CN110760445B - 一种植物乳杆菌发酵液的常温保存方法 - Google Patents

Abstract

本发明属于微生物领域，涉及一种植物乳杆菌发酵液常温保存方法。主要步骤如下：将植物乳杆菌、假丝酵母、光合细菌分别单独发酵，之后分别将发酵后的植物乳杆菌、假丝酵母、光合细菌发酵液按比例混合，将混合液加入一定比例的柠檬酸钠固体粉剂，制备保存母液，最后利用无菌水将母液稀释后获得保存液，瓶装密闭保藏，上述保存方法在液体植物乳杆菌中添加柠檬酸钠作为缓释碳源，并添加了酵母菌及光合细菌发酵液，有效地提高了植物乳杆菌的存活率，该方法涉及物料简单，操作方便，在农业领域具有良好的前景。

Description

一种植物乳杆菌发酵液的常温保存方法

技术领域

本发明涉及微生物技术领域，具体提供了一种植物乳杆菌发酵液的常温保存方法。

背景技术

植物乳杆菌是一类能利用碳水化合物产生大量乳酸的无芽孢、***的通称。功能性植物乳杆菌可调节肠道微生物菌群，减少有害菌的生长。研究表明，植物乳杆菌可以提高人体免疫力，增强人体抵抗力，减少疾病的发生。

由于植物乳杆菌属为无芽孢细菌，且代谢产酸，因此在发酵结束后容易大量死亡。植物乳杆菌单菌的常温保存依然属于行业难题，目前，没有理想的保护措施，因此，只能以低温(4℃)或者以固体粉剂的形式保藏。低温冷藏可更大限度的保持菌量，CN 103820323 A名称为一种提高液体植物乳杆菌存活率的保存方法，其中公开了一种专利保藏技术，该技术采用柠檬酸钠作为保护剂，保存温度必须为4-5℃，30d存活率仍为100％。该方法需要保冷设备，保存成本高。植物乳杆菌固体保存工艺相对成熟，工艺复杂，技术要求更高，需要添加固体保护剂后低温冷冻干燥，制作成干粉后，仍然需要对干粉进行低温保藏。固体保存可最大限度的保持菌量，但保存成本也大大提高。

对于以功能性为主的农业领域，上述保藏方法无疑大大增加了使用成本，因此，需要寻找一种较为廉价的保藏方式。

发明内容

本发明针对上述技术存在的空白，提供了一种植物乳杆菌发酵液常温保存方法，主要步骤如下：将植物乳杆菌、假丝酵母、光合细菌分别单独发酵，之后分别将发酵后的植物乳杆菌、假丝酵母、光合细菌发酵液按比例混合，将混合液加入一定比例的柠檬酸钠固体粉剂，制备保存母液，最后利用无菌水将母液稀释后获得保存液，瓶装密闭保藏，上述保存方法在液体植物乳杆菌中添加柠檬酸钠作为缓释碳源，并添加了酵母菌及光合细菌发酵液，有效地提高了植物乳杆菌的存活率实现了液体植物乳杆菌的常温保存和运输，该方法涉及物料简单，操作方便，在农业领域具有良好的前景。

本发明的具体技术方案如下：

一种植物乳杆菌发酵液常温保存方法，主要步骤如下：

(1)将植物乳杆菌、假丝酵母、光合细菌分别发酵培养；

(2)分别将发酵后的植物乳杆菌、假丝酵母、光合细菌发酵液按比例混合，将混合液加入一定比例的柠檬酸钠固体粉剂，制备保存母液；

(3)利用无菌水将母液稀释后获得保存液，瓶装密闭保藏。

所述步骤(1)中的植物乳杆菌发酵培养基配方按重量百分比为：红糖6-8％，糖蜜8-10％，酵母浸粉或酵母膏0.1-0.3％，蛋白胨0.1-0.2％，磷酸二氢钾0.04-0.1％，用水定容至相应体积，氢氧化钠调节pH至6.5-6.8；

所述植物乳杆菌的发酵方法利用发酵罐发酵，分为种子制备和发酵罐发酵两步完成，种子制备利用MRS培养基或上述培养基35-37℃静置培养24h获得，按1-2％(V/V)比例将种子液转接进入发酵罐发酵，发酵罐内转速100-150rpm之间，35-37℃，0.05MPa保压40-48小时。

所述步骤(1)中的植物乳杆菌发酵液的发酵终点为pH≤3.5，菌量30-50亿cfu/mL；

所述步骤(1)中的假丝酵母发酵培养基配方按重量百分比为：葡萄糖2-3％，酵母粉1-2％，蛋白胨2-3％，硫酸镁0.1-0.2％，磷酸二氢钾0.5-1％，用水定容至相应体积。

所述步骤(1)中的假丝酵母利用发酵罐发酵，发酵温度28-30℃，罐压0.05MPa，转速150-180rpm，调节通气量，控制溶氧≥20％。

所述步骤(1)中的假丝酵母为乙醇假丝酵母，采用稀释涂布平板法计数发酵液的菌量为5-10亿cfu/mL。

所述步骤(1)中光合细菌的培养基为光合细菌专用培养基，配制方法如下：

①基础培养基配方按重量百分比为：柠檬酸0.1-0.2％，牛肉膏0.15-0.2％，酵母膏0.1-0.3％，蛋白胨0.1-0.2％，乙酸钠0.1-0.3％，七水硫酸镁0.03-0.04％，硫酸亚铁0.001-0.05％，氯化钙0.02-0.03％，磷酸二氢钾0.02-0.04％(单独灭菌)，用水定容至相应体积并调节pH 6.8-7.0；

②微量元素溶液配方按重量百分比为：EDTA 0.05-0.1％，硫酸亚铁0.02-0.05％，硫酸锌0.001-0.003％，硼酸0.003-0.005％，氯化锰0.0003-0.0005％，氯化钙0.002-0.005％，氯化铜0.0001-0.0004％，钼酸钠0.0003-0.0008％。在酸性条件下(用稀硫酸调pH至5-6)配置，用水定容至相应体积；

③复合维生素溶液配方按重量百分比为：生物素0.01-0.03％，烟酸0.035-0.05％，盐酸硫胺0.03-0.1％，VB6 0.01-0.05％，VB12 0.005-0.025％，用水定容至相应体积；

基础培养基、微量元素溶液和复合维生素溶液按上述配方配制后121℃高温灭菌20min，微量元素溶液和复合维生素溶液冷却后均按照1mL/L的量与基础培养基混匀；

光合细菌采用10L透明PET塑料桶，按30-50％(V/V)接种量进行菌种转接，35-37℃，1000-3000LUX条件下培养7-10d，利用MPN5法检测发酵后菌量；

所述步骤(1)中的光合细菌为沼泽红假单胞菌,发酵液的菌量为30-50亿个/mL；

为了达到保藏效果，植物乳杆菌的发酵配方为红糖糖蜜培养基，该培养基中主要以碳源为主，更利于植物乳杆菌的保藏，同时，该培养基成本较低；酵母发酵培养基以及光合细菌培养基为优化后的配方，利用该配方培养，能够提高发酵液最终的菌量，使发酵菌量达到最优。

所述步骤(2)中的植物乳杆菌、假丝酵母、光合细菌发酵液按照7:2:1的体积比进行混合。

所述步骤(2)中的柠檬酸钠添加比例为1-2％(W/V)；

所述步骤(3)中的所述无菌水为灭菌后自来水或蒸馏水；

所述步骤(3)中的无菌水将母液稀释的倍数为3-4倍；

所述步骤(3)中的保藏温度为20-28℃，经检测，60d后植物乳杆菌的存活率为20-30％。

可见本发明提供的方法有效提高植物乳杆菌的存活率，降低植物乳杆菌保藏成本。

本申请的上述技术方案中，首先填补了本领域的技术空白提供了一种全新的植物乳杆菌发酵液常温保存方法，其中采用的柠檬酸钠对发酵液的pH起到一个比较明显的缓冲效果，给植物乳杆菌提供一个较高的pH环境，利于植物乳杆菌的二次繁殖，同时，柠檬酸钠也可以作为缓效碳源为植物乳杆菌的繁殖提供营养；

而采用假丝酵母、光合细菌作为伴生菌则起到了如下的作用：

加入的酵母为乙醇假丝酵母，该酵母可以耐受较低的pH环境，同时，基本无胀气现象，是一株良好的植物乳杆菌共生菌株。而植物乳杆菌与酵母菌能够共存于一个体系中，是因为酵母菌在发酵过程为植物乳杆菌提供了肽类、酶类、氨基酸及维生素等营养因子。

光合细菌发酵液作为增效因子，大大延长了植物乳杆菌的存活率。光合细菌可能在两方面发挥作用，一是光合细菌本身在厌氧条件下利用硫化氢、硫代硫酸盐、分子氢或其他还原剂,把二氧化碳还原成有机物，降低保藏液中有害物质；二是提供植物乳杆菌保藏过程中的营养功能，研究表明,光合细菌的菌体无毒,是一种营养价值较高而其营养组分又较齐全的细菌。干菌体蛋白质含量高达60％以上,并且含有各种比例适宜的氨基酸,而且富含各种族维生素、促生长因子、辅酶和抗病毒因子等生理活性物质。光合细菌发酵液中也包含了大量的微量元素及其他营养物质，大大提高了保藏液中营养。

本发明所提供的保藏方式为混菌保藏法，后期无法实现植物乳杆菌的单独分离，因此只能作为复合益生菌使用，该方法虽然加入了酵母菌、光合细菌，但该两株菌主要体现其营养功能，但其优势菌株依然为植物乳杆菌，因此发酵液的功能性未发生改变。同时，该方法所采用的酵母菌、光合细菌为农业领域常用益生菌株，在养殖水中可降低氨氮、降低亚硝酸盐，在发酵饲料中可提高饲料营养，改善饲料风味等等。因此，该方法在农用菌剂方面可大面积推广应用。

综上，本申请提供了一种植物乳杆菌发酵液常温保存方法，填补了本领域的空白，最终获得了以植物乳杆菌为优势菌株的复合益生菌，较之单一的乳杆菌固体菌剂有更好的应用效果，同时较之固体菌剂的制备，大大节省了设备投入和制备时间。

附图说明

图1为常温28℃条件下植物乳杆菌保存时间与菌量变化示意图；

图2为乙醇假丝酵母对植物乳杆菌存活率的影响示意图；

图3为光合细菌对植物乳杆菌存活率的影响示意图。

具体实施方式

以下通过实施例形式的具体实施方式，对本发明的上述内容做进一步的详细说明，但不应将此理解为本发明上述主题的范围仅限于以下的实例。凡基于本发明上述内容所实现的技术均属于本发明的范围，除特殊说明外，下述实施例中均采用常规现有技术完成。

实施例1常温28℃条件下保存周期

本实施例在于说明密闭条件下，不同稀释倍数的保藏液保存周期，对照组为发酵液自然pH，处理1为发酵液未稀释保存母液，处理2为稀释4倍条件下的保存液，具体操作如下：

(1)利用发酵罐发酵植物乳杆菌，按1-2％(V/V)比例将种子液转接进入发酵罐发酵，发酵罐内转速100rpm，35℃，0.05MPa保压40小时，发酵终点为pH 3.5，菌量30亿cfu/mL。

(2)乙醇假丝酵母利用发酵罐发酵，发酵温度28℃，罐压0.05MPa，转速180rpm，调节通气量，控制溶氧≥20％，发酵液的菌量10亿cfu/mL。

(3)光合细菌采用10L透明PET塑料桶，按30％接种量进行菌种转接，35℃，3000LUX条件下培养7d，利用MPN5法检测发酵后菌量为30亿个/mL。

(4)将三种发酵液按体积比7:2:1混合，并按2％(W/V)的比例加入柠檬酸钠，制备保存母液；

(5)取500mL植物乳杆菌发酵液置于塑料瓶内，拧紧瓶盖，记为对照组，取500mL保存母液置于塑料瓶内，拧紧瓶盖，记为处理1，将保存母液用灭菌自来水稀释4倍后，制备保存液，取500mL保存液置于塑料瓶内，拧紧瓶盖，记为处理2；

(6)将3组处理置于28℃培养箱内，培养60d，每7-10d检测菌量变化。

表1常温28℃条件下植物乳杆菌保存时间与菌量变化

0d

7d

15d

22d

30d

40d

50d

60d

对照

100％

11.66％

1.72％

0.28％

0

处理1

100％

217.95％

68.94％

13.79％

3.59％

0

处理2

100％

326.74％

360.47％

186.05％

120％

84.55％

35.77％

22.75％

如图1及表1所示，对照组植物乳杆菌存活率下降最快，这主要与发酵液中pH太低有关，同时，缺乏可利用的碳源，造成菌量急速下降。处理1前期菌量下降较慢的原因一是柠檬酸钠不仅提高了保存母液的pH，而且提供了有效的碳源。但保存后期菌量迅速下降是由于母液中植物乳杆菌代谢迅速，瓶内有机酸积累，同时，酵母菌活动产生了大量的二氧化碳，造成瓶内压力增加，造成植物乳杆菌菌量下降迅速。处理2经过稀释后初始菌量较低(约5.5亿cfu/mL)，为植物乳杆菌提供了生长的空间，保存60d后存活率为20％以上。

实施例2乙醇假丝酵母的有益效果

本实施例在于说明乙醇假丝酵母的有益效果。试验设置3个处理组，对照组为发酵液自然pH，处理1为植物乳杆菌发酵液与乙醇假丝酵母菌体混合液，混合比例按7：3(V/V)；处理2为植物乳杆菌发酵液与乙醇假丝酵母发酵液混合液，混合比例按7：3(V/V)。具体实验设计如下：

(1)利用发酵罐发酵植物乳杆菌，按1-2％比例将种子液转接进入发酵罐发酵，发酵罐内转速120rpm，35℃，0.05MPa保压45小时，发酵终点为pH 3.4，菌量40亿cfu/mL。

(2)乙醇假丝酵母利用发酵罐发酵，发酵温度30℃，罐压0.05MPa，转速150rpm，调节通气量，控制溶氧≥20％，发酵液的菌量5亿cfu/mL。

(3)取500mL植物乳杆菌发酵液置于塑料瓶内，拧紧瓶盖，记为对照组，取350mL植物乳杆菌发酵液与150mL乙醇假丝酵母菌体(5000rpm离心10min后，等体积生理盐水重悬)置于塑料瓶内，拧紧瓶盖，记为处理1，取350mL植物乳杆菌发酵液与150mL乙醇假丝酵母发酵液置于塑料瓶内，拧紧瓶盖，记为处理2，将3组处理分别加入1％(W/V)柠檬酸钠，置于28℃培养箱内，培养30d，每7天检测菌量变化。

表2乙醇假丝酵母对植物乳杆菌存活率的影响

	0d	7d	15d	22d	30d
						对照	100％	20.50％	0
处理1	100％	218.42％	17.11％	1.84％	0.36％
						处理2	100％	387.78％	31.11％	3.22％	0.77％

上表和图2结果表明，与对照组相比，处理1加入乙醇假丝酵母菌体大大提高了植物乳杆菌存活率，证明了乙醇酵母在植物乳杆菌保藏过程中具有保护效果。处理2中，乙醇假丝酵母发酵液中除了菌体外，还含有部分营养成分，处理2的植物乳杆菌存活率略高于处理1。

实施例3光合细菌的增效效果

本实施例在于说明光合细菌在植物乳杆菌保存过程中的增效效果，试验的设计对照组为发酵液自然pH，处理1为植物乳杆菌发酵液与乙醇假丝酵母发酵液混合液，混合比例按7：3(V/V)。处理2为植物乳杆菌未稀释的保存母液。

试验设计如下：

(1)利用发酵罐发酵植物乳杆菌，按2％比例将种子液转接进入发酵罐发酵，发酵罐内转速150rpm，37℃，0.05MPa保压48小时，发酵终点为pH 3.3，菌量50亿cfu/mL。

(2)乙醇假丝酵母利用发酵罐发酵，发酵温度28℃，罐压0.05MPa，转速180rpm，调节通气量，控制溶氧≥20％，发酵液的菌量10亿cfu/mL。

(3)光合细菌采用10L透明PET塑料桶，按30％接种量进行菌种转接，35℃，3000LUX条件下培养10d，利用MPN法检测发酵后菌量为40亿个/mL。

(4)取500mL植物乳杆菌发酵液置于塑料瓶内，拧紧瓶盖，记为对照组，取350mL植物乳杆菌发酵液与150mL乙醇假丝酵母发酵液置于塑料瓶内，拧紧瓶盖，记为处理1。取350mL植物乳杆菌发酵液、100mL乙醇假丝酵母发酵液和50mL光合细菌发酵液置于塑料瓶内，拧紧瓶盖，记为处理2，将3组处理分别加入1％(W/V)柠檬酸钠，置于28℃培养箱内，培养30d，每10天检测菌量变化。

表3光合细菌对植物乳杆菌存活率的影响

上表和图3结果说明，光合细菌发酵液作为增效因子，可提高植物乳杆菌的存活率。

发明人需要特别说明的是，实施例2和3是为了验证乙醇假丝酵母和光合细菌在本申请中的效果，而设定的专用实验条件，最终保存并培养时并未进行稀释，因此其结果所示的存活率较之本申请的实际技术方案低，这是合理的，这是由于未按本申请的技术方案实施，菌株之间难以起到更好的协同作用，同时证明了本申请的技术方案中稀释这一步骤对于整个技术方案也是有明显的作用的。

应用例 混合保藏条件下的车间生产应用

对以上植物乳杆菌保存工艺，进行了车间生产，具体方法如下：

1、植物乳杆菌发酵工艺

(1)按红糖6％，糖蜜10％，酵母浸粉(或酵母膏)0.2％，蛋白胨0.2％，磷酸二氢钾0.04％，用水定容制备种子培养基，用氢氧化钠调节pH至6.5-6.8。121℃灭菌20min，冷却后，接入植物乳杆菌，35℃培养12h获得种子液。

(2)50L发酵罐培养

①50L发酵罐按照操作方法进行空气滤芯灭菌，空消等操作。

②称取红糖1.8kg，磷酸二氢钾12g，蛋白胨30g，酵母粉30g，糖蜜3kg，消泡剂10mL加入到适量的水中，融化后定容至30L，用2mol/L氢氧化钠调节pH至6.8，后全部转移至50L发酵罐内。

③0.13MPa实消30min，待温度降到38℃后接种。

④100rpm，37℃保温，0.05MPa保压48小时。

⑤发酵终点：pH 3.4，检测植物乳杆菌量45亿cfu/mL。

2、乙醇假丝酵母发酵工艺

(1)以葡萄糖3％，酵母粉1％，蛋白胨2％，硫酸镁0.1％，磷酸二氢钾0.5％。制备酵母种子液培养基。

(2)50L发酵罐培养

①50L发酵罐按照操作方法进行空气滤芯灭菌，空消等操作。

②称取蛋白胨0.6kg，酵母粉0.3kg，葡萄糖0.6kg，消泡剂15mL，融化后定容至30L，用2mol/L氢氧化钠调节PH至6.8，后全部转移至50L发酵罐内。并完成实消操作。

③初始控制：温度30℃，罐压0.05MPa，起始转速150rpm，空气1：1。

④中间控制：温度30℃，罐压0.05MPa，溶氧≧20％，发酵6h左右，开始取样镜检。

⑤发酵终点：发酵结束后酵母菌菌量为5亿cfu/mL。

3、光合细菌发酵液制备

(1)种子液制备

基础培养基：柠檬酸0.1％，牛肉膏0.15％，酵母膏0.1％，蛋白胨0.1％，乙酸钠0.1％，硫酸镁(七水硫酸镁)0.03％，硫酸亚铁0.001％，氯化钙0.02％，磷酸二氢钾0.02％(分消)pH6.8-7.0。

复合无机盐：EDTA 0.5g/L,硫酸亚铁0.2g/L，硫酸锌0.01g/L，硼酸0.03g/L，氯化锰0.003g/L，氯化钙0.02g/L，氯化铜0.001g/L，钼酸钠0.003g/L。微量元素溶液在酸性条件下(用稀硫酸调pH至5-6)配置。

复合维生素溶液：生物素0.1g/L，烟酸0.35g/L，盐酸硫胺0.3g/L，VB6 0.1g/L，VB12 0.05g/L。

基础培养基、微量元素溶液和复合维生素溶液按上述配方配制后121℃高温灭菌20min，微量元素溶液和复合维生素溶液冷却后均按照1mL/L的量与基础培养基混匀。

(2)培养工艺：光合细菌发酵工艺为50％(V/V)接种量，37℃，3000LUX条件下培养10d，利用MPN法检测发酵后菌量为50亿个/mL。

4、混合保藏

发酵结束后，按7:2:1体积比将3种发酵液混合均匀，并加入2％(W/V)柠檬酸钠。利用蒸馏水稀释4倍后，置于200L蓝桶内，20℃保藏，60d植物乳杆菌检测存活率为初始菌量的30％。

Claims (1)

1.一种植物乳杆菌发酵液的常温保存方法，其特征在于：主要步骤如下：

(1)将植物乳杆菌、假丝酵母、光合细菌分别发酵培养；

(2)分别将发酵后的植物乳杆菌、假丝酵母、光合细菌发酵液按比例混合，将混合液加入一定比例的柠檬酸钠固体粉剂，制备保存母液；

(3)利用无菌水将母液稀释后获得保存液，瓶装密闭保藏；

所述步骤(1)中的植物乳杆菌发酵液的发酵终点为pH≤3.5，菌量30-50亿cfu/mL；

所述步骤(1)中的假丝酵母为乙醇假丝酵母，采用稀释涂布平板法计数发酵液的菌量为5-10亿cfu/mL；

所述步骤(1)中的光合细菌为沼泽红假单胞菌,发酵液的菌量按照MPN5计数法为30-50亿个/mL；

所述步骤(1)中的植物乳杆菌发酵培养基配方按重量百分比为：红糖6-8％，糖蜜8-10％，酵母浸粉或酵母膏0.1-0.3％，蛋白胨0.1-0.2％，磷酸二氢钾0.04-0.1％，用水定容至相应体积，氢氧化钠调节pH至6.5-6.8；

所述步骤(1)中的假丝酵母发酵培养基配方按重量百分比为：葡萄糖2-3％，酵母粉1-2％，蛋白胨2-3％，硫酸镁0.1-0.2％，磷酸二氢钾0.5-1％，用水定容至相应体积；

所述步骤(1)中光合细菌的培养基为光合细菌专用培养基，配制方法如下：

①基础培养基配方按重量百分比为：柠檬酸0.1-0.2％，牛肉膏0.15-0.2％，酵母膏0.1-0.3％，蛋白胨0.1-0.2％，乙酸钠0.1-0.3％，七水硫酸镁0.03-0.04％，硫酸亚铁0.001-0.05％，氯化钙0.02-0.03％，磷酸二氢钾0.02-0.04％，用水定容至相应体积并调节pH 6.8-7.0；

②微量元素溶液配方按重量百分比为：EDTA 0.05-0.1％，硫酸亚铁0.02-0.05％，硫酸锌0.001-0.003％，硼酸0.003-0.005％，氯化锰0.0003-0.0005％，氯化钙0.002-0.005％，氯化铜0.0001-0.0004％，钼酸钠0.0003-0.0008％；在用稀硫酸调pH至5-6配置，用水定容至相应体积；

③复合维生素溶液配方按重量百分比为：生物素0.01-0.03％，烟酸0.035-0.05％，盐酸硫胺0.03-0.1％，VB6 0.01-0.05％，VB12 0.005-0.025％，用水定容至相应体积；

基础培养基、微量元素溶液和复合维生素溶液按上述配方配制后121℃高温灭菌20min，微量元素溶液和复合维生素溶液冷却后均按照1mL/L的量与基础培养基混匀；

所述步骤(2)中的植物乳杆菌、假丝酵母、光合细菌发酵液按照7:2:1的体积比进行混合；

所述步骤(2)中的柠檬酸钠添加比例W/V为1-2％；

所述步骤(3)中的所述无菌水为灭菌后自来水或蒸馏水；

所述步骤(3)中的无菌水将母液稀释的倍数为3-4倍；

所述步骤(3)中的保藏温度为20-28℃。

Images