMEM培养基中培养。痘苗病毒天坛株(Vaccinia Virus Tian Tan)由***北京生物制品所提供。原代鸡胚细胞(CEC),用10日令鸡胚制备在10%小牛血清的DMEM中培养。CV-1细胞由德国马普生化所提供,Vero细胞由上海医科大学闻玉梅教授提供。
c.细胞的转染。CV-1细胞,经痘苗病毒天坛株感染两小时后,用磷酸钙共沉淀的DNA(含10μg质粒和10μg鱼精DNA)转染,37℃培养5小时后,吸去转染液,加入新鲜培液,继续培养48小时后收获细胞。
d.质粒DNA的制备。用碱变性法,经Sepharose 2B纯化。
e.质粒的重组和细菌转化。参照Sambrook,J.等人“分子克隆”书上的方法进行,所用受体菌为TG-1或JM105。
f.重组痘苗病毒的筛选和病毒DNA抽提。痘苗病毒DNA制备参见文献(Espostto,J.等,J.Virol.Meth 1980,2,175)方法进行。TK-重组病毒按照Weir等的方法(Weir,J.P.等,Proc.Natl.Acd.Sci.USA1982,79,1210),在BUdR存在下,选择空斑并进行分析鉴定。
g.HBsAg和preS1的测定。HBsAg的测定用AUSRIA药盒(Abbott公司产品)或北京生物制品所乙肝表面抗原放免检测药盒。preS1抗原的测定,采用Organon Teknika公司检测药盒,或由本所张祖传组提供的ELISA检测试剂进行。分泌至培养液中的抗原,可直接用培液测定或细胞内的抗原经PBS悬浮后,用干冰冻融四次,离心后的上清液为冻融细胞液样品,也可用细胞的裂解液样品进行测定(参见方法Ⅰ项)。所用抗preS1单抗(MA18/7)由联邦德国W.H.Gerlich博士所赠。
h.表达产物的蛋白电泳分析。采用SDS聚丙烯酰胺电泳参照Laemmli法进行(Laemmli,U.K.等 Nature,1970,227.680)。
i.表达产物的35S-甲硫氨酸标记及免疫沉淀。取磷酸钙沉淀法转染后20小时的细胞,去培液,用无甲硫氨酸培液洗涤后,在无甲硫氨酸FCS和无甲硫氨酸培液中,培养1小时,再经无甲硫氨酸培液洗涤后,加入50-80uci35S-标记的甲硫氨酸培养3小时,然后换成DMEM/HG培液过夜。收集标记的细胞,经预冷的PBS洗涤二次后悬于0.8mlHypotonic缓冲液,再加入0.2ml 5×lysis缓冲液,振摇,离心后上清-20℃保存备用为细胞裂解液。
标记的细胞裂解液或细胞培液,分别加入S抗体或抗preS1抗体,混匀,0℃30分钟后,离心弃上清。沉淀用RIPA缓冲液洗三次,悬于上样缓冲液,100℃4分钟,离心收集上清,进行电泳分析。电泳胶抽干后,压片自显影。
j.ECL非放射性标记检测试剂和标记操作方法,详细参见Amersham公司提供的操作步骤。
下面分步描述实施的具体步骤:
实施例1,含肝细胞结合位点的preS1(21-47)抗原决定簇基因的合成和克隆。
我们选定含肝细胞结合位点的preS1抗原决定簇,氨基酸序号第21-47位。用含有preS1的重组质粒DNA作为模板(pUC/LS-1),采用PCR法扩增了含有第21-47位的preS1的DNA片段,所用5’端引物为:
5'CTTTCTGTTCCC
AGGCCTCTGGG 3'
StuI
共长23个核苷酸,其中划线部分为设计引入的一个StuⅠ酶切点顺序。3’端引物为:5' CTGGCCAGTGAT
CTCTAGAGGGTTGAAG 3'
XbaI
共长29个核苷酸,其中划线部分为设计引入的一个XbaⅠ切点顺序。PCR反应体系参见Biolabs方法。PCR扩增的片段用StuI和XbaI双酶解后,***到质粒pWR13的StuI和XbaI位置上,得含preS1(21-47)的重组克隆pWR/PS1,preS1(21-47)经DNA顺序测定验证(见图1)。
实施例2,preS1(21-47)与S基因融合克隆pUC/SA-28的组建。
为实现preS1(21-47)片段与S抗原羧端的融合,我们首先将含preS1(21-47)基因片段的质粒(pWR/PS1),用XbaI酶解,再用大片段聚合酶将其补平后连接,造成一个终止码TAG,同时也使XbaI切点丢失。另外为保持由S基因到preS1(21-47)片段阅读框架正确无误,我们在preS1(21-47)上StuI酶切点处经StuI酶解后,加上10个核苷酸SmaI接头得pUC/10preS1(21-47)TAG。
选定S基因对应氨基酸序号第223处AccI切点为preS1(21-47)片段的融合点。将带有S基因的重组质粒pWR/HBS-4△SalI,先将AccI酶切打开,再经大片段酶补齐。再将3’端补平的S基因用SacI酶切下,插在pUC/10 preS1(21-47)TAG的SacI和SmaI双酶解的位点上,产生pUC/SA-28,经顺序测定,验证S基因与preS1(21-47)融合处框架正确,并在preS1(21-47)羧端含有终止码后,再构建含融合基因的重组痘苗表达质粒(见图2A)。
实施例3,含S基因与preS1(21-47)基因融合的重组痘苗表达质粒pGJPSA-28的构建。
重组质粒pUC/SA-28,经BamHI酶解后完整地分出含有S基因与preS1(21-47)融合的DNA片段,直接***经BamHI酶切的重组痘苗表达质粒pGJP-5,得重组质粒pGJPSA-28,经BamHI回切,得长约0.78Kb的融合基因。这样该重组质粒的上游依次为TK基因,痘苗启动子p7.5,ATGS(1-223)+Val,Trp,Gly+preS1(21-47)+Ser,Ser+TAG,质粒多用酶切点,TK基因。重组质粒pGJPSA-28还有APr耐药标记,可在大肠杆菌中转化(如TG-1),选择和扩增,以制备重组质粒DNA(见图2B)。含重组质粒pGJPSA-28的大肠杆菌Escherichia coli TG-1/pGJPSA-28保存于编号为CCTCC NO:93074。
实施例4,含有S和preS1(21-47)基因融合的重组痘苗病毒的筛选和vSA-28的鉴定。
重组的痘苗是通过重组痘苗表达质粒pGJPSA-28和天坛株病毒在CV-1细胞体内发生重组而产生。再通过感染TK-143细胞,在BUdR存在下,选择重组痘苗空斑。由于表达质粒TK基因中插有p7.5启动子和融合基因,TK已失去活性,即TK-,在发生体内重组后,重组痘苗病毒也是TK-的,也即BUdR存在下,只有重组的TK-才能存活下来,经过两次空斑纯化,并经HBsAg和preS1抗原表达的测定为阳性后,选择得到重组的痘苗病毒vSA-28。
对重组痘苗病毒vSA-28在DNA水平上进行了Southern blot鉴定。
制备vSA-28 DNA,以天坛株痘苗病毒DNA和融合基因的表达质粒pGJPSA-28 DNA为对照,都经BamHI酶解电泳后,再转移至硝酸纤维素膜上,用S基因为探针进行杂交,结果由图3所示。已知重组表达质粒pGJPSA-28,BamHI酶解片段包含有完整的S和preS1融合基因长约0.78Kb,而重组痘苗vSA-28 DNA,BamHI酶解的片段中能与S基因杂交的也是0.78Kb的片段,天坛株对照则呈阴性,这表明,融合基因已正确的插在重组痘苗病毒DNA中。
实施例5,重组痘苗病毒vSA-28表达产物具有S和preS1双重抗原性的鉴定。
我们用35S-甲硫氨酸标记vSA-28感染20小时后的CV-1细胞,追踪20小时后收集1ml细胞裂解液和3ml培液,取100μl细胞裂解液和300μl培液,用免抗S血清沉淀后电泳,用vTH-2(仅含S主蛋白的重组痘苗病毒)感染的CV-1细胞和未经感染的CV-1细胞作对照。由图4A可见,在vTH-2中有特异的24KD沉淀带和糖苷化的27KD带,而在vSA-28中也有能和S抗体特异沉淀的27KD和糖苷化的29KD条带,同样在培液中也有能被S抗体结合的条带,但被糖苷化的比细胞内的略大,这可能是在分泌过程中,糖苷化的程度增加的原故。
另外,表达产物用抗preS1(29-36)单抗MA18/7,进行免疫沉淀后电泳,结果见图4B,由于vTH-2只表达S抗原,因而不能与单抗MA18/7特异结合而沉淀。而在vSA-28表达产物中无论在培液和细胞内,用preS1(29-36)单抗MA18/7都有特异的条带24KD和29KD出现,结果与图4A中用S抗血清结合沉淀的条带大小一致。这表明vSA-28的表达产物既能被抗S抗体所识别又能被抗preS1抗血清所识别,即vSA-28的表达产物SA-28蛋白,同时具有S抗原和preS1抗原的双重抗原性。
实施例6,vSA-28表达产物SA-28蛋白的分泌性。
由脉冲标记追踪--免疫沉淀的实验结果看出,在培液中可检测到SA-28蛋白存在,这表明产物具有分泌性。
我们进一步测定了SA-28蛋白在不同细胞CV-1,Vero和CEC中的分泌情况。在感染Vero和CEC细胞后96小时取样,分别测定培液和细胞裂解液中的S抗原量为指标的SA-28量,结果见图5。与vTH-2相似,vSA-28在CV-1中分泌表达较差,在Vero细胞和CEC细胞表达和分泌水平较高,尤以Vero细胞最好,SA-28与vTH-2相比表达S抗原的水平和分泌性非常相似。在培养液和细胞裂解液中检测到的抗原量接近相当,这表明大约有占总共S抗原的一半是分泌到培液中的。
用ELISA方法检测preS1的结果与S抗原的结果是一致的(数据未列)。
实施例7,重组痘苗病毒vSA-28表达的SA-28蛋白颗粒性的分析。
我们用vTH-2和vSA-28分别感染Vero细胞,96小时后培液中表达的S抗原和融合的SA-28的S抗原经氯化铯密度梯度离心后进行了测定。在vTH-2和vSA-28培液中,可找到密度分别为1.20g/ml和1.23g/ml的S抗原放免测定阳性峰(见图6B),在除去氯化铯,再经浓缩和负染后,在电镜下可见直径约为25(μm)的SA-28颗粒(见图6A)。融合蛋白的颗粒与S抗原颗粒在密度和大小上没有十分明显的区别。
实施例8,vSA-28表达的SA-28的免疫原性分析
我们将vSA-28感染CV-1细胞48小时的培液,离心去痘苗后,经过疏水介质JL-QT6S-C4(A)柱层析和Sepharose 4B柱纯化,收集S抗原活性峰,得到部分纯化的SA-28蛋白。免疫Balb/C小鼠,取1.9μg SA-28蛋白以氢氧化铝为佐剂,经同样方法纯化的HBsAg3.2μg为对照,每组小鼠6-7只腹腔注射,21天后同样量加强,在第21天和第49天,即加强后的第28天,采血测定抗S抗体和抗preS1抗体含量,结果见图7。SA-28免疫Balb/C小鼠有良好的免疫原性,无论是在一次免疫或两次免疫以后,SA-28样品与用标准疫苗相比,产生抗S抗体几乎处在同一水平上。
在一次免疫以后,即有较高水平的抗preS1抗体产生,这提示抗preS1抗体可能早于抗S抗体的产生。而在两次免疫后有更大幅度的提高,显示了SA-28也具有良好的preS1免疫原性。
我们的结果表明,与合成的多肽相比,我们发明的优点在于vSA-28表达的SA-28蛋白的颗粒性为SA-28良好的免疫原性,提供了基础。而SA-28颗粒良好的分泌性,为制备新型乙肝基因工程亚单位疫苗的分离纯化提供了有利条件。
已知抗preS1(21-47)抗体具有中和病毒的能力而具保护作用。因而SA-28抗原,发展成新型乙肝疫苗有可能具有以下优越性:
1.除产生抗S抗体外,还能产生抗preS1抗体。能在中和病毒和阻断病毒与肝细胞结合两个环节上起作用。因此能得到更彻底的保护。
2.能较早的高水平的产生抗preS1抗体,提供更早的保护作用。
3.临床上约有10%的人群对S抗原不能产生应答反应,应用SA-28产生抗preS1抗体阻断病毒粒子与肝细胞的结合,也有可能诱导产生抗S抗体从而达到保护作用。
4.慢性乙肝患者是在于T细胞水平上对S抗原无反应,但在体内preS1抗原在T细胞水平上的免疫反应要大大高于S抗原。因而有可能在高剂量的SA-28作用下使T细胞反应帮助产生preS1抗体和抗S抗体,以中和并清除病毒颗粒,达到治疗的目的。