CN110747254B - 一种单细胞5-hmC的检测方法 - Google Patents

一种单细胞5-hmC的检测方法 Download PDF

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Abstract

本发明公开了一种单细胞5‑hmC的检测方法，属于分子生物学技术领域，通过微流控芯片法获取包裹单细胞的琼脂糖凝胶微球，对包裹单细胞的琼脂糖凝胶微球去乳化处理后，在琼脂糖凝胶微球中将细胞裂解，再利用点击化学反应原理，将Cy5荧光基团连接到基因组DNA上，实现基因组DNA上5‑hmC的化学标记。本发明利用点击化学反应原理实现5‑hmC的检测和分析，克服了难以进行大量样品检测、无法进行单个细胞内5‑hmC检测、化学反应条件苛刻、反应效率低等缺点。

Description

一种单细胞5-hmC的检测方法
技术领域
本发明属于分析化学、修饰碱基的检测领域，涉及一种单细胞5-hmC的检测方法。
背景技术
当前研究已经证明同种细胞在微观角度是有显著差异的，即存在着显著的微观不一致性(异质性)，传统的生物学实验都是基于大量细胞的，其实验结果难以反映单细胞水平上的生命活动规律。因此，单细胞分析可以分析同种细胞间的个体差异，能在更微观层次上揭示生命活动的规律，能更加准确的揭露生命活动的本质，也就可以为探究重大疾病的起因、发展和治疗提供更可靠的科学依据。而基因组DNA甲基化是人类基因组中一种重要的表观遗传(epigenetic)修饰，作为转录沉默的标志，DNA甲基化是许多细胞过程的中心环节，而这些细胞过程发挥着重要的作用。5-羟甲基胞嘧啶(5-hydroxymethylcytosine,5-hmC)是一种表观修饰的胞嘧啶，是5-甲基胞嘧啶(5-methylcytosine,5-mC)的羟基化形式，可以调控基因表达的关闭，是一种重要的表观遗传修饰。研究表明，5-hmC的表达水平在众多肿瘤组织中显著下降，在研究肿瘤发生及发展过程具有重要作用。
当前，抗体检测法是探究5-hmC在组织中分布的主要手段之一，通过5-hmC特异性抗体，利用免疫荧光技术(Immunofluoresence，IF)确定组织中5-hmC的分布；或者使用点杂交等技术来显示组织或细胞DNA中5-hmC的含量。也可以利用重亚硫酸盐将5-hmC转化成5-磺酸胞嘧啶(Cytosine-5-methylsuphonate，CMS)，再利用相应抗体对CMS进行检测，从而对5-hmC进行间接检测，这样可以不受5-hmC丰度约束，但是这种方法很难准确定量，也达不到单碱基分辨率。
另一种DNA样品中5-hmC的检测方法是色谱、质谱检测法。通过色谱或质谱也可以同时对DNA样本中的5-hmC和5-mC水平进行检测，结果显示不同组织中5-hmC含量具有差异性。还可以利用液相色谱-质谱联用的方法对5-hmC含量进行检测。该方法利用了不用物质的荷质比(m/z)不同，将样品中的不同组分在电场或者磁场中分离，从而对样品中5-hmC总量进行检测。但是色谱、质谱检测法并不适用于大量样品检测。
此外，还有其他细胞内5-hmC的检测方法。葡糖基化标记-液闪分析法利用化学修饰对DNA样本中5-hmC水平进行检测。葡萄糖基转移酶(β-glycosyltransferase，β-GT)可以将葡萄糖从供体转移至5-hmC上，生成β-葡萄糖基-5-羟甲基胞嘧啶(5-gmC)。利用[H3]对尿苷酸二磷酸葡萄糖(UDP-[H3]-glucose)进行标记，通过T4噬菌体β-GT将标记过的葡萄糖转移至5-hmC上，最后放射性计数分析就可以对样本整体的5-hmC进行测定。该方法灵敏度比之前的方法更高，所需样本更小，没有序列偏倚，但是化学反应所需条件更苛刻，不能保证完全的酶学反应。
发明内容
为了克服上述现有技术的缺点，本发明的目的在于提供一种单细胞5-hmC的检测方法，该方法基于包裹单细胞的琼脂糖凝胶微球，利用点击化学反应原理实现5-hmC的检测和分析，克服了难以进行大量样品检测、无法进行单个细胞内5-hmC检测、化学反应条件苛刻、反应效率低的技术缺点。
为了达到上述目的，本发明采用以下技术方案予以实现：
本发明公开了一种单细胞5-hmC的检测方法，包括：通过微流控芯片法获取包裹单细胞的琼脂糖凝胶微球，对包裹单细胞的琼脂糖凝胶微球去乳化处理后，在琼脂糖凝胶微球中将细胞裂解，再利用点击化学反应原理，将Cy5荧光基团连接到基因组DNA上，实现基因组DNA上5-hmC的化学标记。
优选地，获取包裹单细胞的琼脂糖凝胶微球后，将包裹单细胞的琼脂糖凝胶微球于4℃下固化处理3～5h，使琼脂糖凝胶微球中琼脂糖含量达到1.5％。
优选地，所述对包裹单细胞的琼脂糖凝胶微球去乳化处理是将包裹单细胞的琼脂糖凝胶微球离心后，依次用异丙醇、无水乙醇震荡混合、离心处理，再加入PBS，震荡混合后离心处理，收集沉淀。
优选地，在琼脂糖凝胶微球中将细胞裂解，是将包裹单细胞的琼脂糖凝胶置于细胞裂解液中并加入蛋白酶K，37℃300r/min震荡处理过夜。
进一步优选地，细胞裂解液包含：30mM Tris-HCl(pH＝8.0)、10mM NaCl、5mMEDTA、0.5％Triton-X 100和10mM DTT，pH值为8.0。
优选地，利用点击化学反应原理，将Cy5荧光基团连接到基因组DNA上，是在β-葡萄糖基转移酶的催化作用下，将带有叠氮修饰的尿苷二磷酸葡萄糖转移至5-hmC上，使转移到5-hmC上的UDP-Glu-N3与二苯并环辛烯-Cy5进行环加成反应，实现基因组DNA上5-hmC的荧光标记。
优选地，制备琼脂糖单细胞凝胶微球时细胞悬液中含有17％的OptiPrep以防止细胞沉降。
与现有技术相比，本发明具有以下有益效果：
1)本发明所述的检测方法，利用琼脂糖凝胶液滴技术得到单细胞，进行单细胞内物质的检测和分析，能避免细胞之间差异造成的干扰，即可避免细胞异质性带来的差异，实现准确检测和分析。
2)本发明所述的琼脂糖凝胶微球，可以在细胞裂解后数日内将细胞基因组DNA保留在胶球内，不会外泄，可以在胶球内对基因组DNA上的目标物进行识别和标记，提高单细胞分析的准确度与灵敏度。
3)本发明所述的点击化学反应，将转移到5-hmC上的UDP-Glu-N3与DBCO-Cy5进行环加成反应，是一种高产率、反应条件简单、反应速度快、原料和反应试剂易得的化学反应，且符合原子经济。
4)本发明所述的快速、低耗、高通量的检测方法操作简单，利用琼脂糖液滴技术与点击化学反应，即可实现单个细胞基因组DNA上5-hmC的识别与标记。
附图说明
图1为本发明方法的技术原理图；
图2为利用琼脂糖液滴技术所收集到的琼脂糖凝胶微球的显微图像；
图3为对细胞染色后包裹单细胞的琼脂糖凝胶微球的显微图像；
图4为细胞裂解后不同时间的胶球内基因组DNA分布的超分辨荧光共聚焦显微镜染色图像；
图5为MCF-7细胞与MCF-10A细胞实验组与对照组对比结果；
图6为MCF-7细胞与MCF-10A细胞中5-hmC含量对比结果。
具体实施方式
为了使本技术领域的人员更好地理解本发明方案，下面将结合本发明实施例中的附图，对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例仅仅是本发明一部分的实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都应当属于本发明保护的范围。
需要说明的是，本发明的说明书和权利要求书中的术语“包括”和“具有”以及他们的任何变形，意图在于覆盖不排他的包含，例如，包含了一系列步骤或单元的过程、方法、***、产品或设备不必限于清楚地列出的那些步骤或单元，而是可包括没有清楚地列出的或对于这些过程、方法、产品或设备固有的其它步骤或单元。
参见图1，为本发明的原理图；通过微流控芯片技术，获取包裹单细胞的琼脂糖凝胶微球，在琼脂糖凝胶微球中将细胞裂解，再利用点击化学反应原理，将Cy5荧光基团连接到基因组DNA上，实现基因组DNA上5-hmC的荧光化学标记。具体地，本发明是通过以下技术方案来实现：
1、包裹单细胞的琼脂糖凝胶微球处理方法，包括以下操作：
1)制备琼脂糖凝胶微球，包裹单细胞。制备琼脂糖单细胞凝胶微球时细胞悬液中含有17％的OptiPrep以防止细胞沉降；所制得的琼脂糖凝胶微球中琼脂糖含量为1.5％，胶球外层由Droplet Generation Oil包裹，胶球中包裹单细胞的理论值为14.7％；
如图2所示，为通过微流控芯片所收集到的琼脂糖凝胶微球，胶球中包裹的溶液为DEPC处理水。由于Droplet Generation Oil具有强挥发性，导致胶球样品很快干燥，所以胶球在图中显示为六边形；
2)将上述包裹单细胞的琼脂糖凝胶微球置于4℃，3-5h进行固化；
3)对胶球进行去乳化。将胶球从4℃取出后，3000r离心2min并去除下部清液；向胶球中加入异丙醇，震荡混合均匀后3000r离心2min，去除上清液；向胶球中加入无水乙醇，震荡混合均匀后3000r离心2min，去除上清液，此步骤重复两次；向胶球中加入PBS，震荡混合均匀后3000r离心2min，去除上清液；
如图3所示，为对细胞染色后包裹单细胞的琼脂糖凝胶微球；在获取包裹细胞的凝胶微球后，对胶球进行去乳化、对细胞进行裂解，再对细胞核进行4',6-二脒基-2-苯基吲哚(4',6-diamidino-2-phenylindole，DAPI)染色之后使用倒置荧光显微镜进行成像，可以观察到胶球内包裹有单细胞；
4)对胶球内细胞进行裂解。将配制好的细胞裂解液(30mM Tris-HCl(pH＝8.0)、10mM NaCl、5mM EDTA、0.5％Triton-X 100、10mM DTT)加入到去乳化后的胶球中，37℃500rpm震荡12h裂解；
图4为细胞裂解后不同时间的胶球内基因组DNA分布；在获取包裹细胞的凝胶微球后，对胶球进行去乳化、对细胞进行裂解，再对胶球内基因组DNA进行SYBR GreenⅠ染色。染色结束后在分别经过6h、24h、48h后使用超分辨荧光共聚焦显微镜进行成像分析，可以观察到胶球内基因组DNA没有泄露到胶球之外，即胶球包裹基因组DNA具有稳定性。
2、通过β-葡萄糖转移酶(β-GT)将UDP-N3-Glu连接至5-hmC的过程为：向裂解过后的凝胶微球加入50μl NE Buffer 4震荡混合均匀，3000r离心2min后，去除上清液；向胶球中加入2μMβ-GT和200μM UDP-N3-Glu，在1×NE Buffer 4中进行反应，37℃500rpm震荡反应3h；反应结束后3000r离心2min，去除上清液。
3、利用点击化学反应对5-hmC/N3进行DBCO-Cy5标记的过程为：向胶球中加入50μlPBS，震荡混合均匀后离心，去除上清液，此步骤重复三次；向胶球中加入50μM DBCO-Cy5，在1×PBS溶液中，黑暗环境中37℃500rpm震荡反应2h；反应结束后3000r离心2min，去除上清液。
4、对基因组DNA进行荧光标记的过程为：向含有已经进行DBCO-Cy5标记和FP-Cy5标记DNA的胶球中加入50μl 2×SSC，震荡混合均匀后3000r离心2min，去除上清液，此步骤重复三次；向胶球中加入20μM SYBR-Green，在DEPC水将反应体系中，黑暗环境中37℃500rpm震荡反应1h；反应结束后3000r离心2min，去除上清液。
5、对单细胞基因组DNA上5-hmC荧光成像：使用超高分辨激光共聚焦显微镜(Super-resolution Confocal Microscope)对样品进行成像，对荧光信号进行分析。
实施例1：
将固化后的单细胞凝胶微球3000r离心2min并去除下部清液；向胶球中加入异丙醇，震荡混合均匀后3000r离心2min，去除上清液；向胶球中加入无水乙醇，震荡混合均匀后3000r离心2min，去除上清液，此步骤重复两次；向胶球中加入PBS，震荡混合均匀后3000r离心2min，去除上清液；完成胶球的去乳化。向裂解后的胶球加入50μl 2×SSC，震荡混合均匀后3000r离心2min，去除上清液；向胶球中加入20μM SYBR-Green，在DEPC水将反应体系中，黑暗环境中37℃500rpm震荡反应1h；反应结束后3000r离心2min，去除上清液；向胶球中加入PBS，震荡混合均匀后3000r离心2min，此步骤重复三次。染色结束后在分别经过6h、24h、48h后使用超分辨荧光共聚焦显微镜进行成像分析。
结合图4，观察细胞裂解后不同时间的胶球内基因组DNA分布，可以观察到胶球内基因组DNA没有泄露到胶球之外，即胶球包裹基因组DNA具有稳定性。
实施例2：MCF-7细胞与MCF-10A细胞中实验组与对照组对比，以及MCF-7细胞与MCF-10A细胞中5-hmC含量分析与对比。
向裂解过后的凝胶微球加入50μl NE Buffer 4震荡混合均匀，3000r离心2min后，去除上清液；向胶球中加入2μMβ-GT和200μM UDP-N3-Glu，在1×NE Buffer4中进行反应，37℃500rpm震荡反应3h；反应结束后3000r离心2min，去除上清液；向胶球中加入50μl PBS，震荡混合均匀后离心，去除上清液，此步骤重复三次；向胶球中加入50μM DBCO-Cy5，在1×PBS溶液中，黑暗环境中37℃500rpm震荡反应2h；反应结束后3000r离心2min，去除上清液；向胶球加入50μl2×SSC，震荡混合均匀后3000r离心2min，去除上清液；向胶球中加入20μMSYBR-Green，在DEPC水将反应体系中，黑暗环境中37℃500rpm震荡反应1h；反应结束后3000r离心2min，去除上清液；向胶球中加入PBS，震荡混合均匀后3000r离心2min，此步骤重复三次。染色结束后使用超分辨荧光共聚焦显微镜进行成像分析。
由图5可知，MCF-7细胞与MCF-10A细胞的空白对照组DNA被SYBR GreenⅠ正常标记，但基因组DNA上的5-hmC由于缺乏β-葡萄糖转移酶导致无法被标记，只有极少吸附信号。而两种细胞系实验组中基因组DNA被正常标记，且基因组DNA上5-hmC也被DBCO-Cy5标记为红色。由图6可知，MCF-7和MCF-10A细胞基因组DNA上5-hmC均被染为红色，且含量差异不显著。
以上内容仅为说明本发明的技术思想，不能以此限定本发明的保护范围，凡是按照本发明提出的技术思想，在技术方案基础上所做的任何改动，均落入本发明权利要求书的保护范围之内。

Claims (5)

1.一种非疾病诊断目的的单细胞5-hmC的检测方法，其特征在于，包括：通过微流控芯片法获取包裹单细胞的琼脂糖凝胶微球，对包裹单细胞的琼脂糖凝胶微球去乳化处理后，在琼脂糖凝胶微球中将细胞裂解，再利用点击化学反应原理，将Cy5荧光基团连接到基因组DNA上，实现基因组DNA上5-hmC的化学标记；
其中，利用点击化学反应原理，将Cy5荧光基团连接到基因组DNA上，是在β-葡萄糖基转移酶的催化作用下，将带有叠氮修饰的尿苷二磷酸葡萄糖转移至5-hmC上，使转移到5-hmC上的UDP-Glu-N3与二苯并环辛烯-Cy5进行环加成反应，实现基因组DNA上5-hmC的荧光标记；
制备琼脂糖单细胞凝胶微球时细胞悬液中含有17%的OptiPrep以防止细胞沉降。
2.根据权利要求1所述的非疾病诊断目的的单细胞5-hmC的检测方法，其特征在于，获取包裹单细胞的琼脂糖凝胶微球后，将包裹单细胞的琼脂糖凝胶微球于4℃下固化处理3~5h，使琼脂糖凝胶微球中琼脂糖含量达到1.5%。
3.根据权利要求1所述的非疾病诊断目的的单细胞5-hmC的检测方法，其特征在于，所述对包裹单细胞的琼脂糖凝胶微球去乳化处理是将包裹单细胞的琼脂糖凝胶微球离心后，依次用异丙醇、无水乙醇震荡混合、离心处理，再加入PBS，震荡混合后离心处理，收集沉淀。
4.根据权利要求1所述的非疾病诊断目的的单细胞5-hmC的检测方法，其特征在于，在琼脂糖凝胶微球中将细胞裂解，是将包裹单细胞的琼脂糖凝胶置于细胞裂解液中并加入蛋白酶K，37℃ 300r/min震荡处理过夜。
5.根据权利要求4所述的非疾病诊断目的的单细胞5-hmC的检测方法，其特征在于，细胞裂解液包含：30mM pH=8.0的Tris-HCl、10mM NaCl、5mM EDTA、0.5% Triton-X 100和10mMDTT，pH值为8.0。
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