CN110812472A - E3泛素连接酶stub1在抑制乙型肝炎病毒复制中的应用 - Google Patents

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Abstract

本发明公开了一种E3泛素连接酶stub1在抑制乙型肝炎病毒复制中的应用，涉及生物医药领域，所述应用是指E3泛素连接酶stub1基因或所述E3泛素连接酶stub1基因的表达产物在抑制乙型肝炎病毒复制中的应用。本发明提供的E3泛素连接酶stub1能够泛素化HSP90的底物蛋白，并与乙型肝炎病毒核心蛋白HBc结合、缩短其半衰期，下调衣壳蛋白，有效抑制乙肝病毒的复制，且弥补了衣壳蛋白抑制剂如HAPs等类药物代谢快、半衰期短的缺点，在抑制、清除乙肝病毒方面具有良好的应用前景。而且，因为E3泛素连接酶stub1发挥功能需要与HSP70、HSP90形成符合体并降解乙肝的衣壳蛋白，所以HSP90抑制剂可以增强其功能，发挥stub1类似的功能。

Description

E3泛素连接酶stub1在抑制乙型肝炎病毒复制中的应用
技术领域
本发明涉及生物医药领域，尤其涉及一种E3泛素连接酶stub1在抑制乙型肝炎病毒复制中的应用。
背景技术
乙型肝炎病毒(HBV)属于嗜肝DNA病毒科。HBV感染导致慢性乙型肝炎，并与肝硬化、肝癌的发生、发展密切相关。50％以上的原发性肝癌与HBV相关。我国是HBV感染高发区，有超过一亿人的HBV携带者。目前批准的抗病毒药物主要有干扰素(包括IFN-α和PEG-IFN)和核苷酸类似物，它们可以抑制病毒逆转录酶，降低病毒滴度，但它们对乙肝病毒的清除率很低。
HBV核心蛋白(HBc)，也称为衣壳蛋白，为病毒结构蛋白，是HBV核衣壳的主要组成成分。目前针对衣壳蛋白的抑制剂成为抗HBV药物研发的热点。Deres,K等研究人员在筛选抑制乙肝复制的药物时发现异芳基二氢嘧啶(heteroaryldihydropyrimidines，HAPs)如Bay41-4109，可以通过与HBc结合抑制核衣壳的正常组装，同时使得HBc的半衰期大大缩短。目前，一些HAPs化合物已在进行I期、II期临床实验，但这些化合物在体内的代谢速度很快，在动物水平效果还有待改善。
HBV的复制需要许多细胞蛋白的帮助，如热休克蛋白90(HSP90)等。同时一些细胞的蛋白如apobec3c等也是HBV的复制的限制因子。Stub1是一个E3泛素连接酶，能泛素化与热休克蛋白结合的底物蛋白。Stub1是否泛素化HSP90的底物蛋白决定了该底物蛋白是被HSP90重折叠，还是被降解。因此，stub1在细胞的蛋白质质量控制和蛋白质平衡中起了关键的角色。
因此，本领域的技术人员致力于开发一种E3泛素连接酶，能够下调乙肝病毒衣壳蛋白，弥补HAPs等类药物代谢快、半衰期短的缺点，提高抑制乙肝病毒复制的效果。
发明内容
有鉴于现有技术的上述缺陷，本发明所要解决的技术问题是如何开发一种E3泛素连接酶，使其具有下调乙肝病毒衣壳蛋白、高效抑制乙肝病毒复制的效果，且不存在代谢快、半衰期短等缺点。
为实现上述目的，本发明提供了一种E3泛素连接酶stub1在抑制乙型肝炎病毒复制中的应用。
进一步地，所述应用是指E3泛素连接酶stub1基因或所述E3泛素连接酶stub1基因的表达产物在抑制乙型肝炎病毒复制中的应用。
进一步地，所述E3泛素连接酶stub1基因的表达产物包括stub1蛋白，以及具有该活性的stub1的突变体和功能结构域。
进一步地，所述E3泛素连接酶stub1基因可通过载体递送到感染乙型肝炎病毒的细胞中发挥作用。
进一步地，所述载体包括腺病毒、腺相关病毒、慢病毒、质粒。
进一步地，所述E3泛素连接酶stub1能够与HSP90的客户蛋白HBc结合，缩短其半衰期，并由此下调HBc蛋白水平。
进一步地，还可结合HSP90抑制剂使用，通过增强所述E3泛素连接酶stub1的功能，从而发挥作用。
进一步地，所述HSP90抑制剂包括格尔德霉素及其衍生物。
进一步地，还可结合衣壳蛋白抑制剂使用。
进一步地，所述衣壳蛋白抑制剂包括异芳基二氢嘧啶HAPs。
与现有技术相比，本发明至少具备以下有益的技术效果：
(1)本发明提供的E3泛素连接酶stub1能够与核心蛋白HBc高效结合并促进其降解，进而显著下调乙肝病毒衣壳蛋白、抑制乙肝病毒的复制；
(2)本发明提供的E3泛素连接酶stub1可以弥补衣壳蛋白抑制剂如HAPs等类药物代谢较快的缺点、提高抑制效率。
以下将结合附图对本发明的构思、具体结构及产生的技术效果作进一步说明，以充分地了解本发明的目的、特征和效果。
附图说明
图1是本发明的一个较佳实施例的stub1降低HepAD38细胞分泌的HBV病毒DNA水平；
图2是本发明的一个较佳实施例的stub1降低HepGAD38细胞内乙肝病毒核心蛋白的水平；
图3是本发明的一个较佳实施例的stub1调控HBc的半衰期的效果示意图；
图4是本发明的一个较佳实施例的Hsp90抑制剂调控HBc的半衰期的效果示意图；
图5是本发明的一个较佳实施例的stub1提高Bay41-4109抑制HepAD38细胞分泌乙肝病毒的能力水平结果图；
图6是本发明的一个较佳实施例的Hsp90的抑制剂提高Bay41-4109抑制HepAD38细胞分泌乙肝病毒的能力水平结果图；
图7是本发明的一个较佳实施例的stub1下调HBV转基因小鼠血清中HBV DNA水平结果示意图；
图8是本发明的一个较佳实施例的尾静脉注射腺相关病毒8型在转基因小鼠肝脏组织中过表达stub1以及Bay41-4109和17AAG药物处理流程示意图；
图9是本发明的一个较佳实施例的stub1或17AAG提高Bay41-4109对HBV转基因小鼠血清HBV DNA的抑制效果示意图。
具体实施方式
以下参考说明书附图介绍本发明的多个优选实施例，使其技术内容更加清楚和便于理解。本发明可以通过许多不同形式的实施例来得以体现，本发明的保护范围并非仅限于文中提到的实施例。
实施例1stub1和HSP90抑制剂在细胞中抑制HBV的效果以及与HAPs联用的效果
我们采用整合了HBV基因组的HepAD38细胞系，其在无四环素诱导时能稳定产生感染性HBV颗粒。以表达stub1的重组腺病毒(Ad-stub1)或空载体对照病毒(Ad-GFP)感染HepAD38细胞，感染的同时给细胞更换培养液，3天后取培养液用乙肝病毒DNA检测试剂盒(圣湘)检测。
结果如图1所示，过表达stub1时细胞外病毒DNA减少。裂解HepAD38细胞，采用western blot检测HBc蛋白和actin蛋白(如图2所示)。结果表面stub1的过表达显著降低了HBc蛋白水平，而空载体没有引起任何差异。
为了研究stub1是否能降低HBc的半衰期，我们通过环己酰亚胺(CHX)阻断了Huh7-HBc细胞内的蛋白质合成，并在24小时内追踪HBc蛋白水平。尽管HBc非常稳定，但当stub1过度表达时，HBc的半衰期在Huh7-HBc细胞中从19小时缩短到6小时左右(如图3所示)。Hsp90的抑制剂17AAG处理细胞也显著缩短了HBc的半衰期(如图4所示)。
由于stub1的过表达具有缩短HBc半衰期的效果，我们测试了过表达stub1后Bay41的抑制效果。采用0-8μM Bay41-4109处理HepAD38细胞，2天后用Ad-stub1或对照Ad-GFP感染细胞，4天后收集培养液检测HBV DNA。结果表面，stub1显著提高Bay41效力(如图5所示)。同样，HSP90的抑制剂17AAG也显著提高Bay41-4109效力(如图6所示)。
实施例2乙肝转基因小鼠体内stub1和HSP90抑制剂对HBV抑制效果以及与HAPs联用的效果
选取8周龄大小的C57BL/6型HBV转基因雄性小鼠，实验组和对照组5只，选取的小鼠血清中HBV病毒滴度约为5-6×106IU/ml。stub1实验组每只小鼠尾静脉注射表达stub1的重组腺相关病毒8型(AAV-stub1)，用量为1x1012 v.g/只，对照组每只小鼠尾静脉注射同样剂量的空载体对照病毒(AAV-GFP)，注射后20天设为第0天。于第0天、第6天、第12天、第18天、第24天和第30天进行划眼眶取血，取血清，测小鼠血清中病毒滴度。
结果如图7所示，对照组小鼠血清中HBV DNA含量在前20天在5.0-8.0×106IU/ml左右。实验组小鼠血清中HBV DNA含量总体呈下降趋势，由6.0×106IU/ml下降至1.5×106IU/ml左右。这说明stub1降低HBV转基因小鼠血清中病毒滴度。
我们也在HBV转基因小鼠中研究stub1和Hsp90抑制剂17AAG是否提高Bay41-4109对HBV的抑制效果。将小鼠分为4个不同的实验组(每组5只)，处理如下:i)对照溶剂和AAV-GFP，ii)Bay41-4109和AAV-GFP，iii)Bay41-4109 and AAV-stub1，iv)Bay41-4109 and17AAG。给药和AAV处理时间如图8所示，AAV提前三周通过尾静脉注射，Bay41-4109(10mg/kg体重)和17AAG(50mg/kg体重)腹腔注射，注射频率分别为一天两次和两天一次。给药第30天Bay41-4109抑制血清HBV DNA 1.8log 10copies/ml。BAY41-4109联合17AAG或stub1过表达在血清中进一步抑制约1log 10copies/ml(如图9所示)。
以上详细描述了本发明的较佳具体实施例。应当理解，本领域的普通技术无需创造性劳动就可以根据本发明的构思作出诸多修改和变化。因此，凡本技术领域中技术人员依本发明的构思在现有技术的基础上通过逻辑分析、推理或者有限的实验可以得到的技术方案，皆应在由权利要求书所确定的保护范围内。

Claims (10)

1.一种E3泛素连接酶stub1在抑制乙型肝炎病毒复制中的应用。
2.如权利要求1所述的E3泛素连接酶stub1在抑制乙型肝炎病毒复制中的应用，其特征在于，所述应用是指E3泛素连接酶stub1基因或所述E3泛素连接酶stub1基因的表达产物在抑制乙型肝炎病毒复制中的应用。
3.如权利要求2所述的E3泛素连接酶stub1在抑制乙型肝炎病毒复制中的应用，其特征在于，所述E3泛素连接酶stub1基因的表达产物包括stub1蛋白，以及具有该活性的stub1的突变体和功能结构域。
4.如权利要求2所述的E3泛素连接酶stub1在抑制乙型肝炎病毒复制中的应用，其特征在于，所述E3泛素连接酶stub1基因可通过载体递送到感染乙型肝炎病毒的细胞中发挥作用。
5.如权利要求4所述的E3泛素连接酶stub1在抑制乙型肝炎病毒复制中的应用，其特征在于，所述载体包括腺病毒、腺相关病毒、慢病毒、质粒。
6.如权利要求1所述的E3泛素连接酶stub1在抑制乙型肝炎病毒复制中的应用，其特征在于，所述E3泛素连接酶stub1能够与HSP90的客户蛋白HBc结合，缩短其半衰期，并由此下调HBc蛋白水平。
7.如权利要求1所述的E3泛素连接酶stub1在抑制乙型肝炎病毒复制中的应用，其特征在于，还可结合HSP90抑制剂使用，通过增强所述E3泛素连接酶stub1的功能，从而发挥作用。
8.如权利要求7所述的E3泛素连接酶stub1在抑制乙型肝炎病毒复制中的应用，其特征在于，所述HSP90抑制剂包括格尔德霉素及其衍生物。
9.如权利要求1所述的E3泛素连接酶stub1在抑制乙型肝炎病毒复制中的应用，其特征在于，还可结合衣壳蛋白抑制剂使用。
10.如权利要求9所述的E3泛素连接酶stub1在抑制乙型肝炎病毒复制中的应用，其特征在于，所述衣壳蛋白抑制剂包括异芳基二氢嘧啶HAPs。
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