CN110804601A

CN110804601A - 一种利用己糖培养基生产纳豆激酶的方法

Info

Publication number: CN110804601A
Application number: CN201911265275.7A
Authority: CN
Inventors: 孙婧; 蒋继宏
Original assignee: Jiangsu Normal University
Current assignee: Jiangsu Normal University
Priority date: 2019-12-11
Filing date: 2019-12-11
Publication date: 2020-02-18

Abstract

一种利用己糖培养基生产纳豆激酶的方法，包括：在摇瓶反应器中加入一定量的含己糖培液体养基，高温灭菌后备用；将活化后的枯草芽孢杆菌种子液接入摇瓶反应器中进行振荡培养，其中，培养温度为21℃‑37℃，摇瓶反应器的转速为180rpm，种子液接种量为2％，培养基初始pH5‑9。本发明针对纳豆芽孢杆菌生产纳豆激酶过程中普遍存在的纳豆激酶活力低的瓶颈问题，改进培养基碳源并进一步优化培养条件，促进了纳豆激酶活力的提升。本发明所采用的木糖是一种廉价的碳源，在提高纳豆激酶活力的同时有利于减少生产成本提高产品价值，根据商业化应用的不同需要，可进行下一步深加工。

Description

一种利用己糖培养基生产纳豆激酶的方法

技术领域

本发明涉及发酵工程，具体涉及一种利用己糖培养基促使纳豆芽孢杆菌生产纳豆激酶并提高纳豆激酶总活力的方法。

背景技术

纳豆激酶是一种丝氨酸蛋白酶，最早由科学家由纳豆芽孢杆菌的分泌物中提取并鉴定功效。血栓导致的心血管疾病威胁着人类健康，数据显示全世界每年大概有1700多万人死于这些疾病。血栓形成的主要原因是血液中纤维蛋白过多，阻塞血管中血液的流动。纳豆激酶具有较强的纤溶活性，因而具有预防和治疗血栓相关疾病的能力。纳豆激酶有助于改善血液循环，降低血粘度，改善血液循环。纳豆激酶在血液中可保留超过3小时，比其他纤溶酶(如尿激酶)具有更强的溶栓活性，可降低血栓形成的风险。同时纳豆激酶不易被胃酸分解，因而可以口服给药，具有很强的应用价值。纳豆激酶及其衍生物已广泛用作人类健康食品，医药和其他高附加值领域。

纳豆激酶在传统上是由多种微生物发酵产生的，其中以纳豆芽孢杆菌产生纳豆激酶的效果最为突出。纳豆芽孢杆菌是从纳豆发酵过程中分离出来的一种好氧的产芽孢杆菌，隶属于枯草芽孢杆菌。纳豆芽孢杆菌生长周期短，环境友好，对人类与动物没有危害。纳豆芽孢杆菌可以天然分泌纳豆激酶，是一类广泛应用于食品、药物、保健品等行业的益生菌，利用纳豆芽孢杆菌生产纳豆激酶在工业上具有优良的应用前景和生产潜力。

发明内容

本发明的目的是提供一种利用己糖培养基生产纳豆激酶的方法，通过接入纳豆枯草芽孢杆菌菌液，优化培养条件，促使提高纳豆激酶活力。

为实现上述发明目的，本发明的技术方案具体如下：

一种利用己糖培养基生产纳豆激酶的方法，包括以下步骤：

S1：在摇瓶反应器中加入一定量的含己糖培液体养基，高温灭菌后备用；

S2：将活化后的枯草芽孢杆菌种子液接入摇瓶反应器中进行振荡培养，其中，培养温度为21℃-37℃，摇瓶反应器的转速为180rpm，种子液接种量为2％，培养基初始pH5-9。

进一步的，所述培养基的成分包括以重量比例计的以下各组分：

2％的己糖，2％的胰蛋白胨，0.5％的NaCl，余量为水。

进一步的，所述己糖为葡萄糖、木糖、果糖或甘露糖。

进一步的，所述己糖为木糖。

与现有技术相比，本发明的有益效果：

本发明针对纳豆芽孢杆菌生产纳豆激酶过程中普遍存在的纳豆激酶活力低的瓶颈问题，改进培养基碳源并进一步优化培养条件，促进了纳豆激酶活力的提升。本发明采用的纳豆芽孢杆菌是一种高度工业化的环境友好型的益生菌，所获得的纳豆激酶属于安全无害产品；优化后所采用的木糖是一种廉价的碳源，在提高纳豆激酶活力的同时有利于减少生产成本提高产品价值，根据商业化应用的不同需要，可进行下一步深加工。

附图说明

图1是本发明实施例1中，测定不同碳源对纳豆激酶活力的影响，即：在摇瓶反应器中，纳豆芽孢杆菌在四种不同的己糖(葡萄糖，木糖，果糖，甘露糖)液体培养基中，培养体系中纳豆激酶活力的测定情况；

图2是本发明实施例2中，测定不同初始pH值对纳豆激酶活力的影响，即：纳豆芽孢杆菌在木糖液体培养基中，以5/6/7/8/9作为初始pH值，培养体系中纳豆激酶活力的测定情况；

图3是本发明实施例3中，测定不同培养温度对纳豆激酶活力的影响，即：纳豆芽孢杆菌在木糖液体培养基中，7作为初始pH值，培养温度为21℃/25℃/29℃/33℃/37℃的培养条件下培养体系中纳豆激酶活力的测定情况。

具体实施方式：

下面将结合本发明实施例中的附图，对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例仅是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。

实施例1

本实施例中提高纳豆激酶总活力的培养工艺是使用摇瓶反应器，选择四种不同的己糖(葡萄糖，木糖，果糖，甘露糖)液体培养基中，以180rpm，2％接种量的培养条件，将纳豆芽孢杆菌接入培养体系的应用。

挑取2％活化后的纳豆芽孢杆菌(初始OD值为0.2-0.6)接种于装有50mL培养基的250mL锥形瓶中，温度28℃，转速180rpm条件下振荡培养72h。发酵液离心后用于测量纳豆激酶总活力。其中培养基含有重量2％的己糖(葡萄糖、果糖、山梨糖、甘露糖)，重量2％的胰蛋白胨，重量0.5％的NaCl，pH 6.3。

纳豆激酶总活力测定方法为纤维蛋白平板法，即配置含有凝血酶的纤维蛋白原平板；发酵液以10000rpm离心10min后吸取10微升发酵液，分别点在平板的指定位置；静置观察并在10min时记录光圈直径。

本实施方案中纳豆枯草芽孢杆菌为中国工业微生物菌种保藏管理中心保藏，编号CICC10262。

附图1所示为不同碳源培养基体系中以光圈直径为表征的纳豆激酶总活力的变化趋势。如图1可知，采用木糖培养基，发酵液的纳豆激酶活力在整个培养周期中获得明显提升，利用木糖培养基培养可使发酵液的光圈直径达到值达到13.2mm，高于其他培养基发酵液中的纳豆激酶活力。

实施例2

本实施例中提高纳豆激酶总活力的培养工艺是使用摇瓶反应器，选择5/6/7/8/9作为初始pH值，以木糖液体培养基作为基础培养基的培养条件，将纳豆芽孢杆菌接入培养体系的应用。

具体方法为50mL木糖培养基，高温灭菌后接入2％活化后的枯草芽孢杆菌种子液(初始OD值为0.2-0.6)，初始pH值5/6/7/8/9，温度28℃条件下进行振荡培养。发酵液离心后用于测量纳豆激酶总活力。

所述培养基和具体实施例1相同。

所述纳豆枯草芽孢杆菌和具体实施例1相同。

所述纳豆激酶总活力测定方法和具体实施例1相同。

附图2所示为不同转速培养体系中以光圈直径为表征的纳豆激酶总活力的变化趋势。如图2可知，初始pH值为7时，培养纳豆芽孢杆菌所得到的纳豆激酶的光圈直径达到16.1mm。与具体实施例1中相比，纳豆激酶总活力可提高22.0％。

实施例3

本实施例中提高纳豆激酶总活力的培养工艺是使用摇瓶反应器，选择7作为初始pH值，培养温度21℃/25℃/29℃/33℃/37℃，以木糖液体培养基作为基础培养基的培养条件，将纳豆芽孢杆菌接入培养体系的应用。

具体方法为50mL木糖培养基，高温灭菌接入2％活化后的枯草芽孢杆菌种子液(初始OD值为0.2-0.6)，温度21℃/25℃/29℃/33℃/37℃，初始pH值7条件下进行振荡培养。发酵液离心后用于测量纳豆激酶总活力。

所述培养基和具体实施例1相同。

所述纳豆枯草芽孢杆菌和具体实施例1相同。

所述纳豆激酶总活力测定方法和具体实施例1相同。

附图3所示为不同转速培养体系中以光圈直径为表征的纳豆激酶活力的变化趋势。如图3可知，培养纳豆芽孢杆菌所得到的纳豆激酶的光圈直径达到18.2mm。与实施例1中相比，纳豆激酶总活力可提高37.9％。

Claims

1.一种利用己糖培养基生产纳豆激酶的方法，其特征在于，包括以下步骤：

2.根据权利要求1所述的一种利用己糖培养基生产纳豆激酶的方法，其特征在于，所述培养基的成分包括以重量比例计的以下各组分：

2％的己糖，2％的胰蛋白胨，0.5％的NaCl，余量为水。

3.根据权利要求2所述的一种利用己糖培养基生产纳豆激酶的方法，其特征在于，所述己糖为葡萄糖、木糖、果糖或甘露糖。

4.根据权利要求3所述的一种利用己糖培养基生产纳豆激酶的方法，其特征在于，所述己糖为木糖。