CN110776579A - 一种利用响应曲面法优化玄参多糖硫酸酯化的工艺 - Google Patents

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Abstract

本发明涉及一种利用响应曲面法优化玄参多糖硫酸酯化的工艺，包括以下步骤：⑴样品制备：将玄参的干燥根制成玄参多糖粉末；然后按不同的反应温度、反应时间、酯化试剂比例进行反应提取，得到对应于不同比例酯化试剂的玄参多糖硫酸酯粉末；⑵用氯化钡‑明胶比浊法测定样品取代度；⑶样品ABTS+清除率的测定；⑷实验设计与统计分析：①单因素试验：②响应面法优化设计：根据单因素试验结果，以反应温度、反应时间、酯化试剂比例作为考察因素建立多元二次回归方程：⑸实验结果分析与优化：利用Design Expert 8.0.6软件根据多元二次回归方程进行绘图分析，得到回归方程的响应面及其等高线图。本发明操作简单、提取率高。

Description

一种利用响应曲面法优化玄参多糖硫酸酯化的工艺
技术领域
本发明涉及生物技术领域，尤其涉及一种利用响应曲面法优化玄参多糖硫酸酯化的工艺。
背景技术
玄参（ScrophulariaeRadix）为玄参科（Scrophulariaceae）植物玄参（Scrophularia ningpoensis Hemsl.）的干燥根。主产于浙江、湖北、江苏、江西等省，其中以浙江出产的玄参为佳品，公认为浙八味之一。其味甘、苦、咸，微寒，具有清热凉血、泻火解毒、滋阴降火等功效，多用于热入营血、温毒发斑、热病伤阴、舌绛烦渴，津伤便秘等症。目前认为其主要化学成分有环烯醚萜类、苯丙素苷类、苯乙醇苷类、甾醇类、黄酮类及多糖类等化学成分，具有镇痛、抗疲劳、抗炎、抑菌、保护心肌、抗血凝、抗脑缺血损伤，增强免疫等药理作用，临床上常用玄参治疗阴虚血瘀型冠心病心绞痛。
中药多糖作为天然大分子化合物，具有提取来源广泛且基本无细胞毒性的特点。目前国内对于中药多糖的研究十分广泛，如人参多糖、黄芪多糖、大枣多糖、灵芝多糖等；研究方向上主要集中于提取工艺优化、分离纯化工艺研究、组分结构分析、体内外抗氧化活性及药理于免疫活性等部分。大量报道表明，中药多糖具有良好的抗肿瘤、抑菌抗病毒、抗氧化衰老、免疫调节及降血糖等作用。
随着人们对多糖成分活性的深入研究，多糖结构修饰成为提高多糖生物活性或其生物利用度的重要方法之一。目前常见的多糖结构修饰方法有羧甲基化、乙酰化、硫酸酯化、硒化、烷基化等修饰方法。经结构修饰后的多糖衍生物在很多方面都显示出较高的活性。
硫酸酯化多糖即多糖通过硫酸化修饰得到的衍生物，包括自然界存在的天然多糖硫酸酯和经人工合成的多糖硫酸酯衍生物。目前发现的天然的多糖硫酸酯如硫酸软骨素、肝素等，均具有非常良好的药理活性。通过对多糖的硫酸酯化结构修饰，可提高多糖抗氧化、抗肿瘤、免疫调节，抗菌抗病毒等功能。目前常采用Wblform法硫酸酯化吡喃型多糖，Nagasawa法常用于吠喃型多糖。多糖硫酸酯化常见方法有氯磺酸-吡啶法、三氧化硫-吡啶法、浓硫酸法、氯磺酸-DMF法等。虽然三氧化硫-吡啶法和浓硫酸法操作简单，但衍生物取代度低且产品回收率也较低；氯磺酸-吡啶法操作繁琐，反应周期长，但产品取代度较高，且方便回收。
如Wang等证明枸杞多糖硫酸酯可显著促进细胞增殖，同时提高HI抗体效价，增强LBPS免疫活性（Wang J M, Hu Y L, Wang D Y, et al. Sulfated Modification canenhance the immune-enhancing activity of lycium barbarum polysaccharide [J].Cell Immunol, 2010, 263 (2): 219-23.）。Zhao等发现经硫酸酯化修饰的银耳多糖可显著增强脾淋巴细胞的体外增殖能力（Zhao X N, Hu Y L, Wang D Y. The comparison ofimmune-enhancing activity of sulfated polysaccharides from Tremella andCondonpsis pilosula [J]. Carbohydr Polym, 2013, 98 (1): 438-443.）。
但对于玄参多糖的有关报道较少，对于其结构修饰及衍生化产物活性的研究更是未见报道。
目前，玄参的研究重点多在环烯醚萜苷类成分及其活性的研究，而对玄参多糖的提取分离及其体外抗氧化活性报道较少，对玄参多糖体内药理活性的研究更为少见。
发明内容
本发明所要解决的技术问题是提供一种操作简单、提取率高的利用响应曲面法优化玄参多糖硫酸酯化的工艺。
为解决上述问题，本发明所述的一种利用响应曲面法优化玄参多糖硫酸酯化的工艺，包括以下步骤：
⑴样品制备：
将玄参的干燥根在50℃温度下烘干24h后粉碎至10目，按200g：6L的料液比加入去离子水浸泡1h，微沸煎煮2h，煎煮液过滤，药渣再煎煮一次，合并滤液；所述滤液经减压浓缩至350~450 mL后，得到浓缩液，该浓缩液中加入其体积4倍的无水乙醇，混匀，静置过夜，弃去上清，得到沉淀物；所述沉淀物中加入100 mL的去离子水溶解，过大孔树脂柱DM-130脱除色素，洗脱液经减压浓缩，Sevage法脱除蛋白，得到脱除色素和蛋白的玄参多糖提取液；所述脱除色素和蛋白的玄参多糖提取液经浓缩、冷冻干燥，得到玄参多糖粉末；
在所述玄参多糖粉末0.50 g中加入无水甲酰胺20 mL溶解，得25 mg/mL的玄参多糖甲酰胺溶液；将该溶液缓慢加入不同比例酯化试剂中，充分搅拌下于60℃~100℃不同的温度水浴加热，反应1~5 h的不同时间，得到反应液；所述反应液用质量浓度为40 %的NaOH溶液调节pH到中性，装入分子截留量1000的透析袋内，常流水下透析3 d；透析完成后的溶液经减压浓缩、冷冻干燥，即得对应于不同比例酯化试剂的玄参多糖硫酸酯粉末；所述酯化试剂是指将4℃下预冻2 h的吡啶4.0~6.0 mL，加入置于冰水浴中的三颈烧瓶中；取氯磺酸6.0~9.0 mL逐滴加入三颈烧瓶内，剧烈搅拌下使之与吡啶反应，30~40 min滴加完成；当无浓烟产生结束反应，即得淡黄色酯化试剂；
⑵用氯化钡-明胶比浊法测定样品取代度：
①标准曲线制作：
精密称取100.0 mg K2SO4，用1 mol/L的盐酸定容至100mL，制得1.0 mg/mL K2SO4标准溶液；分别取20μL、60μL、100μL、140μL、180μL、200μL的质量浓度为1.0 mg/mL的K2SO4标准溶液于试管中，用1 mol/L的盐酸补足200μL；依次加入质量浓度为3%的三氯乙酸3.8mL与质量浓度为0.5% 的BaCl2-明胶溶液1mL；以1 mol/L的盐酸做空白，加样完成后的5~15min内于360 nm波长下测定，记吸光度为A1；以质量浓度为0.25%的明胶溶液代替BaCl2-明胶溶液，同法测定记得吸光度A2；以K2SO4标准溶液mg/mL为横坐标，吸光度值差A1-A2为纵坐标，绘制标准曲线；
②样品取代度的测定：
精密称量10mg硫酸酯化玄参多糖于试管中，加5mL的1 mol/L盐酸，90℃水浴水解5小时；水解完成后用盐酸补加至5 mL，得2 mg/mL硫酸酯化玄参多糖水解液；取200μL水解液于试管中，其余操作均与所述步骤①制作标准曲线相同，根据标准曲线查出K2SO4浓度；
⑶样品ABTS+清除率的测定：
a) ABTS+溶液的配制：称取10 mgABTS于试管中，加入2.6 mL的0.66 mg/mL的过硫酸钾溶液，充分混合，室温避光状态下反应16 h，以生成ABTS+；反应完成后以无水乙醇稀释，于734 nm下测定，至吸光度为0.7±0.02；
b) 样品清除率的测定：取硫酸酯化玄参多糖粉末2.5 mg溶解于5mL蒸馏水中，得0.5mg/mL样品溶液；精密移取样品溶液1 mL于试管中，加入稀释好的ABTS+溶液3mL，室温下避光反应1 h；反应结束后于734 nm波长下测定吸光度A1，以无水乙醇代替ABTS+溶液，同法测定记吸光度为Ax；以蒸馏水代替样液做空白，同法测定，记吸光度为A0；；计算ABTS+清除率（%）；
ABTS+清除率（%）= （A1-Ax）/ A0×100%；
⑷实验设计与统计分析：
①单因素试验：
依次改变反应温度、反应时间、酯化试剂比例进行单因素试验，用氯化钡-明胶比浊法测定所得的硫酸酯化玄参多糖中样品硫酸根浓度Cs按下式计算硫百分含量S%及取代度DS，每次处理重复3次：
S%=0.092 Cs×100%；
Figure 669748DEST_PATH_IMAGE001
；
式中162是指单糖相对分子量，32是指硫原子质量分数，102是指单糖基中羟基被硫酸基取代后相对分子质量的增加值；
②响应面法优化设计：
根据单因素试验结果，以反应温度、反应时间、酯化试剂比例作为考察因素，以取代度和ABTS+清除率为考察指标，利用Design Expert 8.0.6软件根据Box-Behnken设计原则进行实验设计，以反应温度A、反应时间B、酯化试剂比例C为自变量，以取代度DS为响应值y、ABTS+清除率为响应值y´，建立多元二次回归方程：
y=1.21+8.925×10-3A+0.047B+7.925×10-3C+0.033AB-0.039AC+0.016BC-
0.14A2-0.061B2-0.099C2；
y´=（83.34+1.83A+1.81B+3.41C-0.9AB-1.85AC+3.23BC-9.18A2-3.58B2
-10.46C2）×100%；
⑸实验结果分析与优化：
利用Design Expert 8.0.6软件根据多元二次回归方程进行绘图分析，得到回归方程的响应面及其等高线图。
所述步骤①中0.25%明胶溶液是指将1.250 g明胶于100℃水浴加热溶解，定容至500mL所得。
所述步骤①中0.5% BaCl2-明胶溶液是指将1.250 g BaCl2以0.25 %明胶溶液定容至250mL所得。
所述步骤①中3 %三氯乙酸溶液是指将15.0 g三氯乙酸加水溶解定容至500 mL所得。
本发明与现有技术相比具有以下优点：
1、与正交法相比，本发明以反应温度、反应时间、酯化试剂比例为考察因素，通过Design-Expert 8.0.6软件，运用Box-Behnken原理设计出三因素三水平的模型响应面分析法，用3个变化因子、3个水平及少量的实验组（仅17组实验）就可以得出优化结果，获得最佳取代度和ABTS+清除率，在提高了取代度的同时提高了ABTS+清除率，具有工业化生产的实际意义；并且所得的最佳提取条件不是设定的值，而是在设定条件的范围之内。
2、本发明通过对二次回归模型的分析得到最优反应条件为反应温度81℃、反应时间200 min、酯化试剂比例2: 1，在此条件下玄参多糖的取代度达到了1.2175，ABTS+清除率达到了82.21%。同时，取代度与ABTS+清除能力最优点的基本吻合表明玄参多糖硫酸酯ABTS+清除能力与取代度有着密切关系，随着取代度的提升，ABTS+清除率也呈现上升趋势。
3、对本发明采用的氯化钡-明胶比浊法进行方法学考察，该方法标准曲线相关系数R=0.9995，说明该方法线性回归良好（参见图1）。
⑴稳定性考察：
精密移取硫酸酯化多糖水解液200μL，与标准曲线测定方法同法测定，分别在加样完成后的0min、3min、6 min、9 min、12 min、15 min、20minmin、25 min和30 min时进行测定，并计算取代度和RSD（参见表1）。
表1 稳定性考察结果
Figure 99593DEST_PATH_IMAGE002
经过稳定性考察发现，氯化钡-明胶比浊法测定样品取代度时，在0-3 min内吸光度逐渐升高，为氯化钡与硫酸根基团反应生成硫酸钡沉淀的时间；在3-15 min内较为稳定，为测定的最佳时间；15 min之后由于硫酸钡的自然沉降导致溶液浊度下降，吸光度也随之下降。因此使用氯化钡-明胶比浊法测定时，应当以加样完成后的3-15 min内测定完成，避免由于硫酸钡沉淀的自然沉降导致测定结果不准确的现象产生，从而对实验结果产生误差。
⑵精密度考察：
精密移取硫酸酯化多糖水解液200μL于六个具塞试管中。按照标准曲线测定的方法进行测定，计算六个平行组取代度及RSD，考察该方法平行测定精密度。结果见表2。
表2 精密度考察结果
Figure 905000DEST_PATH_IMAGE003
通过精密度考察结果可以发现，氯化钡-明胶比浊法精密度较为良好，各平行组实验间差异较小，测定结果较为可信。
⑶重复性考察：
取硫酸酯化玄参多糖样品，按照样品取代度测定方法重复进行六组测定，并计算各次测定取代度并计算RSD。结果见表3。
表3 重复性考察结果
Figure 180123DEST_PATH_IMAGE004
通过重复性考察实验发现，氯化钡-明胶比浊法在重复测定中结果差异较小，实验数据较为可信。
⑷加样回收率考察：
分别精密移取1.0 mg/mL K2SO4标准溶液100 μL于六支具塞试管中，加入硫酸钾当量为0.1 mg的硫酸酯化玄参多糖水解液，用1 mol/L盐酸补足至200 μL。按照标准曲线测定方法同法测定，根据测定结果计算各组硫酸钾当量，并计算RSD。结果见表4。
表 4 加样回收率考察结果
Figure 885911DEST_PATH_IMAGE005
从加样回收率考察结果来看，氯化钡-明胶比浊法平均加样回收率在95 %~105 %范围内，平均加样回收率为99.3 %，RSD为2.0 %，说明该方法对于样品和氯化钡的灵敏度无显著差异，方法较为可靠。
4、本发明通过比较发现，由于硫酸集团的键入导致糖链构型和电荷分布发生变化。相邻硫酸基团由于空间位阻而相互排斥，引发糖链扭曲变型；同时由于大量给电子基团的键入，使得糖链电荷分布发生改变，玄参多糖硫酸酯相较于玄参多糖来说ABTS+清除能力有非常明显的提高，IC50由酯化前的1.36 mg/mL，降低到酯化后的0.230 mg/mL（如图13所示）。
红外谱图分析中也证明玄参多糖硫酸酯羟基振动峰相较玄参多糖谱图明显减弱，且新出现了S=O和C-O-S特征吸收峰，验证了玄参多糖硫酸酯化修饰成功。
在玄参多糖红外谱图14中，可见在3378 cm-1存在明显的VOH吸收峰；1053 cm-1的吸收峰为羟基中C-O键的伸缩振动吸收峰；2930 cm-1处较为尖锐的峰为-C-H伸缩振动吸收峰；1411 cm-1处为-C-H键弯曲振动吸收峰；1609 cm-1处强而稳定的吸收峰为-C=O振动吸收峰[42,43]。
比较玄参多糖红外谱图14和玄参多糖硫酸酯的红外谱图15可以发现，玄参多糖硫酸酯良好的保留了母体特征吸收峰，且由于硫酸基团的键入，某些特征峰也随之有相应的改变。首先，3354~3363cm-1大而缓的峰是多糖链上的-OH振动吸收峰，通过对比可以发现由于硫酸酯化取代了一部分-OH，酯化多糖的-OH吸收峰较玄参多糖变得小且窄。其次，VC=O吸收峰向高频移动，说明部分分子内氢键被破坏。酯化多糖谱图中在1230 cm-1附近出现的由C-O-S的特征吸收峰和837 cm-1附近出现的S=O的特征吸收峰都是由于硫酸基团的引入而产生的。由此可以证明，玄参多糖硫酸酯化衍生化成功键入了硫酸基团，并且可以在红外光谱中得以充分体现。
5、本发明所得的硫酸酯化玄参多糖和玄参多糖均具有较强的抗炎作用，其抗炎机制与抑制NF-κBp65的磷酸化有关。且玄参多糖经过硫酸酯化修饰后，其抗炎效果更佳。因此，玄参多糖经过硫酸酯化修饰后有可有效改善其药理活性，具有更为广阔的应用前景。
【玄参多糖和硫酸酯化玄参多糖来源】
由正规药材市场购买所得干燥玄参切片，经济宁医学院药学院中药教研室王建安副教授鉴定为玄参科Scrophulariaceae玄参属Scrophularia植物玄参ScrophularianingpoensisHemsl.根的切片，经过烘干→粉碎→过50目筛→用丙酮进行脱脂处理→热水回流浸提→大孔树脂脱色素→sevag试剂脱色素→冷冻干燥→玄参多糖→氯磺酸吡啶法得硫酸酯化玄参多糖。
【动物来源】
所用小鼠均为采购于青岛大任富城畜牧有限公司。小鼠规格为雄性SPF级ICR小鼠（18~22g）40只。实验动物的饲养温度为（24±2）℃的室内，常规饲料，自由饮水进食，适应性饲养一周后用于实验。
【实验方法】
⑴小鼠的分组给药和取材
①小鼠的分组：
将40只ICR小鼠随机分为4组（10只/组）：（1）正常对照组（灌胃和腹腔注射相同剂量生理盐水）；（2）模型组（灌胃生理盐水，腹腔注射LPS 1 mg/kg）；（3）阳性对照组（灌胃阿司匹林10 mg/kg，腹腔注射LPS 1 mg/kg）；（4）硫酸酯化玄参多糖剂量组（200 mg/kg，腹腔注射LPS 1 mg/kg）。
②给药和建模：
按照上述实验分组，不同组小鼠分别灌胃给予相应剂量的硫酸酯化玄参多糖和阿司匹林保护性灌胃给药3天，正常对照组和模型组则给予相应剂量的生理盐水，以保证实验一致性。在末次灌胃给药30 min后，腹腔注射LPS建模。
③小鼠的取材：
LPS注射90 min后，精确称量小鼠的体重。手机小鼠静脉血，室温放置2 h后离心得到血清，备用；取小鼠肝脏组织并精确称量和记录，并置于-80℃冰箱保存。
⑵ELISA法检测血清中IL-6和TNF-α的蛋白表达：
取步骤③中-20℃冰箱储存的小鼠血清放置到室温。
ⅰ血清中IL-6的含量测定：
按照Invitrogen公司的IL-6 ELISA试剂盒说明书加样、孵育并显色，显色后使用多功能酶标仪在450 nm下检测各样本的吸光度，并按试剂盒说明书计算血清中IL-6的蛋白含量。
ⅱ血清中TNF-α的含量测定：
按照Peprotech公司的TNF-α ELISA试剂盒说明书加样、孵育并显色，显色后使用多功能酶标仪在450 nm下检测各样本的吸光度，并按试剂盒说明书计算血清中TNF-α的蛋白含量。
⑶Real time RT-PCR法检测肝脏中IL-6和TNF-α的mRNA表达：
①肝脏组织中总RNA提取、含量测定以及cDNA的合成
ⅰ取肝脏组织充***解后，按照UNIQ-10 Column Trizol试剂盒进行操作，提取组织中的总RNA，收集RNA并计算总RNA浓度。
ⅱ使用逆转录试剂盒将提取的总RNA逆转录合成cDNA。加入随机引物5 μl，样品5μl，并在冰上混匀，在50℃下延伸15 min，然后在80℃下放置5 min使其高温变性，再使用引物进行实时荧光定量聚合酶链式反应。
②Real-time RT-PCR的荧光标记和相对定量计算
在PCR反应液中加入荧光染料SYBR Green I，染料与DNA结合发出荧光，从而定量检测。然后进行溶解度曲线分析，以保证目的基因能特异性扩增。最后应用ABI 7500 real-timePCR仪进行扩增，得到CT值，并采用2-ΔΔC T法进行数据统计。
⑷Western blot法检测小鼠肝脏组织中NF-κBp65、phospho-NF-κBp65的蛋白表达：
取步骤③-80℃冰箱储存的小鼠肝脏组织，按照m:v=1:9，加入相应体积的RIPA裂解液，超声破碎裂解组织，提取分离蛋白质，采用BCA法测定蛋白质浓度，具体步骤参照索莱宝公司BCA试剂盒说明书。将所得蛋白质与SDS-PAGE混匀后进行煮沸3~5min，使蛋白质充分变形后进行聚丙烯酰胺凝胶电泳，然后将已经定量的蛋白质加入到SDS-PAGE胶加样孔中（40 μg每孔），然后将电压设置成100V，设定时间为90~120min进行电泳，安装湿转仪，运用湿转法将蛋白质转印到PVDF膜上(接通外加电源恒流300mA时间30-90min)。用PBTS冲洗并用含有5%脱脂奶粉的PBTS将转膜完成的PVDF膜室温封闭2h，用含有5%脱脂奶粉的PBTS稀释各蛋白的一抗(NF-κBp65、Phospho-NF-κBp65、β-actin)于4℃摇床缓慢摇动孵育过夜，然后用含有0.5% Tween-20的PBST在水平摇床上梯度洗膜5次，然后用辣根过氧化物酶标记的二抗(抗小鼠：β-actin或抗兔：Phospho-NF-κBp65、NF-κBp65)室温孵育1.5 h，继续用含有0.5%Tween-20的PBST在水平摇床上梯度洗膜，吸干PVDF膜的水分后，应用ECL发光试剂盒进行化学发光检测，在暗室中调整压片曝光时间以及进行胶片冲洗，透射扫描仪扫描图像至电脑。
⑸统计学处理分析：
各组间实验数据采用单因素方差分析，数据分析结果以平均数±标准误（Mean ±SE）表示，多组间比较采用方差分析，两组间比较采用t检验，P＜0.05表示有统计学意义。
【结果和讨论】
⑴对LPS诱导的炎性因子IL-6和TNF-α的蛋白表达的影响：
①对LPS诱导的炎性因子IL-6的蛋白表达的影响：
实验结果如图16所示：与正常对照组比较，在模型组中小鼠血清中IL-6蛋白的表达显著升高（P＜0.01）。在给予阿司匹林以及硫酸酯化玄参多糖保护后，各组血清中IL-6蛋白的表达较模型组显著降低（P<0.01），说明硫酸酯化玄参多糖能有效的缓解小鼠的急性炎症损伤，具有良好的抗炎作用。并且硫酸酯化玄参多糖组血清中IL-6蛋白的表达与阿司匹林组的表达相近，说明了硫酸酯化玄参多糖抗炎效果与阿司匹林的抗炎效果相近。
②对LPS诱导的炎性因子TNF-α的蛋白表达的影响：
实验结果如图17所示：与正常对照组比较，在模型组中小鼠血清中IL-6蛋白的表达显著升高（P＜0.01）。在给予阿司匹林保护后血清中TNF-α蛋白的表达较模型组有所降低（P<0.01），在给予硫酸酯化玄参多糖保护后，各组血清中TNF-α蛋白的表达较模型组显著降低（P<0.001），并且硫酸酯化玄参多糖组中TNF-α蛋白的表达较阿司匹林组降低明显，说明硫酸酯化玄参多糖能有效的缓解小鼠的急性炎症损伤，具有良好的抗炎作用，并且硫酸酯化玄参多糖抗炎效果较阿司匹林的抗炎效果更为显著。
⑵对LPS诱导的肝脏组织中IL-6和TNF-α的mRNA表达的影响：
①对LPS诱导的肝脏组织中IL-6的mRNA表达的影响：
实验结果如图18所示：与正常对照组比较，在模型组的肝脏组织中IL-6mRNA的表达显著升高（P＜0.01）。在给予阿司匹林及硫酸酯化玄参多糖保护后，阿司匹林组肝脏组织中IL-6 mRNA的表达较模型组显著降低（P<0.01），硫酸酯化玄参多糖肝脏组织中IL-6 mRNA的表达较模型组的表达降低更为显著（P<0.001），说明硫酸酯化玄参多糖均能有效的缓解小鼠的急性炎症损伤，具有良好的抗炎作用。
②对LPS诱导的肝脏组织中TNF-α的mRNA表达的影响：
实验结果如图19所示：与正常对照组比较，在模型组的肝脏组织中TNF-αmRNA的表达显著升高（P＜0.01）。在给予阿司匹林及硫酸酯化玄参多糖保护后，阿司匹林组肝脏TNF-αmRNA的表达较模型组降低（P<0.01），硫酸酯化玄参多糖肝脏组织中TNF-α mRNA的表达较模型组的表达降低更为显著，并且硫酸酯化玄参多糖肝脏组织中TNF-α mRNA的表达比阿司匹林组更低（P<0.001），说明硫酸酯化玄参多糖能有效的缓解小鼠的急性炎症损伤，具有良好的抗炎作用。
附图说明
下面结合附图对本发明的具体实施方式作进一步详细的说明。
图1为本发明氯化钡-明胶比浊法标准曲线。
图2为本发明反应温度对取代度的影响。
图3为本发明反应时间对取代度的影响。
图4为本发明酯化试剂比例对取代度的影响。
图5为本发明模型诊断图。其中：左图为残差概率正态分布图，右图为残差与方程预测值的对应图。
图6为本发明反应温度与反应时间对取代度的交互影响。
图7为本发明反应温度和试剂比例对取代度的交互影响。
图8为本发明试剂比例和反应时间对取代度的交互影响。
图9为本发明ABTS+清除率响应面模型诊断图。其中：左图为残差概率正态分布图，右图为残差与方程预测值的对应图。
图10为本发明ABTS+清除率温度-时间交互模型。
图11为本发明ABTS+清除率温度-试剂比例交互模型。
图12本发明ABTS+清除率试剂比例-时间交互模型。
图13为本发明多糖硫酸酯与玄参多糖ABTS+清除能力比较图。
图14为本发明玄参多糖红外谱图（以溴化钾为背景片，于400~4000 cm-1波数下进行扫描）。
图15为本发明硫酸酯化玄参多糖红外谱图（以溴化钾为背景片，于400~4000 cm-1波数下进行扫描）。
图16为本发明硫酸酯化玄参多糖对LPS诱导小鼠肝脏IL-6蛋白表达的影响（##表示与空白对照组比较，P<0.01；**表示与LPS组比较P<0.01）。
图17为本发明硫酸酯化玄参多糖对LPS诱导小鼠肝脏TNF-α蛋白表达的影响（##表示与空白对照组比较，P<0.01；*表示与LPS组比较P<0.05；**表示与LPS组比较P<0.01）。
图18为本发明硫酸酯化玄参多糖对LPS诱导小鼠肝脏IL-6mRNA表达的影响（##表示与空白对照组比较，P<0.01；**表示与LPS组比较P<0.01）。
图19为本发明硫酸酯化玄参多糖对LPS诱导小鼠肝脏TNF-αmRNA表达的影响（##表示与空白对照组比较，P<0.01；**表示与LPS组比较P<0.01）。
具体实施方式
一种利用响应曲面法优化玄参多糖硫酸酯化的工艺，包括以下步骤：
⑴样品制备：
将玄参的干燥根在50℃温度下烘干24h后粉碎至10目，按200g：6L的料液比加入去离子水浸泡1h，微沸煎煮2h，煎煮液过滤，药渣再煎煮一次，合并滤液；滤液经经旋转蒸发仪减压浓缩至350~450 mL后，得到浓缩液，该浓缩液中加入其体积4倍的无水乙醇，混匀，静置过夜，弃去上清，得到沉淀物；沉淀物中加入100 mL的去离子水溶解，过大孔树脂柱DM-130脱除色素，洗脱液经经旋转蒸发仪减压浓缩，Sevage法脱除蛋白，得到脱除色素和蛋白的玄参多糖提取液；脱除色素和蛋白的玄参多糖提取液经旋转蒸发仪减压浓缩、真空冷冻干燥机冷冻干燥，得到玄参多糖粉末。
在玄参多糖粉末0.50 g中加入无水甲酰胺20 mL溶解，得25 mg/mL的玄参多糖甲酰胺溶液；将该溶液缓慢加入不同比例酯化试剂中，充分搅拌下于60℃~100℃不同的温度水浴加热，反应1~5 h的不同时间，得到反应液；所述反应液用质量浓度为40 %的NaOH溶液调节pH到中性，装入分子截留量1000的透析袋内，常流水下透析3 d；透析完成后的溶液经旋转蒸发仪减压浓缩、真空冷冻干燥机冷冻干燥，即得对应于不同比例酯化试剂的玄参多糖硫酸酯粉末。
酯化试剂是指将4℃下预冻2 h的吡啶4.0~6.0 mL，加入置于冰水浴中的三颈烧瓶中；取氯磺酸6.0~9.0 mL逐滴加入三颈烧瓶内，剧烈搅拌下使之与吡啶反应，30~40 min滴加完成；当无浓烟产生结束反应，即得淡黄色酯化试剂。
⑵用氯化钡-明胶比浊法测定样品取代度：
①标准曲线制作：
精密称取100.0 mg K2SO4，用1 mol/L的盐酸定容至100mL，制得1.0 mg/mL K2SO4标准溶液；分别取20μL、60μL、100μL、140μL、180μL、200μL的质量浓度为1.0 mg/mL的K2SO4标准溶液于试管中，用1 mol/L的盐酸补足200μL；依次加入质量浓度为3%的三氯乙酸3.8mL与质量浓度为0.5% 的BaCl2-明胶溶液1mL；以1 mol/L的盐酸做空白，加样完成后的5~15min内于360 nm波长下测定，记吸光度为A1；以质量浓度为0.25 %的明胶溶液代替BaCl2-明胶溶液，同法测定记得吸光度A2；以K2SO4标准溶液mg/mL为横坐标，吸光度值差A1-A2为纵坐标，绘制标准曲线。
其中：0.25%明胶溶液是指将1.250 g明胶于100℃水浴加热溶解，定容至500mL所得。
0.5% BaCl2-明胶溶液是指将1.250 g BaCl2以0.25 %明胶溶液定容至250mL所得，现用现配。
3 %三氯乙酸溶液是指将15.0 g三氯乙酸加水溶解定容至500 mL所得，避光保存。
②样品取代度的测定：
精密称量10mg硫酸酯化玄参多糖于试管中，加5mL的1 mol/L盐酸，90℃水浴水解5小时；水解完成后用盐酸补加至5 mL，得2 mg/mL硫酸酯化玄参多糖水解液；取200μL水解液于试管中，其余操作均与步骤①制作标准曲线相同，根据标准曲线查出K2SO4浓度。
⑶样品ABTS+清除率的测定：
a) ABTS+溶液的配制：称取10 mgABTS于试管中，加入2.6 mL的0.66 mg/mL的过硫酸钾溶液，充分混合，室温避光状态下反应16 h，以生成ABTS+；反应完成后以无水乙醇稀释，于734 nm下测定，至吸光度为0.7±0.02。
b) 样品清除率的测定：取硫酸酯化玄参多糖粉末2.5 mg溶解于5mL蒸馏水中，得0.5 mg/mL样品溶液；精密移取样品溶液1 mL于试管中，加入稀释好的ABTS+溶液3mL，室温下避光反应1 h；反应结束后于734 nm波长下测定吸光度A1，以无水乙醇代替ABTS+溶液，同法测定记吸光度为Ax；以蒸馏水代替样液做空白，同法测定，记吸光度为A0；计算ABTS+清除率（%）。
ABTS+清除率（%）= （A1-Ax）/ A0×100%。
⑷实验设计与统计分析：
①单因素试验：
依次改变反应温度、反应时间、酯化试剂比例进行单因素试验，用氯化钡-明胶比浊法测定所得的硫酸酯化玄参多糖中样品硫酸根浓度Cs，按下式计算硫百分含量S%及取代度DS，每次处理重复3次：
S%=0.092 Cs×100%；
Figure 221078DEST_PATH_IMAGE001
；
式中162是指单糖相对分子量，32是指硫原子质量分数，102是指单糖基中羟基被硫酸基取代后相对分子质量的增加值
②响应面法优化设计：
根据单因素试验结果，以反应温度、反应时间、酯化试剂比例作为考察因素，以取代度和ABTS+清除率为考察指标，利用Design Expert 8.0.6软件根据Box-Behnken设计原则进行实验设计（考察因素及水平见表5），以反应温度A、反应时间B、酯化试剂比例C为自变量，以取代度DS为响应值y、ABTS+清除率为响应值y´（实验方案及结果见表6），建立多元二次回归方程：
y=1.21+8.925×10-3A+0.047B+7.925×10-3C+0.033AB-0.039AC+0.016BC-
0.14A2-0.061B2-0.099C2。
y´=（83.34+1.83A+1.81B+3.41C-0.9AB-1.85AC+3.23BC-9.18A2-3.58B2
-10.46C2）×100%。
由回归模型分析表（表7）可知，模型整体的P值＜0.001，达到了极为显著的水平。差拟项中F=2.3，P=0.2188，说明模型差拟项不显著。如图5所示，左图表示残差概率正态分布，残差基本分布于直线附近，且在直线中心较为集中，说明残差分布符合正态分布曲线。右图表示残差与方程预测值的对应值，图中点比较分散，说明该模型对实验结果的拟合良好，模型拟合与实际情况较为相符，模型可信度高。
由该二次多项回归方程可知，各因素项系数之和为-0.22615，说明该方程图像开口向下，有极大值点，因此可以优化出最佳取代度反应条件。根据方程的一次项系数可以得出：影响取代度的三个因素三个中，反应时间＞反应温度＞酯化试剂比例。
由表8中数据可以看出，该ABTS+清除率响应面模型整体的P=0.0065，说明模型达到了极为显著的水平；差拟项的值F=3.6，P=0.1238，说明模型差拟项不显著，从图9诊断模型图（左图）中可以发现，残差正态概率分布图集中在一条直线，且为中间密集两边稀疏，符合正态分布规律；残差与方程预测值（右图）对应值比较分散，说明实验数据拟合良好，与实际情况相符合，模型可靠。
在三个影响因素中，试剂比例对于清除率的影响比较显著；反应温度、反应时间对于清除率的影响并不显著。两因素交互模型对于清除率的影响并不显著，可能由于影响ABTS+清除能力的原因较多，机制较为复杂。此外，各因素的二次项中，温度二次项和也均达到了极为显著的水平，反应时间二次项并不显著。
该二次多项回归方程各因素项系数之和为-15.69，说明该方程图像开口向下，有极大值点，因此可以优化出最佳清除率的反应条件。根据方程的一次项系数可以得出：影响清除率的三个因素三个中，酯化试剂比例＞反应时间＞反应温度。
表5 响应面考察因素与水平
Figure 12316DEST_PATH_IMAGE006
表6 响应面分析方案和结果
Figure 91130DEST_PATH_IMAGE007
表7 回归模型分析表
注：**表示极为显著水平。
表 8 ABTS+清除率响应面回归模型分析表
Figure 423072DEST_PATH_IMAGE009
注：*表示具有显著水平；**表示具有极显著水平。
⑸实验结果分析与优化：
利用Design Expert 8.0.6软件根据多元二次回归方程进行绘图分析，得到回归方程的响应面及其等高线图。
如图2所示，随着反应温度的逐渐上升，玄参多糖的取代度呈现先增后减的趋势，80℃取代度最高。当反应温度从60℃上升至80℃时取代度逐渐升高，可能是由于温度的升高有利于提高部分羟基的活性；80℃~100℃时，取代度随着温度上升逐渐下降，在实验中也发现反应温度在90℃和100℃时反应结束后的反应液液略微有焦化现象，流动性也相对降低，猜测是高温下氯磺酸的强氧化性可能破坏了多糖链中的某些结构，导致其发生取代反应的能力下降。
如图3所示，随着反应时间的增加，玄参多糖取代度先增后降，在3小时达到最大。反应时间从1 h上升到3 h过程中，取代度不断上升，可能是由于该取代反应较为缓慢，需要较长时间才可反应完成。3 h之后，随着反应时间的不断增加，取代度呈现缓慢减小趋势，可能是由于反应时间过长导致被剩余氯磺酸氧化从而导致取代度的下降，或是由于受热时间增加而导致副反应的发生、或原本缔合的硫酸根基团断键，从而导致了取代度的下降。
如图4所示，随着酯化试剂比例的增加，玄参多糖取代度先升高后降低，在氯磺酸于吡啶体积比为2:1时取代度达到最大。当体积比从1:1增加到2:1的过程中，取代度不断增大，应该是由于氯磺酸体积占比不断升高导致酯化试剂的逐渐反应完全，从而使取代度升高。当两者体积比由2:1继续上升至3:1的过程中，取代度不断下降，推测是由于吡啶的量逐渐减少导致的酯化试剂生成量逐渐下降所导致。在实验过程中也发现，酯化试剂比例组透析完成后，透析液的颜色也呈现明显的先变深后变浅的现象，推测硫酸基团的键联可能是使颜色加深的原因之一。
由图6可知，在反应时间和反应温度的交互影响模型（右图）中，反应温度对取代度的影响更加显著。从等高线图（左图）中可见，温度-时间的交互对于取代度有着明显的影响：当反应时间在2 h~3.4 h、反应温度在70~80 ℃时，取代度不断升高，从3.4 h~4 h、80℃~90℃的过程中，取代度不断降低。
从图7温度-试剂比例交互等高线图（左图）可以看出，随着反应温度从70℃上升到80℃、试剂比例从1.5:1上升到2:1的过程中，酯化多糖的取代度不断升高，大致在80℃、2:1达到最高点。从3D模型（右图）来看反应温度和试剂比例的变化曲率大致相当，说明在温度-试剂比例交互影响中，两者均对取代度有着一定影响。
在图8反应时间-试剂比例的交互影响等高线图（左图）中可以发现，取代度在3.5h、试剂比例2:1达到顶点。3D模型（右图）中可以发现，反应时间的曲率要大于试剂比例的曲率，说明在时间-比例的交互影响中反应时间对于取代度的影响更大。
从图10温度-时间对于ABTS+清除率的交互影响等高线图来看，当反应温度从70℃上升至90℃，反应时间从2 h增加到3 h的过程中，ABTS+清除率不断上升，并在3.4 h，80 ℃左右达到最大清除率。3D模型图中可以发现，在温度-时间交互影响中，反应温度对清除率的影响要大于反应时间的影响。
从图11温度-试剂比例交互模型图来看，ABTS+清除率随着反应温度从70℃到80℃、试剂比例从1.5:1到2: 1的过程中ABTS+清除率不断上升。3D模型中可以发现，在温度-试剂比例对ABTS+清除率交互影响中，试剂比例的影响要大于温度的影响。
从图12反应时间-试剂比例对ABTS+清除率的交互作用来看，等高线图中ABTS+清除率随着时间从2 h上升至3.4 h、试剂比例从1.5:1上升至2:1的过程中不断升高。在3D模型中可以发现，试剂比例的变化曲率要大于反应时间的变化曲率，说明在该交互影响中，试剂比例的变化对ABTS+清除率起着更加重要的影响。
【回归模型结果及验证】
按表9建立回归模型：
表9 回归模型预测条件
Figure 931633DEST_PATH_IMAGE010
通过建模分析，预测玄参多糖硫酸酯化工艺的最优条件为反应温度80.60℃、反应时间202.8 min、试剂比例2.07:1，此条件下取代度可达1.2145，清除率可达84.01%。
考虑到实际情况，选择了反应温度81℃、反应时间200 min、酯化试剂比例2:1作为最优条件，并基于此条件进行了验证。三组平行验证的平均取代度达到了1.2175，ABTS+清除率达到了82.21%与模型预测基本相符，说明该模型基本可靠，得到的条件对工艺优化具有较好的参考价值，预测结果及验证结果见表10。
表 10预测结果及验证结果比较
Figure 876455DEST_PATH_IMAGE011
模型中，取代度最优点与清除率最优点的基本吻合说明了玄参多糖硫酸酯的ABTS+清除能力与取代度有着密切联系，但由于ABTS+清除能力有较为复杂的机制和多种因素的影响，因此两者并非完美的线性关系，但由模型可以推断，随着取代度的上升，ABTS+清除能力也有显著的提高。而对于影响清除率的其他因素依然有待研究。
上述实施例中所使用的实验方法如无特殊说明，均为常规方法。
上述实施例中所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。
上述实施例中所用的旋转蒸发仪为上海一恒科学仪器有限公司 的RV-211M；真空冷冻干燥机为宁波新艺生物科技股份公司的SCIENTZ-18N。
玄参药材购于安徽亳州，经济宁医学院中药教研室王建安副教授鉴定为玄参科植物玄参（Scrophularia ningpoensis Hemsl.）的干燥根。

Claims (4)

1.一种利用响应曲面法优化玄参多糖硫酸酯化的工艺，包括以下步骤：
⑴样品制备：
将玄参的干燥根在50℃温度下烘干24h后粉碎至10目，按200g：6L的料液比加入去离子水浸泡1h，微沸煎煮2h，煎煮液过滤，药渣再煎煮一次，合并滤液；所述滤液经减压浓缩至350~450 mL后，得到浓缩液，该浓缩液中加入其体积4倍的无水乙醇，混匀，静置过夜，弃去上清，得到沉淀物；所述沉淀物中加入100 mL的去离子水溶解，过大孔树脂柱DM-130脱除色素，洗脱液经减压浓缩，Sevage法脱除蛋白，得到脱除色素和蛋白的玄参多糖提取液；所述脱除色素和蛋白的玄参多糖提取液经浓缩、冷冻干燥，得到玄参多糖粉末；
在所述玄参多糖粉末0.50 g中加入无水甲酰胺20 mL溶解，得25 mg/mL的玄参多糖甲酰胺溶液；将该溶液缓慢加入不同比例酯化试剂中，充分搅拌下于60℃~100℃不同的温度水浴加热，反应1~5 h的不同时间，得到反应液；所述反应液用质量浓度为40 %的NaOH溶液调节pH到中性，装入分子截留量1000的透析袋内，常流水下透析3 d；透析完成后的溶液经减压浓缩、冷冻干燥，即得对应于不同比例酯化试剂的玄参多糖硫酸酯粉末；所述酯化试剂是指将4℃下预冻2 h的吡啶4.0~6.0 mL，加入置于冰水浴中的三颈烧瓶中；取氯磺酸6.0~9.0 mL逐滴加入三颈烧瓶内，剧烈搅拌下使之与吡啶反应，30~40 min滴加完成；当无浓烟产生结束反应，即得淡黄色酯化试剂；
⑵用氯化钡-明胶比浊法测定样品取代度：
①标准曲线制作：
精密称取100.0 mg K2SO4，用1 mol/L的盐酸定容至100mL，制得1.0 mg/mL K2SO4标准溶液；分别取20μL、60μL、100μL、140μL、180μL、200μL的质量浓度为1.0 mg/mL的K2SO4标准溶液于试管中，用1 mol/L的盐酸补足200μL；依次加入质量浓度为3%的三氯乙酸3.8mL与质量浓度为0.5% 的BaCl2-明胶溶液1mL；以1 mol/L的盐酸做空白，加样完成后的5~15min内于360nm波长下测定，记吸光度为A1；以质量浓度为0.25%的明胶溶液代替BaCl2-明胶溶液，同法测定记得吸光度A2；以K2SO4标准溶液mg/mL为横坐标，吸光度值差A1-A2为纵坐标，绘制标准曲线；
②样品取代度的测定：
精密称量10mg硫酸酯化玄参多糖于试管中，加5mL的1 mol/L盐酸，90℃水浴水解5小时；水解完成后用盐酸补加至5 mL，得2 mg/mL硫酸酯化玄参多糖水解液；取200μL水解液于试管中，其余操作均与所述步骤①制作标准曲线相同，根据标准曲线查出K2SO4浓度；
⑶样品ABTS+清除率的测定：
a) ABTS+溶液的配制：称取10 mgABTS于试管中，加入2.6 mL的0.66 mg/mL的过硫酸钾溶液，充分混合，室温避光状态下反应16 h，以生成ABTS+；反应完成后以无水乙醇稀释，于734 nm下测定，至吸光度为0.7±0.02；
b) 样品清除率的测定：取硫酸酯化玄参多糖粉末2.5 mg溶解于5mL蒸馏水中，得0.5mg/mL样品溶液；精密移取样品溶液1 mL于试管中，加入稀释好的ABTS+溶液3mL，室温下避光反应1 h；反应结束后于734 nm波长下测定吸光度A1，以无水乙醇代替ABTS+溶液，同法测定记吸光度为Ax；以蒸馏水代替样液做空白，同法测定，记吸光度为A0；；计算ABTS+清除率（%）；
ABTS+清除率（%）= （A1-Ax）/ A0×100%；
⑷实验设计与统计分析：
①单因素试验：
依次改变反应温度、反应时间、酯化试剂比例进行单因素试验，用氯化钡-明胶比浊法测定所得的硫酸酯化玄参多糖中样品硫酸根浓度Cs按下式计算硫百分含量S%及取代度DS，每次处理重复3次：
S%=0.092 Cs×100%；
Figure 815614DEST_PATH_IMAGE001
；
式中162是指单糖相对分子量，32是指硫原子质量分数，102是指单糖基中羟基被硫酸基取代后相对分子质量的增加值；
②响应面法优化设计：
根据单因素试验结果，以反应温度、反应时间、酯化试剂比例作为考察因素，以取代度和ABTS+清除率为考察指标，利用Design Expert 8.0.6软件根据Box-Behnken设计原则进行实验设计，以反应温度A、反应时间B、酯化试剂比例C为自变量，以取代度DS为响应值y、ABTS+清除率为响应值y´，建立多元二次回归方程：
y=1.21+8.925×10-3A+0.047B+7.925×10-3C+0.033AB-0.039AC+0.016BC-
0.14A2-0.061B2-0.099C2；
y´=（83.34+1.83A+1.81B+3.41C-0.9AB-1.85AC+3.23BC-9.18A2-3.58B2
-10.46C2）×100%；
⑸实验结果分析与优化：
利用Design Expert 8.0.6软件根据多元二次回归方程进行绘图分析，得到回归方程的响应面及其等高线图。
2.如权利要求1所述的一种利用响应曲面法优化玄参多糖硫酸酯化的工艺，其特征在于：所述步骤①中0.25%明胶溶液是指将1.250 g明胶于100℃水浴加热溶解，定容至500mL所得。
3.如权利要求1所述的一种利用响应曲面法优化玄参多糖硫酸酯化的工艺，其特征在于：所述步骤①中0.5% BaCl2-明胶溶液是指将1.250 g BaCl2以0.25 %明胶溶液定容至250mL所得。
4.如权利要求1所述的一种利用响应曲面法优化玄参多糖硫酸酯化的工艺，其特征在于：所述步骤①中3 %三氯乙酸溶液是指将15.0 g三氯乙酸加水溶解定容至500 mL所得。
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