CN110736840A - Mmp7、ctse或lamc2蛋白在制备肝内胆管细胞癌诊断试剂中的应用 - Google Patents

Mmp7、ctse或lamc2蛋白在制备肝内胆管细胞癌诊断试剂中的应用 Download PDF

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Abstract

本发明涉及医学生物工程技术领域，旨在提供MMP7、CTSE或LAMC2蛋白在制备肝内胆管细胞癌诊断试剂中的应用，是将其中至少一种蛋白用于制备能鉴别诊断肝内胆管细胞癌并区分原发性肝细胞癌的试剂，即利用三种蛋白的单独或组合使用方式去实现鉴别、区分肝细胞癌和肝内胆管细胞癌。本发明提出利用三种蛋白制备试剂或试剂盒产品，通过采用免疫学相关方法检测血液中蛋白的表达水平而作为诊断肝内胆管细胞癌标志物的依据。本发明可以准确特异的为受试者判断肝内胆管细胞癌、受试者判断良性胆道疾病、肝细胞肝癌、受试者判断健康状态的可能性，为医生下一步诊疗方案提供依据。

Description

MMP7、CTSE或LAMC2蛋白在制备肝内胆管细胞癌诊断试剂中的 应用
技术领域
本发明属于医学生物工程技术领域，特别涉及MMP7、CTSE或LAMC2蛋白在制备肝内胆管细胞癌诊断试剂中的应用。
背景技术
肝内胆管细胞癌占肝脏原发恶性肿瘤的10％-15％，为第二大常见的原发性肝癌。肝内胆管细胞癌早期无明显临床症状，多数患者被确诊时已经发展到晚期阶段，已失去手术机会。肝内胆管细胞癌对化疗、免疫治疗、放疗均不敏感，较为有效的治疗方法是手术切除。肝内胆管细胞癌确诊后患者的总体生存期一般为6-12个月，5年生存率小于5％；切除手术后的患者5年生存率也仅有20％-40％，预后非常差。此外，肝内胆管细胞癌的发生部位在肝实质内，在临床上缺乏有效的与肝细胞癌进行区分的诊断方法，亦为随后的有效临床治疗带来极大的困难。
目前临床上缺乏早期诊断肝内胆管细胞癌的标志物。糖类抗原125、糖类抗原19-9、癌胚抗原等虽然在临床上会被用作诊断胆管细胞癌的参考标志物，但其在管道类癌症中均有较高的表达值，灵敏度和特异度均不理想。因此，如能制备和提供灵敏、特异的用于肝内胆管细胞癌检测的试剂，将会对临床上准确鉴别诊断肝内胆管细胞癌，并将其与原发性肝癌进行区分提供较大的帮助。
发明内容
本发明要解决的技术问题是，克服现有技术中的不足，提供MMP7、CTSE或LAMC2蛋白在制备肝内胆管细胞癌诊断试剂中的应用。
为解决技术问题，本发明的解决方案是：
提供一种MMP7、CTSE或LAMC2蛋白在制备肝内胆管细胞癌诊断试剂中的应用，是将其中至少一种蛋白用于制备能鉴别诊断肝内胆管细胞癌并区分原发性肝细胞癌的试剂(即利用其中一种、任意两种或三种蛋白的单独或组合使用方式去实现鉴别、区分肝细胞癌和肝内胆管细胞癌)。
本发明进一步提供了特异性检测MMP7、CTSE或LAMC2蛋白表达水平的试剂的用途，是将特异性检测其中至少一种蛋白的试剂用于制备能鉴别肝内胆管细胞癌以区分原发性肝细胞癌的试剂盒。
本发明中，所述的特异性检测MMP7蛋白表达水平的试剂是抗MMP7蛋白的抗体；所述的特异性检测CTSE蛋白表达水平的试剂是抗CTSE蛋白的抗体；所述的特异性检测LAMC2蛋白表达水平的试剂是抗LAMC2蛋白的抗体。
本发明中，所述的抗体是单克隆抗体或多克隆抗体。
本发明中，所述的试剂盒是基于免疫原理的检测试剂盒；该试剂盒中包括：MMP7、CTSE或LAMC2中至少一种蛋白的单克隆抗体或多克隆抗体；包被抗体的固相载体；能结合可检测信号分子的检测抗体(二抗)；显色底物或发光底物，用于与检测抗体及信号分子发生反应的反应物，以实现定性和定量检测。
本发明中，所述可检测信号分子是本领域的通用分子，例如下述任意一种：辣根过氧化物酶、碱性磷酸酶、葡萄糖氧化酶、β-D-半乳糖苷酶、脲酶、钌复合物。
本发明中，所述显色底物或发光底物是可检测信号分子的反应底物；例如，显色底物可选四甲基联苯胺(TMB)、邻苯二胺(OPD)或对硝基苯磷酸酯，发光底物可选鲁米诺或三丙胺。
与现有技术相比，本发明的有益效果是：
1、MMP7和/或CTSE和/或LAMC2蛋白可用于制备试剂或试剂盒产品，通过采用免疫学相关方法检测血液中MMP7、CTSE、LAMC2蛋白的表达水平而作为诊断肝内胆管细胞癌标志物的依据。
2、结合三种蛋白的表达测量，可以准确特异的为受试者判断肝内胆管细胞癌的可能性，为医生下一步诊疗方案提供依据。
3、结合三种蛋白的表达测量，可以准确特异的为受试者判断良性胆道疾病的可能性，为医生下一步诊疗方案提供依据。
4、结合三种蛋白的表达测量，可以准确特异的为受试者判断肝细胞肝癌的可能性，为医生下一步诊疗方案提供依据。
5、结合三种蛋白的表达测量，可以准确特异的为受试者判断健康状态的可能性，为医生下一步诊疗方案提供依据。
附图说明
图1为本发明实施例中针对MMP7蛋白的标志物蛋白检测结果。
图2为本发明实施例中针对CTSE蛋白的标志物蛋白检测结果。
图3为本发明实施例中针对LAMC2蛋白的标志物蛋白检测结果。
图4为本发明实施例中的操作者特征曲线(肝内胆管细胞癌患者VS健康人)。
图5为本发明实施例中的操作者特征曲线(肝内胆管细胞癌患者VS肝细胞癌患者)。
图6为本发明实施例中的操作者特征曲线(肝内胆管细胞癌患者VS良性胆道疾病患者)。
图1-3中，圆点标记为39例肝内胆管细胞癌患者、方块标记为22例健康人、三角标记为20例良性胆道疾病患者、菱形标记为17例肝细胞癌患者。
具体实施方式
根据业内针对MMP7、CTSE和LAMC2蛋白的现有研究显示，这三种蛋白均为正常的生理功能蛋白，但在某些疾病中有所变化。文献中表明MMP7蛋白是一种基质金属蛋白酶，主要作用是细胞外基质蛋白降解，其相关疾病包括脑胶质母细胞瘤和痉挛性眼睑内翻；CTSE蛋白是一种天门冬氨酸肽链内切酶，据报道和胃肠道腺癌有关，但并非疾病诊断相关；LAMC2蛋白是一种层粘连蛋白，可以与肝素结合，其功能与细胞迁移和运动有关。
申请人进一步深入研究发现，MMP7和/或CTSE和/或LAMC2蛋白在肝内胆管细胞癌患者血液中呈高表达水平，并且其表达水平不同于健康人、良性胆道疾病和肝细胞癌患者血液中的蛋白水平。根据接受者操作特征曲线(ROC曲线)，其中一个蛋白或蛋白组合可以得到较高的特异性和敏感性，因此，可基于该特性将其中一个或多个蛋白组合为特异性早期诊断肝内胆管细胞癌的标志物。在此基础上，本发明建立了一种肝内胆管细胞癌的检测方法，其主要目的是提供一种检测肝内胆管细胞癌发生的技术，改变目前肝内胆管细胞癌缺少诊断技术的现状。
本发明中，单克隆抗体或多克隆抗体均可采用常规技术实现。由于制备抗体属于本领域技术人员熟练掌握的技能，本发明不再赘述。
在获得特异性检测MMP7蛋白或CTSE蛋白或LAMC2蛋白表达水平的试剂后，可以方便地制备用于肝内胆管细胞癌诊断的免疫检测试剂盒。该试剂盒除了包括相应的抗体之外，还包含：可检测信号分子以及可以结合可检测信号分子的检测抗体，用于识别特异性检测MMP7蛋白或CTSE蛋白或LAMC2蛋白的单克隆或多克隆抗体，以及与检测抗体及信号分子反应的反应物。如本发明所述，在得到MMP7蛋白和/或CTSE蛋白和/或LAMC2蛋白的单克隆抗体或多克隆抗体以及它们的检测抗体后，可以采用本领域可以用于结合检测抗体的可检测信号分子，进而需要可以与可检测信号分子发生反应的反应物产生显色反应或者发光反应，最终达到对MMP7蛋白或CTSE蛋白或LAMC2蛋白的定性和定量检测的目的。上述可检测分子可以选择本领域的通用化学物质，例如；辣根过氧化物酶、碱性磷酸酶、葡萄糖氧化酶、β-D-半乳糖苷酶、脲酶、吖啶酯、鲁米诺；根据不同的可检测分子的特性选择适合的反应物，例如与辣根过氧化酶反应的邻苯二胺(OPD)、四甲基联苯胺(TMB)、鲁米诺，与碱性磷酸酶反应的对硝基苯磷酸酯(p-NPP)，与钌复合物反应的三丙胺等。
基于本发明，多种免疫学相关方法可用以检测样品中MMP7蛋白或CTSE蛋白或LAMC2蛋白的表达量，这些方法均可利用现有技术。因属于本领域技术人员熟练掌握的技能，本发明不再赘述。
利用本发明制备的试剂盒，可实现肝内胆管细胞癌诊断，其使用方法如下：
1.应用试剂盒检测受试者血液样本中MMP7、CTSE、LAMC2蛋白的表达水平。
2.分析MMP7、CTSE、LAMC2蛋白的表达水平，确定可能的疾病状态：
如果MMP7蛋白的表达升高，可以为受试者提示肝内胆管细胞癌的发生。
如果CTSE蛋白的表达升高，可以为受试者提示肝内胆管处于病理状态。
如果LAMC 2蛋白的表达升高，可以为受试者提示肝内胆管部位肿瘤的发生。
下面结合具体实施例的数据，对本发明的实现结果进行详细描述。此实施例仅用于阐述本发明而非限制本发明的范围。
实施例1、在某医院选取98名志愿者，包括39例肝内胆管细胞癌患者、22例健康人、20例良性胆道疾病患者和17例肝细胞癌患者。从志愿者提取生物样本、记录特征参数，并利用试剂盒进行特异性检测。试验组的特征参数如表1所示。
表1为39例肝内胆管细胞癌患者、17例肝细胞癌患者和20例良性胆道疾病患者的临床特征。
Figure BDA0002241662850000041
Figure BDA0002241662850000051
(表中：a费舍尔精确检验；b卡方检验；c方差检验)
使用商售抗体夹心法检测三种蛋白，将标本加入抗体包被的微孔中，37度温育1小时后加入生物素化抗体(稀释100倍)，37度再次温育1小时，洗涤后加入检测溶液，37度再次温育半小时，洗涤后加入显色底物37度避光显色10分钟，终止反应并检测光密度。具体检测结果如图1-3所示，图中展示了39例肝内胆管细胞癌患者、22例健康人、20例良性胆道疾病患者和17例肝细胞癌患者血液中MMP7、CTSE、LAMC2蛋白的检测结果，从图4-6的接受者操作特征曲线(ROC曲线)中可以看出，MMP7、CTSE、LAMC2蛋白可以有效地区分肝内胆管细胞癌、肝细胞癌、良性胆道疾病和健康状态。
从上述示例可以看出，基于本发明的试剂可以准确特异的预估病人患有肝内胆管细胞癌的可能性，从而确认是否需要进一步的检查与治疗。

Claims (7)

1.MMP7、CTSE或LAMC2蛋白在制备肝内胆管细胞癌诊断试剂中的应用，其特征在于，是将其中至少一种蛋白用于制备能鉴别诊断肝内胆管细胞癌并区分原发性肝细胞癌的试剂。
2.特异性检测MMP7、CTSE或LAMC2蛋白表达水平的试剂的用途，其特征在于，是将特异性检测其中至少一种蛋白的试剂用于制备能鉴别肝内胆管细胞癌以区分原发性肝细胞癌的试剂盒。
3.根据权利要求2所述的用途，其特征在于，所述的特异性检测MMP7蛋白表达水平的试剂是抗MMP7的抗体；所述的特异性检测CTSE蛋白表达水平的试剂是抗CTSE的抗体；所述的特异性检测LAMC2蛋白表达水平的试剂是抗LAMC2蛋白的抗体。
4.如权利要求3所述的用途，其特征在于，所述的抗体是单克隆抗体或多克隆抗体。
5.根据权利要求2所述的用途，其特征在于，所述的试剂盒是基于免疫原理的检测试剂盒；该试剂盒中包括：
MMP7、CTSE或LAMC2中至少一种蛋白的单克隆抗体或多克隆抗体；
包被抗体的固相载体；
能结合可检测信号分子的检测抗体；
显色底物或发光底物，用于与检测抗体及信号分子发生反应的反应物，以实现定性和定量检测。
6.根据权利要求5所述的用途，其特征在于，所述可检测信号分子是下述任意一种：辣根过氧化物酶、碱性磷酸酶、葡萄糖氧化酶、β-D-半乳糖苷酶、脲酶、钌复合物。
7.根据权利要求5所述的用途，其特征在于，所述显色底物是四甲基联苯胺、邻苯二胺或对硝基苯磷酸酯，所述发光底物是鲁米诺或三丙胺。
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