CN110779780A - 用于脂溶性维生素定量检测的前处理方法 - Google Patents

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Abstract

本发明公开了一种用于脂溶性维生素定量检测的前处理方法，取一定量的血清置入EP管A中，并加入超纯水，混合得到溶液；在混合溶液中加入乙醇和正己烷混合溶剂，放入超声仪进行超声波辅助工作，溶剂通过离心完成后，吸取最上层上清液装入另一EP管B中，在EP管A中加入正己烷并手动旋涡，进行离心后，吸取上清液装入EP管B中得到试剂。本发明通过结合PPT沉淀法和液液萃取法的原理，在加入水溶性有机溶剂的同时混入脂溶性的有机溶剂，使脂溶性维生素在从蛋白质上解离出的同时转移到脂溶性有机溶剂中，防止已经解离的脂溶性维生素被沉淀出来的蛋白质吸附，与传统方法相比，具有更加简单的操作步骤和优良蛋白质的沉淀效果。

Description

用于脂溶性维生素定量检测的前处理方法
技术领域
本发明涉及化学检测技术领域，具体涉及一种用于脂溶性维生素定量检测的前处理方法。
背景技术
脂溶性维生素主要分为A、D、E、K，是维持人体生命健康必需的微量化合物，可大量的贮存于肝脏部位，它不同于水溶性维生素，如果摄入过量会引起中毒。
目前用于体外定量检测脂溶性维生素的样本类型有：唾液、血清或血浆样本、干血斑(DBS)样本等。脂溶性维生素具有较大的油水分配系数，提取液一般也选择油水分配系数较大有机溶剂进行提取，如正己烷，乙酸乙酯，三氯甲烷等。从血清中提取脂溶性维生素需要先从蛋白质中解离出与蛋白质结合的脂溶性维生素，先沉淀蛋白质，然后除去脂质，最后进样分析。此处理过程主要目的是将待分析物从复杂的样本组成中有效提取出来，得到高质量的待分析物，降低基质效应，以此提高分析方法灵敏度。
传统的生物样本前处理技术主要有，PPT(蛋白沉淀法)法、液液萃取法、固相萃取法等。
PPT法通过加入有机溶剂、中性盐、强酸等，使蛋白质的空间结构发生变化或使蛋白质以阳离子形式存在，形成不溶性盐，最后通过离心、过滤等方式除去蛋白质，其操作简单，无需特殊装置，但净化效果差，检测灵敏度和可靠性低。
液液萃取法，选择性高，可除去大部分杂质，样本较干净，对仪器污染小，并降低基质效应，缺点一般提取回收率较低，需要耗费大量的有机溶剂，环境污染大，导致成本高。
固相萃取法(SPE)，由液固萃取和固液相色谱技术相结合发展而来。SPE是一个柱色谱分离过程，在分离机理、固定相和溶剂的选择等方面与高效液相色谱(HLPC)有许多相似之处。SPE的填料粒径(＞40μm)要比HLPC(3～10μm)。因此，SPE只能用于分离保留性质有很大差别的化合物。固相萃取法集样品及净化与一身，能提高检测灵敏度；可自动化批量处理；重现性好；比液液萃取节省溶剂，但固相萃取小柱一次性使用，成本高，需要专业人员协助方法开发。
发明内容
本发明的目的在于提供一种用于脂溶性维生素定量检测的前处理方法，用于解决现有的解决PPT净化效果差，检测灵敏度和可靠性低，液液萃取法回收率低的问题。
为解决上述的技术问题，本发明采用以下技术方案：
用于脂溶性维生素定量检测的前处理方法，包括以下步骤：
S1、取一定量的血清置入EP管A中，并加入超纯水，混合得到溶液；
S2、在S1溶液中加入乙醇和正己烷混合溶剂，放入超声仪进行超声波辅助工作；
S3、将溶剂放入离心机中，离心完成后，吸取最上层上清液装入另一EP管 B中；
S4、在EP管A中加入正己烷并手动旋涡，进行离心后，吸取上清液装入EP 管B中得到试剂。
作为优选，所述S1步骤中加入超纯水的体积是血清体积的二分之一。
作为优选，所述S2步骤中乙醇添加量与血清添加量相等，正己烷添加量为血清添加量的2倍，超声仪频率为40kHz-60kHz，超声仪作用时间10min-16min。
作为优选，所述S3步骤中离心机旋转速度为13000转/min-16000转/min，离心工作时间为5mim-10min。
作为优选，所述S4步骤中正己烷添加量为血清添加量的2倍，涡旋时间 30s-50s，离心转速13000转/min-16000转/min，离心时间为5mim-7min。
作为优选，所述S2步骤中乙醇可用丙酮替代。
与现有技术相比，本发明的有益效果是：
本发明通过结合PPT沉淀法和液液萃取法的原理，在加入水溶性有机溶剂的同时混入脂溶性的有机溶剂，使脂溶性维生素在从蛋白质上解离出的同时转移到脂溶性有机溶剂中，防止已经解离的脂溶性维生素被沉淀出来的蛋白质吸附，随后通过有机溶剂提取脂溶性维生素，以此解决PPT净化效果差，检测灵敏度和可靠性低，液液萃取法回收率低的问题，与传统方法相比，具有更加简单的操作步骤和优良蛋白质的沉淀效果。
具体实施方式
为了使本发明的目的、技术方案及优点更加清楚明白，以下结合实施例，对本发明进行进一步详细说明。应当理解，此处所描述的具体实施例仅仅用以解释本发明，并不用于限定本发明。
实施例1
取200uL的血清置入EP管A中，并加入100μL超纯水，得到混合溶液；在混合溶液中加入200μL乙醇和400μL正己烷混合溶剂，放入超声仪进行超声波辅助工作，超声仪的频率设置为40kHz，超声仪作用16min；引入超声波辅助，以此促进有机溶剂进入蛋白质分子内部，破坏蛋白质分子内的疏水键使蛋白质沉淀，同时利用超声波的空化效应两相溶剂分子的接触频次，提高萃取效率，然后将溶剂放入离心机中，离心机旋转速度为13000转/min，离心10min后吸取最上层上清液装入另一EP管B中；在EP管A中添加400μL正己烷并手动旋涡30s，然后采用13000转/min的频率离心7min后，吸取上清液装入EP管B中得到样本溶液。该种处理方法与传统方法相比，具有更加简单的操作步骤和优良蛋白质的沉淀效果，检测灵敏度和可靠性高，具有较高的回收率。
实施例2
取200uL的血清置入EP管A中，并加入100μL超纯水，得到混合溶液；在混合溶液中加入200μL丙酮和400μL正己烷混合溶剂，放入超声仪进行超声波辅助工作，超声仪的频率设置为50kHz，超声仪作用13min；引入超声波辅助，以此促进有机溶剂进入蛋白质分子内部，破坏蛋白质分子内的疏水键使蛋白质沉淀，同时利用超声波的空化效应两相溶剂分子的接触频次，提高萃取效率，然后将溶剂放入离心机中，离心机旋转速度为14000转/min，离心13min后吸取最上层上清液装入另一EP管B中；在EP管A中添加400μL正己烷并手动旋涡40s，然后采用14000转/min的频率离心6min后，吸取上清液装入EP管B中得到样本溶液。该种处理方法与传统方法相比，具有更加简单的操作步骤和优良蛋白质的沉淀效果，本实施例采用丙酮代替乙醇，处理效果更好，检测灵敏度和可靠性高，具有较高的回收率。
实施例3
取200uL的血清置入EP管A中，并加入100μL超纯水，得到混合溶液；在混合溶液中加入200μL乙醇和400μL正己烷混合溶剂，放入超声仪进行超声波辅助工作，超声仪的频率设置为60kHz，超声仪作用10min；引入超声波辅助，以此促进有机溶剂进入蛋白质分子内部，破坏蛋白质分子内的疏水键使蛋白质沉淀，同时利用超声波的空化效应两相溶剂分子的接触频次，提高萃取效率，然后将溶剂放入离心机中，离心机旋转速度为16000转/min，离心10min后吸取最上层上清液装入另一EP管B中；在EP管A中添加400μL正己烷并手动旋涡50s，然后采用16000转/min的频率离心5min后，吸取上清液装入EP管B中得到样本溶液。该种处理方法与传统方法相比，具有更加简单的操作步骤和优良蛋白质的沉淀效果，检测灵敏度和可靠性高，具有较高的回收率。
在本说明书中所谈到的“实施例”，指的是结合该实施例描述的具体特征、结构或者特点包括在本申请概括性描述的至少一个实施例中。在说明书中多个地方出现同种表述不是一定指的是同一个实施例。进一步来说，结合任一实施例描述一个具体特征、结构或者特点时，所要主张的是结合其他实施例来实现这种特征、结构或者特点也落在本发明的范围内。
尽管这里参照本发明的多个解释性实施例对本发明进行了描述，但是，应该理解，本领域技术人员可以设计出很多其他的修改和实施方式，这些修改和实施方式将落在本申请公开的原则范围和精神之内。更具体地说，在本申请公开、权利要求的范围内，可以对主题组合布局的组成部件和/或布局进行多种变型和改进。除了对组成部件和/或布局进行的变形和改进外，对于本领域技术人员来说，其他的用途也将是明显的。

Claims (6)

1.用于脂溶性维生素定量检测的前处理方法，其特征在于，包括以下步骤：
S1、取一定量的血清置入EP管A中，并加入超纯水，混合得到溶液；
S2、在S1溶液中加入乙醇和正己烷混合溶剂，放入超声仪进行超声波辅助工作；
S3、将溶剂放入离心机中，离心完成后，吸取最上层上清液装入另一EP管B中；
S4、在EP管A中加入正己烷并手动旋涡，进行离心后，吸取上清液装入EP管B中得到试剂。
2.根据权利要求1所述的用于脂溶性维生素定量检测的前处理方法，其特征在于：所述S1步骤中加入超纯水的体积是血清体积的二分之一。
3.根据权利要求1所述的用于脂溶性维生素定量检测的前处理方法，其特征在于：所述S2步骤中乙醇添加量与血清添加量相等，正己烷添加量为血清添加量的2倍，超声仪频率为40kHz-60kHz，超声仪作用时间10min-16min。
4.根据权利要求1所述的用于脂溶性维生素定量检测的前处理方法，其特征在于：所述S3步骤中离心机旋转速度为13000转/min-16000转/min，离心工作时间为5mim-10min。
5.根据权利要求1所述的用于脂溶性维生素定量检测的前处理方法，其特征在于：所述S4步骤中正己烷添加量为血清添加量的2倍，涡旋时间30s-50s，离心转速13000转/min-16000转/min，离心时间为5mim-7min。
6.根据权利要求1所述的用于脂溶性维生素定量检测的前处理方法，其特征在于：所述S2步骤中乙醇可用丙酮替代。
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