CN110819645A - 锦鲤Gtpch2基因、编码蛋白及其应用 - Google Patents

锦鲤Gtpch2基因、编码蛋白及其应用 Download PDF

Info

Publication number
CN110819645A
CN110819645A CN201911021373.6A CN201911021373A CN110819645A CN 110819645 A CN110819645 A CN 110819645A CN 201911021373 A CN201911021373 A CN 201911021373A CN 110819645 A CN110819645 A CN 110819645A
Authority
CN
China
Prior art keywords
gtpch2
recombinant
koi
gene
protein
Prior art date
Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
Granted
Application number
CN201911021373.6A
Other languages
English (en)
Other versions
CN110819645B (zh
Inventor
田雪
冯彩
马晓
宋飞彪
王良炎
王磊
吴利敏
刘慧芬
董传举
胡菊
李俊茹
李学军
Current Assignee (The listed assignees may be inaccurate. Google has not performed a legal analysis and makes no representation or warranty as to the accuracy of the list.)
Henan Normal University
Original Assignee
Henan Normal University
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Henan Normal University filed Critical Henan Normal University
Priority to CN201911021373.6A priority Critical patent/CN110819645B/zh
Publication of CN110819645A publication Critical patent/CN110819645A/zh
Application granted granted Critical
Publication of CN110819645B publication Critical patent/CN110819645B/zh
Active legal-status Critical Current
Anticipated expiration legal-status Critical

Links

Images

Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N9/00—Enzymes; Proenzymes; Compositions thereof; Processes for preparing, activating, inhibiting, separating or purifying enzymes
    • C12N9/14—Hydrolases (3)
    • C12N9/78—Hydrolases (3) acting on carbon to nitrogen bonds other than peptide bonds (3.5)
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
    • C12N15/09—Recombinant DNA-technology
    • C12N15/63—Introduction of foreign genetic material using vectors; Vectors; Use of hosts therefor; Regulation of expression
    • C12N15/70—Vectors or expression systems specially adapted for E. coli
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Y—ENZYMES
    • C12Y305/00—Hydrolases acting on carbon-nitrogen bonds, other than peptide bonds (3.5)
    • C12Y305/04—Hydrolases acting on carbon-nitrogen bonds, other than peptide bonds (3.5) in cyclic amidines (3.5.4)
    • C12Y305/04025—GTP cyclohydrolase II (3.5.4.25)
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
    • G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
    • G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
    • G01N33/53—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor
    • G01N33/573—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor for enzymes or isoenzymes
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N2333/00—Assays involving biological materials from specific organisms or of a specific nature
    • G01N2333/90—Enzymes; Proenzymes
    • G01N2333/914—Hydrolases (3)
    • G01N2333/978—Hydrolases (3) acting on carbon to nitrogen bonds other than peptide bonds (3.5)
    • Y—GENERAL TAGGING OF NEW TECHNOLOGICAL DEVELOPMENTS; GENERAL TAGGING OF CROSS-SECTIONAL TECHNOLOGIES SPANNING OVER SEVERAL SECTIONS OF THE IPC; TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC CROSS-REFERENCE ART COLLECTIONS [XRACs] AND DIGESTS
    • Y02—TECHNOLOGIES OR APPLICATIONS FOR MITIGATION OR ADAPTATION AGAINST CLIMATE CHANGE
    • Y02A—TECHNOLOGIES FOR ADAPTATION TO CLIMATE CHANGE
    • Y02A40/00—Adaptation technologies in agriculture, forestry, livestock or agroalimentary production
    • Y02A40/80—Adaptation technologies in agriculture, forestry, livestock or agroalimentary production in fisheries management
    • Y02A40/81—Aquaculture, e.g. of fish

Landscapes

  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Wood Science & Technology (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • Biomedical Technology (AREA)
  • Zoology (AREA)
  • General Engineering & Computer Science (AREA)
  • Biotechnology (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • Immunology (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • Physics & Mathematics (AREA)
  • Urology & Nephrology (AREA)
  • Hematology (AREA)
  • Cell Biology (AREA)
  • Plant Pathology (AREA)
  • Biophysics (AREA)
  • Food Science & Technology (AREA)
  • Analytical Chemistry (AREA)
  • General Physics & Mathematics (AREA)
  • Pathology (AREA)
  • Peptides Or Proteins (AREA)
  • Preparation Of Compounds By Using Micro-Organisms (AREA)
  • Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)

Abstract

本发明公开了一种锦鲤Gtpch2基因、编码蛋白及其应用，属于基因工程技术领域。本发明的技术方案要点为：锦鲤Gtpch2基因，该锦鲤Gtpch2基因的核苷酸序列如SEQ ID NO:2所示，还公开了含有上述锦鲤Gtpch2基因的重组表达载体、重组菌株及其在检测鱼类Gtpch2免疫印迹和免疫组化中的应用。本发明首次克隆获得锦鲤Gtpch2基因，并将该基因构建表达载体和重组大肠杆菌菌株，利用重组大肠杆菌菌种在体外获得大量表达的锦鲤Gtpch2蛋白，该蛋白可以用于免疫组化和免疫印迹等组织免疫学实验，检测和分析Gtpch2蛋白鱼类组织中的表达和定位。

Description

锦鲤Gtpch2基因、编码蛋白及其应用
技术领域
本发明属于基因工程技术领域，具体涉及一种锦鲤Gtpch2基因、编码蛋白及其应用。
背景技术
体色是鱼类的重要表型性状之一，由色素细胞形成。鱼类皮肤及鳞片中色素细胞的种类、数量和分布都会影响其体色。色素细胞由外胚层神经嵴细胞分化形成。在胚胎发育过程中，神经嵴细胞沿背腹轴分化成包括色素细胞在内的不同类型细胞。相对于哺乳动物只具有一种黑色素细胞，鱼类具有六种色素细胞，包括黑色素细胞、红色素细胞、黄色素细胞、虹彩细胞、蓝色素细胞和白色素细胞。蝶啶代谢通路在斑马鱼（Danio rerio）和花鳉（Poecilia reticulata）等鱼类中是调控体色变化的一条重要代谢通路。蝶啶代谢通路的终产物为黄色和微红的蝶啶色素。碟啶是由嘧啶和吡嗪环组成的杂环复合物，根据结构可以分为蝶呤和黄素两种类型。这些喋啶色素是以GTP为底物经过该通路转化而来，Gtpch（GTP cyclohydrolase）是碟啶合成通路的关键酶，对黄色素、蝶啶、果蝇蝶呤等色素的合成起重要的调控作用。Gtpch参与三个途径用于BH4和蝶啶色素化合物的合成：BH4的从头合成，氧化BH4的补救合成途径和参与生成黄色嘌呤色素/红色蝶啶色素。
锦鲤（Cyprinus carpio var. Koi）属于鲤科（Cyprinidae）、鲤属（Cyprinus），因体色丰富且组合形式多样化深受人们喜爱，是研究鱼类乃至脊椎动物体色变化的重要模式动物。目前为止，所有的锦鲤品系基本由杂交选育获得。但经杂交选育的锦鲤性状极不稳定，具有较高观赏价值的锦鲤个体很少。Gtpch蛋白参与生成黄色嘌呤色素/红色蝶啶色素。通过解析Gtpch2基因的功能，确定其在锦鲤黄色素和红色素形成中的作用，有助于定向培养体色遗传性状稳定的锦鲤，降低了锦鲤选育的成本，同时提高观赏鱼类的观赏性，对锦鲤乃至观赏鱼养殖业具有重要意义。
发明内容
本发明的目的是提供了一种锦鲤Gtpch2基因及含有该基因的重组表达载体、重组菌株及其在检测鱼类Gtpch2免疫印迹、免疫组化和组织定位分布中的应用。
本发明为实现上述目的采用如下技术方案，锦鲤Gtpch2基因，其特征在于：该锦鲤Gtpch2基因的核苷酸序列如SEQ ID NO:2所示。
本发明克隆了锦鲤Gtpch2基因，并得到了3'UTR和部分5'UTR。克隆的方法是常规的基因克隆方法，利用同源物种的基因比对设计简并引物，经过PCR后得到中间片段，然后根据中间片段的序列分别设计两个5'RACE的下游引物和两个3'RACE的上游引物，在利用通用引物UPM-L和UPM-S进行5'和3'嵌套PCR得到了Gtpch2的ORF、5'UTR和3'UTR。最后设计克隆ORF的引物，PCR后把得到目的基因连接到pMD-19载体为pMD-19-gtpch2。
本发明构建了含有锦鲤gtpch2的大肠杆菌表达载体，这个载体的构建方法是按常规方法利用自己所构建的载体pMD-19-gtpch2为模板，通过PCR方法合成带有酶切接头的锦鲤Gtpch2基因，经酶切和分离纯化后接入到已有的载体pET32a的相应酶切位点即BamH I和Sac I之间，即构建成所需的含有锦鲤Gtpch2基因的表达载体pET32a-gtpch2。
本发明还用上述含有锦鲤Gtpch2基因的相应表达载体构建了能高效表达锦鲤gtpch2基因的大肠杆菌重组株。
本发明的上述能表达锦鲤Gtpch2大肠杆菌重组菌株由含有锦鲤Gtpch2基因的表达载体pET32a-gtpch2转化大肠杆菌BL21而得到的菌株，命名为pET32a-gtpch2-BL21。
本发明还提供了利用上述大肠杆菌重组株生产锦鲤Gtpch2的方法。将该菌种接种在LB液体培养基中，37℃，200转/分培养至OD600达到0.4-0.6，然后加入IPTG至终浓度为1mM，37℃，200转/分培养4小时后5000g离心10min收集菌体，超声破碎后12000g离心10min收集上清，经分离纯化得到重组锦鲤Gtpch2蛋白。
锦鲤具有较高的经济价值，采用常规的基因工程技术，可利用本发明的锦鲤gtpch2基因重组株pET32a-gtpch2-BL21，生产重组锦鲤Gtpch2蛋白，并可进一步通过免疫组化和免疫印迹的方法检测Gtpch2蛋白在鱼类组织的分布和定位。
与现有技术相比，本发明具有以下有益效果：
本发明首次克隆获得锦鲤Gtpch2基因，并将该基因构建表达载体和重组大肠杆菌菌株，利用重组大肠杆菌菌种在体外获得大量表达的锦鲤Gtpch2蛋白，该蛋白可以用于免疫组化和免疫印迹等组织免疫学实验，检测和分析Gtpch2蛋白鱼类组织中的表达和定位。
附图说明
图1是以棉鲤的反转录cDNA为模板进行PCR扩增Gtpch2 ORF产物的凝胶电泳分析图，其中，M：Marker；1和2：PCR扩增产物；
图2是5'RACE和3'RACE的PCR电泳图；A是5'RACE第一轮产物的凝胶电泳图，其中M：Marker；1：PCR扩增产物；B是3'RACE第一轮产物的凝胶电泳图，其中M：Marker；1：PCR扩增产物；C是5'RACE第二轮产物的凝胶电泳图，其中M：Marker；1：PCR扩增产物；D是克隆Gtpch2中间片段产物的凝胶电泳图，其中M：Marker；1：PCR扩增产物；E是3'RACE第二轮产物的凝胶电泳图，其中M：Marker；1：PCR扩增产物；
图3中A是带酶切位点Gtpch2的PCR扩增凝胶电泳分析图，其中，M：Marker；1、2：PCR扩增产物；B是PCR扩增产物的电泳鉴定图；C是重组质粒pET32a-gtpch2的酶切鉴定凝胶电泳分析图，其中，M：Marker；1：pET32a-gtpch2 BamH I和SacI双酶切；2：pET32a-gtpch2未酶切；
图4中A是重组株pET32a-gtpch2-BL21表达产物Gtpch2的SDS-PAGE电泳分析图，其中：M：蛋白Marker；1：空载；2：未诱导菌液；3：重组株pET32a-gtpch2-BL21表达产物；4：纯化后的重组株pET32a-gtpch2-BL21表达产物；B是Western blot检测Gtpch2抗血清鉴定图谱；其中，M：蛋白Marker；1、2、3为Gtpch2在纯红锦鲤的鳍条、鳞片、皮肤的表达；4、5、6为Gtpch2在纯白锦鲤的鳍条、鳞片、皮肤的表达；C是重组锦鲤Gtpch2的单克隆抗体ECL显色图。
具体实施方式
以下通过实施例对本发明的上述内容做进一步详细说明，但不应该将此理解为本发明上述主题的范围仅限于以下的实施例，凡基于本发明上述内容实现的技术均属于本发明的范围。
实施例1
Gtpch2基因中间片段的克隆
对已报道的尼罗罗非鱼（Oreochromis niloticus），剑尾鱼（Xiphophorus maculatus），秀美花鳉（Poecilia formosa），斑马鱼（Danio rerio）中所获得的Gtpch2序列进行比对，找到相对保守区域，设计克隆锦鲤 Gtpch2序列中间片段的一对简并引物，上游引物为5' GGCAGAACTGAACGGTTTGT 3'，下游引物为5'CTCCACGCATGACCATACAC 3'；以锦鲤总RNA反转录后的cDNA为模板做PCR。PCR条件为：94℃ 3min；94℃ 30s，60℃ 30s，72℃ 2min，35个循环；72℃ 5min；4℃ ∞。PCR反应后的凝胶电泳图见图1。
实施例2
Gtpch2基因 5’RACE和3’RACE
根据已经获得的中间片段序列分别设计5'RACE和3'RACE各两条引物并利用通用引物UPM-L和UPM-S。
5'RACE out引物为：
AAP：5'ACATCGTAGATGGTCTCGTGGTAGC 3'、
5'RACE in引物为：
R1：5'ACTGTCAGCTCGCTAAAGCCGTTAC3'；
3'RACE out引物为:
F1：5'GATGGTCTCGTGGTAGCCTTTGGTC3'；
3'RACE in引物：
R1 5'CAAGCTTACTGAGGCCAACGACCTT3'。
以锦鲤总RNA反转录后的cDNA为模板做PCR。PCR条件为：94℃ 3min；94℃ 30s，56℃ 30s，72℃ 60s，35个循环；72℃ 10min；4℃ ∞。PCR反应后的凝胶电泳图见图2中的A、B、C、D、E。
实施例3
Gtpch2 ORF的克隆
根据实施例1和实施例2的结果，设计一对克隆Gtpch2 ORF的引物，上游引物F-ORF的核苷酸序列为5'ATGGAATACCAAAAGGCGGCAGA3'、下游引物R-ORF的核苷酸序列为5'TCATCTTCTGCACGCCACGCATA3'，以锦鲤总RNA反转录后的cDNA为模板做PCR。PCR条件为：94℃3min；94℃ 30s，61℃ 30s，72℃ 2min，35个循环；72℃ 2min；12℃ ∞。经过PCR后把得到的产物与pMD-19载体连接在一起为pMD-19-Gtpch2。PCR反应后的凝胶电泳图见图3中A。
实施例4
带酶切位点的斜带石斑鱼Gtpch2基因合成
根据自己克隆到的锦鲤Gtpch2基因的序列及限制性内切酶BamH I和SacI的识别序列以及保护碱基，设计合成一对特异性引物，上游引物F为 5'CGGGATCCGAGGCGTACACAACCATCCT3' 是在Gtpch2基因的成熟肽序列前添加了BamH I酶切识别位点和6×HIS标签，下游引物R为 5'CGAGCTCAAGCTTACTGAGGCCAACGA3'是在Gtpch2基因成熟肽序列后添加了保护碱基及SacI酶切识别位点。利用自己构建的pMD-19-Gtpch2为模板进行PCR反应，PCR反应条件为： 94℃ 3 min；94℃ 30s， 60℃ 30s，72℃ 2min，35个循环；72℃ 5min；12℃ ∞。PCR扩增产物的电泳鉴定图见图3中B。
实施例5
锦鲤Gtpch2基因的大肠杆菌表达载体pET32a-Gtpch2的构建
PCR产物用限制性内切酶BamH I和Sac I双酶切后，酶切产物用E.Z.N.A.® GelExtraction Kit回收，进行琼脂糖凝胶电泳，分离纯化锦鲤Gtpch2基因片段；载体质粒pET32a经限制性内切酶BamH I和SacI双酶切后分离纯化，与分离纯化斜带石斑鱼Gtpch2基因片段混合，用T4连接酶16℃连接过夜后用标准氯化钙转化法转入大肠杆菌DH5a中，用LB平板筛选具Ampicillin抗性的转化子，以标准方法提取质粒，用限制性内切酶BamH I和SacI双酶切重组质粒，得到大和小两个片段，大小分别与锦鲤Gtpch2基因和表达载体pET32a大小相同，证明锦鲤Gtpch2基因已克隆入大肠杆菌表达载体pET32a中，重组质粒命名为pET32a-Gtpch2。酶切分析图分别见图3中的C。
实施例6
能高效表达锦鲤Gtpch2的大肠杆菌重组株pET32a-Gtpch2-BL21的构建
制备好的重组质粒pET32a-gtpch2用热激法转入大肠杆菌BL21感受态细胞中，在含Ampicillin的LB平板上37℃进行培养。过夜后长出单克隆，挑取单克隆经诱导培养与鉴定筛选出能高效表达锦鲤Gtpch2的大肠杆菌重组株pET32a-Gtpch2-BL21。
实施例7
利用大肠杆菌基因工程菌pET32a-Gtpch2-BL21生产重组锦鲤Gtpch2
挑取大肠杆菌工程菌pET32a-Gtpch2-BL21单菌落接种在10ml LB液体培养基中，37℃，200转/分培养过夜，然后按照1:100的比例接种于1L LB液体培养基中，37℃，200转/分培养至OD600到0.4-0.6，然后加入IPTG使其终浓度为1mM， 37℃，200转/分培养4小时后5000g离心10min收集菌体，超声破碎后12000g离心10min收集上清，经分离纯化得到重组锦鲤Gtpch2蛋白。取3μL菌液加2×电泳上样缓冲液，煮沸10min后按标准方法跑SDS-PAGE凝胶电泳，同时取阴性对照按同样方法处理后电泳。阴性对照为空载质粒pET32a转化BL21后长出的单克隆培养后的菌液。结果见图4中的A。pET32a-Gtpch2-BL21表达破碎后上清用Novagen公司的His-bind Resin进行纯化处理，结果见图4中A。
将重组锦鲤Gtpch2蛋白采用免疫印迹（Western blot）方法进行鉴定。一抗为鼠抗HIS单克隆抗体（购自Novagen公司），二抗为羊抗鼠IgG-HRP（购自索莱宝生物工程有限公司）。结果见图4中B。
实施例8
重组锦鲤Gtpch2的单克隆抗体制备
锦鲤Gtpch2抗血清的制备：将纯化的Gtpch2融合蛋白和等体积弗氏完全佐剂充分混合后，每只小鼠皮下和腹腔注射融合蛋白300μg；初次免疫4周后加强免疫1次，接下来1周后眼球采血检测抗体效价。分离血清，分装后置-20℃保存。Western blot检测Gtpch2抗血清：将锦鲤皮肤、鳍条、鳞片分别提取蛋白以25μg的蛋白量上样，经SDS-PAGE凝胶电泳后，并转膜，依次加入按1:100稀释的锦鲤Gtpch2多克隆抗体及二抗HRP羊抗鼠IgG，ECL显色后观察结果。结果见图4中C。
以上实施例描述了本发明的基本原理、主要特征及优点，本行业的技术人员应该了解，本发明不受上述实施例的限制，上述实施例和说明书中描述的只是说明本发明的原理，在不脱离本发明原理的范围下，本发明还会有各种变化和改进，这些变化和改进均落入本发明保护的范围内。
序列表
<110> 河南师范大学
<120> 锦鲤Gtpch2基因、编码蛋白及其应用
<130> 2019
<141> 2019-10-25
<160> 13
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 209
<212> PRT
<213> 人工序列(artificial sequence)
<400> 1
Met Glu Tyr Gln Lys Ala Ala Glu Leu Asn Gly Leu Cys Asn Gly Lys
1 5 10 15
Ile Val Thr Glu Tyr Leu Cys Arg Asn Gly Phe Ser Glu Leu Thr Val
20 25 30
Asp Ala Lys Lys Val Ala Val Gln His Lys Asn Glu Thr Ser Arg Lys
35 40 45
Glu Ala Glu Asp Glu Ser Arg Leu Pro Ala Leu Glu Glu Ala Tyr Thr
50 55 60
Thr Ile Leu Arg Gly Leu Gly Glu Asn Thr Asp Arg Gln Gly Leu Leu
65 70 75 80
Lys Thr Pro Leu Arg Ala Ala Lys Ala Met Gln Phe Leu Thr Lys Gly
85 90 95
Tyr His Glu Thr Ile Tyr Asp Val Leu Asn Asp Ala Ile Phe Asp Glu
100 105 110
Asp His Glu Glu Leu Val Ile Val Lys Asp Ile Asp Met Glu Thr Phe
115 120 125
Ser Leu Cys Glu His His Leu Val Pro Phe Phe Gly Lys Val His Ile
130 135 140
Gly Tyr Leu Pro Ser Lys Lys Val Val Gly Leu Ser Lys Leu Ala Arg
145 150 155 160
Ile Val Glu Ile Tyr Ser Arg Arg Leu Gln Val Gln Glu Arg Leu Thr
165 170 175
Lys Gln Ile Ala Met Glu Thr Ala Ile Ser Glu Ala Leu Gln Pro Val
180 185 190
Gly Val Ala Val Val Ile Glu Ala Ala Phe Thr Cys Val Trp Leu Cys
195 200 205
Val Ala Cys Arg Arg
210
<210> 2
<211> 630
<212> DNA
<213> 人工序列(artificial sequence)
<400> 2
atggaatacc aaaaggcggc agaactgaac ggtttgtgca atggcaaaat tgtcacagag 60
tatctctgcc gtaacggctt tagcgagctg acagtcgatg cgaagaaagt cgccgtacag 120
cacaaaaacg agacatcccg gaaagaggcg gaggatgagt cgcggttacc tgctctggag 180
gaggcgtaca caaccatcct gcgaggtctg ggagagaaca cggaccgaca ggggctcctc 240
aaaaccccgc tccgtgcagc aaaggccatg cagttcctga ccaaaggcta ccacgagacc 300
atctacgatg tccttaatga tgccatcttt gatgaagacc acgaggagct tgttattgtg 360
aaagatattg acatgttttc actttgtgaa catcatctag taccattttt tggcaaggtt 420
cacattggat atctgccaag taaaaaggtc gttggcctca gtaagcttgc aaggattgtt 480
gaaatttaca gtcgcagact tcaagttcaa gagcgcctaa caaagcaaat agcaatggca 540
atctctgagg ccttgcagcc tgtcggtgtg gcagttgtca tcgaggcagc tttcacatgt 600
gtatggttat gcgtggcgtg cagaagatga 630
<210> 3
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列(artificial sequence)
<400> 3
ggcagaactg aacggtttgt 20
<210> 4
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列(artificial sequence)
<400> 4
ctccacgcat gaccatacac 20
<210> 5
<211> 22
<212> DNA
<213> 人工序列(artificial sequence)
<400> 5
ctaatacgac tcactatagg gc 22
<210> 6
<211> 45
<212> DNA
<213> 人工序列(artificial sequence)
<400> 6
ctaatacgac tcactatagg gcaagcagtg gtatcaacgc agagt 45
<210> 7
<211> 25
<212> DNA
<213> 人工序列(artificial sequence)
<400> 7
actgtcagct cgctaaagcc gttac 25
<210> 8
<211> 25
<212> DNA
<213> 人工序列(artificial sequence)
<400> 8
gatggtctcg tggtagcctt tggtc 25
<210> 9
<211> 25
<212> DNA
<213> 人工序列(artificial sequence)
<400> 9
caagcttact gaggccaacg acctt 25
<210> 10
<211> 23
<212> DNA
<213> 人工序列(artificial sequence)
<400> 10
atggaatacc aaaaggcggc aga 23
<210> 11
<211> 23
<212> DNA
<213> 人工序列(artificial sequence)
<400> 11
tcatcttctg cacgccacgc ata 23
<210> 12
<211> 28
<212> DNA
<213> 人工序列(artificial sequence)
<400> 12
cgggatccga ggcgtacaca accatcct 28
<210> 13
<211> 27
<212> DNA
<213> 人工序列(artificial sequence)
<400> 13
cgagctcaag cttactgagg ccaacga 27

Claims (8)

1.锦鲤Gtpch2基因，其特征在于：该锦鲤Gtpch2基因的核苷酸序列如SEQ ID NO:2所示。
2.权利要求1所述的锦鲤Gtpch2基因编码的锦鲤Gtpch2蛋白，其特征在于：该锦鲤Gtpch2蛋白的氨基酸序列如SEQ ID NO:1所示。
3.一种含有权利要求1所述的锦鲤Gtpch2基因的重组表达载体。
4.根据权利要求3所述的重组表达载体，其特征在于：所述重组表达载体为含有编码锦鲤Gtpch2蛋白基因的表达载体pET32a-Gtpch2。
5.权利要求3或4所述的重组表达载体转化的大肠杆菌重组菌株，其特征在于：该重组菌株是由含有编码锦鲤Gtpch2蛋白基因的表达载体pET32a-gtpch2转化大肠杆菌BL21而得到的大肠杆菌重组菌株pET32a-gtpch2-BL21。
6.权利要求5所述的大肠杆菌重组菌株在制备重组锦鲤Gtpch2蛋白中的应用。
7.根据权利要求6所述的应用，其特征在于重组锦鲤Gtpch2蛋白的具体制备过程为：将重组菌株接种在LB液体培养基中，37℃，20转/分培养至OD600达到0.4-0.6，再加入IPTG至终浓度为1mM，37℃，200转/分培养6h后5000g离心10min收集菌体，超声破碎后12000g离心10min收集上清，经分离纯化得到重组锦鲤Gtpch2蛋白。
8.权利要求2所述的锦鲤Gtpch2蛋白或权利要求6所述的重组锦鲤Gtpch2蛋白在检测鱼类Gtpch2免疫印迹和免疫组化中的应用，用于检测和分析Gtpch2蛋白鱼类组织中的表达和定位。
CN201911021373.6A 2019-10-25 2019-10-25 锦鲤Gtpch2基因、编码蛋白及其应用 Active CN110819645B (zh)

Priority Applications (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
CN201911021373.6A CN110819645B (zh) 2019-10-25 2019-10-25 锦鲤Gtpch2基因、编码蛋白及其应用

Applications Claiming Priority (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
CN201911021373.6A CN110819645B (zh) 2019-10-25 2019-10-25 锦鲤Gtpch2基因、编码蛋白及其应用

Publications (2)

Publication Number Publication Date
CN110819645A true CN110819645A (zh) 2020-02-21
CN110819645B CN110819645B (zh) 2023-08-15

Family

ID=69550813

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
CN201911021373.6A Active CN110819645B (zh) 2019-10-25 2019-10-25 锦鲤Gtpch2基因、编码蛋白及其应用

Country Status (1)

Country Link
CN (1) CN110819645B (zh)

Cited By (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN110714017A (zh) * 2019-11-06 2020-01-21 河南师范大学 锦鲤ptps基因、编码蛋白及应用

Citations (4)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US5846775A (en) * 1997-04-22 1998-12-08 Incyte Pharmaceuticals, Inc. GTP cyclohydrolase I regulatory protein
CN107937408A (zh) * 2017-10-24 2018-04-20 中山大学 斜带石斑鱼insulin基因、编码蛋白及其应用
CN109942694A (zh) * 2019-04-03 2019-06-28 河南师范大学 草鱼Akirin1基因、编码蛋白及其应用
CN110055259A (zh) * 2019-05-09 2019-07-26 河南师范大学 草鱼Akirin2基因、编码蛋白及其应用

Patent Citations (4)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US5846775A (en) * 1997-04-22 1998-12-08 Incyte Pharmaceuticals, Inc. GTP cyclohydrolase I regulatory protein
CN107937408A (zh) * 2017-10-24 2018-04-20 中山大学 斜带石斑鱼insulin基因、编码蛋白及其应用
CN109942694A (zh) * 2019-04-03 2019-06-28 河南师范大学 草鱼Akirin1基因、编码蛋白及其应用
CN110055259A (zh) * 2019-05-09 2019-07-26 河南师范大学 草鱼Akirin2基因、编码蛋白及其应用

Non-Patent Citations (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
GENBANK: "NCBI Reference Sequence: XP_026078455.1" *
李晓敏;李炯棠;肖贵宝;宋迎楠;王秀利;孙效文;: "红白锦鲤GTP环化水解酶1基因(Gch1)的表达及其进化分析" *

Cited By (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN110714017A (zh) * 2019-11-06 2020-01-21 河南师范大学 锦鲤ptps基因、编码蛋白及应用
CN110714017B (zh) * 2019-11-06 2023-09-01 河南师范大学 锦鲤ptps基因、编码蛋白及应用

Also Published As

Publication number Publication date
CN110819645B (zh) 2023-08-15

Similar Documents

Publication Publication Date Title
KR100316347B1 (ko) 대장균엔테로톡신ⅱ신호펩티드의변형체와인체성장호르몬의융합단백질을발현하는재조합미생물및그를이용한인체성장호르몬의제조방법
CN108912221A (zh) 用于生产重组融合蛋白的辅助蛋白、编码基因、重组融合蛋白、重组表达载体及制备方法
CN113637068B (zh) 一种重组i型人源化胶原蛋白c1l5t及其制备方法和用途
CA1341015C (en) Outer membrane protein f of pseudomonas aeruginosa
Takeda et al. Cloning, expression and characterization of horse L-ferritin in Escherichia coli
CN108840951A (zh) 一种由猪白蛋白、猪干扰素γ和猪干扰素α组成的融合蛋白及其制备方法
CN110819645B (zh) 锦鲤Gtpch2基因、编码蛋白及其应用
Ohbayashi et al. Isolation of cDNA, chromosome mapping, and expression of the human TBP-like protein
IE52781B1 (en) Human proinsulin and preproinsulin genes
CN107937408B (zh) 斜带石斑鱼insulin基因、编码蛋白及其应用
JPH06509229A (ja) シクロヘキシミド耐性タンパク質及びヌクレオチド配列
JPH02163088A (ja) 緑膿菌のリポタンパク質ｉ
CN109942694A (zh) 草鱼Akirin1基因、编码蛋白及其应用
KR101531286B1 (ko) 민물장어 단일체인 난포 자극 호르몬 폴리펩타이드 및 이의 용도
CN113372452B (zh) 一种细粒棘球绦虫重组蛋白CTLA4-IgV-EgG1Y162及其应用
CN103864939A (zh) mGM-CSF/βhCG融合蛋白及其制备方法和应用
CN100404680C (zh) 鸭B淋巴细胞刺激因子cDNA及其克隆方法和重组应用
CN110714017B (zh) 锦鲤ptps基因、编码蛋白及应用
JPH04144684A (ja) エンドセリン受容体
CN110055259A (zh) 草鱼Akirin2基因、编码蛋白及其应用
CN102121010B (zh) 暗纹东方鲀B淋巴细胞刺激因子cDNA及其克隆方法和重组应用
CN114621959B (zh) 一种编码牙鲆igf2可溶性蛋白的基因及蛋白重组表达方法与应用
CN113683707B (zh) 一种抗原融合蛋白及其编码基因和应用
CN108794644A (zh) 一种由牛白细胞介素2、牛干扰素γ和牛干扰素α组成的融合蛋白及其制备方法
CN108864305A (zh) 一种由羊白蛋白、羊干扰素γ和羊干扰素τ组成的融合蛋白及其制备方法

Legal Events

Date Code Title Description
PB01 Publication
PB01 Publication
SE01 Entry into force of request for substantive examination
SE01 Entry into force of request for substantive examination
GR01 Patent grant
GR01 Patent grant