CN110790803A - 一种***衍生物及其制备方法和应用 - Google Patents

一种***衍生物及其制备方法和应用 Download PDF

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Abstract

本发明涉及有机合成技术领域，公开了种***衍生物及其制备方法和应用。本发明所述***衍生物具有式1所示结构。本发明采用***4位修饰方法，与3‑巯基/羟基/氨基丙酸偶联成一种新型的***4位含有羧基的衍生物，所述衍生物相比***3位衍生物具备较佳的特异性和精确性，同时表现出良好的梯度，作为抗原的反应效果好，具有较高的经济价值；

Description

一种***衍生物及其制备方法和应用
技术领域
本发明涉及有机合成技术领域，具体涉及一种***衍生物及其制备方法和应用。
背景技术
***(estradiol)，亦称“动情素”、“求偶素”，***的一种。含量最多，活性也最强。由卵巢内卵泡的颗粒细胞分泌。其代谢物是雌酮及雌三醇。含18个碳原子。其靶器官为子宫、***、输卵管和垂体。是一种为经皮肤吸收的***治疗剂。补充女性卵巢分泌的17-β***的不足，同时又可避免因口服引起的副作用(***疼痛、体重增加、高血压、胆结石及肝功能异常等)。***能促使细胞合成DNA、RNA和相应组织内各种不同的蛋白质。
在人体内多种激素的测定中，***的测定一直被认为是一个难题。传统的免疫方法不能准确地去测定人体内***的含量。通常，抗原或抗体外检测原理根据抗原抗体结合形成免疫复合物的性状与活性特点，对标本中的抗原或抗体进行定性、定位或定量的检测。抗原抗体的适配特点会随着抗原或抗体结构的不同而变化。对于抗原来说，游离状态的特异反应的官能团越多越好。当前研究的主要方向是合成出高效的***衍生物来代替***作为半抗原，通过标记与抗体进行特异性反应进行检测。
目前***衍生物的合成路线主要是以下两种条路线：
Figure BDA0002273312410000011
路线1
Figure BDA0002273312410000021
路线2
路线1采用3位上修饰***的方法。然而，这些衍生物与抗体的适配性及特异性结合效率会变得不理想；路线2采用6位***衍生物的合成方法，虽然能够改善衍生物与抗体的适配性及特异性结合效率，但缺点在于合成路线较长，反应时间长，收率低。
发明内容
有鉴于此，本发明的目的在于提供一种***衍生物及其制备方法，使得所述***衍生物用于检测***时具有更高的特异性和精确性，同时表现出良好的梯度；
本发明的另外一个目的在于提供基于上述***衍生物的相关应用。
一种***衍生物，具有如下式1结构：
Figure BDA0002273312410000022
其中，R1选自S、O或NH。
相对于目前普遍3位或6位的修饰方案，本发明采用4位上修饰***的方法，提供了一种新型***4位含有羧基的衍生物，该化合物能够作为***诊断试剂盒抗原的制备原料，制备过程简单，作为抗原的反应效果好，具备较佳的特异性和精确性，同时表现出良好的梯度；基于此，本发明提出了所述***衍生物在检测***中的应用或在制备检测***的试剂盒中的应用。
同时，本发明还提供了所述***衍生物的制备方法，先将***与N-溴代丁二酰亚胺(NBS)进行自由基反应，得到4-位溴取代的***衍生物，再与式2化合物反应得到***4位含有羧基的衍生物，整个反应操作简单，并且能够得到收率较高的产物，具体步骤为：
步骤1、***在有机溶剂中与N-溴代丁二酰亚胺避光发生自由基取代反应，得到4位溴取代的***衍生物；
步骤2、所述4位溴取代的***与式2化合物在碱性条件下反应，得到式1结构化合物；
Figure BDA0002273312410000031
其中，R1选自S、O或NH；当R1选自S、O或NH时，式2化合物分别对应于3-巯基丙酸、3-羟基丙酸和3-氨基丙酸。
在本发明具体实施方式中，步骤1和步骤2在反应完成后还进行了产物纯化，具体为乙酸乙酯萃取分液、硅胶拌样、柱层析三个步骤。
作为优选，步骤1和步骤2反应的有机溶剂为对反应底物***具有较好溶解性的溶剂，包括但不限于甲醇、二甲亚砜、四氢呋喃和乙醇。
为提高***的转化率和反应效率，优选的原料的摩尔比为：***：N-溴代丁二酰亚胺＝1：(1.1～1.5)，该比例可具体选择为1:1.1、1:1.2、1:1.3、1:1.4或1:1.5；所述4位溴取代的***与式2化合物的摩尔比为1：(1.2～3)，该比例可具体选择为1:1.2、1:1.25或1:1.3。步骤2中所述的碱性条件的pH＝8-9。
为了提高反应效率，作为优选，步骤1所述反应的温度为10-30℃，更优选为25℃；为了能够更好地获得目标化合物，步骤2所述反应的温度为50-80℃，更优选为60℃。
步骤1和步骤2的反应时间为10～30h，反应时间过长增加反应成本，反应时间过短则难以保证反应的完全，实际过程中可通过薄层色谱进行实时监测反应是否完全。步骤2所述碱性条件为通过加入碱性物质实现，所述碱性物质可以是任何常规的碱性试剂，包括但不限于为氢氧化钠和氢氧化钾。
按照本发明制备方法制备***4位含有羧基的衍生物可达到89％以上的收率，产物纯度达到95％以上，整个方法合成路线短、时间少，操作简单，构型单一。
由以上技术方案可知，本发明采用***4位修饰方法，与3-巯基/羟基/氨基丙酸偶联成一种新型的***4位含有羧基的衍生物，所述衍生物相比***3位衍生物具备较佳的特异性和精确性，同时表现出良好的梯度，作为抗原的反应效果好，具有较高的经济价值。
具体实施方式
本发明公开了一种***衍生物及其制备方法和应用，本领域技术人员可以借鉴本文内容，适当改进工艺参数实现。特别需要指出的是，所有类似的替换和改动对本领域技术人员来说是显而易见的，它们都被视为包括在本发明。本发明所述***衍生物及其制备方法和应用已经通过较佳实施例进行了描述，相关人员明显能在不脱离本发明内容、精神和范围内对本文所述***衍生物及其制备方法和应用进行改动或适当变更与组合，来实现和应用本发明技术。
本发明方法所需的原料均为现有的化合物，均有市售；本发明步骤1中自由基反应需要严格避光，否则无法生成目标物质。
以下就本发明所提供的一种***衍生物及其制备方法和应用做进一步说明。
实施例1：制备本发明所述***衍生物(R1为O)
在50mL的Schlenk管中加入***，滴入甲醇10mL，***溶解完全后，依次缓慢滴加NBS(N-溴代丁二酰亚胺)(***：NBS＝1:1.3)，室温搅拌反应24小时。点板监测反应完全后，加水淬灭反应，乙酸乙酯萃取分液，硅胶拌样，经过柱层析(洗脱剂PE:EA:MeOH＝1:1:0.2)纯化得到4-位溴取代的***衍生物，收率96％；
将4-位溴取代的***衍生物加入到10ml的无水甲醇中，然后向其中加入3-羟基丙烯酸(4-位溴取代的***衍生物：3-羟基丙烯酸＝1:1.25)，升温至60℃，控温反应20小时，乙酸乙酯萃取分液，硅胶拌样，经过柱层析(洗脱剂为CH2CL2:MeOH＝1:1)纯化得到***4位含有羧基衍生物，收率为92％，纯度为98％。
制备得到的***4位含有羧基衍生物的核磁共振(1H NMR和13C NMR)检测数据为：
1H NMR(CDCl3):δ0.81(3H,s,18-CH3),1.38–2.3(m,),2.75(3H,t,J＝4.6Hz,17-CH),2.81(2H,t,J＝4.5Hz,O-CH2),6.89(1H,d,J＝6.3Hz,2-H),7.22(1H,d,J＝6.7Hz,1-H)
13C NMR(CDCl3):δ14.2,21.2,21.4,22.8,23.1,24.0,25.4,26.8,29.1,29.8,30.2,31.0,33.8,34.2,37.1,50.9,74.6,90.5,171.5,194.0。
实施例2：制备本发明所述***衍生物(R1为S)
在50mL的Schlenk管中加入***，滴入甲醇10mL，***溶解完全后，依次缓慢滴加NBS(N-溴代丁二酰亚胺)(***：NBS＝1:1.3)，室温搅拌反应24小时。点板监测反应完全后，加水淬灭反应，乙酸乙酯萃取分液，硅胶拌样，经过柱层析(洗脱剂PE:EA:MeOH＝1:1:0.2)纯化得到4-位溴取代的***衍生物，收率96％；
将4-位溴取代的***衍生物加入到10ml的无水甲醇中，然后向其中加入3-巯基丙烯酸(4-位溴取代的***衍生物：3-巯基丙烯酸＝1:1.2)，升温至60℃，控温反应20小时，乙酸乙酯萃取分液，硅胶拌样，经过柱层析(洗脱剂为CH2CL2:MeOH＝1:1)纯化得到***4位含有羧基衍生物，收率为96％，纯度为97％。
制备得到的***4位含有羧基衍生物的核磁共振(1H NMR和13C NMR)检测数据为：
1H NMR(CDCl3):δ0.81(3H,s,18-CH3),1.38–2.3(m,),2.75(3H,t,J＝4.6Hz,17-CH),2.81(2H,t,J＝4.5Hz,S-CH2),6.89(1H,d,J＝6.3Hz,2-H),7.22(1H,d,J＝6.7Hz,1-H)；
13C NMR(CDCl3):δ14.2,21.2,21.4,22.8,23.1,24.0,25.4,26.8,29.1,29.8,30.2,31.0,33.8,34.2,37.1,50.9,74.6,90.5,171.5,194.0。
实施例3：制备本发明所述***衍生物(R1为NH)
在50mL的Schlenk管中加入***，滴入甲醇10mL，***溶解完全后，依次缓慢滴加NBS(N-溴代丁二酰亚胺)(***：NBS＝1:1.3)，室温搅拌反应24小时。点板监测反应完全后，加水淬灭反应，乙酸乙酯萃取分液，硅胶拌样，经过柱层析(洗脱剂PE:EA:MeOH＝1:1:0.2)纯化得到4-位溴取代的***衍生物，收率96％；
将4-位溴取代的***衍生物加入到10ml的无水甲醇中，然后向其中加入3-氨基丙烯酸(4-位溴取代的***衍生物：3-氨基丙烯酸＝1:1.2)，升温至60℃，控温反应20小时，乙酸乙酯萃取分液，硅胶拌样，经过柱层析(洗脱剂为CH2CL2:MeOH＝1:1)纯化得到***4位含有羧基衍生物，收率为89％，纯度为93％。
制备得到的***4位含有羧基衍生物的核磁共振(1H NMR和13C NMR)检测数据为：
1H NMR(CDCl3):δ0.81(3H,s,18-CH3),1.38–2.3(m,),2.75(3H,t,J＝4.6Hz,17-CH),2.81(2H,t,J＝4.5Hz,N-CH2),6.33(1H,d,J＝3.3Hz,NH),6.89(1H,d,J＝6.3Hz,2-H),7.22(1H,d,J＝6.7Hz,1-H)；
13C NMR(CDCl3):δ14.2,21.2,21.4,22.8,23.1,24.0,25.4,26.8,29.1,29.8,30.2,31.0,33.8,34.2,37.1,50.9,74.6,90.5,171.5,194.0。
实施例4：应用测试试验
利用***磁微粒化学发光免疫定量检测试剂盒结合制备的***衍生物进行应用测试，具体如下：
所采用的***磁微粒化学发光免疫定量检测试剂盒包括：用***抗体包被的磁微粒悬浮液、辣根过氧化物酶标记***制备酶结合物。通过免疫反应形成抗体-酶标抗原复合物。其中本发明所涉及的磁微粒悬浮液配方：PH6.0MES+0.5％BSA+3‰ADP+0.5‰P300+1.5％NaCl+0.75％DSS+400ng/ml甲基睾酮+1.5％EDTA+0.5％乙醇；酶结合物配方：PH6.0MES+0.5％BSA+3‰ADP+0.5‰P300+1.5％NaCl。
实施例1-3的***衍生物与郑州安图生物工程股份有限公司在产试剂盒所用的3位***衍生物(作为对照用)分别标记辣根过氧化物酶，加入上述酶结合物溶液中(酶结合物的浓度为1/1K)。
上述所述郑州安图生物工程股份有限公司在产试剂盒所用的3位***衍生物结构式如下：
Figure BDA0002273312410000071
1、梯度测试
将***粉末(购于Sigma公司)溶解于无水甲醇中，制成1μg/mL的储存液，并将此储存液稀释于不含***的空白人造血清中，至终浓度分别为0.00，30.00，100.00，500.00，1500，4500pg/mL，将上述配制好的人造血清作为校准品进行ELISA实验。
结果见表1。
表1
Figure BDA0002273312410000081
由表1可知，实施例1～3生成的***酶衍生物所配制试剂盒的校准品的梯度T0/T1，T0/T5值均高于在产衍生物所配制的试剂盒。
2、精密度测试
取浓度为80pg/ml，600pg/ml的两个***标准样品，分别用3位***试剂、实施例1-3***衍生物结合***化学发光免疫分析试剂盒重复测定这两个样品25次，统计异常数的百分比，结果见表2。
表2
Figure BDA0002273312410000082
结果表明：采用实施例1-3***衍生物的精密度均低于5％，且低于3位***试剂，尤其在低值区，明显改善精密性。
3、特异性试验(交叉反应)
选取常见激素及激素代谢物进行干扰检测，调浓度至1ng/ml，然后用3位***、实施例1-3***衍生物结合***化学发光免疫分析试剂盒分别测定上述配置好的激素及激素代谢产物。结果见表3。
表3
Figure BDA0002273312410000083
通过对常见的激素及激素代谢物做交叉实验，以上数据表明，实施例1-3***衍生物与上述几种化合物交叉率都明显低于3位***衍生物，尤其是对3位***衍生物交叉率较高的化合物，改善较为明显。
4、临床样本检测
分别用3位***、实施例1-3***衍生物结合***化学发光免疫分析试剂盒对500份临床样本进行测试，并测两次复孔，与高效液相所测试的结果进行对比，结果见表4。
表4
Figure BDA0002273312410000092
Figure BDA0002273312410000101
数据表明：3位***衍生物所配制的试剂盒与高效液相的R2＝0.9112，明显低于实施例1-3所配制的试剂盒与高效液相的R2；并且实施例1-3所配制的试剂盒对跳值、异常样本有很大改善。
5、稳定性试验
将用3位***、实施例1-3***衍生物结合***化学发光免疫分析试剂盒放置37℃环境下，分别做0、5、7和10天的考核，统计各时间点测试结果相对于0天的降幅百分比，结果见表5。
表5
Figure BDA0002273312410000102
以上数据表明，3位***、实施例1-3***衍生物结合***化学发光免疫分析试剂盒加速稳定性差异不大。
以上所述仅是本发明的优选实施方式，应当指出，对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明原理的前提下，还可以做出若干改进和润饰，这些改进和润饰也应视为本发明的保护范围。

Claims (10)

1.一种***衍生物，其特征在于，具有如下式1结构：
Figure FDA0002273312400000011
其中，R1选自S、O或NH。
2.权利要求1所述***衍生物在检测***中的应用或在制备检测***的试剂盒中的应用。
3.式1结构化合物的制备方法，其特征在于，包括：
步骤1、***在有机溶剂中与N-溴代丁二酰亚胺避光发生自由基取代反应，得到4位溴取代的***衍生物；
步骤2、所述4位溴取代的***与式2化合物在碱性条件下反应，得到式1结构化合物；
Figure FDA0002273312400000012
其中，R1选自S、O或NH。
4.根据权利要求3所述制备方法，其特征在于，所述有机溶剂为甲醇、二甲亚砜、四氢呋喃或乙醇。
5.根据权利要求3所述制备方法，其特征在于，步骤1所述反应的温度为10-30℃。
6.根据权利要求3所述制备方法，其特征在于，步骤2所述反应的温度为50-80℃。
7.根据权利要求3所述制备方法，其特征在于，所述碱性条件的pH值为8-9。
8.根据权利要求3所述制备方法，其特征在于，所述碱性条件为通过加入碱性物质实现。
9.根据权利要求3所述制备方法，其特征在于，所述***和N-溴代丁二酰亚胺的摩尔比为1：(1.1～1.5)。
10.根据权利要求1所述制备方法，其特征在于，所述4位溴取代的***与式2化合物的摩尔比为1：(1.2～3)。
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