CN110786321A - 一种金钱鱼***冷冻保存方法 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种金钱鱼***冷冻保存方法,其包括***采集、***稀释、***冷冻保存和***解冻四个步骤,先挑选雄性金钱鱼在背肌注射人绒毛膜***,然后再采用人工腹部挤压法采集金钱鱼的***,然后将***与抗冻液混合得到金钱鱼***的保存液,所述稀释液为TS‑2稀释液、TS‑19稀释液、Hank’s液、Cortland稀释液和灭菌海水中的任意一种与二甲亚砜混合配制的;接着将***保存液注入冻存管中,再采用分段逐步降温法进行冷冻,然后浸入液氮长期保存;取用时将装有***保存液的冻存管从液氮中取出,然后置于温度为42℃的水浴锅中解冻。本发明方法能够长期保存金钱鱼的***,且解冻复苏后***成活率和授精率高。
Description
技术领域
本发明属于生物学低温冷冻保存技术领域,具体涉及一种金钱鱼***冷冻保存方法。
背景技术
南海是世界第三大陆缘海,面积约350万km2,其中我国管辖海域面积约201万km2。由于其海域辽阔、水质优良、海洋资源丰富,鱼、虾、贝、藻等海洋生物种类、品种众多,总计约有4168种,约占全国相应类群种类的52.2%。随着全球经济的加快及南海周边国家竞相发展海洋经济,我国也加快南海区海洋资源的开发步伐。但是伴随着海洋经济的加快发展,我国已出现了渔业种质资源衰退;海域污染情况日趋严重;赤潮频频;近海生态环境恶化等问题,这些严重影响和制约我国海洋经济的健康发展。因此,保护好海洋生态环境的同时,我们也要注重保护原有野生资源、注重种质保存,为今后实现可持续发展提供途径。
金钱鱼(Scatophagus argus),又名金鼓鱼,原产于东南亚的沿海地区,其体长为25~30cm,适宜生活在水温为22~25℃的环境中,金钱鱼属于金钱鱼科,体略呈椭圆形,侧扁而高,背鳍硬棘与软条间具有深缺刻,体表呈褐色,腹缘银白色,鱼体上有许多深色圆斑。金钱鱼为沿岸岩礁区的鱼,能以纯淡水饲养,但最好还是加些盐分,以使其发育得更好。金钱鱼作为一种常见的食材,能为人体补充多种营养,特别是蛋白质和维生素以及氨基酸,另外微量元素也是金钱鱼中最重要的存在,平时人们食用它以后能吸收镁、钙、铁以及磷等多种微量元素,可以满足身体各器官对这些营养成分的需要,对提高身体素质有很大的好处,同时金钱鱼还因为其背部独特花纹,现在许多人喜欢将金钱鱼的稚鱼作为观赏鱼饲养。随着人们对金钱鱼的需求增加,许多地区都开始进行人工养殖,而且养殖规模不断增加,使得金钱鱼种苗的需求也逐渐增大,对金钱鱼种苗的品质也逐年提高。尽管人工繁殖可以使金钱鱼集中产卵,提高鱼卵受精率、孵化率和鱼苗成活率,并做到有计划地生产。但因为金钱鱼的繁育具有季节性,而且存在雌雄性腺发育不同步、雄性一般先于雌性成熟的现象,这些都增加了人工繁殖的难度。如果能在繁育季节采集并长期保存金钱鱼的***,就能克服这些困难,从而满足金钱鱼全年的繁育生产需要,提高金钱鱼在非繁育季节时的人工授精效率和育苗成活率,但是目前少有能够长期保存金钱鱼***的方法。
发明内容
针对上述不足,本发明公开了一种金钱鱼***冷冻保存方法,能够长期保存金钱鱼的***,且解冻复苏后***成活率和授精率高。
本发明是采用如下技术方案实现的:
一种金钱鱼***冷冻保存方法,其特征在于:包括如下步骤:
(1)***采集:挑选体重为190~220g的2龄金钱鱼,在背肌注射150IU/kg的人绒毛膜***,在水温27~28℃条件下催产20h以上,期间观察雄鱼***量的变化,然后将金钱鱼麻醉后用干毛巾擦干鱼体生殖孔周围水分和黏液,再沿着中线轻轻挤压腹部至生殖孔流出乳白色***,用注射器吸取***,防止尿液、血液和水混入,将采集的***注入冻存管中;
(2)***稀释:先将步骤(1)中采集到的***与抗冻液按照体积比为1:1的比例混合稀释得到保存液,所述抗冻液包括以下体积分数的组分:5~15%二甲亚砜,余量为稀释液;所述稀释液为TS-2稀释液,TS-19稀释液、Hank’s液、Cortland稀释液和灭菌海水中的任意一种;
(3)***冷冻保存:将步骤(2)得到的保存液注入冻存管中,再将冻存管置于在4℃下的冷冻仓中平衡30min,接着按照每分钟降低5℃的速度降温至-20℃,然后在-20℃下平衡5min,再按照每分钟降低10℃的速度降温至-80℃,然后在-80℃下平衡5min,接着立即将装有保存液的冷冻管放入液氮罐中,在-196℃下长期保存;
(4)***解冻:将装有***保存液的冻存管提到液氮液面上平衡3~5min,然后迅速将冷冻管放置于42℃水浴锅中解冻,再将解冻后的***保存液置于4℃下保存备用。
进一步的,步骤(2)中所述抗冻液还包括浓度为0.25mol/L的海藻糖。
进一步的,所述TS-2稀释液包括以下浓度的组分:10g/L KHCO3 ,3.13g/L BSA,37.65g/LSucrose,1.21g/L Tris,所述TS-2稀释液的pH为8.2;所述TS-19稀释液包括以下浓度的组分:4.56g/L NaC1,2.1g/L NaHCO3 ,3.5g/L KHCO3 ,3.13g/L BSA,7.13g/LGlucose,17g/L Sucrose,1.21g/L Tris,所述TS-19的pH为9.56;所述Hank’s稀释液包括以下浓度的组分:8.01g/L NaC1,0.4g/L KCI,0.14 g/L CaCl2·2H2O,0.35g/L NaHCO3 ,0.06g/L KH2PO4,0.1g/L MgCl·6 H2O ,0.1g/L MgSO4·7 H2O,0.06g/L Na2HPO4·2 H2O ,10g/L Glucose,所述Hank’s稀释液的pH为6.8;所述Cortland稀释液包括以下浓度的组分:7.25g/L NaC1,0.38g/L KCI,0.18g/L CaCl2·2H2O,1g/L NaHCO3,0.23g/L MgSO4·7H2O,0.41g/L NaH2PO4·H2O,1g/L Glucose,所述Cortland稀释液的pH为7。
进一步的,步骤(2)中所述抗冻液是置于4℃的温度下保存备用。
本技术方案与现有技术相比较具有以下有益效果:
1、本发明根据金钱鱼的***特性,将稀释液和二甲亚砜按照比例进行混合配制抗冻液,然后将金钱鱼的***和抗冻液混合后进行低温冷冻保存,所用的抗冻液能防止***受到冰晶和氧化损伤而影响***保存效果和解冻后***的成活率和受精率,同时严格控制抗冻液中二甲亚砜的浓度,使其在金钱鱼***所适应的浓度范围内,不会因为二甲亚砜浓度过高造成金钱鱼***中毒;同时本发明在抗冻液中还加入了海藻糖,海藻糖能够对金钱鱼***起到保护作用,减少金钱鱼***细胞的损伤,从而提高了金钱鱼***的活力。
2、本发明冷冻保存过程中设定了多种不同稀释液进行抗冻液的配制,同时采用分步降温方法、严格控制单一变量进行冷冻条件筛选,所得冷冻保存条件组合更适合金钱鱼***的冷冻保存,解冻后金钱鱼***的活力能够达到80%以上。
3、本发明降温前将稀释液与抗冻保护剂混合配制成抗冻液,并置于4℃冰箱保存备用,操作简便快捷,节省了时间。
4、本发明方法选择体重为190~220g的2龄金钱鱼雄鱼进行***提取和保存,是因为这样选择的雄鱼的生殖***发育较完善、机制较健全,比较适合人工繁殖,而且在注射人绒毛膜***后能够在一个时间段内集中产卵***,以提高鱼类人工繁殖效率。
5、本发明方法操作简单、冷冻保存效果好、成本低,可以长期保存金钱鱼的***,实现金钱鱼种质资源的永久保存,而且能够在金钱鱼的繁育季节大量挑选保存优质***,用于金钱鱼全年的人工繁育生产。
具体实施方式
以下通过实施例进一步说明本发明,但不作为对本发明的限制。下列实施例中未注明的具体实验条件和方法,所采用的技术手段通常为本领域技术人员所熟知的常规手段。
实施例1:
一种金钱鱼***冷冻保存方法,其特征在于:包括如下步骤:
(1)***采集:挑选体重为200g的2龄金钱鱼,在背肌注射150IU/kg的人绒毛膜***,在水温27~28℃条件下催产20h,期间观察雄鱼***量的变化,并且每间隔2~3h可以取样***0.5ml按照常规方法进行一次***活力和寿命等参数的测定,然后将金钱鱼麻醉后用干毛巾擦干鱼体生殖孔周围水分和黏液,再沿着中线轻轻挤压腹部至生殖孔流出乳白色***,用注射器吸取***,防止尿液、血液和水混入,将采集的***注入冻存管中;
(2)***稀释:先将步骤(1)中采集到的***与抗冻液按照体积比为1:1的比例混合稀释得到保存液,所述抗冻液包括以下体积分数的组分:10%二甲亚砜,余量为稀释液;所述稀释液为Hank’s液;所述抗冻液是置于4℃的温度下保存备用;所述Hank’s稀释液包括以下浓度的组分:8.01g/L NaC1,0.4g/L KCI,0.14 g/L CaCl2·2H2O,0.35g/L NaHCO3 ,0.06g/LKH2PO4,0.1g/L MgCl·6 H2O ,0.1g/L MgSO4·7 H2O,0.06g/L Na2HPO4·2 H2O ,10g/LGlucose,所述Hank’s稀释液的pH为6.8;
(3)***冷冻保存:将步骤(2)得到的保存液注入冻存管中,再将冻存管置于在4℃下的冷冻仓中平衡30min,接着按照每分钟降低5℃的速度降温至-20℃,然后在-20℃下平衡5min,再按照每分钟降低10℃的速度降温至-80℃,然后在-80℃下平衡5min,接着立即将装有保存液的冷冻管放入液氮罐中,在-196℃下长期保存;
(4)***解冻:将装有***保存液的冻存管提到液氮液面上平衡4min,然后迅速将冷冻管放置于42℃水浴锅中解冻,再将解冻后的***保存液置于4℃下保存备用。
按照本实施例所述方法进行金钱鱼***的冷冻保存,解冻后用海水激活金钱鱼的***,置于***质量分析***中连接的显微镜下观察,同时利用***质量分析***(CASA)进行***质量的计算机辅助检测,利用现代化的计算机识别技术和图像处理技术,对***的动静态特征进行全面的量化分析,检测得到解冻***的活力为90.118%。
实施例2:
一种金钱鱼***冷冻保存方法,其特征在于:包括如下步骤:
(1)***采集:挑选体重为210g的2龄金钱鱼,在背肌注射150IU/kg的人绒毛膜***,在水温27~28℃条件下催产24h,期间观察雄鱼***量的变化,并且每间隔2~3h可以取样***0.5ml按照常规方法进行一次***活力和寿命等参数的测定,然后将金钱鱼麻醉后用干毛巾擦干鱼体生殖孔周围水分和黏液,再沿着中线轻轻挤压腹部至生殖孔流出乳白色***,用注射器吸取***,防止尿液、血液和水混入,将采集的***注入冻存管中;
(2)***稀释:先将步骤(1)中采集到的***与抗冻液按照体积比为1:1的比例混合稀释得到保存液,所述抗冻液包括以下体积分数的组分:10%二甲亚砜,余量为稀释液;所述稀释液为灭菌海水;所述抗冻液是置于4℃的温度下保存备用;
(3)***冷冻保存:将步骤(2)得到的保存液注入冻存管中,再将冻存管置于在4℃下的冷冻仓中平衡30min,接着按照每分钟降低5℃的速度降温至-20℃,然后在-20℃下平衡5min,再按照每分钟降低10℃的速度降温至-80℃,然后在-80℃下平衡5min,接着立即将装有保存液的冷冻管放入液氮罐中,在-196℃下长期保存;
(4)***解冻:将装有***保存液的冻存管提到液氮液面上平衡3min,然后迅速将冷冻管放置于42℃水浴锅中解冻,再将解冻后的***保存液置于4℃下保存备用。
按照本实施例所述方法进行金钱鱼***的冷冻保存,解冻后用海水激活金钱鱼的***,置于***质量分析***中连接的显微镜下观察,同时利用***质量分析***(CASA)进行***质量的计算机辅助检测,利用现代化的计算机识别技术和图像处理技术,对***的动静态特征进行全面的量化分析,检测得到解冻***的活力为91.70%。
实施例3:
一种金钱鱼***冷冻保存方法,其特征在于:包括如下步骤:
(1)***采集:挑选体重为220g的2龄金钱鱼,在背肌注射150IU/kg的人绒毛膜***,在水温27~28℃条件下催产36h,期间观察雄鱼***量的变化,并且每间隔2~3h可以取样***0.5ml按照常规方法进行一次***活力和寿命等参数的测定,然后将金钱鱼麻醉后用干毛巾擦干鱼体生殖孔周围水分和黏液,再沿着中线轻轻挤压腹部至生殖孔流出乳白色***,用注射器吸取***,防止尿液、血液和水混入,将采集的***注入冻存管中;
(2)***稀释:先将步骤(1)中采集到的***与抗冻液按照体积比为1:1的比例混合稀释得到保存液,所述抗冻液包括以下体积分数的组分:8%二甲亚砜,余量为稀释液;所述稀释液为TS-2稀释液;所述抗冻液是置于4℃的温度下保存备用;所述TS-2稀释液包括以下浓度的组分:10g/L KHCO3 ,3.13g/L BSA,37.65g/LSucrose,1.21g/L Tris,所述TS-2稀释液的pH为8.2;
(3)***冷冻保存:将步骤(2)得到的保存液注入冻存管中,再将冻存管置于在4℃下的冷冻仓中平衡30min,接着按照每分钟降低5℃的速度降温至-20℃,然后在-20℃下平衡5min,再按照每分钟降低10℃的速度降温至-80℃,然后在-80℃下平衡5min,接着立即将装有保存液的冷冻管放入液氮罐中,在-196℃下长期保存;
(4)***解冻:将装有***保存液的冻存管提到液氮液面上平衡5min,然后迅速将冷冻管放置于42℃水浴锅中解冻,再将解冻后的***保存液置于4℃下保存备用。
按照本实施例所述方法进行金钱鱼***的冷冻保存,解冻后用海水激活金钱鱼的***,置于***质量分析***中连接的显微镜下观察,同时利用***质量分析***(CASA)进行***质量的计算机辅助检测,利用现代化的计算机识别技术和图像处理技术,对***的动静态特征进行全面的量化分析,检测得到解冻***的活力为83.522%。
实施例4:
一种金钱鱼***冷冻保存方法,其特征在于:包括如下步骤:
(1)***采集:挑选体重为190g的2龄金钱鱼,在背肌注射150IU/kg的人绒毛膜***,在水温27~28℃条件下催产32h,期间观察雄鱼***量的变化,并且每间隔2~3h可以取样***0.5ml按照常规方法进行一次***活力和寿命等参数的测定,然后将金钱鱼麻醉后用干毛巾擦干鱼体生殖孔周围水分和黏液,再沿着中线轻轻挤压腹部至生殖孔流出乳白色***,用注射器吸取***,防止尿液、血液和水混入,将采集的***注入冻存管中;
(2)***稀释:先将步骤(1)中采集到的***与抗冻液按照体积比为1:1的比例混合稀释得到保存液,所述抗冻液包括以下体积分数的组分:10%二甲亚砜,余量为稀释液;所述稀释液为TS-19稀释液;所述抗冻液是置于4℃的温度下保存备用;所述TS-19稀释液包括以下浓度的组分:4.56g/L NaC1,2.1g/L NaHCO3 ,3.5g/L KHCO3 ,3.13g/L BSA,7.13g/LGlucose,17g/L Sucrose,1.21g/L Tris,所述TS-19的pH为9.56;
(3)***冷冻保存:将步骤(2)得到的保存液注入冻存管中,再将冻存管置于在4℃下的冷冻仓中平衡30min,接着按照每分钟降低5℃的速度降温至-20℃,然后在-20℃下平衡5min,再按照每分钟降低10℃的速度降温至-80℃,然后在-80℃下平衡5min,接着立即将装有保存液的冷冻管放入液氮罐中,在-196℃下长期保存;
(4)***解冻:将装有***保存液的冻存管提到液氮液面上平衡3min,然后迅速将冷冻管放置于42℃水浴锅中解冻,再将解冻后的***保存液置于4℃下保存备用。
按照本实施例所述方法进行金钱鱼***的冷冻保存,解冻后用海水激活金钱鱼的***,置于***质量分析***中连接的显微镜下观察,同时利用***质量分析***(CASA)进行***质量的计算机辅助检测,利用现代化的计算机识别技术和图像处理技术,对***的动静态特征进行全面的量化分析,检测得到解冻***的活力为86.310%。
实施例5:
一种金钱鱼***冷冻保存方法,其特征在于:包括如下步骤:
(1)***采集:挑选体重为208g的2龄金钱鱼,在背肌注射150IU/kg的人绒毛膜***,在水温27~28℃条件下催产48h,期间观察雄鱼***量的变化,并且每间隔2~3h可以取样***0.5ml按照常规方法进行一次***活力和寿命等参数的测定,然后将金钱鱼麻醉后用干毛巾擦干鱼体生殖孔周围水分和黏液,再沿着中线轻轻挤压腹部至生殖孔流出乳白色***,用注射器吸取***,防止尿液、血液和水混入,将采集的***注入冻存管中;
(2)***稀释:先将步骤(1)中采集到的***与抗冻液按照体积比为1:1的比例混合稀释得到保存液,所述抗冻液包括以下体积分数的组分:10%二甲亚砜,余量为稀释液;所述稀释液为Cortland稀释液;所述抗冻液是置于4℃的温度下保存备用;所述Cortland稀释液包括以下浓度的组分:7.25g/L NaC1,0.38g/L KCI,0.18g/L CaCl2·2H2O,1g/L NaHCO3,0.23g/L MgSO4·7H2O,0.41g/L NaH2PO4·H2O,1g/L Glucose,所述Cortland稀释液的pH为7;
(3)***冷冻保存:将步骤(2)得到的保存液注入冻存管中,再将冻存管置于在4℃下的冷冻仓中平衡30min,接着按照每分钟降低5℃的速度降温至-20℃,然后在-20℃下平衡5min,再按照每分钟降低10℃的速度降温至-80℃,然后在-80℃下平衡5min,接着立即将装有保存液的冷冻管放入液氮罐中,在-196℃下长期保存;
(4)***解冻:将装有***保存液的冻存管提到液氮液面上平衡5min,然后迅速将冷冻管放置于42℃水浴锅中解冻,再将解冻后的***保存液置于4℃下保存备用。
按照本实施例所述方法进行金钱鱼***的冷冻保存,解冻后用海水激活金钱鱼的***,置于***质量分析***中连接的显微镜下观察,同时利用***质量分析***(CASA)进行***质量的计算机辅助检测,利用现代化的计算机识别技术和图像处理技术,对***的动静态特征进行全面的量化分析,检测得到解冻***的活力为81.127%。
实施例6:
一种金钱鱼***冷冻保存方法,其特征在于:包括如下步骤:
(1)***采集:挑选体重为215g的2龄金钱鱼,在背肌注射150IU/kg的人绒毛膜***,在水温27~28℃条件下催产28h,期间观察雄鱼***量的变化,并且每间隔2~3h可以取样***0.5ml按照常规方法进行一次***活力和寿命等参数的测定,然后将金钱鱼麻醉后用干毛巾擦干鱼体生殖孔周围水分和黏液,再沿着中线轻轻挤压腹部至生殖孔流出乳白色***,用注射器吸取***,防止尿液、血液和水混入,将采集的***注入冻存管中;
(2)***稀释:先将步骤(1)中采集到的***与抗冻液按照体积比为1:1的比例混合稀释得到保存液,所述抗冻液包括以下体积分数的组分:10%二甲亚砜,余量为稀释液;所述稀释液为灭菌海水;所述抗冻液还包括浓度为0.25mol/L的海藻糖;所述抗冻液是置于4℃的温度下保存备用;
(3)***冷冻保存:将步骤(2)得到的保存液注入冻存管中,再将冻存管置于在4℃下的冷冻仓中平衡30min,接着按照每分钟降低5℃的速度降温至-20℃,然后在-20℃下平衡5min,再按照每分钟降低10℃的速度降温至-80℃,然后在-80℃下平衡5min,接着立即将装有保存液的冷冻管放入液氮罐中,在-196℃下长期保存;
(4)***解冻:将装有***保存液的冻存管提到液氮液面上平衡5min,然后迅速将冷冻管放置于42℃水浴锅中解冻,再将解冻后的***保存液置于4℃下保存备用。
按照本实施例所述方法进行金钱鱼***的冷冻保存,解冻后用海水激活金钱鱼的***,置于***质量分析***中连接的显微镜下观察,同时利用***质量分析***(CASA)进行***质量的计算机辅助检测,利用现代化的计算机识别技术和图像处理技术,对***的动静态特征进行全面的量化分析,检测得到解冻***的活力为94.871%。
实施例7:
一种金钱鱼***冷冻保存方法,其特征在于:包括如下步骤:
(1)***采集:挑选体重为190g的2龄金钱鱼,在背肌注射150IU/kg的人绒毛膜***,在水温27~28℃条件下催产30h,期间观察雄鱼***量的变化,并且每间隔2~3h可以取样***0.5ml按照常规方法进行一次***活力和寿命等参数的测定,然后将金钱鱼麻醉后用干毛巾擦干鱼体生殖孔周围水分和黏液,再沿着中线轻轻挤压腹部至生殖孔流出乳白色***,用注射器吸取***,防止尿液、血液和水混入,将采集的***注入冻存管中;
(2)***稀释:先将步骤(1)中采集到的***与抗冻液按照体积比为1:1的比例混合稀释得到保存液,所述抗冻液包括以下体积分数的组分:10%二甲亚砜,余量为稀释液;所述稀释液为Hank’s液;所述抗冻液还包括浓度为0.25mol/L的海藻糖;所述抗冻液是置于4℃的温度下保存备用;所述Hank’s稀释液包括以下浓度的组分:8.01g/L NaC1,0.4g/L KCI,0.14 g/L CaCl2·2H2O,0.35g/L NaHCO3 ,0.06g/L KH2PO4,0.1g/L MgCl·6 H2O ,0.1g/LMgSO4·7 H2O,0.06g/L Na2HPO4·2 H2O ,10g/L Glucose,所述Hank’s稀释液的pH为6.8;
(3)***冷冻保存:将步骤(2)得到的保存液注入冻存管中,再将冻存管置于在4℃下的冷冻仓中平衡30min,接着按照每分钟降低5℃的速度降温至-20℃,然后在-20℃下平衡5min,再按照每分钟降低10℃的速度降温至-80℃,然后在-80℃下平衡5min,接着立即将装有保存液的冷冻管放入液氮罐中,在-196℃下长期保存;
(4)***解冻:将装有***保存液的冻存管提到液氮液面上平衡4min,然后迅速将冷冻管放置于42℃水浴锅中解冻,再将解冻后的***保存液置于4℃下保存备用。
按照本实施例所述方法进行金钱鱼***的冷冻保存,解冻后用海水激活金钱鱼的***,置于***质量分析***中连接的显微镜下观察,同时利用***质量分析***(CASA)进行***质量的计算机辅助检测,利用现代化的计算机识别技术和图像处理技术,对***的动静态特征进行全面的量化分析,检测得到解冻***的活力为95.008%。
实施例8:
一种金钱鱼***冷冻保存方法,其特征在于:包括如下步骤:
(1)***采集:挑选体重为195g的2龄金钱鱼,在背肌注射150IU/kg的人绒毛膜***,在水温27~28℃条件下催产24h,期间观察雄鱼***量的变化,并且每间隔2~3h可以取样***0.5ml按照常规方法进行一次***活力和寿命等参数的测定,然后将金钱鱼麻醉后用干毛巾擦干鱼体生殖孔周围水分和黏液,再沿着中线轻轻挤压腹部至生殖孔流出乳白色***,用注射器吸取***,防止尿液、血液和水混入,将采集的***注入冻存管中;
(2)***稀释:先将步骤(1)中采集到的***与抗冻液按照体积比为1:1的比例混合稀释得到保存液,所述抗冻液包括以下体积分数的组分:8%二甲亚砜,余量为稀释液;所述稀释液为TS-2稀释液;所述抗冻液还包括浓度为0.25mol/L的海藻糖;所述抗冻液是置于4℃的温度下保存备用;所述TS-2稀释液包括以下浓度的组分:10g/L KHCO3 ,3.13g/L BSA,37.65g/LSucrose,1.21g/L Tris,所述TS-2稀释液的pH为8.2;
(3)***冷冻保存:将步骤(2)得到的保存液注入冻存管中,再将冻存管置于在4℃下的冷冻仓中平衡30min,接着按照每分钟降低5℃的速度降温至-20℃,然后在-20℃下平衡5min,再按照每分钟降低10℃的速度降温至-80℃,然后在-80℃下平衡5min,接着立即将装有保存液的冷冻管放入液氮罐中,在-196℃下长期保存;
(4)***解冻:将装有***保存液的冻存管提到液氮液面上平衡3min,然后迅速将冷冻管放置于42℃水浴锅中解冻,再将解冻后的***保存液置于4℃下保存备用。
按照本实施例所述方法进行金钱鱼***的冷冻保存,解冻后用海水激活金钱鱼的***,置于***质量分析***中连接的显微镜下观察,同时利用***质量分析***(CASA)进行***质量的计算机辅助检测,利用现代化的计算机识别技术和图像处理技术,对***的动静态特征进行全面的量化分析,检测得到解冻***的活力为90.112%。
实施例9:
一种金钱鱼***冷冻保存方法,其特征在于:包括如下步骤:
(1)***采集:挑选体重为220g的2龄金钱鱼,在背肌注射150IU/kg的人绒毛膜***,在水温27~28℃条件下催产40h,期间观察雄鱼***量的变化,并且每间隔2~3h可以取样***0.5ml按照常规方法进行一次***活力和寿命等参数的测定,然后将金钱鱼麻醉后用干毛巾擦干鱼体生殖孔周围水分和黏液,再沿着中线轻轻挤压腹部至生殖孔流出乳白色***,用注射器吸取***,防止尿液、血液和水混入,将采集的***注入冻存管中;
(2)***稀释:先将步骤(1)中采集到的***与抗冻液按照体积比为1:1的比例混合稀释得到保存液,所述抗冻液包括以下体积分数的组分:10%二甲亚砜,余量为稀释液;所述稀释液为TS-19稀释液;所述抗冻液还包括浓度为0.25mol/L的海藻糖;所述抗冻液是置于4℃的温度下保存备用;所述TS-19稀释液包括以下浓度的组分:4.56g/L NaC1,2.1g/LNaHCO3 ,3.5g/L KHCO3 ,3.13g/L BSA,7.13g/L Glucose,17g/L Sucrose,1.21g/L Tris,所述TS-19的pH为9.56;
(3)***冷冻保存:将步骤(2)得到的保存液注入冻存管中,再将冻存管置于在4℃下的冷冻仓中平衡30min,接着按照每分钟降低5℃的速度降温至-20℃,然后在-20℃下平衡5min,再按照每分钟降低10℃的速度降温至-80℃,然后在-80℃下平衡5min,接着立即将装有保存液的冷冻管放入液氮罐中,在-196℃下长期保存;
(4)***解冻:将装有***保存液的冻存管提到液氮液面上平衡3min,然后迅速将冷冻管放置于42℃水浴锅中解冻,再将解冻后的***保存液置于4℃下保存备用。
按照本实施例所述方法进行金钱鱼***的冷冻保存,解冻后用海水激活金钱鱼的***,置于***质量分析***中连接的显微镜下观察,同时利用***质量分析***(CASA)进行***质量的计算机辅助检测,利用现代化的计算机识别技术和图像处理技术,对***的动静态特征进行全面的量化分析,检测得到解冻***的活力为88.020%。
实施例10:
一种金钱鱼***冷冻保存方法,其特征在于:包括如下步骤:
(1)***采集:挑选体重为195g的2龄金钱鱼,在背肌注射150IU/kg的人绒毛膜***,在水温27~28℃条件下催产56h,期间观察雄鱼***量的变化,并且每间隔2~3h可以取样***0.5ml按照常规方法进行一次***活力和寿命等参数的测定,然后将金钱鱼麻醉后用干毛巾擦干鱼体生殖孔周围水分和黏液,再沿着中线轻轻挤压腹部至生殖孔流出乳白色***,用注射器吸取***,防止尿液、血液和水混入,将采集的***注入冻存管中;
(2)***稀释:先将步骤(1)中采集到的***与抗冻液按照体积比为1:1的比例混合稀释得到保存液,所述抗冻液包括以下体积分数的组分:10%二甲亚砜,余量为稀释液;所述稀释液为Cortland稀释液;所述抗冻液还包括浓度为0.25mol/L的海藻糖;所述抗冻液是置于4℃的温度下保存备用;所述Cortland稀释液包括以下浓度的组分:7.25g/L NaC1,0.38g/LKCI,0.18g/L CaCl2·2H2O,1g/L NaHCO3,0.23g/L MgSO4·7H2O,0.41g/L NaH2PO4·H2O,1g/L Glucose,所述Cortland稀释液的pH为7;
(3)***冷冻保存:将步骤(2)得到的保存液注入冻存管中,再将冻存管置于在4℃下的冷冻仓中平衡30min,接着按照每分钟降低5℃的速度降温至-20℃,然后在-20℃下平衡5min,再按照每分钟降低10℃的速度降温至-80℃,然后在-80℃下平衡5min,接着立即将装有保存液的冷冻管放入液氮罐中,在-196℃下长期保存;
(4)***解冻:将装有***保存液的冻存管提到液氮液面上平衡5min,然后迅速将冷冻管放置于42℃水浴锅中解冻,再将解冻后的***保存液置于4℃下保存备用。
按照本实施例所述方法进行金钱鱼***的冷冻保存,解冻后用海水激活金钱鱼的***,置于***质量分析***中连接的显微镜下观察,同时利用***质量分析***(CASA)进行***质量的计算机辅助检测,利用现代化的计算机识别技术和图像处理技术,对***的动静态特征进行全面的量化分析,检测得到解冻***的活力为82.712%。
实施例11:
一种金钱鱼***冷冻保存方法,其特征在于:包括如下步骤:
(1)***采集:挑选体重为215g的2龄金钱鱼,在背肌注射150IU/kg的人绒毛膜***,在水温27~28℃条件下催产32h,期间观察雄鱼***量的变化,并且每间隔2~3h可以取样***0.5ml按照常规方法进行一次***活力和寿命等参数的测定,然后将金钱鱼麻醉后用干毛巾擦干鱼体生殖孔周围水分和黏液,再沿着中线轻轻挤压腹部至生殖孔流出乳白色***,用注射器吸取***,防止尿液、血液和水混入,将采集的***注入冻存管中;
(2)***稀释:先将步骤(1)中采集到的***与抗冻液按照体积比为1:1的比例混合稀释得到保存液,所述抗冻液包括以下体积分数的组分:5%二甲亚砜,余量为稀释液;所述稀释液为Hank’s液;所述抗冻液还包括浓度为0.25mol/L的海藻糖;所述抗冻液是置于4℃的温度下保存备用;所述Hank’s稀释液包括以下浓度的组分:8.01g/L NaC1,0.4g/L KCI,0.14 g/L CaCl2·2H2O,0.35g/L NaHCO3 ,0.06g/L KH2PO4,0.1g/L MgCl·6 H2O ,0.1g/LMgSO4·7 H2O,0.06g/L Na2HPO4·2 H2O ,10g/L Glucose,所述Hank’s稀释液的pH为6.8;
(3)***冷冻保存:将步骤(2)得到的保存液注入冻存管中,再将冻存管置于在4℃下的冷冻仓中平衡30min,接着按照每分钟降低5℃的速度降温至-20℃,然后在-20℃下平衡5min,再按照每分钟降低10℃的速度降温至-80℃,然后在-80℃下平衡5min,接着立即将装有保存液的冷冻管放入液氮罐中,在-196℃下长期保存;
(4)***解冻:将装有***保存液的冻存管提到液氮液面上平衡4min,然后迅速将冷冻管放置于42℃水浴锅中解冻,再将解冻后的***保存液置于4℃下保存备用。
按照本实施例所述方法进行金钱鱼***的冷冻保存,解冻后用海水激活金钱鱼的***,置于***质量分析***中连接的显微镜下观察,同时利用***质量分析***(CASA)进行***质量的计算机辅助检测,利用现代化的计算机识别技术和图像处理技术,对***的动静态特征进行全面的量化分析,检测得到解冻***的活力为86.433%。
实施例12:
一种金钱鱼***冷冻保存方法,其特征在于:包括如下步骤:
(1)***采集:挑选体重为205g的2龄金钱鱼,在背肌注射150IU/kg的人绒毛膜***,在水温27~28℃条件下催产20h,期间观察雄鱼***量的变化,并且每间隔2~3h可以取样***0.5ml按照常规方法进行一次***活力和寿命等参数的测定,然后将金钱鱼麻醉后用干毛巾擦干鱼体生殖孔周围水分和黏液,再沿着中线轻轻挤压腹部至生殖孔流出乳白色***,用注射器吸取***,防止尿液、血液和水混入,将采集的***注入冻存管中;
(2)***稀释:先将步骤(1)中采集到的***与抗冻液按照体积比为1:1的比例混合稀释得到保存液,所述抗冻液包括以下体积分数的组分:15%二甲亚砜,余量为稀释液;所述稀释液为灭菌海水;所述抗冻液是置于4℃的温度下保存备用;
(3)***冷冻保存:将步骤(2)得到的保存液注入冻存管中,再将冻存管置于在4℃下的冷冻仓中平衡30min,接着按照每分钟降低5℃的速度降温至-20℃,然后在-20℃下平衡5min,再按照每分钟降低10℃的速度降温至-80℃,然后在-80℃下平衡5min,接着立即将装有保存液的冷冻管放入液氮罐中,在-196℃下长期保存;
(4)***解冻:将装有***保存液的冻存管提到液氮液面上平衡3min,然后迅速将冷冻管放置于42℃水浴锅中解冻,再将解冻后的***保存液置于4℃下保存备用。
按照本实施例所述方法进行金钱鱼***的冷冻保存,解冻后用海水激活金钱鱼的***,置于***质量分析***中连接的显微镜下观察,同时利用***质量分析***(CASA)进行***质量的计算机辅助检测,利用现代化的计算机识别技术和图像处理技术,对***的动静态特征进行全面的量化分析,检测得到解冻***的活力为89.065%。
此外,应当理解,虽然本说明书按照实施方式加以描述,但并非每个实施方式仅包含一个独立的技术方案,说明书的这种叙述方式仅仅是为清楚起见,本领域技术人员应当将说明书作为一个整体,各实施例中的技术方案也可以经适当组合,形成本领域技术人员可以理解的其他实施方式。
Claims (4)
1.一种金钱鱼***冷冻保存方法,其特征在于:包括如下步骤:
(1)***采集:挑选体重为190~220g的2龄金钱鱼,在背肌注射150IU/kg的人绒毛膜***,在水温27~28℃条件下催产20h以上,期间观察雄鱼***量的变化,然后将金钱鱼麻醉后用干毛巾擦干鱼体生殖孔周围水分和黏液,再沿着中线轻轻挤压腹部至生殖孔流出乳白色***,用注射器吸取***,防止尿液、血液和水混入,将采集的***注入冻存管中;
(2)***稀释:先将步骤(1)中采集到的***与抗冻液按照体积比为1:1的比例混合稀释得到保存液,所述抗冻液包括以下体积分数的组分:5~15%二甲亚砜,余量为稀释液;所述稀释液为TS-2稀释液,TS-19稀释液、Hank’s液、Cortland稀释液和灭菌海水中的任意一种;
(3)***冷冻保存:将步骤(2)得到的保存液注入冻存管中,再将冻存管置于在4℃下的冷冻仓中平衡30min,接着按照每分钟降低5℃的速度降温至-20℃,然后在-20℃下平衡5min,再按照每分钟降低10℃的速度降温至-80℃,然后在-80℃下平衡5min,接着立即将装有保存液的冷冻管放入液氮罐中,在-196℃下长期保存;
(4)***解冻:将装有***保存液的冻存管提到液氮液面上平衡3~5min,然后迅速将冷冻管放置于42℃水浴锅中解冻,再将解冻后的***保存液置于4℃下保存备用。
2.根据权利要求1所述的金钱鱼***冷冻保存方法,其特征在于:步骤(2)中所述抗冻液还包括浓度为0.25mol/L的海藻糖。
3.根据权利要求1所述的金钱鱼***冷冻保存方法,其特征在于:所述TS-2稀释液包括以下浓度的组分:10g/L KHCO3 ,3.13g/L BSA,37.65g/LSucrose,1.21g/L Tris,所述TS-2稀释液的pH为8.2;所述TS-19稀释液包括以下浓度的组分:4.56g/L NaC1,2.1g/L NaHCO3 ,3.5g/L KHCO3 ,3.13g/L BSA,7.13g/L Glucose,17g/L Sucrose,1.21g/L Tris,所述TS-19的pH为9.56;所述Hank’s稀释液包括以下浓度的组分:8.01g/L NaC1,0.4g/L KCI,0.14 g/L CaCl2·2H2O,0.35g/L NaHCO3 ,0.06g/L KH2PO4,0.1g/L MgCl·6 H2O ,0.1g/L MgSO4·7H2O,0.06g/L Na2HPO4·2 H2O ,10g/L Glucose,所述Hank’s稀释液的pH为6.8;所述Cortland稀释液包括以下浓度的组分:7.25g/L NaC1,0.38g/L KCI,0.18g/L CaCl2·2H2O,1g/L NaHCO3,0.23g/L MgSO4·7H2O,0.41g/L NaH2PO4·H2O,1g/L Glucose,所述Cortland稀释液的pH为7。
4.根据权利要求1所述的金钱鱼***冷冻保存方法,其特征在于:步骤(2)中所述抗冻液是置于4℃的温度下保存备用。
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