CN110819579A

CN110819579A - 一种固态枯草芽孢杆菌菌剂的制备方法

Info

Publication number: CN110819579A
Application number: CN201911347786.3A
Authority: CN
Inventors: 毛相朝; 孙建安; 赵甜宇
Original assignee: Ocean University of China
Current assignee: Ocean University of China
Priority date: 2019-12-24
Filing date: 2019-12-24
Publication date: 2020-02-21

Abstract

本发明属于微生物菌剂技术领域，公开了一种固态枯草芽孢杆菌菌剂的制备方法。本发明固态枯草芽孢杆菌菌剂的制备方法包括以下步骤：(1)种子液制备，取枯草芽孢杆菌菌株，接种到LB培养基上培养，获得种子液；(2)菌泥的制备，将种子液按照7％‑12％的接种量接种到培养基中培养，培养结束后离心，获得菌泥；(3)制成菌悬液，将步骤(2)所得菌泥与质量浓度5％‑15％的甘油以1：6‑8的比例复溶制成菌悬液；(4)鼓风干燥。该方法利用枯草芽孢杆菌菌株进行液态发酵培养，得到一种可获得高芽孢数的培养基、培养条件，再通过载体与保护剂保护条件下的鼓风干燥工艺，制备出一种操作简单、成本低廉的固态微生物菌剂。

Description

一种固态枯草芽孢杆菌菌剂的制备方法

技术领域

本发明涉及微生物菌剂技术领域，具体是涉及一种固态枯草芽孢杆菌菌剂的制备方法。

背景技术

枯草芽孢杆菌是一种能形成内生抗逆芽孢的革兰氏阳性杆状细菌，可以抑制有害菌的生长，调节肠道菌群平衡，改善肠道微生态环境，提高消化酶活力，促进营养物质的吸收，提高免疫力。同时，枯草芽孢杆菌还是一种植物根际促生菌，可用作生物肥料，能够提高作物抗性、促进作物生长、改良土壤、改善作物品质。

近年来，枯草芽孢杆菌因其无毒无害、抗逆性强等优点在饲料、肥料中广泛应用，可作为抗生素、化学肥料和农药的替代品。但目前国内外菌剂的制备过程中，菌株发酵培养基多采用蛋白胨、酵母粉等，存在成分复杂、成本较高的缺点，且所采用的干燥技术多为真空冷冻干燥、喷雾干燥等，真空冷冻干燥适用范围广、菌体存活率高，但设备昂贵，耗时长，操作复杂，喷雾干燥技术操作简单，易于连续化生产，但热消耗大，投资成本高，且高温不利于菌体的存活。因此，如何在菌剂制备过程中降低能耗成本、缩短制备周期、提高菌剂存活率，对于枯草芽孢杆菌菌剂的高效制备和广泛推广应用，具有重要的理论价值和实际意义。

发明内容

本发明为了克服上述背景技术的不足，提供了一种固态枯草芽孢杆菌菌剂的制备方法。该方法利用枯草芽孢杆菌菌株进行液态发酵培养，得到一种可获得高芽孢数的培养基、培养条件，再通过载体与保护剂保护条件下的鼓风干燥工艺，制备出一种操作简单、成本低廉的固态微生物菌剂，这种菌剂可作为饲料添加剂和微生态制剂应用于饲料业、畜牧业，又可作为土壤生态制剂应用于种植业，为农业生产应用提供了一种可行的菌剂制备工艺。

为达到本发明的目的，本发明固态枯草芽孢杆菌菌剂的制备方法包括以下步骤：

(1)种子液制备，取枯草芽孢杆菌菌株，接种到LB培养基上培养，获得种子液；

(2)菌泥的制备，将种子液按照7％-12％的接种量接种到培养基中培养，培养结束后离心，获得菌泥，所述培养基是包含玉米淀粉、豆粕、葡萄糖中一种或多种的LB培养基；

(3)制成菌悬液，将步骤(2)所得菌泥与质量浓度5％-15％的甘油以1：6-8的比例复溶制成菌悬液；

(4)鼓风干燥，以沸石粉、玉米淀粉、麸皮粉末或虾头粉末作为烘干载体，将载体与菌悬液以2：3-4的质量体积比混合后，于45-55℃鼓风烘干6-10h。

进一步地，所述步骤(1)中以0.8％-1.2％的接种量接种到LB培养基上。

进一步地，所述步骤(1)中在28-32℃，180-220rpm摇瓶中培养22-26h。

进一步地，所述步骤(2)中培养基是包含质量分数为2.3％-2.8％的玉米淀粉、质量分数为2.8％-3.2％的豆粕、质量分数为1.8％-2.2％的葡萄糖的混合物的LB培养基。

优选地，所述步骤(2)中培养基是包含质量分数为2.5％的玉米淀粉、质量分数为3％的豆粕、质量分数为2％的葡萄糖的混合物的LB培养基。

优选地，所述步骤(2)中种子液按照7.5％-8.5％的接种量接种到培养基中培养。

进一步地，所述步骤(2)中在28-32℃，180-220rpm摇瓶中培养22-26h。

进一步地，所述步骤(2)中离心是于3-5℃，4500-5500rpm离心10-20min。

优选地，所述步骤(3)中菌泥与pH为6.5-7.5、质量浓度4.5％-5.5％的甘油以1：6.5-7.5的比例复溶制成菌悬液。

更优选地，所述步骤(4)中以虾头粉末作为烘干载体。

进一步优选地，所述步骤(4)中于50℃鼓风烘干6h。

与现有技术相比，本发明的液态发酵培养基成分简单、价格低廉、发酵周期短、培养芽孢数量高，固态微生物菌剂的制备方法简便、易于操作、成本低廉，适合工业化生产，且其原料豆粕、玉米淀粉、虾头等物质绿色且易于获取，本工艺可将其高值化，应用于饲料添加剂、生物肥料当中，具有实际意义。

附图说明

图1是本发明实施例1中玉米淀粉(a)、豆粕(b)、葡萄糖(c)添加量对芽孢数的影响；

图2是本发明实施例5中载体种类对菌体存活率的影响，其中zeolite为沸石粉，corn starch为玉米淀粉，wheat bran为麸皮粉末，shrimp head为虾头粉末；

图3是本发明实施例6中载体与菌悬液混合比例对菌体存活率的影响；

图4是本发明实施例7中保护剂种类对菌体存活率的影响，其中，Trehalose为海藻糖，skimmed milk powder为脱脂奶粉，glycerin为甘油，soluble starch为可溶性淀粉，chitosan为壳聚糖，contrast为仍用生理盐水复溶的对比例；

图5是本发明实施例8中保护剂浓度对菌体存活率的影响；

图6是本发明实施例9中菌泥与保护剂混合比例对菌体存活率的影响。

具体实施方式

为了使本发明的目的、技术方案及优点更加清楚明白，以下结合附图及实施例，对本发明进行进一步详细说明。本发明的附加方面和优点将在下面的描述中部分给出，部分将从下面的描述中变得明显，或通过本发明的实践了解到。应当理解，以下描述仅仅用以解释本发明，并不用于限定本发明。

本文中所用的术语“包含”、“包括”、“具有”、“含有”或其任何其它变形，意在覆盖非排它性的包括。例如，包含所列要素的组合物、步骤、方法、制品或装置不必仅限于那些要素，而是可以包括未明确列出的其它要素或此种组合物、步骤、方法、制品或装置所固有的要素。

当量、浓度、或者其它值或参数以范围、优选范围、或一系列上限优选值和下限优选值限定的范围表示时，这应当被理解为具体公开了由任何范围上限或优选值与任何范围下限或优选值的任一配对所形成的所有范围，而不论该范围是否单独公开了。例如，当公开了范围“1至5”时，所描述的范围应被解释为包括范围“1至4”、“1至3”、“1至2”、“1至2和4至5”、“1至3和5”等。当数值范围在本文中被描述时，除非另外说明，否则该范围意图包括其端值和在该范围内的所有整数和分数。

本发明要素或组分前的不定冠词“一种”和“一个”对要素或组分的数量要求(即出现次数)无限制性。因此“一个”或“一种”应被解读为包括一个或至少一个，并且单数形式的要素或组分也包括复数形式，除非所述数量明显只指单数形式。

本发明各个实施方式中所涉及到的技术特征只要彼此之间未构成冲突就可以相互组合，所涉及到的试剂都为分析纯。

本发明各个实施方式中芽孢数的测定方法为：液体菌液直接进行测定，固体菌剂制备成浸提液(取2g固态样品加入含有7-10颗玻璃珠的20mL无菌水，置于200rpm的恒温振荡器中震荡30min即获得浸提液)后进行测定。将菌液/浸提液置于80℃水浴中维持15min后，吸取100μL的菌液/浸提液加入到900μL无菌生理盐水中，混匀制成1:10样品匀液，依次做10倍系列稀释，分别吸取各稀释度的100μL稀释液注入到平板计数培养基中，用涂布棒将稀释液混匀铺平，倒置，于30℃恒温培养箱中培养24h，选取菌落数在30-300之间的培养皿计菌落数。

水分含量测定采用全自动水分测定仪进行测定。

产品得率的计算公式如下：

存活率的计算公式如下：

离心回收率的计算公式如下：

本发明固态枯草芽孢杆菌菌剂的制备方法包括以下步骤：

(1)种子液制备，取-20℃保藏的枯草芽孢杆菌甘油管菌株，接种到LB培养基上培养，获得种子液；

(2)菌泥的制备，将种子液按照6-8％的接种量接种到培养基中培养，培养结束后离心，获得菌泥，所述培养基是包含玉米淀粉、豆粕、葡萄糖中的一种或多种的LB培养基；

(3)制成菌悬液，将步骤(2)所得菌泥与pH为7.0的生理盐水以1：7的比例复溶制成菌悬液；

(4)干燥，将载体与菌悬液混合后，于50℃干燥6h。

若无特别说明，所述步骤(1)中以1％的接种量接种到LB培养基上；所述步骤(1)中在30℃，200rpm摇瓶中培养24h；所述步骤(2)中在30℃，200rpm摇瓶中培养24h；所述步骤(3)中于4℃，5000rpm离心15min；所述步骤(4)中干燥方式为鼓风干燥，以虾头粉末作为烘干载体，载体与菌悬液以1：2的比例混合。

实施例1

取-20℃保藏的枯草芽孢杆菌甘油管菌株，接种到LB培养基上培养，获得种子液，将种子液按照7％的接种量接种到包含玉米淀粉、豆粕、葡萄糖中的一种的LB培养基中培养，30℃，200rpm培养28h，测定芽孢数。单因素实验结果如图2所示，随着玉米淀粉、豆粕、葡萄糖质量含量的增加，芽孢数均分别呈先增加后减少的趋势，说明三种物质的浓度过高或过低均不适于芽孢的形成。玉米淀粉含量为2％时，芽孢数最多(图1a)。豆粕含量的改变对芽孢数的影响较大，不同含量时，芽孢数的差异较为显著，豆粕含量为3％时，芽孢数最多，可达到4.4×10⁹CFU/mL(图1b)。多于或少于2.5％的葡萄糖含量均不适合芽孢最大量的形成，葡萄糖含量为2.5％时，芽孢数量最多(图1c)。

实施例2

与实施例1不同的是，将种子液按照7％的接种量接种到包含玉米淀粉、豆粕、葡萄糖的混合物的LB培养基中培养，通过改变玉米淀粉、豆粕、葡萄糖的添加量，确定最佳配比的培养基。芽孢数如表1所示。

表1改变玉米淀粉、豆粕、葡萄糖的添加量对芽孢数的影响

由表3可知，当选用包含玉米淀粉、豆粕、葡萄糖的混合物的LB培养基中培养时，芽孢数比选用包含玉米淀粉、豆粕、葡萄糖中一种的培养基明显多些，玉米淀粉、豆粕、葡萄糖中各因素对枯草芽孢杆菌芽孢数的影响大小为玉米淀粉＞豆粕＞葡萄糖。通过分析，培养基最佳方案为包含质量分数为2.5％的玉米淀粉、质量分数为3％的豆粕、质量分数为2％的葡萄糖的混合物的LB培养基，此时芽孢数达到3.9×10¹⁰CFU/mL。

实施例3

选用实施例2最佳配比的培养基，在此基础上，改变培养温度或种子液的接种量，当仅改变培养温度时或仅改变接种量时，芽孢数如表2所示。

表2改变培养温度或接种量对芽孢数的影响

实施例4

目前常用的干燥技术有真空冷冻干燥、喷雾干燥、鼓风干燥、微波真空干燥等。真空冷冻干燥、微波真空干燥的时间成本、运行成本较高，不适合商业化大规模生产。本实验选用实施例2中最佳配比的培养基，接种量改为8％，在此基础上，选取喷雾干燥、鼓风干燥两种干燥方式按本发明具体实施方式所述方法(即实施例1前面所述方法)制备菌剂进行比较。实验结果如表5所示。

表5不同干燥方法制备菌剂

由表5可知，以玉米淀粉为助剂进行喷雾干燥，芽孢存活率和得率较沸石粉高，但也仅为30％。鼓风干燥实验中，以沸石粉为载体进行烘干，芽孢存活率和得率较玉米淀粉为载体的高，且远高于以玉米淀粉或沸石粉为助剂进行喷雾干燥，固形物基本无损失。考虑到喷雾干燥的热能、电能消耗较高，且得率较低，本发明选用鼓风干燥制备菌剂。

实施例5

选取合适的基质作为吸附菌液的载体，才能够保证菌剂的产品质量和使用效果。在实施例4选用鼓风干燥制备菌剂的基础上，本实施例除选取沸石粉或玉米淀粉作为干燥载体外，还选取麸皮粉末或虾头粉末作为干燥载体，从图2可以看出，虾头粉末作为烘干载体时，较其他载体的存活率高，且超过100％，这可能是因为在烘干过程中原本的营养细胞因环境变得恶劣而休眠，形成了芽孢，也可能是虾头作为一种营养物质，有利于菌体在温度不高的烘干过程中再次增殖。虾类废弃物含有甲壳素、蛋白质、脂质、钙盐等有价值的化合物，然而大多虾副产物却未能利用。虾类废弃物日益增加，造成了严重的环境问题和经济问题，因此，将其作为微生物菌剂载体进行高值化利用，具有重要意义。

实施例6

在实施例5选用鼓风干燥制备菌剂，选取虾头粉末作为干燥载体的基础上，改变载体与菌悬液的比例，菌体存活率如图3所示。由图3可知，随着载体添加量的减少，存活率呈先升高后降低的趋势。在一定范围内，菌悬液添加量的增多引起菌体与载体结合的增多，存活率增大，当载体与菌悬液以2:3的比例混合时，存活率最高。当菌悬液添加量增大到一定程度，载体过饱和，菌体无法与之结合，使得存活率降低，载体与菌悬液以1:3的比例混合时，可观察到有少许菌液无法吸附。

实施例7

在干燥过程中，细胞因脱水引起渗透压增高、细胞萎缩、蛋白质变性从而导致菌体死亡。如图4所示，在生理盐水中添加海藻糖、脱脂奶粉、甘油、可溶性淀粉、壳聚糖作为保护剂(质量浓度都为7％)，与直接用生理盐水复溶的菌体相比，添加海藻糖、脱脂奶粉、甘油作为保护剂存活率高，以甘油为保护剂，存活率最高。甘油作为一种渗透性保护剂能够进入细胞，维持其渗透压，同时其带有的羟基能够取代水分子与细胞膜上的蛋白质形成氢键，维持、保护蛋白质的结构和功能。可溶性淀粉、壳聚糖作为保护剂时，存活率低于生理盐水复溶的菌悬液，可能是因为壳聚糖灭菌后的溶解性较差，未能完全发挥作用造成的，而可溶性淀粉灭菌冷却后呈凝胶状，不利于操作的进行。

实施例8

在实施例7选用甘油作为保护剂的基础上，改变甘油的浓度。如图5所示，甘油的加入可以提高菌体存活率，甘油浓度为5％时，存活率最高，可达140％左右，随着甘油浓度的增大，存活率开始降低，这可能与渗透压升高有关，加入20％的甘油后由于浓度过高，添加后使产品变得粘腻。

实施例9

在实施例8选用5％的甘油作为保护剂的基础上，改变菌泥与保护剂的比例。由图6可知，在一定范围内，菌泥与保护剂的比例比值越小，即保护剂的添加量越多，存活率越高，因为保护剂添加量不足会使得大量菌体因裸露而得不到保护，影响存活率。菌泥与甘油的质量/体积混合比例为1:7时，存活率最好，可达150％左右。随着比值继续增大，存活率降低，这可能是因为菌泥与保护剂的混合比例不同引起的菌体周围保护剂浓度的变化，过高的浓度会影响枯草芽孢杆菌细胞的渗透压和通透性，从而导致存活率不高。

实施例10

在实施例9菌泥与甘油的质量/体积混合比例为1：7的基础上，考察烘干时间对活菌数的影响，随着烘干时间的增加，固态发酵样品的水分含量逐渐降低，并在6h后基本稳定。随着烘干时间的延长、水分含量的降低，单位质量中的干物质增加，则单位质量中的活菌数随之增加，并在6h后，活菌数趋于稳定，考虑到时间成本，可选择烘干时间6-10h作为制备菌剂的最佳时间。

本领域的技术人员容易理解，以上所述仅为本发明的实施例而已，并不用以限制本发明，凡在本发明的精神和原则之内所作的任何修改、等同替换和改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。

Claims

1.一种固态枯草芽孢杆菌菌剂的制备方法，其特征在于，所述固态枯草芽孢杆菌菌剂的制备方法包括以下步骤：

2.根据权利要求1所述的固态枯草芽孢杆菌菌剂的制备方法，其特征在于，所述步骤(1)中以0.8％-1.2％的接种量接种到LB培养基上。

3.根据权利要求1所述的固态枯草芽孢杆菌菌剂的制备方法，其特征在于，所述步骤(1)中在28-32℃，180-220rpm摇瓶中培养22-26h。

4.根据权利要求1所述的固态枯草芽孢杆菌菌剂的制备方法，其特征在于，所述步骤(2)中培养基是包含质量分数为2.3％-2.8％的玉米淀粉、质量分数为2.8％-3.2％的豆粕、质量分数为1.8％-2.2％的葡萄糖的混合物的LB培养基。

5.根据权利要求4所述的固态枯草芽孢杆菌菌剂的制备方法，其特征在于，所述步骤(2)中培养基是包含质量分数为2.5％的玉米淀粉、质量分数为3％的豆粕、质量分数为2％的葡萄糖的混合物的LB培养基。

6.根据权利要求1所述的固态枯草芽孢杆菌菌剂的制备方法，其特征在于，所述步骤(2)中种子液按照7.5％-8.5％的接种量接种到培养基中培养。

7.根据权利要求1所述的固态枯草芽孢杆菌菌剂的制备方法，其特征在于，所述步骤(2)中在28-32℃，180-220rpm摇瓶中培养22-26h。

8.根据权利要求1所述的固态枯草芽孢杆菌菌剂的制备方法，其特征在于，所述步骤(2)中离心是于3-5℃，4500-5500rpm离心10-20min。

9.根据权利要求1所述的固态枯草芽孢杆菌菌剂的制备方法，其特征在于，所述步骤(3)中菌泥与pH为6.5-7.5、质量浓度4.5％-5.5％的甘油以1：6.5-7.5的比例复溶制成菌悬液。

10.根据权利要求1所述的固态枯草芽孢杆菌菌剂的制备方法，其特征在于，所述步骤(4)中以虾头粉末作为烘干载体；优选地，所述步骤(4)中于50℃鼓风烘干6h。