CN110760481A - 一种改良rpmi1640培养基及其应用 - Google Patents

一种改良rpmi1640培养基及其应用 Download PDF

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Abstract

本发明提出了一种改良RPMI1640培养基，改变了RPMI1640培养基中的氯化钠和氯化钾浓度。与RPMI1640培养基相比，本发明培养基在培养CAR‑T细胞时，能保持CAR‑T细胞的正常增殖，同时能降低CAR‑T细胞的耗竭，增强其抗肿瘤活性，具有良好的应用前景。

Description

一种改良RPMI1640培养基及其应用
技术领域
本发明涉及生物医学细胞治疗领域，特别涉及一种改良RPMI1640培养基及其应用。
背景技术
据全球癌症报告统计，以白血病、淋巴瘤、多发性骨髓瘤等为主的血液肿瘤，严重威胁人类的生命健康，位列常见十大恶性肿瘤第八位，且发病率逐年升高。近年来免疫疗法为人类血液肿瘤治疗带来了新的希望，其中，利用基因工程技术改造T细胞，使之能够表达能识别肿瘤抗原的抗体，靶向识别肿瘤细胞，激活T细胞并杀死肿瘤细胞，即嵌合抗原受体T细胞(Chemeric Antigen Receptor T cell，CAR-T)免疫疗法，是近年来最有前景的肿瘤免疫疗法和研究热点。目前，CAR-T细胞免疫疗法在临床血液病中取得了令人振奋的结果，目前已经有两款针对B细胞白血病CD19抗原的CAR-T细胞产品通过FDA审批，用于临床治疗白血病。
CAR-T细胞治疗的主要过程为：从癌症患者外周血中分离免疫T细胞；经过体外的基因改造，制备CAR-T细胞；在体外细胞培养基中进一步扩增CAR-T细胞；将扩增后的CAR-T细胞重新回输给病人体内。
用于CAR-T细胞体外培养的常规培养基是RPMI1640培养基。但是，CAR-T细胞在体外扩增的过程中，T细胞会耗竭，影响T细胞的杀伤能力。
发明内容
有鉴于此，本发明提出了一种改良的RPMI1640培养基，改变了RPMI1640培养基中钾离子和钠离子的浓度，以克服CAR-T细胞体外培养易耗竭的缺陷，提高了CAR-T细胞的杀伤肿瘤的能力。
本发明的技术方案是这样实现的：
第一方面，本发明提供了一种改良RPMI1640培养基，将RPMI1640培养基中的氯化钠浓度调整为53.4-63.4mM，氯化钾浓度调整为45.3-55.3mM，并且钾离子和钠离子的总浓度为108.7mM。
在以上技术方案的基础上，优选的，所述改良RPMI1640培养基包括以下组分：甘氨酸0.133mM、L-精氨酸1.15mM、L-天冬酰胺0.379mM、L-天冬氨酸0.15mM、L-半胱氨酸0.208mM、L-谷氨酸0.136mM、L-丙氨酰谷氨酰胺2.05mM、L-组氨酸0.0968mM、L-羟脯氨酸0.153mM、L-异亮氨酸0.382mM、L-亮氨酸0.382mM、L-赖氨酸盐酸盐0.219mM、L-甲硫氨酸0.101mM、L-苯丙氨酸0.0909mM、L-脯氨酸0.174mM、L-丝氨酸0.286mM、L-苏氨酸0.168mM、L-色氨酸0.0245mM、L-酪氨酸0.111mM、L-缬氨酸0.171mM、生物素0.00082mM、氯化胆碱0.0214mM、D-泛酸钙0.000524mM、叶酸0.00227mM、烟酰胺0.0082mM、对氨基苯甲酸0.0073mM、盐酸吡哆醇0.00485mM、核黄素0.000532mM、盐酸硫胺素0.00297mM、维生素B120.0000037mM、i-肌醇0.194mM、四水硝酸钙0.424mM、七水硫酸镁0.407mM、碳酸氢钠23.81mM、无水磷酸氢二钠5.63mM、氯化钠53.4-63.4mM、氯化钾45.3-55.3mM、D-葡萄糖11.11mM、还原型谷胱甘肽0.00326mM、酚红0.0133mM。
在以上技术方案的基础上，优选的，所述氯化钠浓度为53.4mM，氯化钾浓度为55.3mM。
第二方面，本发明提供了第一方面所述的改良RPMI1640培养基在CAR-T细胞培养中的应用。
第三方面，本发明还提供了一种CAR-T细胞培养的方法，其包括：采用第一方面所述的改良RPMI1640培养基培养CAR-T细胞。
本发明的改良RPMI1640培养基相对于现有技术具有以下有益效果：
(1)本发明的改良培养基通过改变RPMI1640培养基的钾离子浓度，改变CAR-T细胞的代谢环境，使得CAR-T细胞在扩增的过程中处于干细胞的状态，避免其过度激活，减少CAR-T细胞的凋亡，从而提高CAR-T细胞的杀伤功能；
(2)本发明改良培养基仅改变了RPMI1640培养基的钾离子和钠离子浓度，在培养CAR-T细胞时仅在此基础上添加胎牛血清，无需额外再添加多种氨基酸、维生素等生长因子，可使CAR-T细胞保持良好的增殖状态，而且减少其凋亡，提高CAR-T细胞的杀瘤能力，操作简便，效果显著。
附图说明
为了更清楚地说明本发明实施例或现有技术中的技术方案，下面将对实施例或现有技术描述中所需要使用的附图作简单地介绍，显而易见地，下面描述中的附图仅仅是本发明的一些实施例，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动的前提下，还可以根据这些附图获得其他的附图。
图1为本发明不同培养基对CD19-CAR-T细胞培养后的细胞增殖情况；
图2为本发明不同培养基培养的CD19-CAR-T中Fas(CD95)的表达情况；
图3为本发明不同培养基培养的CD19-CAR-T的杀瘤情况。
具体实施方式
下面将结合本发明实施方式，对本发明实施方式中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施方式仅仅是本发明一部分实施方式，而不是全部的实施方式。基于本发明中的实施方式，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施方式，都属于本发明保护的范围。
术语解释：
嵌合抗原受体(CAR)：是CAR-T的核心部件，赋予T细胞人类淋巴细胞抗原(humanlymphocyte antigen，HLA)非依赖的方式识别肿瘤抗原的能力，这使得经过CAR改造的T细胞相较于天然T细胞抗原受体(T cell receptor，TCR)能够识别更广泛的目标。CAR的基础设计中包括一个肿瘤相关抗原(tumor-associated antigen，TAA)结合区(通常来源于单克隆抗体抗原结合区域的scFV段)，一个胞外铰链区，一个跨膜区和一个胞内信号区。目标抗原的选择对于CAR的特异性、有效性以及基因改造T细胞自身的安全性来讲都是关键的决定因素。
CAR-T细胞：嵌合抗原受体T细胞。
CD19-CAR-T：靶向CD19分子的嵌合抗原受体基因修饰的T细胞。
CD3：在免疫学中，CD3(分化簇3)T细胞的共受体是一种蛋白质复合物，它由四个不同的链组成。在哺乳动物中，该复合物含有一个CD3γ链、一个CD3δ链和两个CD3ε链。这些链具有被称为一个分子副T细胞受体(TCR)和ζ-链以产生激活信号的T淋巴细胞。该TCR、ζ链和CD3分子一起构成的T细胞受体复合物。
PBMC(peripheral blood mononuclear cell)：外周血单个核细胞，是指外周血中具有单个核的细胞，包含淋巴细胞、单核细胞等。
本发明的改良RPMI1640培养基中各原料均应是符合美国药典或《国家标准化学试剂》或《中华人民共和国药典》2010年版第二部的超纯或分析纯试剂，以满足临床安全合理的要求。
RPMI1640培养基购自Gibco公司，CD3抗体购自Milteny biotec公司，anti-fas抗体购自Biolegend公司，白介素2(IL-2)购自Peprotech公司，HEK293T细胞和Raji细胞均购自ATCC细胞库，LDH试剂盒购自Sigma公司。CD19 CAR-T的慢病毒质粒由本实验室构建。
下面结合实施例，进一步阐述本发明：
实施例1-实施例3和对比例的培养基组分详见下表：
Figure BDA0002253546800000051
实施例1-实施例3培养基为改良RPMI1640培养基，用MTM1-MTM3表示；对比例为RPMI1640培养基。
上述实施例1-实施例3及对比例中各培养基的制备方法包括：将上述培养基各组分与高纯灭菌水按比例混合，4℃震荡混匀1小时，然后通过0.22μm的滤膜过滤除菌待用。
以下采用实施例1-实施例3及对比例培养基进行的各实验均在三例健康成人的T细胞中进行重复。
PBMC及T细胞的分离：抽取健康成人捐献者的外周血，用Ficoll分离PBMC，之后用anti-CD3磁珠分离T细胞。
CD19-CAR-T细胞的制备方法如下：将CD19-CAR-T的慢病毒质粒转染HEK 293T细胞，5天后收集细胞培养上清，制备慢病毒；用MOI 5:1(慢病毒：T细胞)转染T细胞。
采用实施例1-实施例3及对比例的培养基进行CD19-CAR-T细胞培养，过程如下：将CD19-CAR-T细胞分别用实施例1-实施例3及对比例的培养基重悬，分别同时加入10％的胎牛血清、30ng/mL OKT3抗体及4个同种异体的PBMC(T细胞与PBMC体积比为1:200)，调整CD19-CAR-T细胞的接种密度为1×105cell/mL，放入5％CO2，37℃培养箱中培养。在培养过程中，每隔一天加入200IU IL-2，共培养12天。
对采用实施例1-实施例3及对比例的培养基按照上述步骤培养的CD19-CAR-T细胞进行检测，具体为：
1)取培养6天和12天的细胞，利用台盼蓝染色法进行细胞计数。
2)用anti-Fas抗体染色培养12天的CD19-CAR-T细胞，用流式细胞仪检测其细胞表面死亡受体因子Fas(CD95)的表达率。
3)将培养12天的CD19-CAR-T细胞与培养的白血病Raji细胞按3:1体积比例共同培养，用LDH试剂盒检测并计算CD19-CAR-T细胞的杀瘤率。
试验结果如下：
1)细胞增殖情况
采用实施例1-实施例3及对比例的培养基对CD19-CAR-T细胞培养后的细胞增殖情况见图1，结果显示，相较于RPMI1640培养基，改良培养基MTM1、MTM2和MTM3对CD19 CAR-T细胞的增殖没有影响。
2)Fas(CD95)表达率的检测结果
采用实施例1-实施例3及对比例的培养基培养的CD19-CAR-T中Fas(CD95)的表达情况如图2所示，改良培养基MTM1和MTM2能显著降低CD19-CAR-T细胞表面Fas(CD95)的表达。
3)CD19-CAR-T细胞杀瘤率的检测结果
采用实施例1-实施例3及对比例的培养基培养CD19-CAR-T的杀瘤率如图3所示，经改良培养基MTM1和MTM2培养的CD19 CAR-T与白血病细胞共同培养之后，能显著增强CD19-CAR-T细胞的杀伤肿瘤的能力。
由试验结果可见，相较于RPMI1640培养基，本发明提供的改良RPMI1640培养基在培养CD19-CAR-T细胞时，对CD19-CAR-T细胞的增殖并没有影响，但是能下调CD19-CAR-T细胞表面Fas(CD95)的表达，从而抑制Fas介导的T细胞凋亡，同时还能显著增强CD19-CAR-T细胞的杀伤肿瘤的能力。
以上所述仅为本发明的较佳实施方式而已，并不用以限制本发明，凡在本发明的精神和原则之内，所作的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。

Claims (5)

1.一种改良RPMI1640培养基，其特征在于：所述培养基中的氯化钠浓度为53.4-63.4mM，氯化钾浓度为45.3-55.3mM，并且钾离子和钠离子的总浓度为108.7mM。
2.如权利要求1所述的改良RPMI1640培养基，其特征在于，包括以下组分：甘氨酸0.133mM、L-精氨酸1.15mM、L-天冬酰胺0.379mM、L-天冬氨酸0.15mM、L-半胱氨酸0.208mM、L-谷氨酸0.136mM、L-丙氨酰谷氨酰胺2.05mM、L-组氨酸0.0968mM、L-羟脯氨酸0.153mM、L-异亮氨酸0.382mM、L-亮氨酸0.382mM、L-赖氨酸盐酸盐0.219mM、L-甲硫氨酸0.101mM、L-苯丙氨酸0.0909mM、L-脯氨酸0.174mM、L-丝氨酸0.286mM、L-苏氨酸0.168mM、L-色氨酸0.0245mM、L-酪氨酸0.111mM、L-缬氨酸0.171mM、生物素0.00082mM、氯化胆碱0.0214mM、D-泛酸钙0.000524mM、叶酸0.00227mM、烟酰胺0.0082mM、对氨基苯甲酸0.0073mM、盐酸吡哆醇0.00485mM、核黄素0.000532mM、盐酸硫胺素0.00297mM、维生素B12 0.0000037mM、i-肌醇0.194mM、四水硝酸钙0.424mM、七水硫酸镁0.407mM、碳酸氢钠23.81mM、无水磷酸氢二钠5.63mM、氯化钠53.4-63.4mM、氯化钾45.3-55.3mM、D-葡萄糖11.11mM、还原型谷胱甘肽0.00326mM、酚红0.0133mM。
3.如权利要求1所述的改良RPMI1640培养基，其特征在于：所述氯化钠浓度为53.4mM，所述氯化钾浓度为55.3mM。
4.权利要求1所述的改良RPMI1640培养基在CAR-T细胞培养中的应用。
5.一种CAR-T细胞培养的方法，其特征在于：采用权利要求1所述的改良RPMI1640培养基培养CAR-T细胞。
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