CN110777193A - 一种核酸单碱基突变检测的方法 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种核酸单碱基突变的检测方法，通过锁式探针成环，通用引物1延伸，阻断剂和引物2特异性竞争引发超支化滚环扩增突变型核酸，从而达到检测突变的目的。所述方法从动力学角度解决了常规热力学方法检测核酸单碱基突变时的温度敏感性问题，克服了PCR需要变温及昂贵的缺点，同时提高了滚环扩增检测单碱基突变的灵敏度和特异性；将合理的竞争杂交反应与滚环等温扩增技术结合，使得可以灵敏地识别和选择性恒温扩增等位基因频率为0.1％的单碱基突变，可以对完整基因组DNA中包含的低频率单碱基未知突变进行简便、快速和高选择性等温扩增检测。可以用于癌症相关突变的检测，具有潜在的应用价值。

Description

一种核酸单碱基突变检测的方法

技术领域

本发明属于基因突变检测领域，涉及一种核酸单碱基突变检测的方法，特别涉及一种通过阻断剂选择性竞争引发等温超支化滚环扩增，超灵敏和特异地富集核酸中的单碱基突变的检测方法。

背景技术

基因突变是癌症(如乳腺癌、结肠癌)诊断和监视的重要生物标志物。小的基因变异，如DNA点突变，是疾病发展的重要驱动因素，也是诊断的重要指标。

由于局部环境、细胞异质性和迁移，它们通常在人体中的含量很低(<1％)。对具有低频率等位基因的稀有核酸变体进行分析，例如细胞外DNA中的癌症突变或病原体亚种群中的药物抗性，对当前的分子诊断技术提出了挑战。

已有的检测方法还存在以下几个问题：I.现有的方法要求操作反应温度位于每个单个阻断剂或探针的“Goldilocks”区域，依赖于精确的温度控制和引物设计。II.数字PCR检测对于碱基位置和特异性碱基变化都是特异性的。对于隐性疾病，肿瘤抑制基因的突变，甚至许多癌基因的反复突变，通常需要在许多碱基位置重新检测变异，而无法同时检测未知和多重突变。III.深测序方法不经济，因为它们在测序野生型(WT)模板和扩增子时浪费了大部分读取能力。

BDA***在提供良好的突变灵敏度，高突变复制，快速周转方面是独一无二的，但仍然需要PCR变温过程，导致一定程度上的经济成本。滚环扩增作为一种等温扩增技术，不需要昂贵复杂的变温仪器，普通水浴锅就可以实现，但是其受锁式探针非特异性连接的影响，背景信号较高，降低了检测的灵敏度和特异性；此外，锁式探针只能识别已知突变，对未知突变难以检测。因此，发明一种新的等温、经济、高特异性检测未知核酸突变的方法将具有重要的研究意义和应用价值。

发明内容

针对现有技术的上述不足，本发明的目的在于从动力学角度解决常规热力学方法检测核酸单碱基突变时的温度敏感性问题，克服PCR需要变温及昂贵的缺点，同时提高滚环扩增检测单碱基突变的灵敏度和特异性；将合理的竞争杂交反应与滚环等温扩增技术结合，使得可以灵敏地识别和选择性恒温扩增等位基因频率为0.1％的单碱基突变，可以对完整基因组DNA中包含的低频率单碱基未知突变进行简便、快速和高选择性等温扩增检测。

本发明通过阻断剂选择性竞争引发等温超支化滚环扩增，超灵敏和特异地富集核酸中的单碱基突变的检测原理如图1所示，具体原理如下所述：

提取的基因组DNA通过特定的核酸内切酶片段化，使其便于后续锁式探针的定位连接。然后加入两端与目标链匹配的锁式探针，通过碱基互补配对原则进行杂交，其中留下一小段(10～20nt)间隙(单碱基突变存在区域)，通过dNTPs以“gap-fill”方式填充并连接。连接成环后得到只有一个碱基差异的两个环，加入通用引物1，引物2和阻断剂进行特异性扩增：先由通用引物1扩增出一条串联重复的长单链，然后引物2和阻断剂在此链上选择性竞争杂交，阻断剂被设计为与已知的野生型目标序列完全互补；引物2序列的3'末端与阻断剂序列的5'末端有6～14nt重叠区域，诱导引物2和阻断剂之间的分子竞争，因此与相同目标分子的引物2和阻断剂杂交是相互排斥的；阻断剂的3'末端含有12～30nt序列，其不存在于引物2中，该区域中模板的任何序列变异将显示阻断剂-目标双链体中的错配泡状结构(bubble)或凸起(bulge)，增加了引物替代阻断剂的有利性。对于给定的一组序列，ΔG°_野生型和ΔG°_突变型的值仅在很小程度上取决于扩增步骤的温度，因为温度类似地影响引物和阻断剂两者与目标的杂交稳定性。具有特征ΔΔG°为4kcal mol^-1的单核苷酸变异将引起取代变体模板上的阻断剂的引物2的ΔG°从+2kcal mol^-1降至-2kcal mol^-1，导致平衡时约95％的杂交产量。扩增产量差异在许多次竞争中复合到1000倍以上的富集。

根据上述原理，本发明采用如下的技术方案：

本发明提出了一种核酸单碱基突变的检测方法(也称一种通过阻断剂选择性竞争引发等温超支化滚环扩增，超灵敏和特异地富集核酸中的单碱基突变的检测方法)，包括以下步骤：

(1)样品制备：向基因组DNA中加入内切酶进行DNA片段化，得到片段化DNA。

(2)杂交连接：向步骤(1)得到的片段化DNA中加入锁式探针、dNTPs、聚合酶和连接酶进行靶标杂交、填充和连接成环；之后加入核酸外切酶I和核酸外切酶III进行消化，得到环。

(3)阻断扩增：向步骤(2)消化后得到的环中加入阻断剂、引物1、引物2、dNTPs、聚合酶进行扩增，得到扩增产物。

(4)检测分析：然后对步骤(3)得到的扩增产物进行进行定性分析或者进行定量分析。

步骤(1)中，所述基因组DNA优选使用试剂盒提取得到。

其中，所述试剂盒为任何可以从血液、细胞、组织、尿液、粪便等物质中提取基因组DNA或者RNA的试剂盒。

步骤(1)中，所述基因组DNA中待检测片段的序列为：

TATAAACTTGTGGTAGTTGGAGCTGTTGGCGTAGGCAAGAGTGCCTTGACGATACAGC(SEQ IDNO.1)或

步骤(1)中，所述内切酶由待测基因决定，需要可以限制性地内切待测片段上下游核酸而不影响待测位置，酶切条件参考酶说明书。

步骤(2)中，所述锁式探针的序列为：

步骤(2)中，所述锁式探针的浓度为1～100nM；优选地，为100nM。

步骤(2)中，所述dNTPs的浓度为200～400μM；优选地，为200μM。

步骤(2)中，所述聚合酶为Taq DNA聚合酶、T4 DNA聚合酶、T7 DNA聚合酶等中的一种或多种；优选地，为Taq DNA聚合酶。

步骤(2)中，所述聚合酶的浓度为0.2-0.5U/μL；优选地，为0.25U/μL。

步骤(2)中，所述连接酶为Ampligase连接酶、T4 DNA连接酶、Taq DNA连接酶等中的一种或多种；优选地，为Ampligase连接酶。

步骤(2)中，所述连接酶的浓度为0.2-1.0U/μL；优选地，为0.5U/μL。

步骤(2)中，所述连接的温度为16～60℃；优选地，为60℃。

步骤(2)中，所述连接的时间为1～10h；优选地，为2h。

步骤(2)中，所述核酸外切酶I的浓度为0.2-0.5U/μL；优选地，为0.25U/μL。

步骤(2)中，所述核酸外切酶III的浓度为5～20U/μL；优选地，为10U/μL。

步骤(2)中，所述消化的时间为1-4h；优选地，为2h。

步骤(2)中，所述消化的温度优选为37℃。

步骤(2)中加入核酸外切酶I和核酸外切酶Ⅲ的目的为消化掉多余的线性链。

步骤(2)中加入锁式探针的目的为通过碱基互补配对原则定位到待检测目标区域，使待检测目标转化为锁式探针的扩增。

步骤(2)中加入dNTPs的目的为通过“gap-fill”的形式填充空位，通过聚合酶作用延伸锁式探针和目标杂交后形成的缺口，使锁式探针可以成环。

步骤(2)中加入聚合酶的目的为作用于dNTPs使其延伸锁式探针之间的间隙，使锁式探针可以成环。

步骤(2)中加入连接酶的目的为连接锁式探针使其成环。

步骤(2)中靶标杂交指锁式探针和待检测目标通过碱基互补配对原则形成稳定的双链体。

步骤(2)中填充指通过dNTPs的延伸，使锁式探针3’和5’端之间的间隙被充满，两端相邻从而可以使用连接酶连接。

步骤(3)中，所述阻断剂被设计为与已知的野生型目标序列完全互补，引物2序列的3'末端与阻断剂序列的5'末端有6～14nt重叠区域，阻断剂的3'末端含有12～30nt序列，其不存在于引物2中。

其中，已知的野生型目标序列具体指：

TATAAACTTGTGGTAGTTGGAGCTGGTGGCGTAGGCAAGAGTGCCTTGACGATACAGC(SEQ IDNO.4)或

AGGGACCAGGTAAATATTTACCACGTCTTGGTGTTTATTTTACCGTCTATATACAAG(SEQIDNO.5)，主要取决于待检测目标。

步骤(3)中，所述引物1的序列为：CTAAAGCTGAGACAT GACGAGTC(SEQ ID NO.6)，需根据探针和目标设计。

步骤(3)中，所述引物2的序列为：CACTCTTGCCTACGCCA(SEQ ID NO.7)或CTTGTATATAGACGG TAAAATAAACACCAAGA(SEQ ID NO.8)，需根据目标设计。

步骤(3)中，所述阻断剂的序列为：GCCTACGCCACCAGCTCATTA(SEQ ID NO.9)或TAAACACCAAGACGTGGTAAATATTTACCTGGTAAAA(SEQ ID NO.10)。

步骤(3)中，所述阻断剂的浓度为0.1～10μM；优选地，为1.5μM。

步骤(3)中，所述阻断剂和引物2的摩尔比为1-10：1；优选地，为3：1。

步骤(3)中，所述阻断剂和引物1的摩尔比比例为1-10：1；优选地，为1.5：1。

步骤(3)中，所述引物1的浓度为0.1～1μM；优选地，为1μM。

步骤(3)中，所述引物2的浓度为0.1～1μM；优选地，为0.5μM。

步骤(3)中，所述dNTPs的浓度为200～400μM；优选地，为200μM。

步骤(3)中，所述聚合酶为vent(exo-)DNA聚合酶、Bsu DNA聚合酶、Bst 3.0DNA聚合酶等中的一种或多种；优选地，为vent(exo-)DNA聚合酶。

步骤(3)中，所述聚合酶的浓度为0.1-0.4U/μL；优选地，为0.2U/μL。

步骤(3)中，所述扩增的温度为58～63℃；优选地，为60℃。

步骤(3)中，所述扩增的时间为45-120min；优选地，为90min。

步骤(3)中加入聚合酶的目的为作用于dNTPs使其延伸引物1和引物2，扩增目标序列，实现信号放大。

步骤(4)中，所述定性分析优选采用琼脂糖凝胶电泳进行。

其中，所述琼脂糖凝胶的浓度为1-3％；优选地，为3％。

其中，所述电泳的时间为2-3h；优选地，为3h。

步骤(4)中通过在扩增产物中加入SYBR GreenⅠ孵育进行定量分析。

其中，所述SYBR GreenⅠ的浓度为1-20×；优选地，为20×。

其中，所述SYBR GreenⅠ还可以采用Gel red替代。

步骤(4)中，所述孵育的时间为10-60min；优选地，为15min。

步骤(4)中，所述定量分析优选在荧光分光光度计中测定荧光进行定量分析。

其中，所述分光光度计的激发波长为493nm。

其中，所述分光光度计的发射波长为524nm。

在一个具体的实施方式中，所述方法具体包括如下步骤：

(1)样品制备：

1)基因组DNA提取

a)用胰酶将培养的单层细胞人结肠癌细胞SW48和SW620(贴壁)，从培养瓶中分离出来后收集在培养基中，并将适当数量的细胞(不超过5×10⁶细胞)和正常染色体转移到1.5ml的微离心管中，300×g离心5min。完全取出上清液并丢弃。

b)在PBS中重新悬浮细胞颗粒至200μl的最终体积。

c)添加20μL蛋白酶k。

d)然后向样品中添加200μL缓冲液AL。脉冲涡旋混15s。

e)56℃孵育10min。

f)将1.5ml微离心管离心，除去盖子内液滴。

g)在样品中加入200μL乙醇(96％～100％)，再用脉冲涡流搅拌15s。混合后，将1.5ml的微离心管短暂离心，除去盖子内的液滴。

h)小心地将混合物从第g步转移到QIAamp微型旋转柱(在2ml收集管中)，而不润湿边缘。关闭盖子，离心机在8000rpm下离心1分钟。将QIAamp微型旋转柱放置在一个干净的2ml收集管中，并丢弃含有滤液的收集管。

i)打开QIAamp微型旋转柱，添加500μL缓冲液AW1，而不润湿边缘。关闭盖子，离心机在8000rpm下离心1分钟。将QIAamp微型旋转柱放置在干净的2ml收集管中，并丢弃含有滤液的收集管。

j)打开QIAamp迷你旋转柱，添加500μL缓冲液AW2而不润湿边缘。关闭盖子和离心机，以全速(20000rpm)持续离心3分钟。

k)将QIAamp微型旋转柱放置在1.5ml微离心管中，并丢弃含有滤液的收集管。打开QIAamp微型旋转柱，加入200μL蒸馏水。室温(15～25℃)孵育5min，然后在8000rpm离心1min。

l)紫外测定A260/A280，定量并确定纯度。浓度＝A260×50ng/μL，纯DNA的A260/A280比值为1.7-1.9。通过琼脂糖凝胶电泳(PFGE)可以确定基因组DNA的长度。

2)基因组DNA片段化

在冰上依次加入提取的DNA、Smart缓冲液(1×)、BSA(0.3μg/μL)、MseⅠ酶(0.5U/μL)后微离心，37℃水浴消化2h，65℃水浴20min灭活酶活性，4℃冰箱保存。

(2)杂交连接：

片段化DNA于100℃10min使之变性，放冰上10min后依次加入缓冲液(1×)、锁式探针(100nM)，dNTPs(200μM)、Taq聚合酶(0.25U/μL)和Ampligase连接酶(0.5U/μL)，60℃水浴2h使其空位填充和连接成环。之后加入核酸外切酶Ⅲ(10U/μL)和核酸外切酶Ⅰ(0.25U/μL)，37℃水浴2h消化掉多余的线性链，得到纯净的环，80℃水浴20min灭活酶活性，4℃冰箱保存。

(3)阻断扩增

在冰上依次加入水、ThermoPol缓冲液(1×)、dNTPs(200μM)、步骤(2)得到的纯净的环、引物1(1μM)、引物2(0.5μM)、阻断剂(1.5μM)、Vent(exo-)聚合酶(0.2U/μL)后微离心，92℃水浴3min变性，60℃水浴90min扩增，4℃冰箱保存。

(4)产物检测：

3％琼脂糖凝胶电泳或荧光检测。

1)电泳：3％琼脂糖，1×TAE，每个孔上样10μL，100V电压电泳3h。

2)荧光：5μL样品加入195μL水，并使SYBR GreenⅠ的终浓度为20×。室温避光静置15min后在493nm激发波长下测最大发射波长。

其中，步骤(1)中，不同试剂盒请参照具体说明书。

其中，步骤(2)中，具体DNA的量取决于提取核酸的浓度，总体积可自行设置。

本发明的创新点主要体现在滚环等温扩增技术和竞争性检测体系相结合，解决PCR需要变温及昂贵的缺点，同时提高了滚环扩增的灵敏度和特异性。该方法非常适合检测热点突变和环状核酸中的突变。

本发明通过阻断剂选择性竞争引发等温超支化滚环扩增，超灵敏和特异地富集核酸中的单碱基突变的检测方法能对完整基因组DNA中包含的低频率单碱基未知突变进行简便、快速和高选择性检测，解决了PCR需要变温及昂贵的缺点，同时提高了滚环扩增的灵敏度和特异性。该方法非常适用于热点突变的富集及环状核酸突变的直接检测。

本发明中，所述通过阻断剂选择性竞争引发等温超支化滚环扩增，超灵敏和特异地富集核酸中的单碱基突变的检测方法可以作为一种突变富集方法。

本发明中，所述通过阻断剂选择性竞争引发等温超支化滚环扩增，超灵敏和特异地富集核酸中的单碱基突变的检测方法可以作为一种突变检测方法。

本发明中，所述通过阻断剂选择性竞争引发等温超支化滚环扩增，超灵敏和特异地富集核酸中的单碱基突变的检测方法可以灵敏地识别和选择性恒温扩增等位基因频率为0.1％的单碱基突变。

本发明中，所述通过阻断剂选择性竞争引发等温超支化滚环扩增，超灵敏和特异地富集核酸中的单碱基突变的检测方法用于检测KRAS突变，具有如下特征：①等温扩增，不需要精密的控温仪器；②特异性和灵敏度高，可以检测低至0.1％的单碱基突变；③可以检测到未知的单碱基突变；④可以直接检测环状DNA中的突变。

本发明中，所述通过阻断剂选择性竞争引发等温超支化滚环扩增，超灵敏和特异地富集核酸中的单碱基突变的检测方法，包括但不限于检测DNA突变，也可检测RNA突变。

本发明中，所述通过阻断剂选择性竞争引发等温超支化滚环扩增，超灵敏和特异地富集核酸中的单碱基突变的检测方法，包括但不限于用于KRAS突变的检测。

本发明还提出了所述的检测方法在提取的DNA或RNA单碱基突变检测中的应用。

本发明还提出了所述的检测方法在细胞原位DNA或RNA单碱基突变检测中的应用。

本发明还提出了所述的检测方法在DNA甲基化检测中的应用。

本发明中，所采用的所有序列可以通过从生物体中提取，或人工合成的方式获得。本发明的有益效果在于：本发明所提供的通过阻断剂选择性竞争引发等温超支化滚环扩增，超灵敏和特异地富集核酸中的单碱基突变的检测方法，所需仪器简单易操作，成本低。本发明所提供的检测方法用于核酸单碱基突变检测，具有等温扩增，对设备要求较低，经济简单、检测低频率突变、检测未知突变、实现热点富集的优点。本发明所提供的检测方法用于癌症相关突变的检测，具有潜在的应用价值。

附图说明

图1是本发明通过阻断剂选择性竞争引发等温超支化滚环扩增，超灵敏和特异地富集核酸中的单碱基突变的检测方法的实验原理图。

图2是该检测方法的灵敏度分析。

图3是从人结肠癌细胞提取的基因组DNA中KRAS突变荧光和测序结果。

具体实施方式

结合以下具体实施例和附图，对本发明作进一步的详细说明。实施本发明的过程、条件、实验方法等，除以下专门提及的内容之外，均为本领域的普遍知识和公知常识，本发明没有特别限制内容。

实施例1

(1)杂交连接：于冰上依次加入目标链(100nM)、锁式探针(100nM)、Ampligase连接酶缓冲液(1×)、dNTPs(200μM)、Taq DNA聚合酶(0.25U/μL)和Ampligase连接酶(0.5U/μL)后在95℃变性5min，然后60℃2h进行靶标杂交、填充和连接成环；之后加入核酸外切酶Ⅲ(10U/μL)和核酸外切酶Ⅰ(0.25U/μL)在37℃反应2h消化掉多余的线性链，80℃20min灭活酶活性。4℃冰箱保存。

其中，目标链的序列为：突变型：57nt

野生型：

AGGGACCAGGTAAATATTTACCACGTCTTGGTGTTTATTTTACCGTCTATATACAAG；

其中，锁式探针的序列为：95nt

(2)阻断扩增：在冰上依次加入水、ThermoPol缓冲液(1×)、步骤(1)中的环、阻断剂(1.5μM)、引物1(1μM)、引物2(0.5μM)、dNTPs(200μM)、vent(exo-)DNA聚合酶(0.2U/μL)进行选择性扩增，得到扩增产物。

其中，引物1的序列为：5′-CTAAAGCTGAGACAT GACGAGTC-3′；引物2的序列为：CTTGTATATAGACGG TAAAATAAACACCAAGA；阻断剂的序列为：

TAAACACCAAGAcGTGGTAAATATTTAC CTGGTAAAA。

(3)检测分析：将步骤(2)得到的扩增产物通过3％琼脂糖凝胶电泳100V 3h进行定性分析或者在扩增产物中加入20×SYBR GreenⅠ室温孵育15min，在荧光分光光度计中于493nm激发波长下测定荧光进行定量分析。

实施例2

(1)样品制备：使用商业化的试剂盒(

DNAMini and BloodMiniHandbook)按说明书从人结肠癌细胞SW48和SW620中提取基因组DNA，紫外定量并加入MseI内切酶使之片段化，得到片段化DNA。

其中，所述DNA中待检测片段的序列为：sw48野生型(提取)：

TATAAACTTGTGGTAGTTGGAGCTGGTGGCGTAGGCAAGAGTGCCTTGACGATACAGC；

sw620突变型(提取)：

TATAAACTTGTGGTAGTTGGAGCTGTTGGCGTAGGCAAGAGTGCCTTGACGATACAGC。

(2)然后将步骤(1)片段化的DNA于100℃10min使之变性，放冰上10min后依次加入Ampligase连接酶缓冲液(1×)和锁式探针(100nM)，dNTPs(200μM)、Taq聚合酶(0.25U/μL)和Ampligase连接酶(0.5U/μL)，60℃2h使其空位填充和连接成环。之后加入核酸外切酶Ⅲ(10U/μL)和核酸外切酶Ⅰ(0.25U/μL)，37℃反应2h消化掉多余的线性链，80℃20min灭活酶活性，4℃保存。

(3)阻断扩增：在冰上依次加入水、ThermoPol缓冲液(1×)、步骤(2)中的环、阻断剂(1.5μM)、引物1(1μM)、引物2(0.5μM)、dNTPs(200μM)、vent(exo-)DNA聚合酶(0.2U/μL)进行选择性扩增，得到扩增产物。

其中，引物1的序列为：CTAAAGCTGAGACAT GACGAGTC；引物2的序列为：CACTCTTGCCTACGCCA；阻断剂的序列为：GCCTACGCCACCAGCTCATTA。

(4)检测分析：将步骤(3)得到的扩增产物在荧光分光光度计中于493nm激发波长下测定荧光进行定量分析。并通过测序验证该方法用于实际样的潜力。

实施例3本发明方法灵敏度分析。

以本发明实验例1中的步骤进行灵敏度分析。其中步骤(1)中目标链浓度依次为0、0.1、0.5、1.0、2.0、5.0、10、20、50、100fM。

结果如图2所示，在0-100fM范围内，荧光强度(已归一化)随目标浓度的增大而增大，并且在1-50fM范围内与浓度的对数值成良好的线性关系。

实施例4本发明方法用于实际样检测KRAS突变。

以本发明实验例2中的步骤进行KRAS突变检测。

结果如图3所示，通过本发明的检测方法富集之后的核酸主要为突变型，可以检测到0.1％的单碱基突变，对比本方法扩增前和扩增后的桑格测序图，可以看出，0.1％的突变型目标存在的情况下，未扩增时桑格测序只能检测出野生型模板，检测不到突变型目标的存在；而当用本方法扩增之后，体系中突变型目标大于野生型目标，可以被桑格测序检测到。证明本发明方法对突变型目标有非常好的富集作用，可以用于检测0.1％的单碱基突变。

如上所述仅为本发明的几个具体实施例，并不用于限制本发明。凡在本发明的精神和原则之内，采用与其相似的检测方法用于核酸突变检测，均在本发明保护范围内。

SEQUENCE LISTING

<110> 华东师范大学

<120> 一种核酸单碱基突变检测的方法

<160> 10

<170> PatentIn version 3.3

<210> 1

<211> 58

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 1

tataaacttg tggtagttgg agctgttggc gtaggcaaga gtgccttgac gatacagc 58

<210> 2

<211> 57

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 2

agggaccagg taaatattta ccacctcttg gtgtttattt taccgtctat atacaag 57

<210> 3

<211> 95

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 3

gtggtaaata tttacctggt ccctattctg actcgtcatg tctcagcttt agtttaatac 60

gactcactat agggcttgta tatagacggt aaaat 95

<210> 4

<211> 58

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 4

tataaacttg tggtagttgg agctggtggc gtaggcaaga gtgccttgac gatacagc 58

<210> 5

<211> 57

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 5

agggaccagg taaatattta ccacgtcttg gtgtttattt taccgtctat atacaag 57

<210> 6

<211> 23

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 6

ctaaagctga gacatgacga gtc 23

<210> 7

<211> 17

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 7

cactcttgcc tacgcca 17

<210> 8

<211> 32

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 8

cttgtatata gacggtaaaa taaacaccaa ga 32

<210> 9

<211> 21

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 9

gcctacgcca ccagctcatt a 21

<210> 10

<211> 37

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 10

taaacaccaa gacgtggtaa atatttacct ggtaaaa 37

Claims (11)

1.一种核酸单碱基突变的检测方法，其特征在于，该方法的具体步骤为：

(1)样品制备：向基因组DNA中加入内切酶进行DNA片段化，得到片段化DNA；

(2)杂交连接：向所述步骤(1)得到的片段化DNA中加入锁式探针、dNTPs、聚合酶和连接酶进行靶标杂交、填充和连接成环，再加入核酸外切酶I和核酸外切酶III进行消化，得到环；

(3)阻断扩增：向所述步骤(2)消化后得到的环中加入阻断剂、引物1、引物2、dNTPs、聚合酶进行选择性扩增，得到扩增产物；

(4)检测分析：然后对所述步骤(3)得到的扩增产物进行定性分析或者进行定量分析。

2.如权利要求1所述的检测方法，其特征在于，所述步骤(1)中，所述基因组DNA中待检测片段的序列如SEQ ID NO.1或SEQ ID NO.2所示。

3.如权利要求1所述的检测方法，其特征在于，所述步骤(2)中，所述聚合酶为Taq DNA聚合酶、T4 DNA聚合酶、T7 DNA聚合酶中的一种或多种；和/或，所述连接酶为Ampligase连接酶、T4 DNA连接酶、Taq DNA连接酶中的一种或多种；和/或，所述聚合酶的浓度为0.2-0.5U/μL；和/或，所述连接酶的浓度为0.2-1.0U/μL；和/或，所述核酸外切酶Ⅰ的浓度为0.2-0.5U/μL；和/或，所述核酸外切酶Ⅲ的浓度为5-20U/μL；和/或，所述锁式探针的序列如SEQID NO.3所示。

4.如权利要求1所述的检测方法，其特征在于，所述步骤(2)中，所述连接温度为16-60℃；和/或，所述连接时间为1-10小时；和/或，所述消化的温度为37℃；和/或，所述消化的时间为1-4h。

5.如权利要求1所述的检测方法，其特征在于，所述步骤(3)中，所述阻断剂和引物2的比例为1-10：1；和/或，所述阻断剂和引物1的摩尔比为1-10：1；和/或，所述引物1的浓度为0.1～1μM；和/或，所述引物1的序列如SEQ ID NO.6所示；和/或，所述引物2的浓度为0.1～1μM；和/或，所述引物2的序列如SEQ ID NO.7或SEQ ID NO.8所示；和/或，所述dNTPs的浓度为200～400μM。

6.如权利要求1所述的检测方法，其特征在于，所述步骤(3)中，所述聚合酶为vent(exo-)DNA聚合酶、Bsu DNA聚合酶、Bst 3.0DNA聚合酶中的一种或多种；和/或，所述聚合酶的浓度为0.1-0.4U/μL。

7.如权利要求1所述的检测方法，其特征在于，所述步骤(3)中，所述阻断剂被设计为与已知的野生型目标序列完全互补，所述引物2序列的3'末端与所述阻断剂序列的5'末端有6～14nt重叠区域，所述阻断剂的3'末端含有12～30nt序列，其不存在于所述引物2中，其中，所述野生型目标序列如SEQ ID NO.4或SEQ ID NO.5所示；和/或，所述阻断剂的浓度为0.1～10μM；和/或，所述阻断剂的序列如SEQ ID NO.10所示。

8.如权利要求1所述的检测方法，其特征在于，所述步骤(3)中，所述扩增的温度为58～63℃；和/或，所述扩增的时间为45-120min。

9.如权利要求1所述的检测方法在提取的DNA或RNA单碱基突变检测中的应用。

10.如权利要求1所述的检测方法在细胞原位DNA或RNA单碱基突变检测中的应用。

11.如权利要求1所述的检测方法在DNA甲基化检测中的应用。

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