CN110763835A - 过敏原特异性IgE抗体独特型异质性强度在过敏原检测用试剂盒中的应用 - Google Patents

Abstract

本发明属于临床医学/实验诊断学领域，涉及***反应性疾病的实验诊断，具体是为***反应疾病提供一个崭新的实验诊断指标，即过敏原特异性IgE(sIgE)抗体独特型异质性。过敏原sIgE抗体独特型异质性强度与患者临床表现或过敏症状的严重程度相关。尤其是涉及过敏原特异性IgE抗体独特型异质性强度在过敏原检测用试剂盒中的应用。

Description

过敏原特异性IgE抗体独特型异质性强度在过敏原检测用试 剂盒中的应用

技术领域

本发明属于临床医学/实验诊断学领域，涉及***反应性疾病的实验诊断，具体是为***反应疾病提供一个崭新的实验诊断指标，即过敏原特异性IgE(sIgE)抗体独特型异质性。过敏原sIgE抗体独特型异质性强度与患者临床表现或过敏症状的严重程度相关。尤其是涉及过敏原特异性IgE抗体独特型异质性强度在过敏原检测用试剂盒中的应用。

背景技术

(1)***反应性疾病

超敏反应是指已致敏的机体，再次遇到相同抗原刺激，引起的病理性或异常的免疫应答。根据临床表现和发生机理不同，超敏反应分为4种类型，其中，Ⅰ型超敏反应由免疫球蛋白E(IgE)介导，肥大细胞和嗜碱性粒细胞参与，多数情况发生迅速，也称之为“速发型”超敏反应。临床医学将Ⅰ型超敏反应称之为“***反应”，带有“异常”之含义，与机体内“正常”的免疫应答相对应。导致***反应的抗原称为“变应原”或“过敏原”，分布极为广泛，包括吸入性过敏原(如各种花粉)、食入性过敏原(禽蛋、牛奶)、某些药物、昆虫毒液等等。***反应可引起过敏性休克、哮喘发作、鼻炎、呕吐、腹痛、局部湿疹、皮疹等等，因***反应引起的疾病，称之为***反应性疾病。***反应性疾病已是一种多发病和常见病，如过敏性鼻炎、过敏性哮喘、过敏性皮疹、过敏性肠胃炎等等。***反应性疾病已发展成为世界性的卫生问题，影响人类的健康，困扰正常生活。免疫球蛋白E是***反应疾病的重要介质，并在此类疾病发生发展过程中发挥重要作用。免疫球蛋白E抗体(IgE)具有亲细胞性，其Fc段与肥大细胞或嗜碱性粒细胞表面受体(FcεR)结合，致使肥大细胞或嗜碱性粒细胞致敏。处于致敏状态的细胞，如遇到相应过敏原，位于细胞表面的IgE抗体，通过可变区(VH/VL)结合相应抗原表位，形成“抗原桥”结果，致使细胞膜发生复杂的级联反应，致敏细胞脱颗粒释放生物活性介质，活性介质作用于靶组织或器官导致临床症状。

(2)常规实验诊断方法

目前，***反应性疾病的诊断依赖于询问病史、皮肤点刺和实验诊断。实验诊断相对简单容易实施，备受临床重视。实验诊断包括血清总IgE水平检测、过敏原特异性IgE(sIgE)水平检测、外周血嗜碱性粒细胞激活试验(BAT)等。

总IgE水平常作为***反应疾病的辅助诊断指标。一般情况，如成人血清总IgE(tIgE)水平大于110IU/ml提示存在***反应的可能性，但不能提示过敏原种类，不能做出临床诊断。过敏原sIgE抗体指针对单一物种的特性抗体，可明确过敏原的种类，临床作为病因学诊断的重要依据。但是，目前临床实验室使用的诊断试剂，检测结果sIgE不能针对到某一特定蛋白(抗原)，一般采用有代表意义的组合蛋白作为捕获抗原，结果代表的是混合抗体。近年来，针对吸入性过敏原和或食入性过敏原，国外学者提倡单一组分诊断(component-resolved diagnostics，CRD)，或分子诊断(molecular diagnostics，MD)，即分别以单一抗原作为捕获抗原，分别与相应抗原的sIgE抗体结合，再通过信号分子标记的抗人IgE抗体进行检测。纵然为分子诊断水平，sIgE也没有深入到最基础的层面。因为，B细胞表面分布的抗原识别受体(mIgM和mIgD)的基本单位是抗原表位，并不是完整的抗原分子。换言之，针对单一蛋白的sIgE抗体同样是一组针对不同表位抗体的混合物。

与tIgE和sIgE检测不同，嗜碱性粒细胞激活试验(basophil activation test，BAT)是基于细胞生物学方法，模拟体内真实的致敏细胞的激活过程，检测对象是结合于细胞表面的“结合型”抗体，即致敏细胞表面的sIgE抗体。更重要的是细胞生物学方法能够鉴别过敏原sIgE抗体与抗原表位的结合能力(亲和性)，高亲和性抗体具有更强的桥联过敏原的能力，显示更高激活嗜碱性粒细胞的病理活性。临床应用表明，BAT能够定量分析嗜碱性粒细胞的活化程度和功能状态，适用于评估特异性脱敏治疗效果、或接触疑似食物风险等等。

(3)常规实验诊断缺陷

无论tIgE，还是sIgE，检测方法均依赖于抗原-抗体特异性结合的测定原理，为免疫化学技术。tIgE是将待检IgE作为一种蛋白，采用“双抗体夹心”模式测定，结果只代表血清IgE的“含量”，并不代表体内真实的“病理活性”。sIgE是将待检sIgE作为抗体检测，采用“已知抗原-待检抗体-标记抗抗体”分析模式检测，结果只代表sIgE抗体的“相对含量”，同样不能代表体内真实的“病理活性”。更重要的是，目前临床使用的sIgE检测产品，不能反映针对表位水平的sIgE抗体的情况，或不能检测到sIgE抗体独特型表位异质性的程度。

BAT是一种能够反映IgE抗体体内病理活性的理想检测方法。但是，细胞生物学试验，需要新鲜外周血并提取白细胞，需要预定时间单独采血。同时，整个检测过程较为复杂，需要流式细胞仪，对操作人员技术要求较高，加之昂贵的检测费用，不适合作为常规检测方法推广使用。

发明内容

有鉴于此，本发明提出一种***反应性疾病的实验诊断新指标，该新指标具体为过敏原sIgE抗体独特型异质性强度，及该指标在试剂盒中的应用。

该异质性强度可通过液相悬浮芯片法进行检测；异质性强度与过敏原sIgE抗体交联过敏原的能力相关，即与过敏原sIgE抗体的生物活性呈正相关。所谓“独特型异质性强度“是指过敏患者血清单一过敏原sIgE抗体，能够识别的此类过敏原中抗原表位的种类数量。

该检测原理如下：液相悬浮芯片采用多种编码的磁性微球作为固相材料，包被链霉亲合素分子(MB-SA)；此种微球携带两种荧光素分子(APC和APC-Cy7)，但荧光强度不同，通过流式细胞仪(FCM)可将不同编码的微球进行区分；由于包被有链霉亲合素，此微球能够结合带有生物素的多肽片段，制备间接包被抗原表位的系列微球。选择某一过敏原(如-乳球蛋白)sIgE抗体作为检测对象，将已明确的抗原表位用人工合成的方式进行合成，并在人工合成过程中将氨基端或羧基端标记生物素分子(Bio-E)；将不同的抗原表位(epitope，E)(多肽片段)分别与不同编码的磁性微球结合，制备出不同抗原表位的磁性微球溶液，此溶液作为R1试剂，R1试剂由一组抗原表位不同，且微球编码不同的溶液组成，表述为R101，R102，R103，R104…R148，R149，可检测49种sIgE抗体的独特型表位。微球具体结构为磁性微球-链霉亲合素-生物素-抗原表位(多肽)，表述为MB(01-49)-SA-Bio-E(01-49)，不同编码的微球等浓度混合。此外，采用藻红蛋白(PE)标记鼠抗人IgE单克隆抗体(PE-Anti-hIgE)作为标记抗体，此标记抗体溶液作为R2试剂。

将一组MB-SA-Bio-E微球溶液(R1)，共同与待检血清(含sIgE抗体温浴，独特型表位各异的sIgE抗体分别与微球表面相应肽段一一结合，形成免疫复合物。采用磁性分离方式，去除未结合血清蛋白组分，再加入标记抗体(PE-Anti-hIgE)溶液(R2)；标记抗体结合微球表面IgE分子，最终形成多肽抗原-待检sIgE抗体-标记抗体复合物。采用磁性分离方式洗涤，去除游离标记抗体。上述溶液用流式细胞仪检测：首先，先通过APC和APC-Cy7的荧光强度，识别并圈选已知编码的微球，不同编码代表不同的抗原表位信息；其次，再观察每一种编码微球是否显示藻红蛋白(PE)的荧光强度，如显示荧光强度其超过设定阈值，说明标本中含有相应抗原表位的sIgE独特型抗体，如显示荧光强度未超过设定阈值，说明标本中没有相应抗原表位的sIgE独特型抗体。最终，计算有多少种微球表面显示藻红蛋白(PE)的荧光，说明患者血清中含有多少种针对此种过敏原的sIgE单克隆抗体(独特型抗体)，其数量即为患者的sIgE独特型抗体异质性强度。

应用上述液相悬浮芯片检测原理可制备过敏原检测用试剂盒，该试剂盒主要包括R1溶液、R2溶液和洗涤缓冲液，具体地，

(1)R1溶液的制备

包括包被SA的不同编码荧光微球(MB)分别与不同生物素标记的抗原表位(E)结合的步骤；具体方法是：荧光微球1ml(浓度为1mg/mL)+Bio-E(浓度为1mg/mL)100μL，混匀后震荡温育1小时，洗涤微球，用荧光微球保存液恢复至原体积。将包被好不同抗原表位的、不同编码的荧光微球按等比例混合，并将微球浓度调整为0.01mg/ml作为工作液，即得R1溶液。

(2)R2溶液的制备

该R2溶液为藻红蛋白(PE)标记鼠抗人IgE单克隆抗体(PE-Anti-hIgE)，该PE-Anti-hIgE的使用浓度为5μL/100μL反应液。

(3)洗涤缓冲液(PBST)由以下原料配制：

最后加0.05％Tween-20

以下对于sIgE独特型抗体的异质性进行具体说明：

(1)sIgE抗体的独特型

抗体的化学本质为免疫球蛋白，过敏相关IgE抗体的是重链为ε的球蛋白。免疫球蛋白具有抗原特异性，分为同种型抗原表位、同种异型抗原表位、和独特型抗原表位。本发明涉及的是独特型抗原表位，简称“独特型表位”。独特型表位(idiotype，ID)是指免疫球蛋白分子可变区(VH/VL)的特定氨基酸序列和所显示的空间构象，决定识别和结合的抗原表位种类。即，独特型表位位于抗体VH/VL区域，代表与相应表位结合强度。抗体分子独特型表位是指由单一B细胞克隆产生免疫球蛋白、VH/VL显示的独特抗原特异性。独特型表位异质性强度指过敏患者所含有、针对单一表位的、过敏原sIgE抗体的数量，或者是食物过敏原活化体内B细胞克隆数量。每种B细胞克隆含有单一抗原受体(BCR)，分泌的免疫球蛋白具有相同的独特型抗原特异性。本发明中sIgE抗体的独特型指免疫球蛋白E(IgE)CH/VL具有的特定氨基酸序列和其特定空间构象，抗体独特型与抗原表位之间是空间互补关系，相互之间发生特异性结合。用特定的抗原表位(肽段)作为已知便可以检测与之对应的sIgE抗体的独特型。

(2)sIgE独特型的异质性

异质性是一种“差异性”或“多态性”。无论吸入性过敏，还是吸入性过敏，病理机制是一种由特异性IgE抗体介导、肥大细胞和嗜碱性粒细胞参与的病理过程。特异性IgE抗体是***反应的重要介质。特异性IgE抗体是重要实验诊断指标。但是，任何特异性IgE抗体所针对的抗原可以理解为三个层次：针对特定物种的抗体，如牛奶sIgE抗体、或鸡蛋sIgE抗体；针对特定分子(蛋白)的抗体，如牛奶β-LG-sIgE抗体或鸡蛋OVA-sIgE抗体；针对特定抗原表位的抗体，如同是β-LG-sIgE抗体，也是一组针对不同表位抗体的混合物。实际上，抗体识别抗原的基本单位不是完整的抗原分子，而是分布于抗原分子中、决定抗原特异性的特定氨基酸序列，定义为抗原表位(antigen epitope)。不仅如此，抗原表位同样是B细胞和T细胞识别的基本功能和结构单位。因此，无论是吸入性过敏原(花粉、霉菌)，还是食入性过敏原(牛奶、禽蛋)。所谓针对某种食品或花粉的特异性IgE抗体(sIgE)，一定是针对多种蛋白质抗原特异性抗体(分子水平)混合物，同时也是针对不同表位特异性抗体(亚分子水平)的混合物。但是，最本质的、最基础的，特异性IgE抗体(sIgE)一定是针对不同过敏原分子中特定抗原表位的单克隆抗体，每种单克隆抗体是由某一B细胞克隆产生的、具有相同的IgE独特型表位。由于天然蛋白质结构的复杂性，一般含有众多抗原表位，将可能诱导过敏患者产生众多的、独特型不同的sIgE抗体分子，从而构成过敏患者体内sIgE抗体的复杂性。如前文所述，异质性是一种多态性，是一种个体间差异性。过敏原sIgE抗体独特型的异质性是指任何单一过敏原分子(蛋白)所产生的sIgE抗体，在不同过敏患者之间，含有针对抗原表位水平的sIgE抗体分子种类和数量存在较大差异。

(3)导致sIgE独特型异质性的原因分析

导致sIgE抗体独特型异质性的原因，主要内因和外因两个方面因素。在外部因素方面，无论吸入性过敏，还是食入性过敏，导致过敏的物质蛋白组成非常复杂，多数不是单一蛋白。从蛋白分子水平上，复杂的蛋白结构复杂，往往含有众多抗原表位。同时，***反应性疾病具有地域特征，不同环境生态，物种存在某些差异。不同饮食***，还是在抗原表位水平，sIgE抗体独特型存在显著的差异性。

(4)检测sIgE独特型异质性的临床价值

众所周知，过敏患者的临床症状是肥大细胞或嗜碱性粒细胞释放的活性介质所致。组织胺具有扩张毛细血管作用，导致血压降低致使过敏性休克发生，同时也会导致局部水肿，或引起窒息。白三烯具有促进平滑肌收缩、甚至痉挛，致使支气管痉挛，导致哮喘发作，或胃肠道疼痛、呕吐等。然而，导致致敏细胞激活脱颗粒的启动因素是过敏原桥联肥大细胞或嗜碱性粒细胞表面IgE抗体分子。肥大性细胞或嗜碱性粒细胞表面具有IgE抗体Fc段受体(FcR)，IgE具有亲细胞性，二者结合致使效应细胞致敏。同时，IgE抗体结合细胞表面受体，与IgE抗体特异性无关。但是，细胞表面IgE抗体的“桥联抗原”过程，则与IgE抗体与抗原表位的亲和力、以及IgE抗体可能结合的抗原表位的数量和性质密切相关。如不考虑亲和力因素，致敏细胞表面的sIgE抗体独特型的种类越多，或独特型表位的异质性越强，与过敏原分子上抗原表位结合的机会则越多，形成“抗原桥”的几率就越高，致敏细胞越容易激活，相应脱颗粒释放介质的程度越强。为此，我们认为过敏原sIgE抗体独特型表位的异质性，与患者体内sIgE抗体的病理活性相关，与患者的过敏症状或临床表现密切相关。为此，本申请提出“sIgE抗体独特型异质性”，作为一种新的、能够反映sIgE抗体病理活性的、与患者过敏症状或临床表现密切相关的实验诊断指标或实验诊断方法。此外，最新研究表明，过敏患者的临床症状与患者血清中sIgE抗体所识别的表位数量和种类密切相关。这些报道也进一步证实我们上述论断。

相对于现有技术，本发明具有以下优势：

首次提出过敏原sIgE抗体独特型表位异质性问题，且异质性强度与sIgE介导的致敏细胞活化、释放生物介质引起临床症状相关。过敏原sIgE抗体独特型表位异质性强度，异质性强度反映sIgE抗体病理活性，有望作为反映患者临床症状的创新指标，并可应用于过敏性检测试剂盒。不同于临床常规的过敏原sIgE抗体检测，其临床价值可等同于外周血嗜碱性粒细胞激活试验(BAT)，与外周血BAT检测结果具有很好的相关性。

附图说明

图1外周血嗜碱粒细胞的圈选；

图2外周血嗜碱粒细胞接受牛奶过敏原刺激后活化百分比；

注：图2中每例患者均进行阴性对照、阳性对照检测，证明结果可靠性，再根据实验组的结果判定结果，左侧为对牛奶敏感者，右侧为对牛奶不敏感患者，二者阴性对照管均未发生CD63表达，相反，阳性对照管的细胞均发生一定比例的CD63表达，说明实验成立；此时，计数测定管细胞CD63的表达比例，即为待检患者嗜碱性粒细胞被β-乳球蛋白的激活程度；

图3为实施例3与对比例1结果相关性分析。

具体实施方式

除有定义外，以下实施例中所用的技术术语具有与本发明所属领域技术人员普遍理解的相同含义。以下实施例中所用的试验试剂，如无特殊说明，均为常规生化试剂；所述实验方法，如无特殊说明，均为常规方法。

本发明中“独特型”指抗体分子可变区(VH/VL)特定的氨基酸序列和结构、所表现的免疫球蛋白抗原特异性，表现为抗体识别的抗原表位不同。本文中“独特型异质性”是指同一种过敏原、不同个体间，过敏原sIgE抗体独特型表位(针对同一过敏原、不同抗原表位sIgE抗体)的种类数量存在的显著差异性。

下面结合实施例来详细说明本发明。

实施例1试剂盒的制备

试剂盒主要含有R1溶液、R2溶液和洗涤缓冲液，具体地制备方法如下：

(1)R1溶液的制备

包括包被SA的不同编码荧光微球(MB，购自默克公司)分别与不同生物素标记的抗原表位(E)结合的步骤；具体方法是：荧光微球1ml(浓度为1mg/mL)+Bio-E(浓度为1mg/mL)100μL，混匀后震荡温育1小时，洗涤微球，用荧光微球保存液恢复至原体积。将包被好不同抗原表位的、不同编码的荧光微球按等比例混合，并将微球浓度调整为0.01mg/ml作为工作液，即得R1溶液。

(2)R2溶液的制备

该R2溶液为藻红蛋白(PE)标记鼠抗人IgE单克隆抗体(PE-Anti-hIgE，购自美国biolegend公司)，该PE-Anti-hIgE的使用浓度为5μL/100μL反应液。

(3)洗涤缓冲液(PBST)由以下原料配制：

最后加0.05％Tween-20

实施例2实施例1中试剂盒的使用过程的检测方法

检测步骤如下：

(1)稀释血清样本用0.01M pH 7.2磷酸盐缓冲液(含5％牛血清白蛋白)按1:10稀释血清样本，如180μL缓冲液+20μL血清；

(2)将25μL1:10稀释的血清样本，100μL与间接包被有不同抗原表位的、不同荧光编码的混合试剂1，加入96孔板中，在平板振荡器上于37℃温浴1h，使待检血清中独特型表位各异的sIgE抗体分别与微球表面相应肽段一一结合，形成免疫复合物；

(3)将96孔板置于磁场上3分钟，弃去上清中未结合的血清蛋白；用洗涤缓冲液洗涤三次后，弃上清加100μL磷酸盐缓冲液(同上)重悬免疫复合物；

(4)加入5μL藻红蛋白(PE)标记鼠抗人IgE单克隆抗体(PE-Anti-hIgE)即试剂2，在平板振荡器上于37℃继续温浴0.5h，标记抗体结合微球表面sIgE分子，形成多肽抗原-待检sIgE抗体-PE标记抗体复合物；

(5)将96孔板置于磁场上3分钟，弃去上清中游离标记抗体，洗涤缓冲液洗涤三次后，200μL磷酸盐重悬荧光微球；

(6)流式细胞仪检测

流式中最重要的图谱有三个点图：一个是前向角散射光FSC对侧向角散射光SSC点图；一个是微球荧光APC对APC-Cy7的双荧光点图；另一个是圈选特定荧光编码的微球PE强度与相应细胞数量的单参数柱状图。通过“零管”在FSC/SSC点图中调节电压，每次检测前均用FlowCheck荧光微球(Beckman Coulter)校准仪器。在FSC/SSC点图中，找到荧光微球的位置，并以此确定分析门，然后在APC/APC-Cy7点图中射门(圈选)，只分析门内的信号，根据APC和APC-Cy7的荧光强度，找到01-49不同荧光微球的位置，同时记录不同荧光微球的PE强度，设定PE荧光强度阈值为10²，超过阈值即为PE阳性。

检测结果分析：

PE荧光强度超过设定阈值，说明标本中含有相应抗原表位的sIgE独特型抗体，反之则没有。统计每个血清样本所识别的抗原表位数量及种类，即得“独特型异质性强度”。

实施例3应用实施例1中试剂盒及实施例2中检测方法检测牛奶过敏原β-乳球蛋白sIgE独特型表位异质性强度

检测过程如下：

(1)选定抗原表位的信息如下：

表：选定β-乳球蛋白抗原表位氨基酸序列

将氨基端标记生物素分子(Bio-E)，委托上海吉尔生化化学合成此8条多肽。

(2)标记：购买包被SA的8种不同编码荧光微球(MB 01-08)，各取1mL(浓度为1mg/mL)加入EP管，再分别加入100μL(浓度为1mg/mL)上述生物素标记的抗原表位，37度震荡温育1h。通过磁场除去未结合的多肽，PBST洗涤三次后，用荧光微球保存液恢复至原体积，即为不同抗原表位的磁性微球溶液。

(3)混合：将上述不同磁性微球溶液等比例混合，此溶液工作浓度为0.01mg/ml，即原溶液稀释100倍，即为试剂1。

(4)反应：取100μL试剂1加入96孔板，再加入25μL血清样本(1:10)，37度震荡温育1h，即形成sIgE抗体-表位复合物。通过磁场除去未结合的血清蛋白，PBST洗涤三次后，100μL PBS重悬。

(5)抗体染色：根据说明书加入5μL藻红蛋白(PE)标记鼠抗人IgE单克隆抗体(PE-Anti-hIgE)即试剂2，37度震荡温育0.5h，标记抗体结合微球表面sIgE分子，最终形成多肽抗原-待检sIgE抗体-标记抗体复合物。通过磁场除去未结合的标记抗体，PBST洗涤三次后，200μL PBS重悬。

(6)流式细胞仪检测PE阳性磁球的百分比：在FSC/SSC点图中，找到荧光微球的位置，并以此确定分析门。然后，在APC/APC-Cy7点图中射门，只分析门内的信号，根据APC和APC-Cy7的荧光强度，找到01-08不同编码荧光微球的位置。每次检测前均用FlowCheck荧光微球(Beckman Coulter)校准仪器。最后，选定特定编码荧光微球，逐一检测八种荧光微球表面，标记抗体(PE)的荧光强度，分布采用单参数方式显示不同PE强度下的荧光微球数量。统计每个待检血清标本，在八种编码荧光微球中，能检测出多少种微球显示PE荧光信号，即说明此标本中含多少种乳球蛋白的sIgE抗体的独特型。

结论分析：

本次共检测30例标本，结果如下表所示。

对比例1外周血特异性过敏原嗜碱粒细胞激活试验(BAT)检测牛奶过敏原β-乳球蛋白实验过程

特异性过敏原嗜碱粒细胞激活试验(basophil activation tests,BATs)使用特异性过敏原激发外周血嗜碱粒细胞活化并脱颗粒，采用流式细胞术(Flow cytometry,FCM)，通过荧光标记特异性抗体识别嗜碱粒细胞活化的标志物(CD63)，定量分析活化嗜碱粒细胞数量，可反映嗜碱粒细胞的活化程度和脱颗粒状态，对诊断过敏性疾病有重要价值。

【实验原理】

过敏患者体内嗜碱粒细胞处于致敏状态，即嗜碱粒细胞表面已结合特异性IgE分子；此时，致敏细胞如遇到相应过敏原，细胞表面的抗体与过敏原结合形成“抗原桥”，激发致敏细胞活化，细胞表面高度表达CD63分子。本实施例将待检患者的外周血与β-乳球蛋白(Bos d 5)溶液混合温育。如患者对β-乳球蛋白过敏，则嗜碱粒细胞活化并表达CD63分子；加入抗CD63-FITC/抗CD123-PE/抗HLA-DR PerCP荧光标记抗体并温育，离心弃上清，用流式细胞仪分析，通过设门选定嗜碱粒细胞(CD123⁺、HLA-DR^-)，根据是否表达CD63分子，即可判断待检患者嗜碱粒细胞被牛奶活化的百分比。

【主要试剂与器材】

1.待检样本新鲜(4小时内)外周血，EDTA或肝素抗凝。

2.荧光标记抗体异硫氰酸荧光素(FITC)标记的抗人CD63抗体，藻红蛋白(PE)标记的抗人CD123抗体、多甲藻叶绿素蛋白(PerCP)标记的抗人HLA-DR抗体。

3.β-乳球蛋白用于刺激嗜碱粒细胞。同时包括阳性对照(羊抗人IgE抗体)和阴性对照缓冲液(PBS)。

4.一般试剂溶血剂，溶血剂用于溶解红细胞，如BD FACS^TMLysing Solution；20mMEDTA；0.5％多聚甲醛(PFA)。

5.流式细胞仪、温箱、微量加样器、试管、流式管等。

【操作方法】

1.测定管：加入20μl含β-乳球蛋白(10ng/ml,用PBS配制)到1ml EP管的底部；阴性对照管：加入20μl PBS，不含过敏原；阳性对照管：加入20μl羊抗人IgE抗体(5μg/ml)，含NFormyl Met Leu Phe(N-formyl-methionyl-leucyl-phenylalanine)。

2.加入100μl新鲜全血(EDTA抗凝)到各管中，37℃涡旋的水浴10～15分钟。

3.温育后立即转移到冰浴中停止脱颗粒，加入10μl 20mM EDTA在室温放置5分钟。

4.将各管离心，小心弃上清。

5.各管依次加入20μl抗CD63-FITC、抗CD123 PE和抗HLA-DR PerCP抗体(抗体最终浓度为5μg/ml)，暗室涡旋冰浴20分钟或者室温15分钟。

6.各管加入2ml 1×BD FACS^TMLysing Solution溶解样品，室温作用15分钟。

7.样品300×g离心5分钟，弃上清，用1ml含1％BSA磷酸盐缓冲液(PBS)洗涤1次。

8.离心后弃上清，加入0.3ml 0.5％多聚甲醛(PFA)重悬样品。

9.在488nm通过BD FACS^TM流式细胞分析仪依次分析上述样本。

【结果判定】

样本经流式细胞分析仪分析并采集数据后进行如下分析：

首先，根据侧向角散射光信号(SSC)、CD123-PE和HLA-DR-PerCP荧光信号设门，选定嗜碱粒细胞群，即侧向角散射光信号低于阈值，且CD123⁺、HLA-DR^-。如图1所示。

其次，根据CD63-FITC荧光信号，确定此标本在β-乳球蛋白刺激情况下，嗜碱粒细胞的激活情况，采用CD123-PE和CD63-FITC双参数作图并计算活化百分比。如图2所示。

实施例3与对比例1结果相关性分析

实施例3中共检测30例β-乳球蛋白过敏患者，对比例1中BAT实验采用β-乳球蛋白作为刺激过敏原。将患者血清能够识别的抗原表位数量和BAT实验活化细胞百分数进行相关分析，相关系数(r)＝0.82，说明二者具有相关性，如图3所示。

以上所述仅为本发明的较佳实施例而已，并不用以限制本发明，凡在本发明的精神和原则之内，所作的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。

Claims (6)

1.过敏原特异性IgE抗体独特型异质性强度在过敏原检测用试剂盒中的应用。

2.根据权利要求1所述的应用，其特征在于，所述独特性异质性强度与与过敏原sIgE抗体的生物活性呈正相关。

3.根据权利要求1所述的应用，其特征在于，所述试剂盒包括R1溶液、R2溶液和缓冲溶液；

所述R1溶液的制备方法包括包被SA的不同编码荧光微球分别与不同生物素标记的抗原表位(E)结合的步骤；

所述R2溶液为藻红蛋白(PE)标记鼠抗人IgE单克隆抗体。

4.根据权利要求3所述的应用，其特征在于，R1溶液的制备步骤如下：荧光微球1ml(浓度为1mg/mL)+Bio-E(浓度为1mg/mL)100μL，混匀后震荡温育，洗涤微球，用荧光微球保存液恢复至原体积；将包被好不同抗原表位的、不同编码的荧光微球按等比例混合，并将微球浓度调整为0.01mg/ml作为工作液，即得R1溶液。

5.根据权利要求3所述的应用，其特征在于，R2溶液的使用浓度为5μL/100μL反应液。

6.根据权利要求1-5所述的应用，其特征在于，所述试剂盒的检测过敏原的方法为液相悬浮芯片法。

Images