CN110794143B - 一种邻细胞间相互作用的研究方法 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种邻细胞间相互作用的研究方法。本发明利用纳米技术结合化学合成方法制备纳米粒子声敏剂,再与一类细胞进行孵育,使细胞摄取该纳米粒子声敏剂。接着在外加磁场作用下,可将吞噬了纳米粒子声敏剂的细胞与另一类细胞混合构建微组织3D细胞群,随后使用超声通过在体外准确调控声强和触发时间来调控细胞内活性氧(ROS)水平,实现体外定时、定量、定位调控细胞损伤。经体外细胞实验、蛋白质组学研究等证明损伤细胞与邻细胞间大量蛋白发生变化。通过此方法可探究并阐明靶向性与邻细胞相互竞争摄取的内在联系以及临床中疾病的发生、发展过程,可用于细胞通讯、制剂设计、医药研发等技术领域。
Description
技术领域
本发明涉及一种邻细胞间相互作用的研究方法,特别涉及一种能够阐明靶向性与邻细胞相互竞争摄取的内在联系,探究疾病的发生、发展过程,研究疾病发病机制的邻细胞间相互作用的研究方法,为靶向制剂设计及临床治疗提供思路和理论依据,用于靶向制剂设计、新药研发、疾病发病机制研究、临床治疗应用。本发明属于医药技术领域。
背景技术
细胞是地球上各种生物结构和生理功能的基本单位,人体细胞约有40万亿-60万亿个,细胞组合成组织,并构成器官,器官合成***,多种器官和***构建成复杂的人体,所以在探索人类发展、保证人类健康的过程中,对细胞的研究极为重要。但是,机体产生的一系列活动和反应,都不是由单一细胞独立完成,而是多种细胞通过传递“信号”互相配合,互相协助共同完成。因此,细胞与细胞之间,尤其是相邻的两个细胞之间如何相互作用,如何传递“信号”,又传递了怎样的“信号”将会成为未来细胞研究的重点内容。
纳米药物靶向递送是药物研究的一个重要领域,旨在提高药物在病灶部位的富集程度并减少其全身性分布,从而有望实现高效低毒的治疗。在纳米药物靶向递送***中,克服人体天然的生物屏障是目前学者们遇见的挑战之一。邻细胞就是纳米药物靶向递送必须考虑的、重要的微环境。首先,邻细胞共享、共建胞外基质微环境;其次,神经细胞间通过电信号、化学信号、物理接触方式进行胞间通讯,影响彼此的生理行为;再次,邻细胞间竞争性摄取纳米药物的能力是靶向性的决定因素,其结果可能受细胞损伤影响。可见,邻细胞作用十分重要。关于组织中邻细胞间对纳米药物的竞争性摄取以及与微环境相关的不同细胞之间还存在哪些联系还尚未见研究。
在临床治疗中,病灶部位健康细胞与损伤细胞并存,如何在不损伤正常健康细胞的前提下,实现对损伤细胞的治疗,始终是科研学者奋斗的目标。但现阶段想精准定位并调控损伤细胞是不可能的,想观察损伤细胞对其邻细胞即健康细胞的影响也是难以实现的,不利于理顺生物事件的因果关系与时空顺序。体外二维培养虽然易于定位、简单可控,但因其失去了组织的三维结构,细胞生物学信息发生改变失去可信性;组织工程技术虽然提供了组织三维结构,但又多了支架材料的干扰。如果能体外构建无支架材料的、接近人体的3D微组织则可以弥补体内不可控、体外失真及材料干扰的不足。
本发明发明人首次利用“3D微组织精准损伤细胞技术”成功制备了损伤细胞,并测得由细胞间相互作用的影响导致其邻细胞蛋白质组学的变化。该方法分为四步:第一,利用纳米技术结合化学合成方法制备纳米粒子声敏剂,与一类细胞(A类细胞)孵育,使细胞摄取纳米粒子声敏剂;第二,在磁效应作用下,先将吞噬纳米粒子声敏剂的A类细胞与另一类细胞(B类细胞)随机混合构建微组织3D细胞群;第三,通过超声强度、触发时间等调控活性氧(ROS)水平,实现体外定时、定量、定位调控A类细胞损伤;第四,使用iTRAQ蛋白组学技术分析该3D细胞群蛋白的变化。蛋白分析发现出现与细胞摄取、胞内运输与能量代谢(线粒体蛋白、ATP结合蛋白)的蛋白表达异常,且这些异常蛋白包括网格蛋白与非网格蛋白,证明与细胞摄取相关。同时,ROS致A类细胞表面Glut1增多,提示细胞摄取纳米粒子增多。除此之外,还有大量其他蛋白发生变化,有待进一步研究。
利用纳米技术与微组织工程学技术定时、定量、定位诱发微组织3D细胞群中A类细胞损伤,观察其对邻细胞的影响。通过蛋白组学研究、生物信息学研究与摄取、胞内运输、能量代谢相关蛋白变化,利用有机合成的方法进行纳米载体修饰,通过此方法可探究并阐明靶向性与邻细胞相互竞争摄取的内在联系以及临床中疾病的发生、发展过程,研究疾病发病机制,为靶向制剂设计及临床治疗提供思路和理论依据,可用于靶向制剂设计、新药研发、疾病发病机制研究、临床治疗应用。
发明内容
本发明的目的在于提供一种邻细胞间相互作用的研究方法,通过该方法能够探究并阐明靶向性与邻细胞相互竞争摄取的内在联系以及临床中疾病的发生、发展过程,研究疾病发病机制,为靶向制剂设计及临床治疗提供思路和理论依据,可以用于靶向制剂设计、新药研发、疾病发病机制研究、临床治疗应用。
为了达到上述目的,本发明采用了以下技术手段:
本发明的一种邻细胞间相互作用的研究方法,包括以下步骤:
(1)制备纳米粒子声敏剂;
(2)将制备得到的纳米粒子声敏剂与A类细胞进行孵育,使所述的A类细胞摄取该纳米粒子声敏剂;
(3)将吞噬了纳米粒子声敏剂的A类细胞与B类细胞混合,以培养基重悬后,在顺磁性环境下,制备顺磁性细胞悬液;
(4)在外加磁场作用下,可将吞噬了纳米粒子声敏剂的A类细胞与B类细胞构建微组织3D细胞群,随后使用超声调控A类细胞内活性氧(ROS)水平,使A类细胞损伤;
(5)对A类细胞与B类细胞间的相互作用方式进行研究;
其中,A类细胞与B类细胞均是生物学中空间上相邻的细胞,所谓空间上相邻指3D结构中的相邻。
其中,优选的,所述的纳米粒子声敏剂为大黄素纳米混悬剂,是通过以下步骤制备得到:称取大黄素、聚乙烯吡咯烷酮与十二烷基硫酸钠于烧杯中,加入去离子水,高速均质;再采用高压均质机多次循环得大黄素纳米混悬剂,即纳米粒子声敏剂;
其中,优选的,所述的大黄素纳米混悬剂,是通过以下步骤制备得到:称取大黄素300mg、聚乙烯吡咯烷酮1.5g与十二烷基硫酸钠30mg于烧杯中,加入100ml去离子水,高速均质5次,每次20秒;再采用高压均质机700bar循环15次得到大黄素纳米混悬剂,即纳米粒子声敏剂。
其中,优选的,纳米粒子声敏剂可通过以下步骤制备得到:
(1)金纳米颗粒制备:取氯金酸于三颈烧瓶中,加入超纯水,超声混匀,水浴锅中回流加热搅拌升温;搅拌条件下加入三水合柠檬酸钠溶液;继续回流加热搅拌;室温下搅拌冷却,得酒红色金纳米颗粒;
(2)姜黄素@金纳米粒的制备:称取姜黄素溶解于乙醇中,将金颗粒分散在溶有姜黄素的乙醇溶液中,避光静置,取上清,得姜黄素@金纳米粒;
(3)糖修饰纳米化姜黄素的制备:称取蛋黄卵磷脂,胆固醇,糖-PEG600-DSPE,其中糖为甘露糖、葡萄糖、半乳糖等,其中,优选的,所述的糖为葡萄糖或甘露糖,将上述物质溶于乙醇,混匀后旋干成膜,加入姜黄素@金纳米粒溶液分散脂膜,再次使用旋转蒸发仪旋干,加入生理盐水超声水化,探头超声后通过聚碳酸酯膜过滤,离心,取上清得糖修饰纳米化姜黄素,即纳米粒子声敏剂;
其中,优选的,黄卵磷脂,胆固醇,糖-PEG600-DSPE的摩尔比为49:50:1;所述的超声水化是指超声处理运行10秒,暂停6秒,工作10次。
其中,优选的,纳米粒子声敏剂还可通过以下步骤制备得到:
原卟啉脂质体:将蛋黄磷脂酰胆碱(EPC)、胆固醇(CHO)和DSPE-PEG-2000用无水乙醇溶解在旋转蒸发瓶中,通过在减压条件下蒸发该混合物形成薄的脂质膜;用含有原卟啉的生理盐水溶液水化该脂质膜;通过超声处理使脂质体溶液分散,探头超声处理后通过聚碳酸酯膜挤出,便得到原卟啉脂质体,即纳米粒子声敏剂。
其中,优选的,蛋黄卵磷脂(EPC),胆固醇(CHO),DSPE-PEG-2000的摩尔比为49:50:1。
其中,优选的,所述的A类细胞包括但不限于胶质细胞、胶质瘤细胞、成纤维细胞、血管平滑肌细胞、内皮细胞、细菌以及真菌;
其中,优选的,所述的B类细胞包括但不限于神经元细胞、胶质细胞、心肌细胞、血管平滑肌细胞、血管内皮细胞、细菌以及真菌。
其中,优选的,所述的顺磁性环境由顺磁性溶剂提供。
其中,优选的,所述的顺磁性溶液为钆类溶剂,更优选的,所述的钆类溶剂为钆布醇。
其中,优选的,在微组织3D细胞群中,定时、定量、定位调控和损伤A类细胞,检测损伤的A类细胞及未损伤B类细胞的蛋白组学变化。
其中,优选的,所述的邻细胞间相互作用的研究方法可以用于细胞通讯、制剂设计、医药研发技术领域。
其中,优选的,所述的邻细胞间相互作用的研究方法可以用于探究并阐明靶向性与邻细胞相互竞争摄取的内在联系。
相较于现有技术,本发明的有益效果是:
本发明通过外加磁场在体外构建微组织3D细胞群,利用“3D微组织精准损伤细胞”技术定时、定量、定位的干预健康细胞使其损伤,并监测损伤细胞与邻细胞间信号传导、蛋白质组学、基因组学等生物信息的变化。经体外细胞实验、蛋白质组学研究等证明损伤细胞与邻细胞间的摄取能力、摄取途径、细胞凋亡、能量代谢、胞内运输的相关蛋白均发生变化。可见部分细胞损伤,可致损伤细胞与邻细胞发生细胞间相互作用,通过本发明可探究并阐明靶向性与邻细胞相互竞争摄取的内在联系以及疾病的发生、发展过程,研究疾病发病机制,为靶向制剂设计及临床治疗提供思路和理论依据,可以用于靶向制剂设计、新药研发、疾病发病机制研究、临床治疗应用。
附图说明
图1为大黄素纳米混悬剂(Emo-ns)的粒径电位图。
图2为原卟啉脂质体(Pro-LIP)的粒径电位图。
图3为姜黄素@金颗粒构建过程中粒径分布图(A);金纳米粒子的电镜图(B);表面包裹后的金纳米粒的电镜图(C);姜黄素包衣前后粒度和荧光图(D)。
图4为糖修饰纳米化姜黄素(MAN-Cur@Au)紫外全波长扫描图,证明成功逐层构建了糖修饰纳米化姜黄素。
图5为三种制剂流式摄取图;证明三种纳米粒子声敏剂均可被细胞摄取。
图6为细胞表面抗原GLUT-1变化流式荧光位移图(A)和流式荧光柱状图(B);说明低频超声对Emo-ns所引发的C6细胞表面Glut1的有促进作用,但这种促进作用与超声后对细胞培养的时间有关,超声后0h时,Glut1的表达增强最明显,4h后Glut1的表达有下降趋势,这可能与超声激活Emo-ns产生的ROS有关,ROS的产生是瞬时的,所以Glut1的表达在超声后达到峰值,但随着时间延长,ROS信号逐渐变弱,Glut1高表达的现象也随之消失。
图7为线粒体膜电位点图(A、B、C)和荧光柱状图(D);说明经过Emo-ns处理后细胞的线粒体膜电位有下降的趋势,经过超声刺激后这种现象得到增强,Emo-ns加超声处理有诱导降低细胞线粒体功能的作用,即产生了细胞损伤。
图8为心肌细胞内凋亡蛋白caspase 3蛋白质印迹图和柱状图(A、C)和caspase9蛋白质印迹和柱状图(B、D);说明低频超声对Pro-LIP所引发的细胞内凋亡相关蛋白caspase3/9的表达有增强作用,这种增强作用与低频超声能够促进细胞对Pro-LIP的摄取有关,细胞内caspase 3/9在声动力治疗后的高表达现象是细胞受Pro-LIP联合超声处理后内部大量产生活性氧而引起的线粒体功能减弱的影响。
图9为血管平滑肌细胞(VSMC)内的ROS对邻细胞血管内皮细胞(VEC)产生影响的微组织3D细胞群图。说明VEC+SDT组、VSMC+VEC+SDT组及VSMC摄取MAN-Cur@Au+VEC组未见明显的DCF绿色荧光,VSMC摄取MAN-Cur@Au+VEC+SDT组DCF绿色荧光细胞明显多于VSMC摄取MAN-Cur@Au+VEC组,分析认为ROS升高的受损伤VSMC向其邻细胞VEC传递了氧化应激信号,但深入机制还未明晰。
图10为不同种类细胞构建的微组织3D细胞群图;说明任何细胞均能成功构建逐层混合与随机混合的微组织3D细胞群。
图11为邻细胞蛋白质组学研究蛋白变化柱状图;说明不同组间存在蛋白表达数量和类型的差异,可见3D混合构建微组织在ROS作用下,存在显著蛋白表达差异。
图12为邻细胞中相关蛋白文氏图;说明细胞微环境邻细胞对脑胶质瘤细胞(C6)、神经元细胞(PC12)的蛋白质组学产生显著影响,无论是种类还是数量都发生明显变化。
图13为邻细胞蛋白谱表达生物信息学分析图;说明原代心肌细胞存在改变了蛋白质谱的表达。
图14为邻细胞中相关蛋白网络分析图;分析结果可以看到血管平滑肌(VSMC)和血管内皮细胞(VEC)的一些蛋白具有多重属性,可能在ATP结合、细胞运输、线粒体结构或功能及细胞内呑发挥作用。
具体实施方式
下面结合具体实施例来进一步描述本发明,本发明的优点和特点将更为清楚。但实施例仅用于说明本发明,并不对本发明的保护范围构成任何限制。本领域技术人员应该理解的是,在不偏离本发明的精神和范围下可以对本发明技术方案的细节和形式进行修改或替换,但这些修改和替换均落入本发明的保护范围内。
下述实施例中所使用的实验方法如无特殊说明,均为常规方法。下述实施例中所用的材料、试剂等,如无特殊说明,均可从商业途径获得。
实施例所用的材料如下:
氯金酸氯购自麦克林生化科技有限公司(上海,中国)
姜黄素购自士锋生物科技有限公司(上海,中国)
二水合柠檬酸三钠购自前尘生物科技有限公司(上海,中国)
PEG 2000,来自阿拉丁工业公司(上海,中国)。
p-对羧基苯基-α-D-乙酰甘露糖胺(Ac4MAN)从中国北京Innochem获得。
蛋黄磷脂酰胆碱(EPC)和胆固醇(CHO)购自Bio Life Science&TechnologyCo.,Ltd(中国上海)。
罗丹明B(Rho)和1,1'-二(十八烷基)-3,3,3',3'-四甲基-碘化二碘花青(DiR)得自HEDE生物技术有限公司(北京,中国)。
抗GLUT-1抗体购自Immunoway(北京,中国)。
ROS检测试剂盒购自贝博试剂(上海,中国)
线粒体膜电位试剂盒购自碧云天生物技术(上海,中国)
CCK-8试剂盒购自碧云天生物技术(上海,中国)
健康Wistar大鼠200~250g购自哈尔滨医科大学实验动物学部(SCXK(黑)2013-001)
实施例1大黄素纳米混悬剂(Emo-ns)的制备
大黄素纳米混悬剂:称取大黄素300mg、聚乙烯吡咯烷酮1.5g与十二烷基硫酸钠30mg于烧杯中,加入100ml去离子水,高速均质5次,每次20秒;再采用高压均质机700bar循环15次得到大黄素纳米混悬剂,即纳米粒子声敏剂。
实施例2糖修饰纳米化姜黄素(MAN-Cur@Au)的制备
(1)金纳米颗粒的制备:取250μl氯金酸于三颈烧瓶中,加入100ml超纯水,超声混匀,水浴锅中回流加热搅拌升温;搅拌条件下加入926μl三水合柠檬酸钠溶液;继续回流加热搅拌15min;室温下搅拌冷却,得酒红色金纳米颗粒。
(2)姜黄素@金纳米粒的制备:称取19.2mg姜黄素溶解于3ml乙醇中,将1ml的金纳米颗粒分散在姜黄素的乙醇溶液中,避光静置24h,取上清,得姜黄素@金纳米粒溶液。
(3)甘露糖-PEG600-DSPE的制备:根据申请号为201811062535.6,发明名称为“糖-聚乙二醇-DSPE偶联化合物及其制备方法和应用”的中国专利申请中所公开的方法制备。
(3)糖修饰纳米化姜黄素的制备:按摩尔比为49:50:1称取蛋黄卵磷脂,胆固醇,甘露糖-PEG600-DSPE,将上述15mg脂材溶于乙醇,混匀后旋干成脂膜,加入1ml姜黄素@金纳米粒溶液分散该脂膜,再次使用旋转蒸发仪旋干,加入生理盐水超声水化,超声处理运行10秒,暂停6秒,工作10次,再通过聚碳酸酯膜过滤,离心,取上清得糖修饰纳米化姜黄素,即纳米粒子声敏剂。
实施例3原卟啉脂质体(Pro-LIP)的制备
按摩尔比为49:50:1称取蛋黄卵磷脂(EPC),胆固醇(CHO),DSPE-PEG-2000,将上述15mg脂材用无水乙醇溶解在旋转蒸发瓶中,通过在减压条件下蒸发该混合物形成薄的脂质膜;用1ml含有0.01mg原卟啉的生理盐水溶液水化该脂质膜;通过超声处理(运行10秒,暂停6秒,工作30次)使脂质体溶液分散,并通过100nm聚碳酸酯膜挤出,便得到原卟啉脂质体,即纳米粒子声敏剂。
实施例4纳米粒子声敏剂的表征
(1)DLS检测粒度分布与Zeta电位:室温下,取去离子水1mL,再取制备好的Emo-ns(实施例1制备)和Pro-LIP(实施例3制备)各10μL,样品分别与去离子水混匀后注射到动态光散射粒度仪的专用小池子中,使用动态光散射粒度仪测试各脂质体的平均粒径和zeta电位。大黄素纳米混悬剂(Emo-ns)的粒径电位图以及原卟啉脂质体(Pro-LIP)的粒径电位图分别如图1和2所示。
(2)TEM检测形态:取制备好的MAN-Cur@Au(实施例2制备)适当稀释,滴加铜网静置1min,根据需要磷钨酸负染,选择合适标尺,使用TEM观察并拍摄粒子形态。MAN-Cur@Au制备过程中粒径电位图如图3所示,说明糖修饰纳米化姜黄素(MAN-Cur@Au)成功构建,姜黄素包衣后颗粒荧光增强,粒度增大。糖修饰纳米化姜黄素(MAN-Cur@Au)紫外全波长扫描图如图4所示,证明成功逐层构建了糖修饰纳米化姜黄素。
实施例5培养原代星型胶质细胞、神经元细胞
(1)原代星型胶质细胞的培养:取出生3天内小鼠(购自哈尔滨医科大学动物学部,SCXK(黑)2013-001),置于冰上2min并喷酒精消毒;将小鼠依此过75%酒精和PBS后,脱臼处死小鼠,取脑,置于预冷的PBS中(PBS置于冰板上);将鼠脑放于湿润的纱布上,用镊子去除其中的血丝;剪刀剪碎鼠脑后,加入胰酶消化,转移至50mL离心管后,于细胞培养箱内放置10min;吹打均匀后,加入培养基(含FBS)终止消化。滤网过滤。4℃12000rpm×5min,同时ddH2O清洗PLL包被的瓶子,3遍;回收PLL。离心,弃上清,加入培养基,吹打均匀,细胞计数后,转移至细胞培养瓶。
(2)原代神经元细胞的培养:0.2mL10%水合氯醛麻醉孕鼠(C57BL/6J,怀孕16-17天左右,购自哈尔滨医科大学动物学部,SCXK(黑)2013-001),取出胎鼠侵泡在PBS。用PBS洗2次胎鼠,去除表面血液。去除胎膜除去粘液(过75%酒精),取出胎鼠,置于DMEM中,断头。用手术器械分离胎鼠鼠脑置于PBS中,显微镜下分离鼠脑皮层。将分离完的皮层组织置于DMEM中。皮层用PBS洗一遍,用剪刀将组织剪碎(无明显团块),加入0.5%胰酶消化吹打,消化至无明显团块(加入20%FBS培养基终止消化)。用培养基终止消化后过滤,1500rpm,离心5min。去除上清液,加入接种培养基10mL(neurobasal medium+0.5%GlutaMAX+2%B27supplement+1%PS),计数。六孔板铺1x106/孔,四小时后半换液。铺板培养一天后加入阿糖胞苷抑制胶质细胞生长(1:4000),培养基每三天换液一次。
实施例6培养原代成纤维细胞、原代心肌细胞
(1)原代成纤维细胞的培养:取1-3天龄的Wistar大鼠的乳鼠,置于75%酒精中消毒片刻,用眼科剪剖开胸部,取出幼鼠心脏,在超净工作台内,用PBS溶液快速清洗心脏,剔除心脏周边的血凝及纤维组织,然后将其放入无血清的DMEM中,将乳鼠心脏剪碎,剪成1mm3左右大小的组织块,然后将组织块溶液移入15mL的离心管中,待组织块沉于管底,吸出DMEM溶液,加入组织量两倍体积的胰酶消化液,于37℃水浴锅中慢慢振摇消化1-3分钟,待胰酶变浑浊时弃去酶液。反复消化3-4次,收集酶液,与培养液的体积比为1:1,放于4℃冰箱中终止消化。将收集的消化液过200目的滤网,然后将滤液以2500rpm,离心3min。去掉上清液,收集细胞沉淀,用含有血清的DMEM培养液使细胞沉淀重悬,吹打细胞至细胞分散开,将细胞悬液移到一次性细胞培养瓶中,于37℃培养箱中培养2小时,成纤维细胞贴壁。
(2)原代心肌细胞的培养:在成纤维细胞贴壁后,收集细胞瓶中的培养液,将剩余的细胞悬液转移到新的培养瓶中,纯化心肌细胞,于37℃培养箱中培养48小时,待用。
实施例7培养血管平滑肌细胞
取健康大鼠2-3只,将1mL肝素(1KU/mL)经腹腔注射,然后等待20~30分钟。在使用水合氯醛进行麻醉,取出肺组织,置于HEPES缓冲液中或PBS缓冲液中。将肺组织及缓冲液转移至超净台中,在显微镜下分离肺血管。血管分离后,纵向剪开血管,使用无菌棉签轻轻擦拭内皮,将内皮细胞去除。使用刀片或剪刀轻轻刮擦血管外膜,除去成纤维。随后将血管剪成小块,转移到Ⅱ型胶原酶消化液中,37℃处理30分钟。收集处理液,并用带血清的培养基中和消化液。在显微镜下观察所得的细胞,重复消化步骤,直至得到长梭形的平滑肌细胞,中和消化液后,将细胞离心,重悬到培养液(含双抗)中,放入37℃CO2培养箱中培养。第二天换液后,每次隔天换液。
实施例8细胞损伤模型的建立
(1)细胞接种:取对数生长期大鼠胶质瘤细胞(或成纤维细胞或血管平滑肌细胞),使用高压后无菌的PBS清洗3次后,胰蛋白酶消化,用含有10%血清的高糖DMEM培养液中和胰酶,适当吹打细胞,使其均匀分散,收集到10EP管中,离心2000rpm×3min,弃去上清;使用培养液重悬细胞,接种到T25细胞培养瓶中。
(2)超声处理:待细胞贴壁24h后,以9μg/mL的浓度给与纳米粒子声敏剂(Emo-ns、Pro-LIP或MAN-Cur@Au),给药4h后使用声动力理疗仪对细胞进行超声。在药物摄取后与超声处理前孵浴DCFH-DA荧光探针,孵育30min,流式细胞仪检测细胞内荧光强度,判断细胞内活性氧产量。
最终,本发明实施例确定在超声强度为0.4W/cm2,超声频率为1MHz,超声时间为15min时建立细胞损伤模型。但本领域技术人员可以根据实际需要,通过调整摄取纳米粒子声敏剂的时间(剂量)、超声强度和超声时间,定时、定量、定位的控制细胞损伤程度,建立相应的细胞损伤模型。
实施例9纳米粒子声敏剂的细胞摄取
(1)取细胞,使用高压后无菌的PBS清洗3次后,胰蛋白酶消化,用含有10%血清的高糖DMEM培养液中和胰酶,适当吹打细胞,使其均匀分散,收集到10mLEP管中,离心2000rpm×3min,弃去上清;使用培养液重悬细胞,接种,密度为7.0×105/孔。实验分组为:空白对照组、Emo-ns组、MAN-Cur@Au组和Pro-LIP组。
(2)根据设计好的实验分组,以9μg/mL的浓度给与纳米粒子声敏剂(Emo-ns、Pro-LIP或MAN-Cur@Au),使细胞和药物孵育4h,孵育后对细胞进行胰酶消化,离心2000rpm×3min,再用PBS重悬,收集细胞,进行检测。流式细胞仪检测细胞内纳米粒子的荧光强度,使用相应的滤光片检测荧光强度,并利用FlowJo 7.6软件对数据进行分析。
图5说明三种纳米粒子声敏剂均可被细胞摄取。
实施例10细胞表面抗原GLUT-1检测
(1)细胞接种:取对数生长期的脑胶质瘤细胞(C6细胞),使用高压后无菌的PBS清洗3次后,胰蛋白酶消化,用含有10%血清的高糖DMEM培养液中和胰酶,适当吹打细胞,使其均匀分散,收集到10mL EP管中,离心2000rpm×3min,弃去上清;使用培养液重悬细胞,接种,密度为7.0×105/孔,分组为空白对照组(Control)、大黄素纳米混悬剂组(Emo-ns)、大黄素纳米混悬剂+超声组(Emo-ns-SDT-0h)、大黄素纳米混悬剂+超声后孵育4小时组(Emo-ns-SDT-4h)。
(2)抗体孵育:按照设计好的实验时间和分组,以9μg/mL的浓度给与纳米粒子声敏剂(Emo-ns),使用声动力理疗仪对细胞进行超声;超声强度0.4W/cm2,超声频率1MHz,超声时间15min。超声处理后,消化细胞,制备成细胞悬液,一抗孵浴4℃过夜,再孵育荧光二抗;使用PBS轻轻清洗3次,上流式细胞仪检测。
图6说明低频超声对Emo-ns所引发的C6细胞表面的Glut1有促进作用,但这种促进作用与超声后对细胞培养的时间有关,超声后0h时,Glut1的表达增强最明显,4h后Glut1的表达有下降趋势,这可能与超声激活姜黄素产生的ROS有关,ROS的产生是瞬时的,所以Glut1的表达在超声后达到峰值,但随着时间延长,ROS信号逐渐变弱,Glut1高表达的现象也随之消失。
实施例11细胞线粒体膜电位检测
(1)取对数生长期脑胶质瘤细胞(C6细胞),使用高压后无菌的PBS清洗3次后,胰蛋白酶消化,用含有10%血清的高糖DMEM培养液中和胰酶,适当吹打细胞,使其均匀分散,收集到10mLEP管中,离心2000rpm×3min,弃去上清;使用培养液重悬细胞,接种,密度为7.0×105/孔。实验分组为:空白对照组、Emo-ns组、Emo-ns+SDT组。
(2)根据设计好的实验分组,以9μg/mL的浓度给与纳米粒子声敏剂(Emo-ns),使细胞和纳米粒子声敏剂孵育4h,孵育后,进行超声处理,超声强度0.4W/cm2,超声频率1MHz,超声时间15min。收集各组细胞并用预先配制好的JC-1染色工作液0.5mL重悬细胞,并在每个样品中补加0.5mL细胞培养液,混匀后于CO2培养箱中孵育30min。孵育期间可进行JC-1 1×缓冲液的配制。孵育结束后离心以弃去细胞培养液与荧光染色工作液,并用1×缓冲液在4℃,1000RPM×4min,此操作重复两次使细胞充分洗涤干净,最后用1×缓冲液重悬细胞,上机检测。
图7说明经过Emo-ns处理后细胞的线粒体膜电位有下降的趋势,经过超声刺激后这种现象得到增强,证明Emo-ns-SDT有诱导降低细胞线粒体功能的作用。
实施例12细胞内凋亡蛋白caspase 3/9表达量变化
(1)取原代成纤维细胞,使用高压后无菌的PBS清洗3次后,胰蛋白酶消化,用含有10%血清的高糖DMEM培养液中和胰酶,适当吹打细胞,使其均匀分散,收集到10mL EP管中,离心2000rpm×3min,弃去上清;使用培养液重悬细胞,接种,密度为7.0×105/孔。实验分组为:空白对照组、Pro-LIP组、Pro-LIP+SDT组。
(2)取适量Pro-LIP,分散于培养液中制成9μg/mL的储备液,4避光;待细胞贴壁后给药,4h后进行超声,超声强度0.4W/cm2,超声频率1MHz,超声时间15min,培养24h;弃去含Pro-LIP的培养液,PBS洗×3次,以RIPA裂解蛋白,收集蛋白。4℃下,13500rpm×20min,取上清,加loading buffer,涡旋,100℃下煮5min,-80℃冰箱贮存样品待用;铺胶、上样,电泳分离,转膜,经丽春红染色后4℃下孵育一抗,过夜;TBST缓冲液洗膜,孵育二抗1h,TBST洗,使用ECL进行显影。
图8说明低频超声对Pro-LIP所引发的细胞内凋亡相关蛋白caspase 3/9的表达有增强作用,这种增强作用与低频超声能够促进细胞对Pro-LIP的摄取有关,细胞内caspase3/9在声动力治疗后的高表达现象是细胞受Pro-LIP联合超声处理后内部大量产生活性氧而引起的线粒体功能减弱的影响。
实施例13邻细胞影响作用实验
(1)取血管平滑肌细胞(VSMC)和血管内皮细胞(VEC),分别使用高压后无菌的PBS清洗3次后,胰蛋白酶消化,用含有10%血清的高糖DMEM培养液中和胰酶,适当吹打细胞,使其均匀分散,收集到10mL EP管中,离心2000rpm×3min,弃去上清;使用培养液重悬细胞,接种,密度为1.0×107/孔。实验分组为:VEC+SDT组(ES)、VSMC+VEC+SDT组(MES)、VSMC+MAN-Cur@Au+VEC组(MCE)、VSMC+MAN-Cur@Au+VEC+SDT组(MCES)。
(2)细胞贴壁24h后,即按照实验分组要求在VSMC中加入MAN-Cur@Au,以9μg/mL的浓度给药,孵育4小时。血管内皮细胞以DAPI染核,再与DCFH-DA探针孵育,分别消化两类细胞;将吞噬了纳米粒子声敏剂的VSMC细胞与VEC细胞随机混合,以培养基重悬后,在细胞悬液中加入钆布醇,制备顺磁性细胞悬液,磁效应下构建微组织3D细胞群,超声处理,超声强度0.4W/cm2,超声频率1MHz,超声时间15min。荧光成像。
图9说明ES组、MES组及MCE未见明显的DCF绿色荧光,MCES组DCF绿色荧光细胞明显多MCE组,分析认为ROS升高的受损伤血管平滑肌向其邻细胞血管内皮细胞传递了氧化应激信号,但深入机制还未明晰。
实施例14微组织3D细胞群构建及定点诱发ROS损伤细胞
(1)取脑胶质瘤细胞(C6细胞)以及正常神经元细胞(PC12细胞),分别使用高压后无菌的PBS清洗3次后,胰蛋白酶消化,用含有10%血清的高糖DMEM培养液中和胰酶,适当吹打细胞,使其均匀分散,收集到10mL EP管中,离心2000rpm×3min,弃去上清;使用HighDMEM10%血清培养基重悬细胞,接种至T25细胞瓶中。
(2)C6细胞贴壁24h后,在C6细胞中以9μg/mL的浓度加入MAN-Cur@Au,孵育4小时;
(3)取摄取纳米粒子声敏剂MAN-Cur@Au的C6细胞,胰蛋白酶消化,离心2000rpm×3min,分别以适量High DMEM无血清培养基重悬细胞置EP管中,待用;取C6细胞悬液加DiO(1mg/mL)标记细胞膜,37℃孵育5min。
(4)随机混合:取PC12细胞加适量DAPI(1mg/mL)标记细胞核,37℃孵育15~20min。将吞噬了纳米粒子声敏剂的C6细胞与PC12细胞随机混合,以高糖无血清培养基重悬后,在细胞悬液中加入钆布醇,制备顺磁性细胞悬液,在外加磁场下构建微组织3D细胞群。
逐层混合:取PC12细胞加适量DAPI(1mg/mL)标记细胞核,37℃孵育15~20min。在细胞悬液中加入钆布醇,制备顺磁性细胞悬液,在外加磁场下构建PC12细胞3D细胞群,然后再加入吞噬了纳米粒子声敏剂的C6细胞细胞悬液,在外加磁场下构建PC12细胞-C6细胞3D细胞群,重复上述步骤,以逐层混合的方法在外加磁场下构建微组织3D细胞群。
(5)微组织3D细胞群建立30分钟后,利用超声作用诱发摄取纳米粒子声敏剂的C6细胞产生ROS损伤C6细胞,超声强度0.4W/cm2,超声频率1MHz,超声时间15min,为观察微组织3D细胞群的邻细胞混合蛋白变化创造条件。
按照上述步骤,分别构建了血管平滑肌细胞(VSMC)和血管内皮细胞(VEC)微组织3D细胞群以及心肌细胞和成纤维细胞微组织3D细胞群。
图10说明不同细胞均可成功构建逐层混合与随机混合的微组织3D细胞群,可以用于后续研究。
实施例15蛋白质组学研究
由C6细胞和PC12细胞构建的微组织3D细胞群在超声后,利用物理吹打的方法将其吹散,收集细胞后,按照蛋白提取方法进行处理,为iTRAQ蛋白分析提供研究对象。
(1)蛋白提取及定量
取细胞于1.5毫升离心管中,用PBS洗涤1-3次,2000rpm×3min,加入裂解液[8M尿素(480mg/mL)+10mM DTT(1.54mg/mL)+超纯水]300μL,冰上探头超声,共20次,充***解,离心20000g离心10min,吸取上清于-80℃贮存。取少量上清溶液,以BCA法测定其蛋白浓度。
(2)胰酶消化蛋白
蛋白溶液中加入二硫苏糖醇使其终浓度为5mM,56℃还原30min。再加入碘乙酰胺(终浓度为10mM),室温避光孵育。最后将样品的尿素浓度稀释至低于2M。以1:50的质量比例(胰酶:蛋白)加入胰酶,37℃酶解过夜。再以1:100的质量比例(胰酶:蛋白)加入胰酶,继续酶解4h。
(3)iTRAQ标记
上述肽段过柱除盐,冻干样品。以TEAB(0.5M)溶解肽段,根据iTRAQ试剂盒操作说明标记肽段。即:用异丙醇溶解解冻标记试剂,与肽段混合后室温孵育2h,标记后的肽段混合后除盐,冻干。
(4)RP反相分离
肽段用高pH反相HPLC分级,色谱填料为C18(军科院制)。操作如下:肽段分级梯度为10%、12.5%、15%、17.5%、25%、50%,溶液pH 10,80μL收集一个组分,冻干后进行后续操作。
(5)液相色谱-质谱联用分析
肽段用液相色谱流动相A相(0.1%(v/v)甲酸水溶液)溶解后使用EASY-nLC1000超高效液相***进行分离。流动相A为含0.1%甲酸和2%乙腈的水溶液;流动相B为含0.1%甲酸和90%乙腈的水溶液。梯度洗脱,流速维持在400nL/min。ESI源电离后进QExactiveTM HF质谱进行分析。肽段母离子及其二级碎片使用高分辨的Orbitrap进行检测和分析。使用数据依赖型扫描(DDA)程序模式采集数据。
(6)数据库搜索
二级质谱数据使用Maxquant(v1.5.2.8)进行检索。检索参数设置:数据库为SwissProt Rat,添加了反库以计算随机匹配造成的假阳性率(FDR),并且在数据库中加入了常见的污染库,用于消除鉴定结果中污染蛋白的影响。定量方法设置为iTRAQ-8plex,蛋白鉴定、PSM鉴定的FDR都设置为1%。
本项研究一共鉴定到2587个蛋白质,如果以大于等于1.2倍为上调变化阈值,小于等于0.83倍为下调变化阈值为标准,那么在定量到的蛋白质中,各组蛋白变化如图11所示。图11说明不同组间存在蛋白表达数量和类型的差异,可见3D混合构建微组织在ROS作用下,存在显著蛋白表达差异。
图12为邻细胞中相关蛋白文氏图;说明细胞微环境邻细胞对脑胶质瘤细胞(C6)、神经元细胞(PC12)的蛋白质组学产生显著影响,无论是种类还是数量都发生明显变化。
实施例16生物系信息学分析-蛋白表达谱
由原代成纤维细胞和原代心肌细胞构建的微组织3D细胞群在超声后,利用物理吹打的方法将其吹散,收集细胞后,按照蛋白提取方法进行处理,利用iTRAQ蛋白分析后,进行蛋白聚类分析。
聚类分析:应用R语言,参考heatmap.R代码,用文件蛋白数据分析.csv,将其中score值大于阈值5的蛋白质取出,应用r包gplots和ggplot2中heatmap函数,找出聚类关系,形成cluster文件。
图13说明原代成纤维细胞的存在改变了原代心肌细胞蛋白质谱的表达。
实施例17生物系信息学分析-网络分析
由VSMC细胞和VEC细胞构建的微组织3D细胞群在超声后,利用物理吹打的方法将其吹散,收集细胞后,按照蛋白提取方法进行处理,利用iTRAQ蛋白分析后,进行网络分析。
网络分析:首先将蛋白数据进行差异蛋白归类,并将其整理成关系对.csv文件,然后应用R语言,参照“关系对.R”代码,计算权值(权值算法:同一功能中,每一种蛋白在几组实验中出现,即为该种功能该种蛋白的权值),得到“relation_weight.csv”文件,最后应用cytoscape软件画制网络图。绘制ATP、线粒体、内吞及细胞运输的蛋白网络关系图,用于说明能量代谢与细胞摄取与运输的关系;绘制ATP、线粒体、凋亡蛋白网络关系图,用以说明能量代谢与凋亡的关系。
图14网络分析结果可以看到一些蛋白具有多重属性,可能在ATP结合、细胞运输、线粒体结构或功能及细胞内吞发挥作用。
Claims (16)
1.一种邻细胞间相互作用的研究方法,其特征在于,包括以下步骤:
(1)制备纳米粒子声敏剂;
(2)将制备得到的纳米粒子声敏剂与A类细胞进行孵育,使所述的A类细胞摄取该纳米粒子声敏剂;
(3)将吞噬了纳米粒子声敏剂的A类细胞与B类细胞混合,以培养基重悬后,在顺磁性环境下,制备顺磁性细胞悬液;
(4)在外加磁场作用下,将吞噬了纳米粒子声敏剂的A类细胞与B类细胞构建微组织3D细胞群,随后使用超声调控A类细胞内活性氧(ROS)水平,使A类细胞损伤;
(5)对A类细胞与B类细胞间的相互作用方式进行研究;
其中,A类细胞与B类细胞均是生物学中空间上相邻的细胞,所谓空间上相邻指3D结构中的相邻。
2.如权利要求1所述的邻细胞间相互作用的研究方法,其特征在于,所述的纳米粒子声敏剂为大黄素纳米混悬剂,是通过以下步骤制备得到:称取大黄素、聚乙烯吡咯烷酮与十二烷基硫酸钠于烧杯中,加入去离子水,高速均质;再采用高压均质机多次循环得大黄素纳米混悬剂,即纳米粒子声敏剂。
3.如权利要求2所述的邻细胞间相互作用的研究方法,其特征在于,所述的大黄素纳米混悬剂,是通过以下步骤制备得到:称取大黄素300mg、聚乙烯吡咯烷酮1.5g与十二烷基硫酸钠30mg于烧杯中,加入100ml去离子水,高速均质5次,每次20秒;再采用高压均质机700bar循环15次得到大黄素纳米混悬剂,即纳米粒子声敏剂。
4.如权利要求1所述的邻细胞间相互作用的研究方法,其特征在于,纳米粒子声敏剂通过以下步骤制备得到:
(1)金纳米颗粒制备:取氯金酸于三颈烧瓶中,加入超纯水,超声混匀,水浴锅中回流加热搅拌升温;搅拌条件下加入三水合柠檬酸钠溶液;继续回流加热搅拌;室温下搅拌冷却,得酒红色金纳米颗粒;
(2)姜黄素@金纳米粒的制备:称取姜黄素溶解于乙醇中,将金纳米颗粒分散在溶有姜黄素的乙醇溶液中,避光静置,取上清,得姜黄素@金纳米粒;
(3)糖修饰纳米化姜黄素的制备:称取蛋黄卵磷脂,胆固醇,糖-PEG600-DSPE,其中糖为甘露糖、葡萄糖或半乳糖,将蛋黄卵磷脂,胆固醇,糖-PEG600-DSPE溶于乙醇,混匀后旋干成膜,加入姜黄素@金纳米粒溶液分散脂膜,再次使用旋转蒸发仪旋干,加入生理盐水超声水化,探头超声后通过聚碳酸酯膜过滤,离心,取上清得糖修饰纳米化姜黄素,即纳米粒子声敏剂。
5.如权利要求4所述的邻细胞间相互作用的研究方法,其特征在于,所述的糖为葡萄糖或甘露糖
6.如权利要求4所述的邻细胞间相互作用的研究方法,其特征在于,黄卵磷脂,胆固醇,糖-PEG600-DSPE的摩尔比为49:50:1;所述的超声水化是指超声处理运行10秒,暂停6秒,工作10次。
7.如权利要求1所述的邻细胞间相互作用的研究方法,其特征在于,纳米粒子声敏剂通过以下步骤制备得到:
原卟啉脂质体:将蛋黄磷脂酰胆碱(EPC)、胆固醇(CHO)和DSPE-PEG-2000用无水乙醇溶解在旋转蒸发瓶中,得到蛋黄磷脂酰胆碱(EPC)、胆固醇(CHO)和DSPE-PEG-2000的混合物,通过在减压条件下蒸发该混合物形成薄的脂质膜;用含有原卟啉的生理盐水溶液水化该脂质膜;通过超声处理使脂质体溶液分散,并通过聚碳酸酯膜挤出,便得到原卟啉脂质体,即纳米粒子声敏剂。
8.如权利要求7所述的邻细胞间相互作用的研究方法,其特征在于,蛋黄卵磷脂(EPC),胆固醇(CHO),DSPE-PEG-2000的摩尔比为49:50:1。
9.如权利要求1所述的邻细胞间相互作用的研究方法,其特征在于,所述的A类细胞包括但不限于胶质细胞、胶质瘤细胞、成纤维细胞、血管平滑肌细胞、内皮细胞、细菌以及真菌。
10.如权利要求1所述的邻细胞间相互作用的研究方法,其特征在于,所述的B类细胞包括但不限于神经元细胞、胶质细胞、心肌细胞、血管平滑肌细胞、血管内皮细胞、细菌以及真菌。
11.如权利要求1所述的邻细胞间相互作用的研究方法,其特征在于,所述的顺磁性环境由顺磁性溶液提供。
12.如权利要求11所述的邻细胞间相互作用的研究方法,其特征在于,所述的顺磁性溶液为钆类溶剂。
13.如权利要求12所述的邻细胞间相互作用的研究方法,其特征在于,所述的钆类溶剂为钆布醇。
14.如权利要求1所述的邻细胞间相互作用的研究方法,其特征在于,在微组织3D细胞群中,定时、定量以及定位调控和损伤A类细胞,检测损伤的A类细胞及未损伤B类细胞的蛋白组学变化。
15.如权利要求1-14任一项所述的邻细胞间相互作用的研究方法,其特征在于,是用于细胞通讯、制剂设计或医药研发技术领域。
16.如权利要求1-14任一项所述的邻细胞间相互作用的研究方法,其特征在于,是用于探究并阐明颗粒靶向性与邻细胞相互竞争摄取的内在联系。
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