CN110760076A - 一种基于胶体颗粒-iPRF双网络结构的可注射、高强度复合水凝胶及其制备方法和应用 - Google Patents
一种基于胶体颗粒-iPRF双网络结构的可注射、高强度复合水凝胶及其制备方法和应用 Download PDFInfo
- Publication number
- CN110760076A CN110760076A CN201911076477.7A CN201911076477A CN110760076A CN 110760076 A CN110760076 A CN 110760076A CN 201911076477 A CN201911076477 A CN 201911076477A CN 110760076 A CN110760076 A CN 110760076A
- Authority
- CN
- China
- Prior art keywords
- iprf
- double
- network
- hydrogel
- colloidal
- Prior art date
- Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
- Granted
Links
Images
Classifications
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C08—ORGANIC MACROMOLECULAR COMPOUNDS; THEIR PREPARATION OR CHEMICAL WORKING-UP; COMPOSITIONS BASED THEREON
- C08J—WORKING-UP; GENERAL PROCESSES OF COMPOUNDING; AFTER-TREATMENT NOT COVERED BY SUBCLASSES C08B, C08C, C08F, C08G or C08H
- C08J3/00—Processes of treating or compounding macromolecular substances
- C08J3/02—Making solutions, dispersions, lattices or gels by other methods than by solution, emulsion or suspension polymerisation techniques
- C08J3/03—Making solutions, dispersions, lattices or gels by other methods than by solution, emulsion or suspension polymerisation techniques in aqueous media
- C08J3/075—Macromolecular gels
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
- A61K47/00—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient
- A61K47/30—Macromolecular organic or inorganic compounds, e.g. inorganic polyphosphates
- A61K47/42—Proteins; Polypeptides; Degradation products thereof; Derivatives thereof, e.g. albumin, gelatin or zein
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
- A61K9/00—Medicinal preparations characterised by special physical form
- A61K9/06—Ointments; Bases therefor; Other semi-solid forms, e.g. creams, sticks, gels
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61L—METHODS OR APPARATUS FOR STERILISING MATERIALS OR OBJECTS IN GENERAL; DISINFECTION, STERILISATION OR DEODORISATION OF AIR; CHEMICAL ASPECTS OF BANDAGES, DRESSINGS, ABSORBENT PADS OR SURGICAL ARTICLES; MATERIALS FOR BANDAGES, DRESSINGS, ABSORBENT PADS OR SURGICAL ARTICLES
- A61L27/00—Materials for grafts or prostheses or for coating grafts or prostheses
- A61L27/40—Composite materials, i.e. containing one material dispersed in a matrix of the same or different material
- A61L27/44—Composite materials, i.e. containing one material dispersed in a matrix of the same or different material having a macromolecular matrix
- A61L27/446—Composite materials, i.e. containing one material dispersed in a matrix of the same or different material having a macromolecular matrix with other specific inorganic fillers other than those covered by A61L27/443 or A61L27/46
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61L—METHODS OR APPARATUS FOR STERILISING MATERIALS OR OBJECTS IN GENERAL; DISINFECTION, STERILISATION OR DEODORISATION OF AIR; CHEMICAL ASPECTS OF BANDAGES, DRESSINGS, ABSORBENT PADS OR SURGICAL ARTICLES; MATERIALS FOR BANDAGES, DRESSINGS, ABSORBENT PADS OR SURGICAL ARTICLES
- A61L27/00—Materials for grafts or prostheses or for coating grafts or prostheses
- A61L27/40—Composite materials, i.e. containing one material dispersed in a matrix of the same or different material
- A61L27/44—Composite materials, i.e. containing one material dispersed in a matrix of the same or different material having a macromolecular matrix
- A61L27/48—Composite materials, i.e. containing one material dispersed in a matrix of the same or different material having a macromolecular matrix with macromolecular fillers
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61L—METHODS OR APPARATUS FOR STERILISING MATERIALS OR OBJECTS IN GENERAL; DISINFECTION, STERILISATION OR DEODORISATION OF AIR; CHEMICAL ASPECTS OF BANDAGES, DRESSINGS, ABSORBENT PADS OR SURGICAL ARTICLES; MATERIALS FOR BANDAGES, DRESSINGS, ABSORBENT PADS OR SURGICAL ARTICLES
- A61L27/00—Materials for grafts or prostheses or for coating grafts or prostheses
- A61L27/50—Materials characterised by their function or physical properties, e.g. injectable or lubricating compositions, shape-memory materials, surface modified materials
- A61L27/507—Materials characterised by their function or physical properties, e.g. injectable or lubricating compositions, shape-memory materials, surface modified materials for artificial blood vessels
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61L—METHODS OR APPARATUS FOR STERILISING MATERIALS OR OBJECTS IN GENERAL; DISINFECTION, STERILISATION OR DEODORISATION OF AIR; CHEMICAL ASPECTS OF BANDAGES, DRESSINGS, ABSORBENT PADS OR SURGICAL ARTICLES; MATERIALS FOR BANDAGES, DRESSINGS, ABSORBENT PADS OR SURGICAL ARTICLES
- A61L27/00—Materials for grafts or prostheses or for coating grafts or prostheses
- A61L27/50—Materials characterised by their function or physical properties, e.g. injectable or lubricating compositions, shape-memory materials, surface modified materials
- A61L27/52—Hydrogels or hydrocolloids
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61L—METHODS OR APPARATUS FOR STERILISING MATERIALS OR OBJECTS IN GENERAL; DISINFECTION, STERILISATION OR DEODORISATION OF AIR; CHEMICAL ASPECTS OF BANDAGES, DRESSINGS, ABSORBENT PADS OR SURGICAL ARTICLES; MATERIALS FOR BANDAGES, DRESSINGS, ABSORBENT PADS OR SURGICAL ARTICLES
- A61L2430/00—Materials or treatment for tissue regeneration
- A61L2430/02—Materials or treatment for tissue regeneration for reconstruction of bones; weight-bearing implants
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61L—METHODS OR APPARATUS FOR STERILISING MATERIALS OR OBJECTS IN GENERAL; DISINFECTION, STERILISATION OR DEODORISATION OF AIR; CHEMICAL ASPECTS OF BANDAGES, DRESSINGS, ABSORBENT PADS OR SURGICAL ARTICLES; MATERIALS FOR BANDAGES, DRESSINGS, ABSORBENT PADS OR SURGICAL ARTICLES
- A61L2430/00—Materials or treatment for tissue regeneration
- A61L2430/06—Materials or treatment for tissue regeneration for cartilage reconstruction, e.g. meniscus
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61L—METHODS OR APPARATUS FOR STERILISING MATERIALS OR OBJECTS IN GENERAL; DISINFECTION, STERILISATION OR DEODORISATION OF AIR; CHEMICAL ASPECTS OF BANDAGES, DRESSINGS, ABSORBENT PADS OR SURGICAL ARTICLES; MATERIALS FOR BANDAGES, DRESSINGS, ABSORBENT PADS OR SURGICAL ARTICLES
- A61L2430/00—Materials or treatment for tissue regeneration
- A61L2430/30—Materials or treatment for tissue regeneration for muscle reconstruction
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C08—ORGANIC MACROMOLECULAR COMPOUNDS; THEIR PREPARATION OR CHEMICAL WORKING-UP; COMPOSITIONS BASED THEREON
- C08J—WORKING-UP; GENERAL PROCESSES OF COMPOUNDING; AFTER-TREATMENT NOT COVERED BY SUBCLASSES C08B, C08C, C08F, C08G or C08H
- C08J2305/00—Characterised by the use of polysaccharides or of their derivatives not provided for in groups C08J2301/00 or C08J2303/00
- C08J2305/08—Chitin; Chondroitin sulfate; Hyaluronic acid; Derivatives thereof
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C08—ORGANIC MACROMOLECULAR COMPOUNDS; THEIR PREPARATION OR CHEMICAL WORKING-UP; COMPOSITIONS BASED THEREON
- C08J—WORKING-UP; GENERAL PROCESSES OF COMPOUNDING; AFTER-TREATMENT NOT COVERED BY SUBCLASSES C08B, C08C, C08F, C08G or C08H
- C08J2389/00—Characterised by the use of proteins; Derivatives thereof
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C08—ORGANIC MACROMOLECULAR COMPOUNDS; THEIR PREPARATION OR CHEMICAL WORKING-UP; COMPOSITIONS BASED THEREON
- C08K—Use of inorganic or non-macromolecular organic substances as compounding ingredients
- C08K3/00—Use of inorganic substances as compounding ingredients
- C08K3/34—Silicon-containing compounds
- C08K3/36—Silica
Landscapes
- Health & Medical Sciences (AREA)
- Chemical & Material Sciences (AREA)
- Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
- Medicinal Chemistry (AREA)
- General Health & Medical Sciences (AREA)
- Public Health (AREA)
- Veterinary Medicine (AREA)
- Animal Behavior & Ethology (AREA)
- Epidemiology (AREA)
- Oral & Maxillofacial Surgery (AREA)
- Dermatology (AREA)
- Transplantation (AREA)
- Dispersion Chemistry (AREA)
- Composite Materials (AREA)
- Engineering & Computer Science (AREA)
- Materials Engineering (AREA)
- Inorganic Chemistry (AREA)
- Pharmacology & Pharmacy (AREA)
- Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
- Vascular Medicine (AREA)
- Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
- Polymers & Plastics (AREA)
- Organic Chemistry (AREA)
- Materials For Medical Uses (AREA)
Abstract
本发明涉及生物医用材料技术领域,具体为一种基于胶体颗粒‑iPRF双网络结构的可注射、高强度复合水凝胶及其制备方法和应用。双网络结构复合水凝胶中纳米胶体颗粒在物理作用下如静电相互作用组装形成第一重胶体凝胶网络,可注射血小板富集纤维蛋白iPRF形成第二重纤维蛋白水凝胶网络,两重凝胶网络间以静电作用、氢键作用、疏水作用物理交联形成双网络结构水凝胶。采用无抗凝药物加入新鲜血液样本,经低速离心操作,取顶层全部黄色液体,快速与胶体颗粒干粉共混,在室温或体温下等待不超过2000秒而完全固化即得。本发明双网络结构复合水凝胶是再生的理想可注射、可塑形生物医用材料。
Description
技术领域
本发明涉及生物医用材料技术领域,具体为一种基于胶体颗粒-iPRF双网络结构的可注 射、高强度复合水凝胶及其制备方法和应用。
背景技术
实现人体组织/器官的损伤修复是临床医学中的关键难题。然而,目前临床上治疗人体组 织/器官修复手段仍以自体组织、同种异体组织或异种组织为主。以骨修复为例,临床上骨修 复的“黄金”治疗标准是患者自体骨移植填充。由于自体组织/器官无免疫排斥,且通常具有良 好的血管化,因此修复效果显著。例如,对骨缺损最佳的临床骨修复方案是从患者自体的髂 骨部位取骨移植到骨缺损病患部位;这一方案尽管临床修复效果好,但缺陷也显而易见:1) 造成患者二次创伤、增加痛苦,2)供体有限、对于较大的骨缺损无法满足修复需求。因此, 同种异体甚至异种异体的组织/器官移植成为临床组织修复治疗的次优选择。例如来自美国 Stryker的骨修复填充材料就是来源于小牛骨。然而,这类骨修复材料同样存在诸多问 题难以解决:1)供体有限,2)异体组织/器官移植后受体自身免疫排斥显著,需要对患者免 疫***进行药物压制,存在造成患者多种并发症和其他器官损伤,3)同种、异种组织移植过 程潜在疾病传播的问题,4)异种、异体组织/器官的去免疫原处理、储存、质量控制体系构 建的难题。
近年来,以人工材料、生物工程技术、细胞治疗技术、药物控释技术为手段,以辅助、 修复和替代人体受创伤或疾病导致的组织/器官缺损为目标的再生医学领域研究飞速发展,为 人类组织器官修复再生开辟了新路径。其中,组织工程技术是再生医学领域的重要分支,其 结合人工生物材料、生物活性因子(生长因子、细胞因子、多肽、siRNA等)、以及多分化 功能的干细胞或特定组织分化的功能性细胞,通过工程方法结合并构建具有功能性的组织/器 官,最终移植体内用于组织修复再生。然而经过三十年的发展,组织工程技术的实质性临床 应用仍然凤毛麟角,其中关键挑战主要包括:1)缺乏全面替代人体组织细胞外基质的、仿生 细胞外微环境的人工生物材料体系,2)生物活性因子的量化生产困难、缺乏可缓控释蛋白药 物因子的载体材料、活性蛋白治疗效果以外的副作用(异位成骨、肿瘤等)难以克服,3)干 细胞体内的分化难以控制、细胞来源有限、异体细胞的免疫排斥、细胞提取扩增到移植治疗 周期和临床质量控制体系难建立。
生物材料是组织工程的基础,其功能是作为细胞外基质(Extracellular matrix,ECM), 同时作为生物信号分子的载体,通过不断向生理组织环境中释放这些因子而控制和调节细胞 的功能和行为,以最终实现组织的修复。然而,传统的组织工程支架材料在再生医学应用过 程中远不能满足组织修复重建的需求。关键难题包括:1)支架材料缺乏可控的降解速度;2) 无法可控释放生物因子药物,已有研究结果表明:直接将生长因子混入块体支架往往在植入 初期产生爆释而对组织修复产生微弱的效果,或因释放过量而产生骨组织的增生;3)临床操 作困难,缺乏可注射和可塑性、难以用于微创手术(Minimallyinvasive surgery);4)难以为 加载的细胞提供理想的细胞外微环境、保证细胞的活性和功能性。
水凝胶是作为目前研究细胞微环境最广泛应用的基质材料,典型水凝胶由亲水性高分子 组成,与天然ECM相似富含水,允许生物大分子通过多孔凝胶网络扩散传播,且水凝胶可 通过交联度调控硬度,易于化学改性和修饰,因此在组织工程和药物控释领域也是最重要的 生物材料之一。典型的水凝胶可通过高分子间键合形成稳定的宏观结构和机械强度,形成的 多孔网络将细胞三维包裹其中,并为细胞提供可贴附、铺展、迁移和增殖的平台。并且对于 化学交联水凝胶,细胞可通过与水凝胶预聚体(或单体)水溶液共混、再引发化学交联/聚合 实现细胞三维固载。然而问题仍然存在:1)通常化学交联水凝胶需引入化学反应实现凝胶固 化,而化学反应通常具有细胞毒性,造成包埋后细胞存活率降低;2)对于临床应用,尽管预 聚体/细胞共混水溶液具有流动性、可注射,然而水凝胶固化过程的化学反应往往具有显著细 胞毒性;3)而对于物理交联水凝胶(如胶原),由于凝胶网络基于弱的物理键合形成,尽管 生物相容性好,但形成的水凝胶力学性能差(例如,胶原水凝胶最大弹性模量Emax~1kPa), 难以进行临床应用;4)药物控释能力差,美敦力是临床上骨科用于骨修复的常用 的载生长因子(BMP-2)的胶原支架材料,但由于胶原支架缺乏对蛋白因子的控释能力,初 期植入后因子暴释严重,因此需要加大蛋白药物的加载量来实现骨诱导作用,因此成本高、 骨诱导性能也有限。因此,开发良好生物相容性、力学强度更优、可注射、可塑性、可实现 蛋白因子药物的缓控释的新型水凝胶体系对临床组织器官修复再生具有革命性意义。
在组织修复过程中,组织修复再生过程经历血凝块形成、炎症期、组织再生几个复杂的 生物过程,其中可诱导细胞聚集、增值、分化的生物活性信号因子在组织修复过程中的作用 至关重要。尤其对于生长周期缓慢的骨、软骨组织而言,骨缺损部位周围生长因子的长期存 在可加速催化骨缺损的修复再生。然而,骨缺损初期形成的血凝块,尽管富含多种成血管、 成骨生长因子,但由于血凝块很快降解吸收,难以持续在缺损部位提供生物活性的因子药物 诱导骨生长。
而活性蛋白因子在时间、空间的表达对组织再生有重要的诱导作用。因此,生长因子的 可控递释是组织工程实现组织修复再生的重要技术挑战。例如,大量生长因子在骨再生过程 中发挥着调控作用,且一些生长因子(如BMP-2,BMP-7,VEGF,FGF-2等)在临床前研究中 呈现出了巨大的应用潜力。近年来,大量的工作是将生长因子与生物材料结合,期望通过生 长因子的释放长期诱导骨组织生长。典型的例子包括美国Medtronic(美敦力)公司和Stryker 公司分别开发的基于胶原海绵材料为载体的载BMP-2(骨形态发生蛋白-2,bonemorphogenic protein-2,一种骨诱导生长因子)和BMP-7的骨组织修复生物材料载体。尤其是Medtronic 的产品,尽管在骨修复再生领域取得巨大临床成功,但该产品技术是直接将生长因 子快速水溶,然后与预成型的胶原支架材料共混,生长因子仅靠表面吸附加载在载体材料的 表面,生长因子加载效率低,且蛋白因子随材料植入后快速暴释,无法在修复区域实现生长 因子的上期缓释,因此该产品需用远高于生理水平的生长因子来刺激骨诱导,增加产品成本、 且远大于生理水平的生长因子造成异位成骨等副作用。此外,生物活性蛋白类药物因子与材 料共混时易发生构象变化失活,且在体内易被酶解,往往需要较大剂量来达到治疗效果,这 往往又会引起毒副作用产生。
总之,生长因子在临床治疗过程中被证明仍存在诸多问题,包括其体内易失活,存在副 作用和安全因素等,因此仍难以实现成功临床转化应用。例如,VEGF具有强力的促进血管 新生的作用,但其也可能引起***性低血压和水肿。BMP-2则存在血液内降解失活极快,并 有报道异位成骨及肿瘤发生的风险。更重要的是,生长因子作为生物活性药物,其生产成本 高,储存、使用过程中都存在诸多应用难题。目前,关于缓控释***对生长因子释放这一治 疗策略的瓶颈在于:1.载体不佳的缓控释能力及突释出超生理剂量生长因子的局部应用所带 来的副作用;2.外源性生长因子高昂的价格和不稳定的治疗效果。因此,急需保持蛋白活性、 实现蛋白药物缓控释的载体材料。
基于上述因素的考虑,有学者建议使用以富血小板血浆(PRP)、浓缩生长因子(PRF) 或富血小板纤维蛋白(CGF)为代表的自体浓缩血液制品及其衍生物作为骨及其他组织修复 的移植及替代材料。以上的血液制品通过高速离心从患者自身血液中分离,制备简单,成本 低廉。同时含有多种高浓度的生长因子及趋化因子,利于组织修复,并且不会发生免疫排斥 反应。然而单独应用血液制品及其衍生物作为骨缺损的填充及替代材料,其治疗效果尚存在 争议。首先,血液制品机械性能较差,难以达到维持空间的效果;其次,凝胶类血液制品在 体内降解吸收过快,难以在缺损部位稳定保持;此外,血液制品类凝胶的过快降解吸收带来 生长因子突释的现象,从而导致难以预估的副作用。上述因素皆可能造成骨缺损充填修复后 预后的不确定性。此外,有部分学者通过向血液制品及其衍生物,如PRP中加入其他生物材 料,以期达到增强其机械性能并调控因子缓释而促进组织愈合的目的。以上策略确实增强了 机械性能和加速了骨及软骨的愈合。然而上述材料依然存在以下缺陷:1、PRP中含有抗凝血 剂等外源性添加剂,其再生潜能受到局限;2、所得材料力学强度较差,且不具有可注射性, 操作复杂,难以精准量化。
近年,Choukroun J将低速离心概念引入到PRF配方中,而获得了可注射、浓缩生长因 子(简称iPRF)的新型血液制品。这种新型血液制品同PRF一样不含有任何外源性添加剂, 且含有大量血小板、纤维蛋白及各种生长因子和趋化因子等。iPRF由于其可注射性和富集的 生长因子,已被用于骨及软骨组织的再生和修复。然而,该材料依然存在机械性能差、体内 降解快等缺点。值得注意的是,在低速离心的情况下,iPRF中富含的血小板只有小部分被激 活,因此可以保持溶胶态约15分钟,随着血小板脱颗粒和凝血酶的激活作用,其内的纤维蛋 白原发生自交联,形成凝胶态的纤维蛋白-血小板复合物。这一溶胶-凝胶态的相转化特性 使iPRF与其他生物材料的联合使用成为可能。然而,iPRF在植入后降解周期短,其中所含 诱导再生的生长因子成分也很快降解失活,因此尽管iPRF具有良好的生物活性和诱导再生功 能,但仍难以实现长期、可控的因子释放、诱导再生效果有限。综上所述,如果将iPRF中的 生物活性因子与可控递释载体或具有骨诱导性无机颗粒材料结合,必将对组织修复再生有推 动作用。
发明内容
为解决上述现有技术中的缺陷,本发明提供一种高强度、可注射的双网络结构复合水凝 胶医用材料及其制备方法和应用。
为实现上述发明目的,本发明采用以下技术方案:
本发明第一方面提供了一种胶体颗粒-iPRF双网络结构复合水凝胶,所述复合水凝胶为基 于胶体颗粒和血液提取物可注射血小板富集纤维蛋白iPRF形成的具有双重网络微观结构的 水凝胶;其中,胶体颗粒在物理作用下形成具有自修复效应的第一重胶体水凝胶网络,可注 射血小板富集纤维蛋白iPRF形成第二重纤维蛋白水凝胶网络,两重凝胶网络间以静电作用、 氢键作用、疏水作用物理交联形成双网络结构水凝胶。
上述技术方案中,进一步地,所述可注射血小板富集纤维蛋白iPRF为来自自体、同种异 体或异种异体的血液提取物。
上述技术方案中,进一步地,所述胶体颗粒是由静电相互作用组装而成,具体通过以下 任一种方式组合而成:
1)由带正电荷的二氧化硅,生物玻璃,聚乳酸纳米颗粒和带负电荷的二氧化硅,生物玻 璃,聚乳酸纳米颗粒分别共混组装而成,其中带正电荷颗粒和负电荷颗粒的混合比例为 0.1~10;
2)由局部带有正电荷和负电荷基团的蒙脱石,壳聚糖,海藻酸,透明质酸,丝素,明胶 纳米颗粒中的一种或几种的组合;
上述技术方案中,进一步地,所述胶体颗粒尺寸在纳米到亚微米尺度,粒径为10nm~2 μm,所述胶体颗粒表面电荷为-40~40mV,其可通过颗粒之间的静电相互作用组装形成剪切 变稀且自修复性能的胶体凝胶网络。
优选地,所述胶体颗粒粒径为10nm~500nm。
本发明第二方面提供了一种胶体颗粒-iPRF双网络结构复合水凝胶的制备方法,所述方法 包括如下步骤:
取新鲜血液样本离心1~10min,转速50~1000g,离心分层后的顶层黄色透明液体即为血 液提取物可注射血小板富集纤维蛋白iPRF,迅速将上层黄色透明液体与胶体颗粒充分混匀, 固化后即得所述胶体颗粒-iPRF双网络结构复合水凝胶;或
将胶体颗粒加入新鲜血液样本中,并放入离心机中离心1~10min,转速50~1000g,离心 分层后的顶层棕黄色胶体即为所述胶体颗粒-iPRF双网络结构复合水凝胶;
其中,胶体颗粒的体积分数φ为φ=0.05~1;
胶体颗粒-iPRF双网络结构复合水凝胶固化的时间为10~2000秒,其中,可注射、可塑 形的时间窗口为<2000秒。
上述技术方案中,进一步地,所述胶体颗粒可以是胶体颗粒的冻干粉或胶体颗粒在水溶 液中的分散液中的一种或两种的组合。
本发明第三方面提供了前述双网络结构复合水凝胶作为药物、生物活性蛋白、活细胞的 载体在组织工程支架材料中的应用,所述应用为用于组织修复填充。
具体的,用于骨组织、软骨组织、肌肉、血管修复的填充物。
本发明第四方面提供了前述双网络结构复合水凝胶在三维细胞培养支架或加在细胞的 3D生物打印墨水材料中的应用,用于组织或器官的3D生物打印,所述双网络结构复合水凝 胶在打印前加入1~100mmol抗凝剂,打印之后浸泡于含Ca2+水性溶液中,得到具有稳定结 构的支架。
本发明的胶体颗粒-iPRF双网络结构复合水凝胶,明胶颗粒的粒径小于2μm,尤其优选 10nm-500nm直径的胶体颗粒,颗粒间存在较强的非共价键作用(例如静电作用、氢键作用、 疏水作用等),因此可在水相溶液中自组装形成由胶体颗粒组装而成的凝胶网络结构,并作 为双网络水凝胶体系的第一重网络;双重网络水凝胶中的第二重网络是有血液提取物可注射 血小板富集纤维蛋白(Injectable platelet-rich fibrin,简称iPRF)中的纤维蛋白形成的共价键 交联的凝胶网络,两重网络间同样以静电作用、氢键作用、疏水作用等物理作用交联形成。
本发明有益效果:
1.双网络的凝胶结构赋予水凝胶增强、增韧的效果:
本发明的胶体颗粒-iPRF双网络结构水凝胶体系中,胶体颗粒可以形成连续的胶体网络, 而不是仅分散在连续相的纤维蛋白网络中,因此双网络水凝胶力学强度的提高是呈数量级的 增加。与单纯iPRF构成的水凝胶储能模量约0.1kPa相比,胶体颗粒-IPRF水凝胶的储能模 量>5kPa,是iPRF形成的水凝胶的至少50倍;并且与单纯胶体颗粒构成的胶体水凝胶相比, 胶体颗粒-iPRF凝胶的储能模量明显增加。
2.胶体颗粒构成的凝胶网络赋予双网络水凝胶可注射、可塑性的特点:
尺寸为纳米到亚微米尺度的纳米颗粒,通过颗粒之间的密堆积和物理相互作用可以形成 具有剪切变稀,自修复力学特征的胶体凝胶,以及iPRF的凝胶过程需要时间窗口性质,本发 明双网络水凝胶混合后,具有可注射,可打印、可塑形的优异性能,当到达时间窗口后,水 凝胶中iPRF网络自动形成。这在临床应用上具有极大的便利性。双网络结构使得胶体颗粒 /iPRF复合水凝胶具有更加优异的机械性能,拓展此前基于iPRF和胶体凝胶生物材料的应用范 围。
3.胶体颗粒/iPRF双网络水凝胶具有生物活性,可诱导组织再生:
本发明双网络水凝胶较传统块体材料的水凝胶或多孔支架具有更优的蛋白药物加载和缓 释效果,因为本发明的胶体凝胶生物材料,因其微纳米尺度的颗粒粒径从而具有高的比表面 积,且胶体颗粒表面有大量带电荷基团而易与蛋白药物形成静电吸附,同时,本发明中所述 血液提取物iPRF与胶体颗粒所构建的双网络水凝胶,利用血液中富集的多种生长因子的特 点,可直接提取自患者自身静脉血,因而可显著降低使用外源性或重组蛋白生长因子的高成 本、及使用外源性蛋白药物潜在的免疫排斥问题。
4.本发明所得的双网络结构、增强、增韧水凝胶生物医用材料制备方法简便,利于临床 推广,是用于人体组织器官缺损重建的充填修复、再生的理想可注射、可塑形生物医用材料, 可作为可注射材料用于人体组织/器官修复填充、可注射止血凝胶、促血管修复再生材料、骨、 软骨、脂肪、肌肉等组织修复再生的植入材料领域。
附图说明
图1是实施例8中水凝胶力学性能示意图;图1a是可注射性光学图片,图1b是压缩应变并恢复 的光学图片;
图2是实施例9,对比例8中水凝胶的生长因子释放曲线;
图3是实施例10,对比例9中比格犬拔牙术后,水凝胶填充牙窝后2周的牙窝的成血管和成骨组 织学分析;其中圆圈代表新生成血管,星号代表新生成的骨;
图4是实施例10中,3D生物打印水凝胶支架的光学图片;图4a代表二氧化硅颗粒-IPRF,图4b代表明胶颗粒-IPRF。
具体实施方式
以下结合具体实施例对本发明作进一步说明。
实施例1
(1)二氧化硅、iprf不同尺寸
使用购买的颗粒尺寸为100,500nm二氧化硅纳米颗粒(购买至西格玛化学有限公司)。 通过纳米粒度仪测试得到颗粒的电位是-30mV。
(2)二氧化硅正电化
称取24g的购买的100,500nm的二氧化硅,将其分散到600mL的乙醇中,超声分散15min, 配制成15mg/mL的二氧化硅悬浮液。将其置于40℃的水浴中,使用注射泵在20分钟内加入3 mL硅烷偶联剂APTMS,搅拌速度为1000rpm。随后在40℃条件下反应5h。反应结束后,分 别使用乙醇(1次)、乙醇-水(1次)、水(4次)6次离心再分散清洗颗粒,制备出带正电荷 二氧化硅纳米颗粒。通过纳米粒度仪测试得到颗粒的电位是30mV。
(3)iPRF的提取
通过不含抗凝剂离心管抽取兔血并通过离心制备iPRF。具体制备过程如下:1)使用兔固 定架固定新西兰兔;2)去除兔耳中动脉周围的兔毛,并揉搓使耳中动脉充分扩张;3)使用 采血针及离心管从耳中动脉采血7ml;4)放入离心机(300g,3分钟)中离心,抽取上清1ml 得到iPRF。
(4)将离心得到的iPRF1 mL与相同尺寸的0.1g正电荷二氧化硅颗粒和0.1g负电荷二氧化 硅颗粒通过鲁尔转接头注射器反复吹打10次,均得到双网络水凝胶;
(5)上述双网络水凝胶的储能模量和损耗模量(表1)使用旋转流变仪的时间扫描模式得到, 其中频率为1Hz,应变为0.5%。压缩断裂应变通过测试力学压缩得到,其中压缩速率为5 mm/min,压缩样品为直径12mm,高8mm的圆柱。可以发现在相同质量分数下,颗粒尺寸 越小得到的复合水凝胶强度更大。
表1
100nm二氧化硅颗粒 | 500nm二氧化硅颗粒 | |
储能模量 | 6.3kPa | 4.2kPa |
损耗模量 | 0.54kPa | 0.48kPa |
压缩断裂应变 | 81% | 79% |
实施例2
(1)二氧化硅不同比例
使用购买的颗粒尺寸为100,500nm二氧化硅纳米颗粒(购买至西格玛化学有限公司)。 通过纳米粒度仪测试得到颗粒的电位是-30mV。
(2)二氧化硅正电化
称取24g的购买的100,500nm的二氧化硅,将其分散到600mL的乙醇中,超声分散15min, 配制成15mg/mL的二氧化硅悬浮液。将其置于40℃的水浴中,使用注射泵在20分钟内加入3 mL硅烷偶联剂APTMS,搅拌速度为1000rpm。随后在40℃条件下反应5h。反应结束后,分 别使用乙醇(1次)、乙醇-水(1次)、水(4次)6次离心再分散清洗颗粒,制备出带正电荷 二氧化硅纳米颗粒。通过纳米粒度仪测试得到颗粒的电位是30mV。
(3)iPRF的提取
通过不含抗凝剂离心管抽取兔血并通过离心制备iPRF。具体制备过程如下:1)使用兔固 定架固定新西兰兔;2)去除兔耳中动脉周围的兔毛,并揉搓使耳中动脉充分扩张;3)使用 采血针及离心管从耳中动脉采血7ml;4)放入离心机(300g,3分钟)中离心,抽取上清1ml 得到iPRF。
(4)将离心得到的iPRF 1mL与相同尺寸的0.16g正电荷二氧化硅颗粒和0.04g负电荷二氧 化硅颗粒通过鲁尔转接头注射器反复吹打10次,均得到双网络水凝胶;
(5)上述双网络水凝胶的储能模量和损耗模量(表2)使用旋转流变仪的时间扫描模式得到, 其中频率为1Hz,应变为0.5%。压缩断裂应变通过测试力学压缩得到,其中压缩速率为5 mm/min,压缩样品为直径12mm,高8mm的圆柱。与表2相比,相同质量分数的带正,负电荷的二氧化硅比例从1:1到4:1之后,复合水凝胶的强度降低。
表2
100nm二氧化硅颗粒 | 500nm二氧化硅颗粒 | |
储能模量 | 4.3kPa | 3.4kPa |
损耗模量 | 0.51kPa | 0.42kPa |
压缩断裂应变 | 75% | 71% |
实施例3
(1)二氧化硅、iprf不同尺寸
使用购买的颗粒尺寸为100,500nm二氧化硅纳米颗粒(购买至西格玛化学有限公司)。 通过纳米粒度仪测试得到颗粒的电位是-30mV。
(2)二氧化硅正电化
称取24g的购买的100,500nm的二氧化硅,将其分散到600mL的乙醇中,超声分散15min, 配制成15mg/mL的二氧化硅悬浮液。将其置于40℃的水浴中,使用注射泵在20分钟内加入3 mL硅烷偶联剂APTMS,搅拌速度为1000rpm。随后在40℃条件下反应5h。反应结束后,分 别使用乙醇(1次)、乙醇-水(1次)、水(4次)6次离心再分散清洗颗粒,制备出带正电荷 二氧化硅纳米颗粒。通过纳米粒度仪测试得到颗粒的电位是30mV。
(3)iPRF的提取
通过不含抗凝剂离心管抽取兔血并通过离心制备iPRF。具体制备过程如下:1)使用兔固 定架固定新西兰兔;2)去除兔耳中动脉周围的兔毛,并揉搓使耳中动脉充分扩张;3)使用 采血针及离心管从耳中动脉采血7ml;4)放入离心机(300g,3分钟)中离心,抽取上清1ml 得到iPRF。
(4)将离心得到的iPRF1 mL与相同尺寸的0.2g正电荷二氧化硅颗粒和0.2g负电荷二氧化 硅颗粒通过鲁尔转接头注射器反复吹打10次,均得到双网络水凝胶;
(5)上述双网络水凝胶的储能模量和损耗模量(表3)使用旋转流变仪的时间扫描模式得到, 其中频率为1Hz,应变为0.5%。压缩断裂应变通过测试力学压缩得到,其中压缩速率为5 mm/min,压缩样品为直径12mm,高8mm的圆柱。
表3
100nm二氧化硅颗粒 | 500nm二氧化硅颗粒 | |
储能模量 | 319.3kPa | 294kPa |
损耗模量 | 26.2kPa | 23.4kPa |
压缩断裂应变 | 43% | 39% |
实施例4
(1)二氧化硅、iprf不同尺寸不同浓度
使用购买的颗粒尺寸为100,500nm二氧化硅纳米颗粒(购买至西格玛化学科技有限公 司),通过纳米粒度仪测试得到颗粒的电位是-30mV。
(2)二氧化硅正电化
称取24g的购买的100,500nm的二氧化硅,将其分散到600mL的乙醇中,超声分散15min, 配制成15mg/mL的二氧化硅悬浮液。将其置于40℃的水浴中,使用注射泵在20分钟内加入3 mL硅烷偶联剂APTMS,搅拌速度为1000rpm。随后在40℃条件下反应5h。反应结束后,分 别使用乙醇(1次)、乙醇-水(1次)、水(4次)6次离心再分散清洗颗粒,制备出带正电荷 SiO2,颗粒表面电荷为30mV
(3)iPRF的提取
通过不含抗凝剂离心管抽取兔血并通过离心制备iPRF。具体制备过程如下:1)使用兔固 定架固定新西兰兔;2)去除兔耳中动脉周围的兔毛,并揉搓使耳中动脉充分扩张。3)使用 采血针及离心管从耳中动脉采血7ml;4)将0.2g正电荷二氧化硅颗粒粉末和0.2g负电荷二氧 化硅颗粒粉末加入含有全血的采血管中,并放入离心机(300g,3分钟)中离心,上层得到双 网络水凝胶。
(4)上述双网络水凝胶的储能模量和损耗模量使用旋转流变仪的时间扫描模式得到,其中频 率为1HZ,应变为0.5%。压缩断裂应变通过测试力学压缩得到,其中压缩速率为5mm/min, 压缩样品为直径12mm,高8mm的圆柱。(表4)
表4
100nm二氧化硅颗粒 | 500nm二氧化硅颗粒 | |
储能模量 | 352.4kPa | 311.2kPa |
损耗模量 | 42.2kPa | 37.1kPa |
压缩断裂应变 | 51% | 43% |
对比例1
通过不含抗凝剂离心管抽取兔血并通过离心制备iPRF。具体制备过程如下。1)使用兔固 定架固定新西兰兔。2)去除兔耳中动脉周围的兔毛,并揉搓使耳中动脉充分扩张。3)使用 采血针及离心管从耳中动脉采血7ml。4)放入离心机(300g,3分钟)中离心,抽取上清1ml 得到iPRF,将iPRF放置30min,得到iPRF凝胶。
iPRF的储能模量和损耗模量使用旋转流变仪的时间扫描模式得到(表5),其中频率为 1HZ,应变为0.5%。压缩断裂应变通过测试力学压缩得到,其中压缩速率为5mm/min,压缩 样品为直径12mm,高8mm的圆柱。
表5
iPRF | |
储能模量 | 0.11kPa |
损耗模量 | 0.02kPa |
压缩断裂应变 | 92% |
对比例2
将等质量的0.1g或者0.2g的正、负电荷二氧化硅粉末与1mL的去离子水溶液混合得到二氧 化硅胶体凝胶。
明胶胶体凝胶的储能模量和损耗模量使用旋转流变仪的时间扫描模式得到(表6),其中 频率为1HZ,应变为0.5%。压缩断裂应变通过测试力学压缩得到,其中压缩速率为5mm/min, 压缩样品为直径12mm,高8mm的圆柱。
表6
实施例1中的二氧化硅复合水凝胶的强度明显高于单纯的iPRF和明胶纳米颗粒水凝胶。
实施例5壳聚糖颗粒iprf
(1)壳聚糖颗粒制备
称取1g壳聚糖粉末溶解在100mL 1%的醋酸溶液得到壳聚糖溶液。再称取20mg三聚磷酸 钠粉末溶解在5mL的去离子水中得到4mg/mL的三聚磷酸钠溶液。将壳聚糖溶液在1000rpm的 速度下高速搅拌并滴加5mL的三聚磷酸钠溶液反应10min,得到局部带有正负电荷基团的壳聚 糖纳米颗粒。通过纳米粒度仪测试,其中颗粒的尺寸为200nm,颗粒的电位是-20mV。
(2)iPRF的提取
通过不含抗凝剂离心管抽取兔血并通过离心制备iPRF。具体制备过程如下:1)使用兔固定 架固定新西兰兔;2)去除兔耳中动脉周围的兔毛,并揉搓使耳中动脉充分扩张;3)使用采 血针及离心管从耳中动脉采血7ml;4)放入离心机(300g,3分钟)中离心,抽取上清1ml 得到iPRF。
(3)将离心得到的iPRF1 mL与0.1g壳聚糖颗粒通过鲁尔转接头注射器反复吹打10次,得 到双网络水凝胶;
(4)上述双网络水凝胶的储能模量和损耗模量使用旋转流变仪的时间扫描模式得到,其中频 率为1HZ,应变为0.5%。压缩断裂应变通过测试力学压缩得到,其中压缩速率为5mm/min, 压缩样品为直径12mm,高8mm的圆柱。(表8)
表8
储能模量 | 7.9kPa |
损耗模量 | 1.2kPa |
压缩断裂应变 | 78% |
实施例6壳聚糖颗粒iprf不同浓度
1)壳聚糖颗粒制备
称取1g壳聚糖粉末溶解在100mL 1%的醋酸溶液得到壳聚糖溶液。再称取20mg三聚磷酸 钠粉末溶解在5mL的去离子水中得到4mg/mL的三聚磷酸钠溶液。将壳聚糖溶液在1000rpm的 速度下高速搅拌并滴加5mL的三聚磷酸钠溶液反应10min,得到局部带有正负电荷基团的壳聚 糖纳米颗粒。通过纳米粒度仪测试,其中颗粒的尺寸为200nm,颗粒的电位是-20mV。
(2)iPRF的提取
通过不含抗凝剂离心管抽取兔血并通过离心制备iPRF。具体制备过程如下:1)使用兔固定 架固定新西兰兔;2)去除兔耳中动脉周围的兔毛,并揉搓使耳中动脉充分扩张;3)使用采 血针及离心管从耳中动脉采血7ml;4)放入离心机(300g,3分钟)中离心,抽取上清1ml 得到iPRF。
(4)将离心得到的iPRF1 mL与0.2g壳聚糖颗粒通过鲁尔转接头注射器反复吹打10次,得 到双网络水凝胶;
(5)上述双网络水凝胶的储能模量和损耗模量使用旋转流变仪的时间扫描模式得到,其中频 率为1HZ,应变为0.5%。压缩断裂应变通过测试力学压缩得到,其中压缩速率为5mm/min, 压缩样品为直径12mm,高8mm的圆柱(表9)。
表9
储能模量 | 36.9kPa |
损耗模量 | 7.2kPa |
压缩断裂应变 | 58% |
实施例7壳聚糖颗粒iprf不同混合方式
(1)壳聚糖颗粒制备
称取1g壳聚糖粉末溶解在100mL 1%的醋酸溶液得到壳聚糖溶液。再称取20mg三聚磷酸 钠粉末溶解在5mL的去离子水中得到4mg/mL的三聚磷酸钠溶液。将壳聚糖溶液在1000rpm 的速度下高速搅拌并滴加5mL的三聚磷酸钠溶液反应10min,得到局部带有正负电荷基团的 壳聚糖纳米颗粒。通过纳米粒度仪测试,其中颗粒的尺寸为200nm,颗粒的电位是-20mV。
(2)iPRF的提取
通过不含抗凝剂离心管抽取兔血并通过离心制备iPRF。具体制备过程如下:1)使用兔固定 架固定新西兰兔;2)去除兔耳中动脉周围的兔毛,并揉搓使耳中动脉充分扩张;3)使用采 血针及离心管从耳中动脉采血7ml;4)将0.2g壳聚糖颗粒粉末加入含有全血的采血管中, 并放入离心机(300g,3分钟)中离心,上层得到双网络水凝胶。
(3)上述双网络水凝胶的储能模量和损耗模量使用旋转流变仪的时间扫描模式得到,其中频 率为1HZ,应变为0.5%。压缩断裂应变通过测试力学压缩得到,其中压缩速率为5mm/min, 压缩样品为直径12mm,高8mm的圆柱。(表10)
表10
储能模量 | 16.5kPa |
损耗模量 | 1.1kPa |
压缩断裂应变 | 73% |
对比例6壳聚糖纳米颗粒
(1)壳聚糖颗粒制备
称取1g壳聚糖粉末溶解在100mL 1%的醋酸溶液得到壳聚糖溶液。再称取20mg三聚磷酸 钠粉末溶解在5mL的去离子水中得到4mg/mL的三聚磷酸钠溶液。将壳聚糖溶液在1000rpm的 速度下高速搅拌并滴加5mL的三聚磷酸钠溶液反应10min,得到局部带有正负电荷基团的壳聚 糖纳米颗粒。通过纳米粒度仪测试,其中颗粒的尺寸为200nm,颗粒的电位是-20mV。
(2)0.2g壳聚糖颗粒与1mL去离子水通过鲁尔转接头注射器反复吹打10次,得到双网络水 凝胶;
(3)上述双网络水凝胶的储能模量和损耗模量使用旋转流变仪的时间扫描模式得到,其中频 率为1HZ,应变为0.5%。压缩断裂应变通过测试力学压缩得到,其中压缩速率为5mm/min, 压缩样品为直径12mm,高8mm的圆柱(表11)。通过对比壳聚糖胶体凝胶和壳聚糖胶体 颗粒-iPRF,发现相同壳聚糖质量分数下,胶体颗粒-iPRF组储能模量比胶体颗粒储能模量高 25倍,压缩断裂应变高1倍。
表11
储能模量 | 1.5kPa |
损耗模量 | 0.2kPa |
压缩断裂应变 | 28% |
实施例8
(1)明胶颗粒的制备
5g明胶溶解在100mL去离子水溶液中,并保持加热到40℃,得到澄清透明的明胶水溶液,滴 加盐酸将溶液pH值调节至2.5,将300mL的丙酮溶液滴加至上述明胶水溶液中并保持加热40℃ 和持续搅拌(1000rpm),滴加总时间为20min,向上述纳米颗粒悬液中加入74μL的交联剂戊 二醛(25wt%水溶液),交联时间12hrs,待反应结束后,向混合物中加入100mM浓度的甘氨 酸,终止未反应完全的戊二醛的端基。将纳米颗粒悬浮液反复离心和在去离子水中重悬。得 到局部带有正负电荷基团的明胶纳米颗粒。通过纳米粒度仪测试,其中颗粒的尺寸为200nm, 颗粒的电位是+8.5mV。
(2)iPRF的提取
通过不含抗凝剂离心管抽取兔血并通过离心制备iPRF。具体制备过程如下:1)使用兔固 定架固定新西兰兔;2)去除兔耳中动脉周围的兔毛,并揉搓使耳中动脉充分扩张;3)使用 采血针及离心管从耳中动脉采血7ml;4)放入离心机(300g,3分钟)中离心,抽取上清1ml 得到iPRF。
(3)将离心得到的iPRF1 mL与0.1g明胶纳米颗粒通过鲁尔转接头注射器反复吹打10次, 均得到明胶颗粒-iPRF水凝胶,此时水凝胶具有剪切变稀,可注射的力学性能,其中图1a代 表水凝胶的可注射性示意图;15分钟后,随着iPRF网络完全固化,复合水凝胶形成,此时 水凝胶具有稳定的力学性能,其中图1b代表复合水凝胶使用铁棒进行压缩形变后,可完全恢 复到初始状态,表明其稳定的力学性能。
(4)上述双网络水凝胶的储能模量和损耗模量(表12)使用旋转流变仪的时间扫描模式得 到,其中频率为1Hz,应变为0.5%。压缩断裂应变通过测试力学压缩得到,其中压缩速率为5mm/min,压缩样品为直径12mm,高8mm的圆柱。
表12
200nm明胶颗粒 | |
储能模量 | 11.4kPa |
损耗模量 | 0.84kPa |
压缩断裂应变 | 65.5% |
对比例7
(1)明胶颗粒的制备
5g明胶溶解在100mL去离子水溶液中,并保持加热到40℃,得到澄清透明的明胶水溶液, 滴加盐酸将溶液pH值调节至2.5,分别将300mL的丙酮溶液滴加至上述明胶水溶液中并保持加 热40℃和持续搅拌(1000rpm),滴加总时间为20min,向上述纳米颗粒悬液中加入74μL的交 联剂戊二醛(25wt%水溶液),交联时间12hrs,待反应结束后,向混合物中加入100mM浓度 的甘氨酸,终止未反应完全的戊二醛的端基。将纳米颗粒悬浮液反复离心和在去离子水中重 悬。得到局部带有正负电荷基团的明胶纳米颗粒。通过纳米粒度仪测试,其中颗粒的尺寸为 200nm,颗粒的电位是+8.5mV。。
(2)0.2g明胶颗粒与1mL去离子水通过鲁尔转接头注射器反复吹打10次,得到双网络水凝 胶;
(3)上述双网络水凝胶的储能模量和损耗模量使用旋转流变仪的时间扫描模式得到,其中频 率为1HZ,应变为0.5%。压缩断裂应变通过测试力学压缩得到,其中压缩速率为5mm/min, 压缩样品为直径12mm,高8mm的圆柱。(表13)同时可以观察单纯的明胶颗粒,IPRF凝胶的凝胶强度均远低于明胶颗粒-IPRF复合凝胶。
表13
200nm明胶颗粒 | |
储能模量 | 0.9kPa |
损耗模量 | 0.24kPa |
压缩断裂应变 | 17% |
实施例9降解实验
使用实施例1中100nm的正负电荷二氧化硅组成的胶体凝胶-iprf凝胶,纯的iprf凝胶在PBS 溶液中进行降解实验。
使用实施例1-6中的双网络水凝胶以确定其生长因子释放曲线。以实施例1中100nm正负电 荷二氧化硅纳米颗粒,实施例8中明胶纳米颗粒为例,将两组样品浸泡在磷酸盐缓冲盐水溶液 中(PBS,pH=7.4)并保持37℃环境温度置于振荡器上(30转/分钟),以模拟体内动态环境。 分别在1d,3d,7d,14d和21d吸收1ml PBS上清液,然后加入等量的新鲜PBS。根据制造商的 说明,使用ELISA试剂盒在每个时间点检查TGF-β,VEGF所有实验一式三份进行,每组三个 样品。如图1所示,经ELISA检测,iPRF-明胶颗粒,iPRF-二氧化硅颗粒水凝胶中VEGF和TGF-β 以一个相对恒定的浓度进行释放,这种均匀的释放在第15天仍能被检测到。
对比例8生长因子释放
使用对比例1中的iPRF凝胶以确定其生长因子释放曲线。将两组样品浸泡在磷酸盐缓冲盐 水溶液中(PBS,pH=7.4)并保持37℃环境温度置于振荡器上(30转/分钟),以模拟体内动 态环境。分别在1d,3d,7d,14d和21d吸收1ml PBS上清液,然后加入等量的新鲜PBS。根 据制造商的说明,使用ELISA试剂盒在每个时间点检查TGF-β,VEGF所有实验一式三份进行, 每组三个样品。第三天iPRF凝胶释放了大量的因子,剩余的因子以浓度递减的方式自iPRF的 纤维蛋白网络中释放,最终在第14d其释放完毕,与胶体颗粒-iPRF复合凝胶相比,活性因子 短期快速释放,无法实现长时间点缓释。
实施例10
使用3wv%戊巴比妥钠(1ml/kg)麻醉比格犬。拔除下颌第四前磨牙,每侧获得2个拔牙 窝。在左侧牙窝填入实施例8中双网络水凝胶。在2周对拔牙位点进行组织学分析。
如图3的结果显示,实施例8中制备的双网络水凝胶,骨效果明显好于对比例7中的单纯明 胶颗粒凝胶。图2a中圆圈代表新血管,图2b中星号代表新形成的骨区域,2w时,可以看到明 胶颗粒-IPRF水凝胶组有更多的血管及新骨生成。上述实验结果说明IPRF-GNPs水凝胶可以促 进局部区域的血管和骨生成。
对比例9
使用比格犬。拔除其下颌第四前磨牙,每侧获得2个拔牙窝。在右侧侧牙窝填入对比例7 中明胶颗粒凝胶。在2周对拔牙位点进行组织学分析。如图3的结果显示,2w时,明胶颗粒凝 胶没有成血管和成骨效。
实施例11
使用实施例1-8中得到的双网络水凝胶,以实施例1中的二氧化硅颗粒-IPRF和实施例8中的 明胶颗粒-IPRF为例,通过加入5mM柠檬酸钠阻止纤维蛋白原网络的聚合,在水凝胶具有剪 切变稀(即可打印)的条件下,使用三维生物打印机进行打印得到定制化支架,并通过浸泡 在10mM的氯化钙溶液中,使纤维蛋白原聚合形成纤维蛋白网络,得到增强,增韧双网络水 凝胶支架,其中明胶颗粒-IPRF颗粒-iPRF支架结构如图4a所示,二氧化硅颗粒-IPRF支架结构 如图4b。
Claims (9)
1.一种基于胶体颗粒-iPRF的双网络结构复合水凝胶,其特征在于,所述复合水凝胶为基于胶体颗粒和血液提取物可注射血小板富集纤维蛋白iPRF形成的具有双重网络微观结构的水凝胶;其中,胶体颗粒在物理作用下形成第一重胶体凝胶网络,可注射血小板富集纤维蛋白iPRF形成第二重纤维蛋白水凝胶网络,两重凝胶网络间以静电作用、氢键作用、疏水作用物理交联形成双网络结构水凝胶。
2.根据权利要求1所述的一种胶体颗粒-iPRF双网络结构复合水凝胶,其特征在于,所述可注射血小板富集纤维蛋白iPRF为来自自体、同种异体或异种异体的血液提取物。
3.根据权利要求1所述的一种胶体颗粒-iPRF双网络结构复合水凝胶,其特征在于,所述胶体颗粒是由静电相互作用组装而成,具体通过以下任一种方式组合而成:
1)由带正电荷的二氧化硅,生物玻璃,聚乳酸纳米颗粒和带负电荷的二氧化硅,生物玻璃,聚乳酸纳米颗粒分别共混组装而成,其中带正电荷颗粒和负电荷颗粒的混合比例为0.1~10;
2)由局部带有正电荷和负电荷基团的蒙脱石,壳聚糖,海藻酸,透明质酸,丝素,明胶纳米颗粒中的一种或几种的组合。
4.根据权利要求1所述的一种胶体颗粒-iPRF双网络结构复合水凝胶,其特征在于,所述胶体颗粒粒径为10nm~2μm,所述胶体颗粒表面电荷为-40~40mV。
5.根据权利要求4所述的一种胶体颗粒-iPRF双网络结构复合水凝胶,其特征在于,所述胶体颗粒粒径为10nm~500nm。
6.一种基于胶体颗粒-iPRF的双网络结构复合水凝胶的制备方法,其特征在于,所述方法包括如下步骤:
取新鲜血液样本离心1~10min,转速50~1000g,离心分层后的顶层黄色透明液体即为血液提取物可注射血小板富集纤维蛋白iPRF,迅速将上层黄色透明液体与胶体颗粒充分混匀,固化后即得所述胶体颗粒-iPRF双网络结构复合水凝胶;或
将胶体颗粒加入新鲜血液样本中,并放入离心机中离心1~10min,转速50~1000g,离心分层后的顶层棕黄色胶体固化后即为所述胶体颗粒-iPRF双网络结构复合水凝胶;
胶体颗粒-iPRF双网络结构复合水凝胶固化的时间为10~2000秒,其中,可注射、可塑形的时间窗口为<2000秒。
7.根据权利要求6所述的一种胶体颗粒-iPRF双网络结构复合水凝胶的制备方法,其特征在于,所述胶体颗粒是胶体颗粒在水溶液中的分散液和胶体颗粒的冻干粉中的一种或两种的组合。
8.根据权利要求1所述的双网络水凝胶,其特征在于,所述双网络结构复合水凝胶作为药物、生物活性蛋白、活细胞的载体,应用于骨组织、软骨组织、肌肉、血管修复的填充物。
9.权利要求1述的双网络水凝胶在三维细胞培养支架或加在细胞的3D生物打印墨水材料中的应用,用于组织或器官的3D生物打印,所述双网络结构复合水凝胶在打印前加入1~100mmol抗凝剂,打印之后浸泡于含Ca2+水性溶液中,得到具有稳定结构的支架。
Priority Applications (1)
Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
---|---|---|---|
CN201911076477.7A CN110760076B (zh) | 2019-11-06 | 2019-11-06 | 一种基于胶体颗粒-iPRF双网络结构的可注射、高强度复合水凝胶及其制备方法和应用 |
Applications Claiming Priority (1)
Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
---|---|---|---|
CN201911076477.7A CN110760076B (zh) | 2019-11-06 | 2019-11-06 | 一种基于胶体颗粒-iPRF双网络结构的可注射、高强度复合水凝胶及其制备方法和应用 |
Publications (2)
Publication Number | Publication Date |
---|---|
CN110760076A true CN110760076A (zh) | 2020-02-07 |
CN110760076B CN110760076B (zh) | 2022-04-08 |
Family
ID=69336523
Family Applications (1)
Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
---|---|---|---|
CN201911076477.7A Active CN110760076B (zh) | 2019-11-06 | 2019-11-06 | 一种基于胶体颗粒-iPRF双网络结构的可注射、高强度复合水凝胶及其制备方法和应用 |
Country Status (1)
Country | Link |
---|---|
CN (1) | CN110760076B (zh) |
Cited By (3)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
CN113336536A (zh) * | 2021-05-31 | 2021-09-03 | 大连理工大学 | 一种无机非金属纳米颗粒组装的水凝胶材料及其在增材制造技术中的应用 |
CN114886919A (zh) * | 2022-03-07 | 2022-08-12 | 西安中美弘康生物科技有限公司 | 一种可注射i-PRF纳米微粒制剂及其制备方法和用途 |
CN115521484A (zh) * | 2022-09-13 | 2022-12-27 | 大连理工大学 | 一种多酚、蛋白质复合颗粒组成的可注射胶体凝胶材料及其制备方法和应用 |
Citations (7)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
CN101305052A (zh) * | 2005-09-09 | 2008-11-12 | 渥太华健康研究所 | 互穿网络和相关方法及组合物 |
CN103037783A (zh) * | 2010-03-30 | 2013-04-10 | 乔治·D.·福卢什 | 用于非压迫性出血的组织封闭剂 |
CN103272258A (zh) * | 2013-05-15 | 2013-09-04 | 中国人民解放军第四军医大学 | 一种新的冻干富血小板纤维蛋白及其制备和应用 |
CN204379848U (zh) * | 2014-12-30 | 2015-06-10 | 中国人民解放军第四军医大学 | 一种复合水凝胶创伤敷料 |
CN106581772A (zh) * | 2016-12-02 | 2017-04-26 | 四川大学华西医院 | 携带G‑CSF缓释***的Fibrin‑HA水凝胶及其制备方法和用途 |
CN106983905A (zh) * | 2017-05-12 | 2017-07-28 | 王华楠 | 一种可注射型自愈合止血材料及其制备方法和应用 |
CN107073170A (zh) * | 2014-10-24 | 2017-08-18 | 赫斯特细胞有限公司 | 用于再生口腔粘膜的生物材料支架 |
-
2019
- 2019-11-06 CN CN201911076477.7A patent/CN110760076B/zh active Active
Patent Citations (7)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
CN101305052A (zh) * | 2005-09-09 | 2008-11-12 | 渥太华健康研究所 | 互穿网络和相关方法及组合物 |
CN103037783A (zh) * | 2010-03-30 | 2013-04-10 | 乔治·D.·福卢什 | 用于非压迫性出血的组织封闭剂 |
CN103272258A (zh) * | 2013-05-15 | 2013-09-04 | 中国人民解放军第四军医大学 | 一种新的冻干富血小板纤维蛋白及其制备和应用 |
CN107073170A (zh) * | 2014-10-24 | 2017-08-18 | 赫斯特细胞有限公司 | 用于再生口腔粘膜的生物材料支架 |
CN204379848U (zh) * | 2014-12-30 | 2015-06-10 | 中国人民解放军第四军医大学 | 一种复合水凝胶创伤敷料 |
CN106581772A (zh) * | 2016-12-02 | 2017-04-26 | 四川大学华西医院 | 携带G‑CSF缓释***的Fibrin‑HA水凝胶及其制备方法和用途 |
CN106983905A (zh) * | 2017-05-12 | 2017-07-28 | 王华楠 | 一种可注射型自愈合止血材料及其制备方法和应用 |
Cited By (5)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
CN113336536A (zh) * | 2021-05-31 | 2021-09-03 | 大连理工大学 | 一种无机非金属纳米颗粒组装的水凝胶材料及其在增材制造技术中的应用 |
CN113336536B (zh) * | 2021-05-31 | 2022-11-15 | 大连理工大学 | 一种无机非金属纳米颗粒组装的水凝胶材料及其在增材制造技术中的应用 |
WO2022252526A1 (zh) * | 2021-05-31 | 2022-12-08 | 大连理工大学 | 一种无机非金属纳米颗粒组装的水凝胶材料及其在增材制造技术中的应用 |
CN114886919A (zh) * | 2022-03-07 | 2022-08-12 | 西安中美弘康生物科技有限公司 | 一种可注射i-PRF纳米微粒制剂及其制备方法和用途 |
CN115521484A (zh) * | 2022-09-13 | 2022-12-27 | 大连理工大学 | 一种多酚、蛋白质复合颗粒组成的可注射胶体凝胶材料及其制备方法和应用 |
Also Published As
Publication number | Publication date |
---|---|
CN110760076B (zh) | 2022-04-08 |
Similar Documents
Publication | Publication Date | Title |
---|---|---|
CN110743038B (zh) | 一种双网络结构复合水凝胶及其制备方法和应用 | |
Wu et al. | Functionalization of silk fibroin electrospun scaffolds via BMSC affinity peptide grafting through oxidative self-polymerization of dopamine for bone regeneration | |
Cao et al. | New perspectives: In-situ tissue engineering for bone repair scaffold | |
Bai et al. | Bioactive hydrogels for bone regeneration | |
CN110760076B (zh) | 一种基于胶体颗粒-iPRF双网络结构的可注射、高强度复合水凝胶及其制备方法和应用 | |
Badylak et al. | Macrophage phenotype as a determinant of biologic scaffold remodeling | |
US6949625B2 (en) | Injectable implant of insoluble globin | |
US20070116680A1 (en) | Stem cells within gel microenvironments | |
Li et al. | Functional microspheres for tissue regeneration | |
JP5684154B2 (ja) | 注射用生体材料 | |
CN105998067A (zh) | 伤口修复剂组合物的制备工艺、管子及装置 | |
Babu et al. | Controlling structure with injectable biomaterials to better mimic tissue heterogeneity and anisotropy | |
Zhang et al. | Bilayer membrane composed of mineralized collagen and chitosan cast film coated with berberine-loaded PCL/PVP electrospun nanofiber promotes bone regeneration | |
Galvez-Martin et al. | Encapsulation in cell therapy: methodologies, materials, and clinical applications | |
Ashraf et al. | Prospects of natural polymeric scaffolds in peripheral nerve tissue-regeneration | |
JP2016514716A (ja) | 組織の再生および創傷の治療のための植え込み型製剤、それらの製剤化方法、および該植え込み型製剤を用いる患者の治療方法 | |
Lu et al. | Engineering exosomes and biomaterial-assisted exosomes as therapeutic carriers for bone regeneration | |
Wang et al. | Hydrogels for treatment of different degrees of osteoarthritis | |
Chen et al. | Nanocomposite hydrogels in regenerative medicine: applications and challenges | |
Miszuk et al. | Biomimetic nanofibrous 3D materials for craniofacial bone tissue engineering | |
CN114149598A (zh) | 一种糖尿病微环境响应性复合智能水凝胶及其制备方法和应用 | |
JP2023537323A (ja) | バイオ適合性の注射用及びインサイチューゲル化用ハイドロゲル並びに組織及び器官修復のための、セルロースナノフィブリルに基づくバイオ適合性の注射用及びインサイチューゲル化用ハイドロゲルの調製及び適用 | |
Pan et al. | Role of nano-hydrogels coated exosomes in bone tissue repair | |
Ying et al. | Shape-memory ECM-mimicking heparin-modified nanofibrous gelatin scaffold for enhanced bone regeneration in sinus augmentation | |
CN114533958B (zh) | 具有塑形作用的骨组织缺损修复材料及其制备方法 |
Legal Events
Date | Code | Title | Description |
---|---|---|---|
PB01 | Publication | ||
PB01 | Publication | ||
SE01 | Entry into force of request for substantive examination | ||
SE01 | Entry into force of request for substantive examination | ||
GR01 | Patent grant | ||
GR01 | Patent grant |